Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:19:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 XavierFerrucio_JulianaMartins_D.pdf: 4222784 bytes, checksum: e2845997ddb128f2d29a2cabc667da17 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A hematopoiese, processo pelo qual a célula-tronco hematopoiética (CTH) dá origem a todas as células do sangue, é regulada através do seu contato com diversos tipos celulares que compõem o estroma da medula óssea, mantendo o balanço entre autorrenovação e diferenciação das CTHs, processos também regulados por vias de sinalização como a via Hedgehog e proteínas reguladoras de citoesqueleto como RhoGTPases. Sendo assim, os objetivos gerais do trabalho foram investigar a via Hedgehog na medula óssea de pacientes com síndromes mielodisplásica (SMD) e a função da ARHGAP21 na autorrenovação das CTH. Através de imunohistoquímica de bióspias de medula óssea de pacientes com SMD em comparação com anemia megaloblástica (usada como controle) observamos o aumento de células marcadas para os ligantes Sonic e Dessert Hedgehog e células positivas para c-Kit nas amostras de SMD. Em seguida, analisamos a expressão gênica dos membros da via Hedgehog em células totais de medula óssea de pacientes SMD e doadores normais. Não houve diferença na expressão de Patched (PTCH) em SMD em comparação com doadores saudáveis, porém quando as amostras são classificadas de acordo com a WHO 2008, observamos aumento significativo de PTCH nos pacientes com <5% de blastos na medula óssea (AR, ARSA e CRDM). As expressões tanto de GLI1 como de SUFU foram reduzidas nos pacientes SMD e no grupo de pacientes com ARSA, CRDM e CRDU quando comparados aos doadores normais. A expressão de SUFU também foi reduzida em grupo de pacientes SMD com > 5% de blastos na medula óssea (AREB-1 e 2). Observamos aumento de 7 vezes na expressão de SMO no grupo de SMD e de 14 vezes no grupo AREB-1 e 2 em comparação com doadores normais. Análises de sobrevida de Cox demonstraram que o aumento na expressão de SMO e a redução na expressão de PTCH são fatores independentes na sobrevida global dos pacientes com SMD. Além disso, confirmamos o aumento da ativação da via Hedgehog em células CD34+ de pacientes com SMD através do aumento da expressão dos alvos da via: GLI1, BMI1 e Nanog. Nossos dados indicam que a via Hedgehog está desregulada na medula óssea dos pacientes com SMD e o possível envolvimento dessa via na progressão da doença. Através do modelo murino Arhgap21+/- estudamos a importância dessa proteína na hematopoiese normal e observamos que esses animais apresentam redução nas diferenciações eritroide e megacariocítica juntamente com aumento da mobilização mielóide. Observamos ainda o aumento na frequência das CTHs de curta e longa duração na medula óssea dos heterozigotos. Esse aumento foi responsável pela maior recuperação no número de neutrófilos após indução de estresse hematopoiético nos animais Arhgap21+/-. Durante o transplante seriado de células de medula óssea observamos menor reconstituição após 4 semanas, juntamente com menor reconstituição a longo prazo nos animais que receberam células dos heterozigotos, sugerindo menor autorrenovação das CTHs nas células com redução da Arhgap21. O nicho medular dos animais Arhgap21+/- demonstrou redução no suporte inicial da hematopoiese o que foi relacionado à maior produção de ROS após irradição subletal dos heterozigotos. Juntos, esses resultados indicam que a ARHGAP21 tem importante papel na hematopoiese normal, pois participa de processos como a diferenciação, mobilização e autorrenovação das CTHs / Abstract: Hematopoiesis is a process by which hematopoietic stem cell (HSC) gives rise to all blood cells and it is regulated by HSC contact with different cell types that compose the bone marrow stroma and maintain the balance between HSC self-renewal and differentiation, processes that are also regulated by signaling pathways such as the Hedgehog and regulatory proteins of the cytoskeleton as RhoGTPases. The overall aims of this work were to investigate the Hedgehog pathway in myelodysplastic syndrome (MDS) bone marrow and the ARHGAP21 role in hematopoiesis. Immunohistochemistry assays revealed that MDS bone marrow biopsies showed increased Sonic and Dessert Hedgehog together with c-kit positive stained cells compared to megaloblastic anemia (used as control).We also analyzed gene expression of the Hedgehog pathway members in total cells from MDS bone marrow and healthy donors. There was no difference in Patched (PTCH) expression in MDS compared to healthy donors, however, when MDS samples were classified according to WHO 2008, we observed a significant increase in PTCH1 expression in MDS patients <5% bone marrow blast (RCUD, RCMD, ARSA). GLI1 and SUFU expressions were significantly reduced in the MDS patients and in the group of patients with RCUD, RCMD, ARSA, when compared to healthy donors. SUFU expression was also decreased in MDS patients > 5% bone marrow blast (RAEB-1 and RAEB-2) compared to controls. We also observed 7-fold increase of SMO transcripts in the MDS group and 14-fold increase in RAEB-1 and RAEB-2. Cox survival analyses showed that increased SMO and decreased PTCH expression were considered as independent factors influencing the survival of these patients. We also confirmed the enhanced Hedgehog activation in CD34+ cells from MDS patients through increased expression of the pathway targets: GLI1, BMI1 and Nanog. Together, our data indicate that the Hedgehog pathway is deregulated in MDS bone marrow and the possible role of that pathway in disease progression. Arhgap21+/- murine model study showed the importance of this protein in normal hematopoiesis as these animals showed alterations in erythroid and megakariocyte differentiation along with increased myeloid mobilization. We also observed increased short and long term HSC frequency in the heterozygous bone marrow. This increase was responsible for enhanced neutrophil reconstitution during induced hematopoietic stress in Arhgap21+/-. Serial bone marrow transplantation assay showed lower chimerism in peripheral blood 4 weeks after the transplant together with lower long term reconstitution in animals who received Arhgap21+/- bone marrow, indicating decreased HSC self-renew from heterozygous cells. Bone marrow niche of Arhgap21+/- animals showed a reduction in initial support hematopoiesis and this result was correlated with the increased ROS production from Arhgap21+/- bone marrow after sublethally irradiation. Taken together, our data indicate that ARHGAP21 has an important role in hematopoiesis regulating process such as differentiation, mobilization and self-renewal of HSC / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutora em Fisiopatologia Médica

Mutations in the CLN3 gene cause Juvenile Neuronal Ceroid Lipofuscinosis (JNCL), a form of Batten disease that is grouped within the broad class of lysosomal storage diseases. JNCL displays a primary central nervous system phenotype characterized by rapid onset blindness, wide spread brain atrophy and reversal of learned abilities with death occurring 10-20 years after symptom onset. The mechanisms underlying these phenotypes are not known. CLN3 encodes CLN3, a protein with no known molecular function. CLN3 is expressed at very low levels natively in most cells, and is highly hydrophobic. Similar to other lysosomal storage diseases, it is difficult to ascertain the primary versus the secondary defects when the protein functions along the endosomal-lysosomal pathway. In JNCL one common finding among several labs, in various cellular systems, is a fluid-phase endocytotic defect. I took this commonality as a key to CLN3 function, and pursued cell biological pathways required for fluid-phase endocytosis. Fluid-phase endocytosis is regulated by cycling of the small GTPase Cdc42 and I discovered increased Cdc42-GTP in CLN3-null mouse brain endothelial cells. In mouse brain endothelial cells enhanced Cdc42-GTP increased Cdc42 dependent signaling, filopodial formation, and retarded cell migration. I also found reduced plasma membrane association of ARHGAP21, a known negative regulator of Cdc42. My data supports a model where loss of CLN3 reduces ARHGAP21 plasma membrane recruitment, and causes aberrant Cdc42 activation. Thus irregular Cdc42 activation underlies the commonly reported fluid-phase endocytic defects in JNCL. Therapeutic development for JNCL has been hampered in part from the varying phenotypes ascribed to CLN3 deficiency. My discovery that the fluid-phase endocytic defects result from Cdc42 pathway aberrations, which in turn contributed to multiple downstream phenotypes, opened the door to novel JNCL therapeutics. Here I present work showing that a Cdc42 inhibitor corrects the Cdc42 dependent defects in vitro and multiple defects in a JNCL mouse model.

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_SandraMara_M.pdf: 1558318 bytes, checksum: d69677a862aa6ba8e96725b7d5c76a87 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Introdução e objetivos: A ARHGAP21 é uma Rho-GAP que promove a ativação de um fator intrínseco da Rho-GTPase Cdc42 responsável pela hidrólise de GTP à GDP e inativação da atividade da proteína. ARHGAP21 se associa à PKC? em cardiomiócitos e à porção C-terminal da FAK em glioblastomas, onde inibe a ativação de Rho-GTPases, e, com isso, o rearranjo do citoesqueleto de actina. A Cdc42, FAK e PKC? estão envolvidas na secreção de insulina estimula por glicose, diferenciação e proliferação de ilhotas pancreáticas. O objetivo deste trabalho foi investigar em células beta pancreáticas: 1) a expressão e localização da ARHGAP21; 2) o efeito da glicose na expressão das proteínas PKC?, FAK e Cdc42 e sua associação à ARHGAP21 e; 3) a função da ARHGAP21 no controle da secreção de insulina estimulada por glicose. Materiais e Métodos: A expressão e localização da ARHGAP21 em células MIN6 foram avaliadas por imunoflorescência. Células MIN6 foram tratadas na presença de 5,6 ou 22 mM de glicose ou, na ausência ou presença de insulina (0,2 U/ml) por 3 dias. Após a extração protéica a expressão das proteínas ARHGAP21, PKC, FAK e Cdc42 foi avaliada por Western blot. Células MIN6 foram incubadas em solução contendo 22 mM de glicose e coletadas em diferentes tempos (0, 5, 15, e 30 min) para avaliação da interação ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? por imunoprecipitação e, para análise do grau de fosforilação tirosina 397 e 925 da FAK e em treonina 410 da PKC?. A expressão dessas proteínas também foi avaliada em ilhotas pancreáticas de camundongos Swiss neonatos previamente tratados por dois dias com 1 nM de anti-sense anti-ARHGAP21 ou mismatch. Essas ilhotas foram incubadas com 2,8 ou 16,7 mM de glicose e a secreção de insulina avaliada. Resultados: A ARHGAP21 localiza-se no citoplasma, mais acentuadamente na região da membrana plasmática. Glicose reduziu a expressão da ARHGAP21 e PKC? e não alterou a expressão da FAK e Cdc42, enquanto a insulina não alterou a expressão de nenhuma das proteínas estudadas. A glicose também promoveu a dissociação ARHGAP21/FAK, levando ao aumento na fosforilação da FAK seguido de aumento na associação ARHGAP21/PKC? e redução na fosforilação da PKC? em Thr 410. Animais Knockdown para ARHGAP21 apresentaram menor expressão de PKC? e maior expressão de Cdc42, além de um aumento na secreção de insulina por ilhotas pancreáticas tanto em condição sub- (2,8 mM) quanto supra-estimulatória (16,7 mM) de glicose. Conclusão: ARHGAP21 modula Cdc42 e FAK, proteínas responsáveis pelo rearranjo do citoesqueleto de actina e extrusão do grânulo de insulina, reduzindo sua expressão e atividade, o que inibe a secreção de insulina. Além disso, observamos que a glicose modula as interações ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? / Abstract: Background/Aims: ARHGAP21 is a Rho-GAP that promotes activation of the Rho-GTPase Cdc42 intrinsic factor, which is responsible for the hydrolysis of GTP to GDP and those proteins inactivation. ARHGAP21 associates with PKC? in cardiomyocytes and to the C-terminal portion of FAK in glioblastoma, inhibiting Rho-GTPases and actin cytoskeleton rearrangement. Cdc42, FAK and PKC? promote glucose-stimulated insulin secretion, differentiation and proliferation in pancreatic islets. The aim this study was to assess in pancreatic beta cells: 1) ARHGAP21 expression and localization; 2) glucose effect in PKC?, FAK e Cdc42 expression and association to ARHGAP21; 3) The role of ARHGAP21 on glucose-stimulated insulin secretion. Materials and Methods: ARHGAP21 expression and localization in MIN6 cells were evaluated by immunofluorescence. MIN6 cells were treated with glucose (5.6 mM and 22 mM) or insulin (0.2 U/ml) for 3 days. After protein extraction, the ARHGAP21, PKC?, FAK e Cdc42 expressions were evaluated by Western blot. MIN6 cells were exposed for 0, 5, 15, e 30 min to 22 mM of glucose. ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/PKC? interactions were evaluated for immunopreciption and phosphorylation of FAK in tyrosine 397 and 925 and phosphorylation of PKC? in threonine 410. The expression of these proteins also was evaluated in pancreatic islets of neonates Swiss mice previously treated for 2 days with 1 nM of ARHGAP21 antisense or mismatch oligonucleotides. These islets were incubated with 2.8 mM or 16.7 mM of glucose and insulin secretion was evaluated. Results: ARHGAP21 is localized in the cytoplasm, mainly the plasmatic membrane. Glucose reduced ARHGAP21 and PKC? expression but not altered FAK and Cdc42 expression, while insulin had no effect whatsoever on the expression of the studied proteins. Glucose also dissociated ARHGAP21/FAK, leading to increased FAK phosphorylation, which was followed by ARHGAP21/PKC? association and reduced Thr410 PKC? phosphorylation. ARHGAP21 Knockdown mice pancreatic islets had lower PKC? and higher Cdc42 expression, and also increased insulin secretion in both sub- (2.8 mM) and supra-stimulatory (16.7 mM) of glucose conditions. Conclusions: ARHGAP21 modulates Cdc42 and FAK, proteins responsible for rearrangement of actin cytoskeleton and extrusion of insulin vesicles, and reducing their expression leads to inhibited insulin secretion. Furthermore, we observed that glucose modulates ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/ PKC? interactions / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschiero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T05:10:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_SandraMara_D.pdf: 2032504 bytes, checksum: da4ca0c7e913b98f9a0ec91b1a14ba82 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A ARHGAP21 é uma proteína da família das RhoGAPs (Proteínas ativadoras de GTPases Rho) que, em diferentes tipos de células, controla múltiplas funções tais como: migração, proliferação, diferenciação e tráfego intracelular de vesículas. Em ilhotas de camundongo Swiss neonato o knockdown da ARHGAP21 aumentou a secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), por mecanismos ainda desconhecidos. Contudo, não se conhece os efeitos da ARHGAP21 sobre a secreção de insulina e sobre a homeostase glicêmica em camundongos adultos. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar: a) em ilhotas pancreáticas de camundongo Swiss neonato knockdown para ARHGAP21, a expressão de genes envolvidos com a proliferação, maturação e extrusão de grânulos de insulina, bem como o rearranjo do citoesqueleto de actina; b) em camundongos C57BL/6 adultos, o efeito do knockdown da ARHGAP21 sobre GSIS e sobre alguns genes que codificam proteínas envolvidas na função secretória (maturação e extrusão) e sobre a homeostase glicêmica. Os neonatos foram tratados (i.p.) com 1 nmol de antisense anti-ARHGAP21 (neonato AS) ou mismatch (CTL) por dois dias (redução da expressão de 60%). Os adultos foram tratados (i.p.) com 1,5 nmol/g de antisense (adulto AS) ou mismatch (adulto CTL) por 3 dias consecutivos (redução de 50%). A secreção de insulina foi avaliada na presença de concentrações crescentes de glicose (2,8 - 22,2 mM). A F-actina (polímero) foi medida através da marcação com faloidina. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real. Tolerância à glicose e ao Piruvato foi medida através de ipGTT e ipPTT, respectivamente, e a sensibilidade à insulina através do ipITT, clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico e, AKT fosforilada. Como já descrito, ilhotas de neonatos AS apresentaram maior secreção basal de insulina (2,8 mM) bem como menor presença de F-actina. Observamos também maior expressão dos genes da VAMP2 e SNAP25. Ilhotas de adultos AS apresentaram maior secreção de insulina apenas na presença de 22,2 mM. Contudo, o aumento do [Ca2+]i, induzido por glicose, foi similar ao CTL. Observou-se também aumento da expressão dos genes da SYT VII (SYNAPTOTAGMINA VII) e CX 36 (CONEXINA 36). Adultos AS apresentaram intolerância à glicose e aumento da insulinemia durante o ipGTT, acompanhado de resistência à insulina específica no músculo, além de menor produção de glicose pelo fígado. Concluímos que a ARHGAP21 modula negativamente a secreção de insulina em neonato provavelmente através do rearranjo da actina e da redução da expressão de VAMP2 e SNAP25. Em ilhotas isoladas de camundongos adultos, a ARHGAP21 modula negativamente a expressão de genes envolvidos na sensibilidade ao cálcio e resposta secretória (SYT VII e CX 36). Apesar da melhora na secreção de insulina, os adultos AS apresentaram intolerância à glicose com discreta resistência à insulina no músculo que parece ser compensada pela menor liberação de glicose pelo fígado / Abstract: ARHGAP21 is a protein of the RhoGAPs (Rho GTPases activating proteins) family that exerts several functions such as: migration, proliferation, differentiation and intracellular traffic of vesicles, in multiple cell types. In islets from Swiss mice knockdown for ARHGAP21 the glucose-induced insulin secretion (GSIS) was significantly increased, by mechanisms not yet elucidated. Although, it is still unknown the effects of ARHGAP21 knockdown on the insulin secretion and glucose homeostasis in adult mice. Here, we evaluated: a) in islets from ARHGAP21 knockdown mice the expression of genes involved in proliferation, maturation, and extrusion of the insulin containing granules, as well as on the rearrangement of the actin cytoskeleton, and b) the effect of ARHGAP21 knockdown on GSIS and on the expression of genes that encode proteins involved with the secretory function (maturation and extrusion), as well as on the glucose homeostasis in adult C57BL/6 mice. Neonatal Swiss mice received (i.p.) 1 nmol of anti-ARHGAP21 anti-sense (neonate AS) (reduction of 60%) or mismatch (neonate CTL), subcutaneously, for two days. Adult C57BL/6 mice received (i.p.) 1.5 nmol/g of anti-ARHGAP21 anti-sense (adult AS) (50% reduction) or mismatch (adult CTL) for three consecutive days. Insulin secretion was measured in the presence of increasing concentrations of glucose (2.8 ¿ 22.2 mM). F-actin (polymer) was measured using phalloidin. Gene expression was assessed by Real Time PCR. Glucose and Piruvate tolerance were measured by ipGTT and ipPTT, respectively, and insulin sensitivity by ipITT, hyperinsulinemic-euglycemic clamp, and AKT phosphorylation. Islets from neonate AS displayed higher insulin secretion at 2.8 mM glucose, and lower expression of F-actin. Higher expression of VAMP2 and SNAP25 genes was also observed. Islets from adult AS showed higher insulin secretion at 22.2 mM glucose. However, glucose-induced increase in [Ca2+]i was not different from CTL. The expression of SYT VII and CX 36 genes was also increased. Adult AS mice displayed glucose intolerance and higher insulinemia during ipGTT, accompanied by insulin resistance specifically in skeletal muscle, and a lower hepatic glucose production. In conclusion, ARHGAP21 negatively modulates insulin secretion in neonatal mice through the rearrangement of the actin cytoskeleton and reduction of the expression of VAMP2 e SNAP25 genes. ARHGAP21 also may negatively modulate the expression of genes involved in the Ca2+ sensitivity and secretory response (SYT VII and CX 36, respectively) in adult mice. Despite the higher insulin secretion, adult AS mice showed glucose intolerance associated with a mild insulin resistance in the skeletal muscle, which may be compensated by a lower glucose production in the liver / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular