Le peptidoglycane est un composant majeur de la paroi cellulaire bactérienne dont l'intégrité est essentielle à la survie cellulaire. La biosynthèse du peptidoglycane est un processus régulé faisant intervenir des enzymes de synthèse, les « Penicillin-Binding Proteins », et des hydrolases qui agissent, selon toute vraisemblance, de façon concertée lors de la croissance et de la division bactérienne. La comparaison des génomes bactériens a permis d'identifier un nouveau domaine protéique, probablement impliqué dans le clivage du peptidoglycane, présent uniquement chez les bactéries à Gram positif : le domaine PECACE (PEptidoglycan CArbohydrate Cleavage Enzyme). Ce domaine, prédit pour avoir un repliement tridimensionnel analogue aux domaines catalytiques de la transglycosylase lytique Slt70 d'Escherichia coli et du lysozyme de type G d'oie, pourrait participer au clivage de la liaison glycosidique β(1-4) entre les résidus acide N-acétyl-D-muramique et N-acétyl-D-glucosamine du peptidoglycane. Chez la bactérie pathogène Streptococcus pneumoniae, ce domaine est présent dans la région extracellulaire d'une protéine que nous nommons Pmp23 (Pneumococcal Membrane Protein). La forme recombinante de cette protéine membranaire bitopique de 23 kDa dégrade in vitro des extraits bactériens contenant du peptidoglycane. L'inactivation du gène pmp23 chez S. pneumoniae modifie le comportement de la bactérie en culture, accroît sa sensibilité aux antibiotiques de la famille des β-lactamines et perturbe la localisation du site de division. Ces observations indiquent que Pmp23 est une hydrolase intervenant dans le métabolisme du peptidoglycane septal.

La création de nouvelles fonctions basées sur la reconnaissance protéique et sur l'assemblage de domaines est un enjeu majeur en biotechnologie et est un moyen de comprendre les relations structures/fonctions des protéines engagées dans des processus d'interactions. Aujourd’hui, des bibliothèques de protéines artificielles obtenues par ingénierie peuvent être sources de protéines aux propriétés de reconnaissance analogues à celles des dérivés d’anticorps.L’équipe Modélisation et Ingénierie des Protéines a ainsi construit une banque de protéines à motifs structuraux répétés appelées « alphaReps ». Les alphaReps présentent des propriétés remarquables en termes de production et de stabilité. Contrairement à la plupart des anticorps et dérivés d’anticorps, elles peuvent même s’exprimer sous forme fonctionnelle dans le cytoplasme de cellules eucaryotes. De tels objets peuvent donc maintenant être utilisés comme des briques élémentaires en vue d’une ingénierie modulaire. Ainsi la construction de nouvelles fonctions de reconnaissance optimisées tant au niveau de la spécificité que de l’affinité sera possible en réarrangeant et/ou dupliquant ces briques élémentaires.Un premier volet de ce projet de thèse a consisté à construire puis étudier les propriétés biophysiques de protéines bidomaines basées sur les alphaReps afin de mieux comprendre les comportements adoptés par de telles constructions. Outre l’aspect fondamental de cette question, cette étude donnera « les règles » pour moduler de façon contrôlée les interactions entre ces protéines. Les résultats montrent qu'il est possible de créer de nouvelles fonctions par simple ajout d'un linker entre deux alphaReps : avidité, coopérativité, changement de conformation.Dans un second temps, l’objectif a été de développer, à partir des protéines bidomaines précédemment étudiées, de nouveaux biosenseurs basés sur le FRET (Förster Resonance Energy Transfer) pouvant être utilisés in vivo et in vitro. Cette deuxième partie présente deux biosenseurs avec des limites de détection de l'ordre du nanomolaire. Les alphaReps utilisées dans ces constructions pouvant être changées en fonction de la cible souhaitée, il s'agit ici d'une preuve de concept pouvant être généralisée à n'importe quelle cible.Enfin la dernière partie de cette thèse s'est portée sur la conception et l'étude de nouveaux biosenseurs génétiquement codables. Ces biosenseurs présentent notamment l’avantage d’être utilisables immédiatement après production et ne nécessitent donc plus d’étape de couplage chimique. Les résultats obtenus montrent que la création de tels biosenseurs est possible mais qu’une optimisation reste encore nécessaire pour améliorer leur spécificité, leur stabilité et leur capacité de détection. / The creation of new protein functions based on recognition and molecular assembly is not only a major goal in biotechnology but is also a means to understand the relation structure/function of proteins involved in interaction processes. Today, libraries of artificial proteins obtained by engineering can be a source of proteins with recognition properties similar to the properties of antibodies.The team Protein Engineering and Modeling has thus created a library of proteins with structural repeats called the “alphaReps”. The alphaReps present remarkable properties in terms of production and stability. Unlike most of the antibodies and their derivatives, they can even be expressed and functional in the cytoplasm of eukaryotic cells. Such objects can therefore be used as building bricks in modular engineering. The construction of new optimized recognition functions both in specificity and in affinity can then be possible by rearranging or duplicating these elementary bricks.The first part of this thesis project consisted in the construction and study of the biophysical properties of bidomain proteins based on alphaRep in order to have a better understanding of the behaviour of such constructions. Beside the fundamental aspect of this question, this study will give the “rules” to modulate the interactions between these proteins in a controlled way. The results show that it is possible to create new functions such as avidity, cooperativity, conformational change, simply by adding a linker between two alphaReps.In a second step, the goal was to develop, with the bidomain proteins previously studied, new biosensors based on the FRET (Förster Resonance Energy Transfer) which can be used in vivo and in vitro. This second part presents two biosensors with limits of detection in the nanomolar range. Since the alphaReps used in these constructions can be changed depending on the chosen target, it is a proof of concept which can be adapted to any desired target.Finally, the third part of this thesis focused on the development of genetically codable biosensors. These biosensors have the particular advantage of being usable directly after production and therefore no longer require a chemical coupling step. The results show that the development of such biosensors is worth considering but an optimization is still required in order to improve their specificity, their stability and their detection capacity.

L'intégration de l'ADN viral dans le génome des cellules hôtes est une étape obligatoire du cycle de réplication des rétrovirus. L'intégrase (IN) catalyse le processus global d'intégration en deux étapes distinctes et consécutives. La première des deux réactions, le 3'-processing, consiste en une coupure spécifique d'un dinucléotide au niveau des deux extrémités 3'-OH de l'ADN viral. L'IN transfère ensuite de manière concertée ces deux extrémités au sein de l'ADN cible. Nous avons, par des techniques basées sur l'anisotropie de fluorescence, caractérisé les paramètres structuraux et cinétiques du 3'-processing catalysé par l'IN du VIH-1. Nous avons montré d'une part que cette activité dépend de la taille des complexes IN / ADN. Nous avons trouvé que le dimère d'IN est la forme multimérique la plus active tandis que les complexes de haut poids moléculaire sont relativement peu efficaces. D'autre part, la structuration du domaine N-ter joue un rôle clé dans l'assemblage coopératif de ce dimère en présence de Mg2+ comme cofacteur cationique. Ce rôle n'est pas essentiel en présence de Mn2+. L'étude de l'IN de PFV-1, un spumavirus, plus soluble, nous a permis de mettre en évidence une reconnaissance préférentielle de l'extrémité processée de l'ADN viral par cette IN, cette propriété n'avait jamais été observée pour l'IN du VIH-1 car elle était masquée par sa propension à l'agrégation. Nous avons également montré que ces deux IN rétrovirales réalisent le 3'-processing suivant un mécanisme catalytique lent de type « single turn-over ».

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et le virus Nipah (NiV) appartiennent respectivement aux familles des Rhabdoviridae et des Paramyxoviridae. VSV est un modèle du virus de la rage tandis que NiV est un virus émergeant, appartenant à la sous-famille des Paramyxovirinae, pour lequel les données moléculaires et structurales sont limitées. Ces sont des virus enveloppés dont le génome code pour cinq à neuf protéines. Le complexe de réplication de ces virus est constitué de trois protéines : la phosphoprotéine (P), la nucléoprotéine (N) et la polymérase virale (L). La N encapside le génome viral et l'ensemble N-ARN sert de matrice pour la transcription et la réplication. La P joue deux rôles : elle sert de cofacteur pour la polymérase et forme le complexe N0-P qui maintient la N sous une forme soluble, compétente pour l'encapsidation des génomes néo-synthétisés. Un premier objectif de mon travail de thèse consistait à étudier la structure et la dynamique des protéines P de VSV et de NiV. Ce sont des protéines modulaires qui contiennent des domaines structurés, séparés par des régions flexibles. A mon arrivée au laboratoire un travail important avait été déjà réalisé sur la P de VSV et j'ai participé à l'achèvement de cette étude. Je me suis ensuite intéressé à la protéine P de NiV. J'ai cristallisé et résolu par diffraction des rayons X les structures du domaine C-terminal et du domaine central (codes PDB : 4F9X et 4GJW). La combinaison de ces modèles cristallographiques avec des données de SAXS sur la P entière et des données de résonance magnétique nucléaire (RMN, collaboration IBS) va permettre d'obtenir un modèle atomique de la P entière sous la forme d'un ensemble de conformères. Un deuxième objectif était d'étudier les complexes N0-P. J'ai activement participé au développement de la méthode de reconstitution et à la caractérisation structurale du complexe N0-P de VSV, entre un mutant de la N (NΔ21) et un peptide N-terminal de la P (code PDB : 3PMK). J'ai ensuite reconstitué, cristallisé et résolu la structure de complexe N0-P de NiV entre la N (tronquée de son domaine C-terminal) et la partie N-terminale de la P. Ces structures montrent par quel mécanismes moléculaires la P maintien la N sous forme monomérique, en empêchant sa polymérisation et son interaction avec l'ARN. Les résultats présentés ici ont permis de générer de nouvelles hypothèses pour expliquer les mécanismes d'encapsidation et d'initiation de la synthèse d'ARN chez ces virus. Le complexe N0-P étant essentiel pour la réplication du virus, l'information structurale obtenue au cours de ce travail devrait permettre d'envisager l'utilisation de ce complexe comme cible pour le développement de composés antiviraux. / Abstract Vesicular stomatitis virus (VSV) and Nipah virus (NiV) belong to the Rhabdoviridae and Paramyxoviridae families, respectively. VSV serves as model system for rabies virus while NiV is an emerging pathogen of the Paramyxovirinae subfamily, for which molecular and structural data are scarce. Both viruses are enveloped and their genomes encode five to nine proteins. Three proteins form their replication complex: the phosphoprotein (P), the nucleoprotein (N) and the viral polymerase (L). N encapsidates the viral genome and this N-RNA complex serves as template for transcription and replication. P has two functions: it serves as a polymerase cofactor and forms an N0-P complex, which keeps the N protein in a soluble and monomeric state, competent for the encapsidation of the newly synthesized genomes. The first goal during the PhD work was to study the structure and dynamics of the VSV and NiV P proteins. These proteins are modular, containing structured domains separated by flexible regions. Before my arrival, a large amount of work was already done on the VSV P protein in the lab and I was involved in the final stages of this work. Then this I studied the NiV P protein, crystallizing and solving the structures of its Central and C-terminal domains by X-ray crystallography (PDB codes: 4F9X and 4GJW). Combining these structures with small angle X-ray scattering (SAXS) and nuclear magnetic resonance (NMR, collaboration with IBS group) data obtained for the entire protein will allow the construction of an atomic model of the phosphoprotein in the form of a conformational ensemble. The second goal was to study the N0-P complex. I actively participated in the development of the method which permitted the reconstruction of the VSV N0-P complex, using a truncation mutant of the N protein (NΔ21) and an N-terminal peptide from P, and to its structural determination (PDB code: 3PMK). Then I reconstructed, crystallized and solved the structure of the NiV N0-P complex using a C-terminally truncated N protein and the N-terminal region of the P protein. Both structures yielded insights into the molecular mechanisms used by the phosphoproteins in order to maintain the corresponding nucleoproteins in their monomeric state, thus inhibiting their polymerization and interaction with RNA. The results presented here also offered new hypothesis about mechanisms of encapsidation and of RNA synthesis initiation. Given that the N0-P complex is an essential component of the replication complex, the structural information gained from this work allow us to consider this complex as a potential antiviral target.

Présente chez les mammifères, mitoNEET (mNT) est une protéine à centre Fe-S ancrée à la membrane externe de la mitochondrie. Cette protéine dimérique possède un centre [2Fe-2S] par monomère lié de façon atypique à la protéine par trois cystéines et une histidine. Notre équipe a auparavant montré l’implication de mNT dans une nouvelle voie de réparation du centre [4Fe-4S] de l’Iron Regulatory Protein-1 (IRP-1), régulateur majeur de l’homéostasie du fer intracellulaire, par transfert du centre Fe-S de mNT à l’IRP-1 à réparer. Au cours de ma thèse, je me suis focalisée sur la caractérisation in vitro de la réaction de transfert de centre Fe-S de mNT vers une protéine réceptrice modèle, l’apo-ferrédoxine d’E. coli. En combinant des approches de biochimie et biophysique (réalisées en collaboration) à l’aide de protéines purifiées, cette étude a permis de démontrer que mNT agit comme un interrupteur moléculaire : lorsque son centre Fe-S est réduit, la protéine est extrêmement stable et le centre ne peut être ni perdu ni transféré; une fois oxydé, il peut alors être transféré à une protéine réceptrice. La présence d’oxygène n’affecte pas cette réaction même s’il s’agit d’un déterminant majeur de la stabilité de la protéine. De plus, la vitesse de transfert du centre est très sensible au pH, ce qui fait de mNT un senseur de pH. Ces études ont aussi montré que mNT est extrêmement résistante à H2O2 en comparaison à d’autres protéines de transfert de centre Fe-S. J’ai également étudié l’interaction d’une molécule anti-oxydante, le resvératrol-3 sulfate, avec mNT. Pour finir, je me suis intéressée à l’effet du glutathion sur mNT. Acteur majeur de la régulation de l’homéostasie rédox, le glutathion existe sous deux formes: oxydée (GSSG) et réduite (GSH). J’ai alors constaté que le GSH déstabilise fortement mNT à certains pH et peut même se lier à cette protéine. La fonction thiol du GSH et la formation de radicaux sur cette dernière sont clairement impliquées dans la déstabilisation de mNT. / Present in mammals, mitoNEET (mNT) is an Fe-S protein anchored to the outer mitochondrial membrane. This dimeric protein contains a [2Fe-2S] per monomer with an atypical ligation involving three cysteines and one histidine. Previously, our team proposed that mNT is involved in a new pathway dedicated to the reparation of the oxidatively damaged [4Fe-4S] cluster of human iron-regulatory protein-1 (IRP-1)/cytosolic aconitase, a key player of the regulation of cellular iron homeostasis. This reparation occurs via Fe-S cluster transfer from mNT to IRP-1 to repair. In the course of my thesis, I focused on the characterization of cluster transfer reaction from mNT to a model receptor protein, the E. coli apo-ferredoxin. Using purified proteins and combining biochemical approaches with biophysical ones performed in colaboration, this study showed that mNT acts as a redox switch: when the Fe-S cluster is reduced, the protein is extremely stable and it cannot be lost or transferred; when it is oxidized, it can be transferred to a receptor protein. Dioxygen does not affect this transfer reaction whereas this is a major determinant of protein stability. The transfer speed is highly sensitive to pH. Thus, mNT seems to act also as a pH sensor. Moreover, this study shows that mNT is extremely resistant to H2O2 compared to other Fe-S cluster transfer proteins. I also looked at the interaction of an antioxidant molecule, the resveratrol-3-sulfate, with mNT. Finally, I studied the effects of glutathione on mNT. Major player of the regulation of redox homeostasis, glutathione exists under two states: a reduced state (GSH) and an oxidized one (GSSG). I observed that GSH strongly destabilizes mNT at specific pHs and can even directly interact with the protein. The thiol function of GSH and the radical formation on this function are clearly involved in the mNT Fe-S destabilization.

Alors que 30% du génome code pour des protéines membranaires, moins de 3% des structures protéiques dans la Protein Data Bank correspondent à ces protéines. En raison de leur nature hydrophobe, les protéines membranaires sont en effet très difficiles à produire dans des systèmes d'expression classique en cellules, notamment en bactéries. L'étude structurale des protéines membranaires du virus de l'hépatite C (VHC) sous forme entière et native a donc été pendant longtemps entravée. Le VHC est un virus à ARN positif dont le complexe de réplication est basé sur un réarrangement spécifique des membranes induit par l'action concertée de plusieurs protéines non structurales du virus dont NS2, NS4B et NS5A. La structure tridimensionnelle et le rôle de ces protéines dans la réplication virale sont encore mal connus. Pour surmonter les limitations qui empêchent leurs études structurales et fonctionnelles, un système d'expression acellulaire à base d'extrait de germe de blé a été développé avec succès, permettant la production des protéines NS2, NS4B et NS5A entières directement sous une forme solubilisée en présence de détergent. Ces protéines membranaires sont produites et purifiées par chromatographie d'affinité dans des quantités de l'ordre du milligramme. Des analyses par filtration sur gel indiquent que les échantillons obtenus sont homogènes. De plus, des analyses structurales par dichroïsme circulaire montrent que les protéines produites dans ce système sont bien repliées. Leur reconstitution dans des lipides est en cours d'optimisation. Le but ultime est en effet de déterminer leur structure par RMN du solide dans un environnement lipidique mimant l'environnement natif / While 30% of the genome encodes for membrane proteins, less than 3% of protein structures in the Protein Data Bank correspond to such proteins. Due to their hydrophobic nature, membrane proteins are indeed notoriously difficult to express in classical cell-based protein expression systems. The structural study of the membrane proteins of hepatitis C virus (HCV) in their full-length and native form has therefore been for long time hampered. HCV is a positive-strand RNA virus building its replication complex on a specific membrane rearrangement (membranous web), which serves as a scaffold for the HCV replicase, and is induced by the concerted action of several HCV non-structural proteins including NS2, NS4B and NSSA. The knowledge of the three- dimensional structure of these proteins and their role in virus replication is still limited. To overcome the limitations that prevent the structural and functional studies of these proteins, a wheat germ cell-free protein expression system has been developed. A production protocol was designed which allows us to directly obtain membrane proteins in a soluble form by adding detergent during the in vitro protein synthesis. A large number of mainly viral proteins were successfully expressed, and full protocols were developed for the full-length NS2, NS4B and NSSA proteins. These membrane proteins were produced and purified by affinity chromatography using a Strep-tag II in the milligram range. These protein samples are homogenous, as shown by gel filtration analysis. Moreover, structural analyses by circular dichroism showed that the proteins produced in the wheat germ cell-free system are well folded. Reconstitution of these proteins in lipids is currently under optimization. The ultimate goal is to determine their structure by solid-state NMR in a native-like membrane lipids environment