Miz-1 est un facteur de transcription qui active la transcription de gènes cytostatiques tels que p15[indice supérieur 1NK4B] ou p21[indice supérieur CIP1]. Il s’agit d’une protéine de la famille BTB/POZ, qui possède un ensemble de 13 doigts de zinc de type Cys?His? dans sa portion C-terminale. L’activation de ces gènes par Miz-1 peut être régulée par les protéines SMAD. SMAD3 et 4 peuvent toutes deux se lier aux doigts de zinc 1 à 4 de Miz-1, et les autres doigts de zinc sont pressentis pour être responsables de la liaison à l’ADN. Les séquences reconnues par Miz-1 sur les promoteurs des deux gènes mentionnés ci-haut ont été identifiées, mais n’ont pas d’homologie entre elles. L’oncogène c-Myc a la possibilité de se lier à Miz-1, et cette interaction cause la répression des gènes normalement activés par Miz-1, favorisant ainsi la prolifération cellulaire. Cette interaction cruciale, de même que celle entre Miz-1 et l'ADN, est toutefois assez mal caractérisée. Le but du projet dont fait partie ce mémoire est d’éclaircir tout ce mécanisme de liaison. Ce mémoire étudie la structure et les propriétés dynamiques des doigts de zinc 5 à 8 de Miz-1, qui, selon l’hypothèse initiale, seraient impliqués dans la liaison au promoteur des gènes-cibles de Miz-1. La résonance magnétique nucléaire est la technique qui a été utilisée dans le but d’obtenir ces résultats, et une partie importante de ce mémoire est dévouée à la théorie derrière cette puissante technique. La détermination de la structure de ces doigts de zinc est en fait une seule des nombreuses étapes du projet de l’élucidation du mécanisme de transrépression par c-Myc/Miz-1. Suite à la présentation des structures de ces doigts de zinc, ce mémoire s’intéresse à leurs caractéristiques dynamiques très particulières pour ce type de domaine protéique. Nous avons en effet découvert que les doigts de zinc 5 à 8 présentaient un niveau très élevé d’échange conformationnel, et qu’une portion du doigt de zinc 6 ne peut être caractérisée structurellement à cause de mouvements dans l’échelle de la micro/milliseconde, eux-mêmes dus à des répulsions électrostatiques. En conclusion, nous proposons que le ZF 6 ait un rôle de charnière entre deux ensembles de ZFs dans Miz-1. Ces résultats permettent l’actualisation du modèle de liaison de Miz-1 au promoteur de p15[indice supérieur INK4B] qui avait été élaboré comme hypothèse, et ils nous rapprochent de la compréhension de la transrépression par c-Myc. [symboles non conformes]

Les patients atteints de cécité cornéenne résultant d'une maladie ou d'une blessure dans de nombreux pays ne seront probablement pas transplantés avec des cornées de donneurs humains en raison d'une grave pénurie mondiale de tissus de donneurs. Cependant, même si des cornées de donneurs étaient disponibles, les patients présentant une inflammation ou une maladie grave ne seraient pas aidés car ils courent un risque élevé de rejet des cornées de donneurs car celles-ci contiennent des cellules allogéniques. Les implants cornéens sans cellules qui ne déclenchent pas de rejet ont été développés comme alternatives à la transplantation de donneurs humains par le laboratoire Griffith, et ont montré dans un premier essai clinique chez l'homme qu'ils régénèrent de manière stable le tissu et les nerfs cornéens. Ces implants comprenaient du collagène humain recombinant, la principale protéine structurelle trouvée dans la cornée humaine. Cependant, les collagènes de pleine longueur sont difficiles et coûteux à produire et ne peuvent pas être personnalisés. Une grande variété de peptides plus courts qui imitent le collagène et d'autres molécules de la matrice extracellulaire ont été développés et testés. Cela comprend les peptides hybrides combinant le collagène et la soie (VBsilk). Le but de ma thèse est de confirmer les simulations de VBsilk d'un peptide hybride collagène-soie produit au Griffith Lab. Un autre objectif est de déterminer les conditions de production et de purification pour montrer que le peptide simulé peut être converti en un peptide réel. En bref, l'ADN codant pour une séquence de VBsilk a été cloné dans ClearColi, une souche d'E. Coli à faible endotoxine. Les bactéries ont été cultivées dans des cultures à grand volume. Le VBsilk a été extrait et purifié par FPLC. SDS-PAGE a montré que des bandes de protéines de taille appropriée étaient obtenues. Par conséquent, il est possible de produire le peptide VBsilk. / Patients with cornea blindness resulting from disease or injury in many countries are unlikely to be transplanted with human donor corneas due a worldwide severe shortage of donor tissues. However, even if donor corneas were available, patients with inflammation or severe disease would not be helped as they are at a high risk of rejecting donor corneas as these contain allogeneic cells. Cell-free corneal implants that do not trigger rejection were developed as alternatives to human donor transplantation by the Griffith lab, and shown in a first-in-human clinical trial to stably regenerate corneal tissue and nerves. These implants comprised recombinant human collagen, the main structural protein found in the human cornea. However, full-length collagens are difficult and expensive to produce, and cannot be customized. A wide variety of shorter peptides that mimic collagen and other extracellular matrix molecules have been developed and tested. This includes hybrid peptides combining collagen and silk (VBsilk). The aim of my thesis is to is to confirm simulations of VBsilk, a hybrid collagen-silk peptide that was produced in the Griffith Lab. A further aim is to determine the conditions for the production and purification to show that simulated peptide can be converted into an actual peptide. Briefly, the DNA coding for a VBsilk sequence was cloned into ClearColi, a strain of E. coli with low endotoxin. The bacteria were grown up in large volume cultures. The VBsilk was extracted and purified by FPLC. SDS-PAGE showed that appropriate-sized bands of protein were obtained. Hence, it is possible to produce VBsilk peptide.

Résumé La ribonucléase P (RNase P) est une ribonucléoprotéine omniprésente dans tous les règnes du vivant, elle est responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNs de transfert (ARNts) et quelques autres petits ARNs. L’enzyme est composée d'une sous unité catalytique d'ARN (ARN-P) et d'une ou de plusieurs protéines selon les espèces. Chez les eucaryotes, l’activité de la RNase P cytoplasmique est distincte de celles des organelles (mitochondrie et chloroplaste). Chez la plupart des espèces, les ARN-P sont constituées de plusieurs éléments structuraux secondaires critiques conservés au cours de l’évolution. En revanche, au niveau de la structure, une réduction forte été observé dans la plupart des mtARN-Ps. Le nombre de protéines composant la RNase P est extrêmement variable : une chez les bactéries, environ quatre chez les archéobactéries, et dix chez la forme cytoplasmique des eucaryotes. Cet aspect est peu connu pour les formes mitochondriales. Dans la plupart des cas, l’identification de la mtRNase P est le résultat de longues procédures de purification comprenant plusieurs étapes dans le but de réduire au minimum le nombre de protéines requises pour l’activité (exemple de la levure et A. nidulans). Cela mène régulièrement à la perte de l’activité et de l’intégrité des complexes ribonucléo-protéiques natifs. Dans ce travail, par l’utilisation de la technique de BN-PAGE, nous avons développé une procédure d’enrichissement de l’activité RNase P mitochondriale native, donnant un rendement raisonnable. Les fractions enrichies capables de cette activité enzymatique ont été analysées par LC/MS/MS et les résultats montrent que l’holoenzyme de la RNase P de chacune des fractions contient un nombre de protéines beaucoup plus grand que ce qui était connue. Nous suggérons une liste de protéines (principalement hypothétiques) qui accompagnent l’activité de la RNase P. IV De plus, la question de la localisation de la mtRNase P de A. nidulans a été étudiée, selon nos résultats, la majorité de la mtRNase P est attachée á la membrane interne de la mitochondrie. Sa solubilisation se fait par l’utilisation de différents types de détergent. Ces derniers permettent l’obtention d’un spectre de complexes de la RNase P de différentes tailles. / Abstract RNase P is a ribonucleo-protein complex (an RNA enzyme or ribozyme) that cleaves 5’ leader sequences of precursor tRNAs and a few other small RNAs. It occurs in all three domains of life, Bacteria, Archaea and Eukarya, with the latter containing distinct nuclear and organellar (mitochondrial or plastid) activities. In most instances, the complex contains a single, well-conserved RNA subunit that carries the active center of the enzyme. Yet, compare to bacterial and nuclear P RNA, most mtP RNAs are structurally highly reduced. The number of P proteins is highly variable: one in Bacteria, about four in Archaea, and ten in the cytoplasmic form of Eukarya. Much less is known in the case of mitochondria. MtRNase P is usually purified by using numerous separation steps that include unphysiological conditions, leading to complexes having a minimum number of subunits (e.g., in yeast and Aspergillus nidulans), that often loose their activity. Here, using BN PAGE, we have developed an enrichment procedure for A. nidulans mtRNase P that avoids some of the most disruptive conditions. The protein composition of active fractions was identified with LC/MS/MS, indicating that the RNase P holoenzyme is much larger than previously thought. Finally, the question of mtRNase P localization within mitochondria was investigated, by tracing its RNA subunit by RT PCR. We found that mtRNase P of A. nidulans is a predominantly membrane-attached enzyme; it is in part solubilized by detergents such as digitonin and Triton.

Les cytochromes c oxydases (CcO), situées dans les chaînes respiratoires eucaryotes et des bactéries aérobiques, catalysent la réduction de l'oxygène en eau, une réaction qui utilise quatre électrons et quatre protons. Ces complexes protéiques membranaires participent également à la formation de la force protonmotrice nécessaire à la synthèse d'ATP, en pompant quatre protons supplémentaires par molécule de dioxygène réduit. Le site actif des CcO aa3 contient un hème de type a de haut spin, l'hème a3, et un atome de cuivre, le CuB. Ces deux cofacteurs peuvent fixer, outre l'O2, d'autres ligands diatomiques impliqués dans la signalisation telle que le monoxyde d'azote (NO) et le monoxyde de carbone (CO). Les travaux présentés dans ce manuscrit, effectué sur l'oxydase mitochondriale et sur des oxydases bactériennes, aa3 et ba3, concernent à la fois l'interaction de ligands avec la CcO et le transfert interne d'électrons. Les oxydases étudiées possèdent quatre centres redox, l'hème a3 et le CuB ainsi que l'hème a (resp. b pour ba3) et le centre CuA, impliqués dans le transfert d'électron (ET) du donneur, le cytochrome c, à l'accepteur, l'oxygène fixé au site actif. L'inhibition réversible de la CcO par le NO est un processus de régulation de la respiration. En étudiant l'influence de la concentration de NO sur la dynamique du NO au sein des oxydases aa3 de P. denitrificans et ba3 de T. thermophilus nous avons mis en évidence une interaction entre plusieurs ligands dans le site actif. Pour l'oxydase aa3, la recombinaison géminée du NO, après sa photodissociation de l'hème a3, a lieu selon deux phases de 200 ps et 20 ns, dont l'intensité augmente pour les concentrations de NO superstoechiométriques. A l'inverse, aucun effet de la concentration n'est observé pour l'oxydase ba3 où l'activité NO réductase de cette CcO exclut la présence stable de deux molécules de NO dans le site actif. L'ensemble de ces résultats converge vers la présence d'une seconde molécule de NO dans ou à proximité du site actif dans l'oxydase aa3, créant un encombrement favorisant une recombinaison géminée plutôt qu'un cheminement vers l'extérieur de la protéine. Des expériences de spectroscopie RPE ont été effectuées afin de déterminer la nature du second site de fixation du NO. La modification du signal avec la concentration de NO est observée uniquement pour l'oxydase aa3. Si le spectre à basses concentrations (NO: CcO<1:1), très similaire à celui obtenu avec l'oxydase ba3, est caractéristique de la liaison du NO sur un hème ayant pour 5ème ligand une histidine, le spectre enregistré à hautes concentrations est similaire à celui mesuré lorsque NO est lié à un hème sans autre ligand en trans. Comme le spectre visible de l'oxydase n'indique pas une rupture de la liaison Fe-NεHis, nous proposons que la 2nd molécule de NO induise une rotation du NO lié à l'hème depuis une position parallèle au plan de l'histidine à une position perpendiculaire à ce plan, rompant ainsi les interactions paramagnétiques entre l'histidine et le NO. Cette interprétation est renforcée par des modélisations de la structure de l'oxydase aa3 avec un et deux molécules de NO dans le site actif. Elles montrent qu'en effet la présence d'un second NO, lié au CuB dans le site actif, induit une rotation du NO lié à l'hème de ~70°. Par ailleurs, à hautes concentrations de NO, il y a apparition d'un signal caractéristique d'une interaction métal de transition-NO, qui peut être attribué, par élimination, à la liaison CuB-NO. L'établissement de la présence simultanée de deux molécules de NO dans le site actif de la CcO aa3 de P. denitrificans dès les faibles concentrations de NO, ouvrent de nouvelles voies dans la compréhension des mécanismes d'inhibition de l'oxydase par le NO. Afin d'étudier plus en détail l'influence de l'environnement du site actif sur la dynamique du NO dans le site actif, le résidu V279 à été substitué par mutagenèse dirigée. Les premiers résultats sur des souches exprimant les oxydases mutées indiquent des modifications de leur activité O2 réductase. Par ailleurs, nous nous sommes intéressé à la vitesse de réduction du site actif par l'hème a. Cette réaction étant trop rapide pour être visualisée par injection d'électrons, nous avons étudié le flux des électrons en sens inverse. Ces expériences ont été effectuées sur l'oxydase mitochondriale dont l'hème a était oxydé et l'hème a3 réduit et lié une molécule de CO. Après photodissociation du CO de l'hème a3, les électrons se répartissent entre les deux hèmes de potentiel redox proche. Par spectroscopie, nous avons ainsi mesuré que 13 ±3 % de ce transfert s'effectue en 1,2 ns; ce temps correspond au transfert intrinsèque. Des études précédentes avaient montré une phase de 3 µs, considérée jusqu'ici comme la phase la plus rapide du ET entre les hèmes. Au regard de nos résultats, cette phase de ET peut être expliquée par le départ du CO du CuB, ce qui modifierait le potentiel redox de l'hème a3. Le transfert intrinsèque des électrons en 1,2 ns, permettrait à l'oxydase, dans des conditions physiologiques ([O2] faibles et e-peu disponibles) de capturer et de réduire l'oxygène en diminuant la durées des périodes où le site actif n'est pas réduit.

Les protéines Argonaute sont associées à de petits ARN et participent à la régulation de l'expression des gènes. Les protéines Piwi, sous-famille des protéines Argonaute, sont principalement exprimées dans les lignées germinales. Elles recrutent les piRNA (Piwi-interacting RNA) et assurent la stabilité du génome en inhibant les transposons. Une caractéristique des piRNA est la présence de groupes 2'-O-methyl à l'extrémité 3'. Les microARN et siRNA (small interfering RNA) de plantes, comme les siRNA de Drosophyle portent aussi cette modification qui est catalysée par l'ARN méthyl-tranférase HEN1. Son homologue murin, mHEN1, méthyle in vitro de petits ARN, mais son rôle dans la voie des piRNA n'avait pas encore été envisagé. Mon objectif était de relier mHEN1 à la voie des piRNA. J'ai démontré que mHEN1 interagit directement avec la partie N-ter de MILI mais pas avec les autres protéines Piwi de souris. La partie N-ter de MILI porte des arginines méthylées. J'ai démontré que l'interaction ne dépendait pas de la présence de cette modification, ce qui suggère que mHEN1 intervient avant la modification de MILI. Par imagerie cellulaire j'ai montré la compartimentation de HEN1 et des protéines Piwi dans des granules cytoplasmiques différents. Parallèlement, afin de caractériser les éléments de la voie piRNA, j'ai développé un nouveau modèle d'étude basé sur des embryons de poisson zèbre (Danio rerio). Ainsi, j'ai évalué le rôle de deux protéines interagissant avec les protéines Piwi, TDRD1 (Tudor-domain containing) et l'hélicase MOV10l décrits chez la souris mais pas chez le poisson zèbre. J'ai montré que l'expression de DrTDRD1, spécifique à la lignée germinale, dépend de sa partie 3'UTR. La réduction de l'expression de DrMOV10l, obtenue grâce à l'utilisation de morpholinos, entraîne la dérépression des éléments rétrotransposables des embryons en développement. Cette technique de Knock Down sera utilisée pour identifier de nouveaux éléments de la biogenèse des piRNA.

Résumé La ribonucléase P (RNase P) est une ribonucléoprotéine omniprésente dans tous les règnes du vivant, elle est responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNs de transfert (ARNts) et quelques autres petits ARNs. L’enzyme est composée d'une sous unité catalytique d'ARN (ARN-P) et d'une ou de plusieurs protéines selon les espèces. Chez les eucaryotes, l’activité de la RNase P cytoplasmique est distincte de celles des organelles (mitochondrie et chloroplaste). Chez la plupart des espèces, les ARN-P sont constituées de plusieurs éléments structuraux secondaires critiques conservés au cours de l’évolution. En revanche, au niveau de la structure, une réduction forte été observé dans la plupart des mtARN-Ps. Le nombre de protéines composant la RNase P est extrêmement variable : une chez les bactéries, environ quatre chez les archéobactéries, et dix chez la forme cytoplasmique des eucaryotes. Cet aspect est peu connu pour les formes mitochondriales. Dans la plupart des cas, l’identification de la mtRNase P est le résultat de longues procédures de purification comprenant plusieurs étapes dans le but de réduire au minimum le nombre de protéines requises pour l’activité (exemple de la levure et A. nidulans). Cela mène régulièrement à la perte de l’activité et de l’intégrité des complexes ribonucléo-protéiques natifs. Dans ce travail, par l’utilisation de la technique de BN-PAGE, nous avons développé une procédure d’enrichissement de l’activité RNase P mitochondriale native, donnant un rendement raisonnable. Les fractions enrichies capables de cette activité enzymatique ont été analysées par LC/MS/MS et les résultats montrent que l’holoenzyme de la RNase P de chacune des fractions contient un nombre de protéines beaucoup plus grand que ce qui était connue. Nous suggérons une liste de protéines (principalement hypothétiques) qui accompagnent l’activité de la RNase P. IV De plus, la question de la localisation de la mtRNase P de A. nidulans a été étudiée, selon nos résultats, la majorité de la mtRNase P est attachée á la membrane interne de la mitochondrie. Sa solubilisation se fait par l’utilisation de différents types de détergent. Ces derniers permettent l’obtention d’un spectre de complexes de la RNase P de différentes tailles. / Abstract RNase P is a ribonucleo-protein complex (an RNA enzyme or ribozyme) that cleaves 5’ leader sequences of precursor tRNAs and a few other small RNAs. It occurs in all three domains of life, Bacteria, Archaea and Eukarya, with the latter containing distinct nuclear and organellar (mitochondrial or plastid) activities. In most instances, the complex contains a single, well-conserved RNA subunit that carries the active center of the enzyme. Yet, compare to bacterial and nuclear P RNA, most mtP RNAs are structurally highly reduced. The number of P proteins is highly variable: one in Bacteria, about four in Archaea, and ten in the cytoplasmic form of Eukarya. Much less is known in the case of mitochondria. MtRNase P is usually purified by using numerous separation steps that include unphysiological conditions, leading to complexes having a minimum number of subunits (e.g., in yeast and Aspergillus nidulans), that often loose their activity. Here, using BN PAGE, we have developed an enrichment procedure for A. nidulans mtRNase P that avoids some of the most disruptive conditions. The protein composition of active fractions was identified with LC/MS/MS, indicating that the RNase P holoenzyme is much larger than previously thought. Finally, the question of mtRNase P localization within mitochondria was investigated, by tracing its RNA subunit by RT PCR. We found that mtRNase P of A. nidulans is a predominantly membrane-attached enzyme; it is in part solubilized by detergents such as digitonin and Triton.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable de nombreuses maladies nosocomiales chez les patients immunodéprimés ainsi que d'infections graves chez les patients atteints de la mucoviscidose (CF). La colonisation des voies respiratoires des patients CF est souvent mortelle car une fois installée, cette bactérie est difficile à éradiquer et provoque le déclin des fonctions respiratoires des patients. L'antibiothérapie devient inefficace face au développement de souches multi-résistantes et sa capacité à former un biofilm. L'étape cruciale initiant l'infection ou la formation du biofilm est l'adhésion durant laquelle des interactions spécifiques lectines/oligosaccharides permettent la fixation de la bactérie à la surface de la cellule hôte. Bloquer l'adhésion serait un moyen de lutter contre l'infection. Dans l'approche d'une thérapie anti-adhésive, plusieurs lectines impliquées dans l'adhésion et l'élaboration du biofilm sont prises comme cibles. Dans un premier temps, des lectines fimbriales putatives identifiées récemment, CupB6 et CupE6, ont fait l'objet d'une étude. Des essais d'expression, de purification et de cristallisation ont été réalisés dans l'objectif de résoudre leur structure cristallographique. Une étude visant à identifier le ligand naturel de CupB6 a également été entreprise. Puis une étude a été menée pour caractériser le potentiel d'inhibition de plusieurs molécules dérivées du galactose sur la lectine soluble, PA-IL. Certaines de ces molécules pourraient être utilisées comme glycomimétiques offrant une alternative aux antibiotiques. Une étude par microcalorimétrie et cristallographie aux rayons X a permis d'étudier la spécificité d'une lectine de légumineuse, PELa.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable de nombreuses maladies nosocomiales chez les patients immunodéprimés ainsi que d'infections graves chez les patients atteints de la mucoviscidose (CF). La colonisation des voies respiratoires des patients CF est souvent mortelle car une fois installée, cette bactérie est difficile à éradiquer et provoque le déclin des fonctions respiratoires des patients. L'antibiothérapie devient inefficace face au développement de souches multi-résistantes et sa capacité à former un biofilm. L'étape cruciale initiant l'infection ou la formation du biofilm est l'adhésion durant laquelle des interactions spécifiques lectines/oligosaccharides permettent la fixation de la bactérie à la surface de la cellule hôte. Bloquer l'adhésion serait un moyen de lutter contre l'infection. Dans l'approche d'une thérapie anti-adhésive, plusieurs lectines impliquées dans l'adhésion et l'élaboration du biofilm sont prises comme cibles. Dans un premier temps, des lectines fimbriales putatives identifiées récemment, CupB6 et CupE6, ont fait l'objet d'une étude. Des essais d'expression, de purification et de cristallisation ont été réalisés dans l'objectif de résoudre leur structure cristallographique. Une étude visant à identifier le ligand naturel de CupB6 a également été entreprise. Puis une étude a été menée pour caractériser le potentiel d'inhibition de plusieurs molécules dérivées du galactose sur la lectine soluble, PA-IL. Certaines de ces molécules pourraient être utilisées comme glycomimétiques offrant une alternative aux antibiotiques. Une étude par microcalorimétrie et cristallographie aux rayons X a permis d'étudier la spécificité d'une lectine de légumineuse, PELa. / P. aeruginosa is an opportunistic pathogenic bacterium responsible for numerous nosocomial infections in immunosuppressed patients. It is the first mortal pathogen in cystic fibrosis (CF) patients. The invasion of the respiratory tract of CF patients by the bacterium is often lethal because it is hard to eradicate and it rapidly impairs the respiratory functions of the patients. None of the current antibiotherapy procedures are efficient against multiresistant, biofilm forming P. aeruginosa. The first step leading to infection or biofilm formation involves the initial adhesion of bacterial cells to the host pulmonary cells via specific lectin/oligosaccharid interactions. Blocking the adhesion would be a way to fight against the infection. The anti-adhesion therapy targets several bacterial lectins involved in adhesiveness and biofilm formation. In this work, the recently identified putative fimbrial lectins CupB6 and CupE6 have been studied. Expression and purification tests followed by crystallization trials have been performed. In parallel, attempts to identify the natural ligand of CupB6 were also carried out. This work also presents a systematic characterization of the inhibitory effects of various galactose-derived molecules on the PA-IL lectin. Some of these molecules could be used as glycomimetic drugs thus offering an interesting alternative to standard antibiotics. Finally, the combination of microcalorimetry together with X-ray crystallography enabled us to gain insights into the ligand specificity of PELa, a legume lectin.

Les acides ribonucléiques (ARN) subissent plusieurs modifications posttranscriptionnelles avant de remplir leur rôle dans la cellule. Un des acteurs responsables de ces modifications sont les ligases à ARN. Il existe deux grandes familles de ligases à ARN soit les « ATP-grasp » et les « RtcB-like ». Malgré le fait que ces enzymes ont des rôles biologiques similaires dans la cellule, leurs mécanismes moléculaires sont très différents. Notre équipe a découvert chez un eucaryote marin la présence de trois gènes codant pour des homologues de ligases à ARN de type RtcB. Ceci est pour le moins inhabituel considérant que la plupart des espèces eucaryotes n’ont qu’un seul gène codant pour des ligases de ce type. Diplonema papillatum, l’organisme en question, est un eucaryote dont l’étude a gagné en popularité au courant des dernières années dû au mode d’expression particulier de son matériel génétique mitochondrial. Celui-ci est fragmenté en plusieurs morceaux appelés modules qui, durant le processus de maturation de l’ARN, sont joints ensemble via épissage en trans. Nous supposons que l’une des ligases de type RtcB présente chez D. papillatum, plus spécifiquement DpRTCB1, est un des acteurs principaux de ce phénomène d’épissage en trans. Nous pensons aussi que les deux autres RtcB présentes chez cet organisme, soit DpRTCB2 et DpRTCB3, ont chacune leur propre rôle dans la cellule. Nous avons donc modélisé la structure tertaire de ces protéines in silico donnant ainsi des indices quant à ce qui pourraient être requis comme cofacteurs par ces trois enzymes. Nous proposons aussi un système de classification des ligases de type RtcB en fonction de leurs rôles biologiques et de leurs variations au niveau des résidus composant le site actif de l’enzyme. Nous avons tenté de purifier des protéines de fusion DpRTCB pour de futurs essais enzymatiques afin de déterminer les rôles biologiques potentiels de ces enzymes. Toutefois, ces protéines formaient des corps d’inclusion rendant leur purification difficile. Ce faisant, nous démontrons les différentes techniques qui existent actuellement pour purifier des protéines à partir d’agrégats insolubles. Ce mémoire prédit les potentiels cofacteurs et substrats nécessaires pour de futurs essais biochimiques des ligases DpRTCB. Nous établissons aussi une base robuste pour un système de classification des ligases de type RtcB. Ce document prodigue entre autres des solutions de base aux chercheurs désireux de purifier des protéines qui forment des corps d’inclusion avant de considérer passer à des méthodes de purification plus laborieuses et coûteuses. / Ribonucleic acids (RNA) undergo several post-transcriptional modifications before fulfilling their role in the cell. One of the actors responsible for these modifications are RNA ligases. There are two main families of RNA ligases, namely “ATP-grasp” and “RtcB-like”. Despite the fact that these enzymes have similar biological roles in the cell, their molecular mechanisms are very different. Our team has discovered in a marine eukaryote the presence of three genes encoding RtcB RNA ligase homologs. This is unusual considering that eukaryotes generally have only one gene encoding for an homolog of this ligase. Diplonema papillatum, the organism in question, is a eukaryote that has grown in popularity in recent years due to the particular mode of expression of its mitochondrial genetic material. Its genome is fragmented into several pieces called modules which, during the RNA maturation process, these modules undergo ligation via trans-splicing. We posit that one of the RtcB-type ligases present in D. papillatum, more specifically DpRTCB1, is a major player in this trans-splicing phenomenon. We also believe that the other two RtcB ligases present in this organism, DpRTCB2 and DpRTCB3, each have its own role in the cell. We therefore established in silico models for these proteins which could hint at the cofactors required by these three enzymes. We also propose a classification system for RtcB-type ligases according to their biological roles and variations in known active site residues. We attempted to purify DpRTCB fusion proteins for future enzymatic assays in order to get a better understanding in the biological role of these enzymes. These proteins, however, formed inclusion bodies making their purification difficult. Thus, we demonstrate various techniques that currently exist to attempt to purify proteins from insoluble aggregates. This Master’s thesis attempts to predict the potential cofactors and substrates necessary for future biochemical assays of DpRTCB enzymes. We also establish a robust foundation for a classification system of RtcB-type ligases. Among other things, this document provides basic solutions to researchers wishing to purify proteins that form inclusion bodies before considering switching to more laborious and expensive purification methods.

Les protéines Binder of Sperm (BSP) appartiennent à une superfamille de protéines exprimées dans le système reproducteur masculin, plus particulièrement dans les vésicules séminales chez les ongulés, et dans l’épididyme chez l’humain et la souris. Jusqu'à présent, des rôles variés chez différentes espèces ont été démontrés pour les protéines BSP, tels que dans la motilité et la capacitation chez le bovin. Cependant, leur rôle demeure élusif chez d’autres mammifères comme la souris et l’humain. Des études in vivo récentes ont démontré que la délétion des gènes Bsph1 et Bsph2 chez la souris n’a aucune conséquence sur la fertilité, et n’induit aucune anomalie au niveau de l'appareil reproducteur masculin. Afin d'élucider le rôle spécifique de la protéine BSP chez l'humain (BSPH1), nous avons d’abord développé une méthode de purification efficace permettant d’obtenir la protéine BSPH1 fonctionnelle car ces protéines ne sont présentes qu'en quantité infime dans l’épididyme humain. Suite, a la purification de BSPH1, j’ai réalisé des expériences in vitro et cherché à identifier son réseau d'interaction protéique. Il a été démontré que les protéines BSP interagissent avec des groupes pseudo-choline tels que le diéthylaminométhyle par affinité plutôt que par des interactions ioniques. Le diéthylaminoéthyle est chargé positivement et par conséquence, est un échangeur d'anions faible, mais les BSP interagissent avec affinité à la résine. Cette étude présente également une nouvelle méthode de purification rapide et peu coûteuse, qui fournit des protéines BSP recombinantes de grande pureté qui peuvent être utilisées pour étudier leurs rôles dans la fécondation chez les mammifères. Nous avons montré que la pré-incubation des ovocytes avec la protéine BSPH1 recombinante peut diminuer le taux de fécondation de manière dose-dépendante. Les spermatozoïdes ont également été pré-incubés avec un anticorps anti-BSPH1 et ont montré une diminution du taux de fécondation. Pour identifier le réseau d’interaction protéique de BSPH1, j'ai utilisé la méthode « Proximity-dependent biotin identification » (BioID) couplée à la spectrométrie de masse. Les résultats de la spectrométrie de masse ont démontré une interaction entre BSPH1 et toutes les sous-unités du complexe CCT / TRIC (Chaperonin containing tailless complex polypeptide 1 (CCT) ou tailless complex polypeptide 1 ring complex (TRiC)). Ce complexe interagit avec un autre complexe appelé BBSome (Bardet–Bied syndrome complex), qui joue un rôle important dans le transport de protéines à travers les cils primaires. BSPH1 a également interagi avec un grand nombre de protéines de la famille CEP (centrosome-associated proteins), importantes dans la formation des cils primaires par les microtubules et de la maturation du centrosome, qui soutiennent le rôle de BSPH1 dans les cils primaires. Dans l’ensemble, cette étude démontre que BSPH1 pourrait avoir un nouveau rôle en tant que chaperonne, à travers les cils primaires dans les cellules qui l’expriment dans l’appareil reproducteur masculin. / Binder of SPerm (BSP) proteins belong to a superfamily of proteins expressed in the male reproductive tract, particularly in seminal vesicles of ungulates (e.g., bovine, ram) and in the epididymis of humans and mice. So far, BSP proteins have been shown to play different roles in different species such as in motility and capacitation in bovine; however, their role remains unclear in other mammals. For instance, depletion of Bsph1/Bsph2 in mice had no effect on fertility. In order to elucidate the specific role of BSP protein in humans (BSPH1), I sought to investigate a purification method to produce functional human BSP protein, as these proteins are only present in minute amounts in the human epididymis. Following purification of BSPH1, I carried out in vitro experiments and sought to identify its protein interaction network. BSP proteins have been shown to interact with pseudo-choline groups such as diethylaminomethyl through affinity rather than ionic interactions. Diethylaminoethyl is positively charged and therefore is a weak anion exchanger, but BSPs interact through affinity to this resin. This study presents a new, rapid and cost-effective purification method that provides recombinant BSP proteins of a high purity level, which can be used to study their roles in mammalian fertilization. We showed that pre-incubation of oocytes with recombinant BSPH1 can decrease fertilization rate in a dose-dependant manner. Sperm were also preincubated with anti-BSPH1 antibody and showed a decrease in fertilization rate. Secondly, I used BioID (proximity-dependent biotin identification), coupled with mass spectrometry to identify the protein-protein interaction network of BSPH1 by proximity labeling. Mass spectrometry results showed an interaction between BSPH1 and all subunits of the CCT/TRIC complex (Chaperonin containing tailless complex polypeptide 1 (CCT) or tailless complex polypeptide 1 ring complex (TRiC). This complex interacts with another complex called BBSome (Bardet–Biedl syndrome complex), which plays a role in protein trafficking through primary cilium. I also identified BBS proteins, as well as other proteins, that interact with the BBSome complex and regulate protein trafficking in the cilia. BSPH1 also interacted with a large number of CEP (centrosome-associated proteins) family proteins, important in the formation of primary cilium through microtubules and centrosome maturation, which further support the potential implication of BSPH1 with the primary cilia. Overall, this study demonstrates that BSPH1 may have a new role as a chaperone involved in protein trafficking through the primary cilia in cells that express it in the male reproductive system