261 |
Regulación de la estructura y funcionalidad de la b-catenina por fosforilación de residuos tirosinaPiedra Bueno, José Antonio 02 April 2003 (has links)
Las uniones adherentes son un tipo de unión que se establece entre células adyacentes. A través de ellas, contactan sus citoesqueletos y el tejido gana en resistencia. En las uniones adherentes, las proteínas transmembrana que establecen contactos homotípicos son las cadherinas. La principal cadherina en tejido epitelial es la E-cadherina. El dominio citosólico de E-cadherina interacciona con el citoesqueleto de actina a través de unas proteínas citosólicas denominadas b-catenina y a-catenina respectivamente. a-catenina interacciona directamente con componentes del citoesqueleto. Otra catenina, la p120-catenina, también interacciona con la facción citoplásmica de la E-cadherina.La alteración de la adhesión celular mediada por cadherina, se asocia con frecuencia con la fosforilación en tirosinas de p120 y b-catenina. Hemos examinado el papel de esta modificación en el control de la asociación b-catenina/E-cadherina utilizando ensayos in vitro con proteínas recombinantes. La quinasa Src recombinante fosforila eficientemente ambas cateninas. La fosforilación por Src, disminuye la unión b-catenina/E-cadherina y aumenta la asociación p120/E-cadherina. A pesar de ello, ambas cateninas pueden interaccionar independientemente con la cadherina. De las tirosinas de b-catenina fosforiladas por Src, es la fosforilación de la 654 la responsable, tanto in vitro como in vivo, de la pérdida de asociación con la cadherina. Otras quinasas como el EGFR o su homólogo erbB2 catalizan la fosforilación de la tirosina 654 con gran eficiencia.A parte de su interacción con E-cadherina, b-catenina interacciona con a-catenina. En este trabajo mostramos como esta interacción entre a y b también se regula por fosforilación en tirosinas. Concretamente, la fosforilación de la tirosina 142 de b-catenina inhibe la asociación entre ambas proteínas, tanto in vitro como in vivo. Esta tirosina puede ser fosforilada in vitro por las quinasas Fer y Fyn. En células intestinales transfectadas con K-ras, hay muy poca asociación entre a- y b-catenina y Fer y Fyn quinasas se encuentran activadas. Ambas quinasas se asocian con p120-catenina en un complejo multiproteico que implica también otras quinasas como Src y Yes. La fosforilación de p120 aumenta su asociación a E-cadherina, reclutando a su vez a las quinasas asociadas hasta los complejos de adhesión. La presencia de las quinasas en las uniones adherentes, posibilitaría la fosforilación de las tirosinas 142 y 654 de b-catenina, lo que provocaría su liberación de a-catenina y E-cadherina respectivamente, y la presencia de b-catenina en forma libre en el citosol.A parte de su papel estructural en las uniones adherentes, b-catenina también funciona como coactivador transcripcional de genes implicados en proliferación celular. Para ello interacciona con factores nucleares como el Tcf-4 o la TATA-box binding protein (TBP).La fosforilación de la tirosina 654 de b-catenina, afecta positivamente a su asociación con TBP, lo que se correlaciona con una mayor actividad transcripcional mediada por b-catenina.Intramolecularmente, los dominios terminales de b-catenina interaccionan con su rígido dominio central y la fosforilación de la tirosina 654, produce la inhibición de la asociación entre el dominio central y el C-terminal. La ausencia de dominios terminales, favorece la interacción de b-catenina con factores como E-cadherina o la TBP. Luego, los extremos terminales de la proteína controlan la unión de los distintos cofactores a b-catenina y, al menos la fosforilación de la tirosina 654 participa en la regulación de estos procesos. / Adherens junctions are a kind of cell-cell contacts between neighbouring cells. They allow the cytoeskeletons to interact confeering tissue resistance. In adherens junctions, cadherins are the transmembrane proteins that establish homotypic interactions. In epithelial tissues, E-cadherin is the main cadherin. The citosolic domain of E-cadherin binds the cytoeskeleton through b-catenin and a-catenina respectively. a-catenin can bind directly to cytoeskeleton proteins. Another catenin, p120-catenin, also binds to E-cadherin.Alteration of cadherin-mediated cell-cell adhesion is frequently associated to tyrosine phosphorylation of p120- and b-catenins. We have examined the role of this modification in the control of b-catenin/E-cadherin binding using in vitro assays with recombinant proteins. Recombinant Src-kinase efficiently phosphorylates both catenins. Src phosphorylation, reduces b-catenin/E-cadherin binding and increases p120/E-cadherin association. However, both catenins can indepently interact with E-cadherin. Among the tyrosines phosphorylated by Src, phosphorylation of Tyr-654 is responsible, both in vitro or in vivo, of b-catenin/E-cadherin decrease. Other tyrosine-kinases as EGFR or its homologue erbB2 can phosphorylate tyrosine 654 with high efficiency.Moreover of its interaction con E-cadherin, b-catenin also interacts with a-catenin. In this work we show that a-catenin/b-catenin binding is regulated by tyrosine phosphorylated, too. Concretely, phosphorylation of b-catenin tyrosine 142, decreases the association between these proteins, both in vitro or in vivo. This residue can be in vitro phosphorylated by Fer and Fyn kinases. In K-ras transfected epithelial cells, very few a- and b-catenin association is detected and Fer and Fyn kinases are found in an activated manner. Both kinases associate with p120-catenin in a multiprotein complex. Other kinases as Yes or Src are also present in the complex. p120 phosphorylation increase its association with E-cadherin, recruiting the kinases to the adhesion complexes. The presence of kinases in adherens junctions enables the phosphorylation of b-catenin tyrosines 142 and 654. This produces b-catenin liberation from a-catenin and E-cadherin respectively, and its translocation to the cytosol.A part of its structural role in adherens junctions, b-catenin also acts as a transcriptional coactivator of pro-proliferative genes. So, b-catenin interacts with nuclear factors as Tcf-4 or TATA-box binding protein (TBP).Phosphorylation of b-catenin Tyr-654, icreases its association with TBP, wich correlates with an increase in b-catenin dependent transcriptional activity.Intramolecularly, terminal domains of b-catenin interact with its central domain and Tyr-654 phosphorylation, produces the inhibition of central domain/C-terminal association. In the absence of terminal domains, b-catenin interaction with factors like E-cadherin or TBP is augmented. Then, the protein terminal domains control cofactors binding to b-catenin and, at least Tyr-654 phosphorylation is implicated in the regulation of this process.
|
262 |
Cloning, expression, purification and crystallisation of the human ets-1/usf1/dna complex & crystal structure of thermotoga maritima histidinol-phosphate aminotransferase (ec 2.6.1.9)Fernández Pérez, Francisco 06 September 2002 (has links)
Ets-1 y USF1 son factores de transcripción implicados en muchos procesos fundamentales del desarrollo y la diferenciación celular. Defectos en su regulación se han asociado con desórdenes patológicos e infecciones virales. Ets-1, en particular, es un paradigma del mecanismo de regulación transcripcional en virtud del cual la capacidad de Ets-1 para unir DNA y, por tanto, de transactivación, están silenciadas constitutivamente (autoinhibición). La desrepresión de Ets-1 se puede lograr por medio de interacciones proteína-proteína, que desenmascaran el dominio de unión a DNA de Ets-1 y conducen a la formación de un complejo ternario de gran afinidad entre Ets-1, una proteína compañera y el sitio de unión combinado para ambos factores de transcripción.En este trabajo, emprendimos la elucidación estructural del mecanismo de autoinhibición de Ets-1. Comenzamos con la clonación, expresión y purificación de Ets-1 y las proteínas compañeras USF1 y MafB. A medida que íbamos enfrentando nuevos desafíos, diseñamos métodos y aproximaciones que facilitaran la producción eficaz de proteínas de unión a DNA para biología estructural. Uno de los conceptos fundamentales que ha reaparecido en el presente estudio es la necesidad de proporcionar a cada proteína un entorno lo mas parecido posible al que disfrutan en su contexto biológico. Por ejemplo, la estabilización de Ets-1 no fue posible hasta que se añadió el complejo USF1/DNA , que semeja las condiciones fisiológicas en las que USF1, unido a DNA, recluta Ets-1 sobre su sitio de unión. Hemos producido con éxito un conjunto de complejos ternarios Ets-1/USF1/DNA para los cuales hemos buscado condiciones de cristalización. Hemos obtenido cristales, que hemos probado contienen Ets-1, USF1 y DNA. El refinamiento (optimización) de esas condiciones de cristalización preliminares debería conducir en definitiva a la obtención de cristales de suficiente calidad para difracción. Estos cristales ofrecen la posibilidad de profundizar nuestro conocimiento en un mecanismo de regulación que tiene una importancia capital en enfermedades como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida o muchos tipos de leucemias. / Ets-1 and USF1 are transcription factors involved in many key processes in development and differentiation. Defects in their regulation have been associated with pathological disorders and viral infections. Furthermore, Ets-1 is a paradigm of a regulation mechanism in transcriptional control whereupon its DNA-binding activity and, thereby, its transactivation properties, are constitutively silenced (autoinhibition). Derepression of Ets-1 can be achieved by protein-protein interactions, which unmask Ets-1's DNA binding domain and lead to the formation of a high affinity ternary complex onto DNA between Ets-1, the partner protein and the combined site for both transcription factors.In this work, we undertook the structural elucidation of the autoinhibitory mechanism of Ets-1. We started off by cloning, expressing and purifying Ets-1 and the partner proteins USF1 and MafB. As new challenges were met in this part of the project, we devised methods and approaches directed towards the efficient production of DNA-binding proteins for structural biology. A key concept turn out to be the necessity to provide proteins with an environment closest to their biological contexts in order to stabilise them. For example, Ets-1 stabilisation could not be attained until a pre-formed USF1/DNA complex was added to it, resembling the in vivo situation, where USF1, bound to their composite binding site, recruits Ets-1 onto DNA.We successfully produced a number of Ets-1/USF1/DNA ternary complexes and have partially screened the vast space of crystallisation conditions. Crystals have been obtained, and they have been proved to contain both protein partners plus DNA. Refinement of these preliminary crystallisation conditions will ultimately render crystals of sufficient quality for diffraction experiments. We are excited about the possibilities open up by these crystal for deeper insight into a not well understood regulatory mechanism, but which underlies such important diseases as the human immunodeficiency syndrome and many different types of leukaemia.
|
263 |
Estudi de la presenilina 1 com a inhibidor de l'activitat transcripcional de la ß (beta)-cateninaRaurell Saborit, Imma 30 May 2007 (has links)
La malaltia de l'Alzheimer és la patologia de demència senil més comú en el món occidental. Mutacions en el gen de la presenilina 1 són responsables de l'aparició d'un tipus d'Alzheimer heretable, caracteritzat per aparèixer en persones d'edats joves. La presenilina 1 (PS1), que s'expressa sobretot en neurones però també en baixos nivells en altres teixits estudiats, és una proteïna integral de membrana que és ràpidament endoproteolitzada generant un fragment amino i un altre de carboxiterminal. La PS1 és la subunitat catalítica del complex (gamma)-secretasa. L'activitat (gamma)-secretasa consisteix en processar proteïnes transmembrana tipus I, com la proteïna precursora (beta)-amiloide o el receptor Notch, pel seu domini transmembrana. Com a conseqüència de l'activitat (gamma)-secretasa sobre les proteïnes de tipus I es generen uns fragments corresponents als dominis intracel·lulars d'aquestes proteïnes. També s'ha descrit que la PS1 és un modulador negatiu de l'activitat transcripcional mediada pel complex Tcf-4·(beta)-catenina.L'efecte inhibidor de la PS1 correctament processada sobre l'activitat transcripcional del complex Tcf-4·(beta)-catenina és depenent de l'activitat (gamma)-secretasa. Aquesta inhibició és deguda a la generació d'un fragment que correspon al domini intracel·lular de l'E-cadherina. Aquest fragment es genera per acció de l'activitat (gamma)-secretasa de la PS1 sobre l'E-cadherina. El fragment citosòlic de l'E-cadherina interacciona amb la (beta)-catenina, però no impedeix que aquesta última proteïna pugui translocar al nucli, ni tampoc modifica la interacció entre la (beta)-catenina i el factor transcripcional Tcf-4. Els nostres resultats suggereixen que el mecanisme inhibidor podria ser degut a un augment de la degradació del factor transcripcional CBP, promogut pel fragment citosòlic de l'E-cadherina. Mutacions específiques en el gen de la PS1, presents en alguns casos de l'Alzheimer familiar precoç, impedeixen un correcte processament de la PS1. L'efecte inhibidor de la forma no processada de la PS1 sobre l'activitat del complex Tcf-4·(beta)-catenina, és diferent a l'efecte produït per la forma processada de la PS1. En aquest cas, la inhibició de l'activitat transcripcional és independent tant de l'activitat (gamma)-secretasa com de la interacció directe amb la (beta)-catenina. La PS1 no processada interacciona amb la placoglobina amb una afinitat similar a la (beta)-catenina, però la interacció no està mediada pels mateixos residus en les dues catenines. A més, la PS1 no processada quan està associada a la placoglobina, augmenta la interacció entre aquesta proteïna i el Tcf-4 impedint que aquest factor transcripcional s'uneixi al DNA. Com a conseqüència hi ha una repressió de l'activitat transcripcional mediada pel complex Tcf-4·(beta)-catenina. / Alzheimer's disease is the most neurodegenerative pathology in Western countries. Presenilin 1 gene mutations are responsible for most cases of early-onset familial Alzheimer's disease. Presenilin 1 product is a transmembrane protein which is processed and detected in many adult tissues, not only in brain. Presenilin 1 (PS1) is a negative modulator of Tcf-4·(beta)-catenin activity. However, the mechanism underlying this effect is not well understood.We show that the effects of processed PS1 on the activity of this complex are dependent of its (gamma)-secretase activity. This repression of unprocessed PS1 is due the cytosolic domain of E-cadherin generated by the PS1 dependent (gamma)-secretase activity. The cytosolic domain of E-cadherin interacts with ?-catenin, but does not avoid that (beta)-catenin translocate to the nucleus and also, not modified the interaction between (beta)-catenin and Tcf-4. The inhibitory effect is due to promote degradation of the transcription factor CBP.One PS1 mutation associated with familial Alzheimer's disease does not processed PS1. We show that the effects of unprocessed PS1 of Tcf-4·(beta)-catenin dependent transcription its different than processed PS1. The effect of unprocessed PS1 on the transcriptional activity is independent of its (gamma)-secretase activity and its interaction with (beta)-catenin. Unprocessed PS1 also binds plakoglobina with similar affinity as (beta)-catenin, although this interaction does not involve equivalent residues in the two catenins. Moreover, unprocessed PS1 association with plakoglobina enhances the interaction of this molecule with Tcf-4 and prevents its binding to DNA.These results provide a new explanation for the effects of processed and unprocessed PS1 on gene transcription mediated by (beta)-catenin.
|
264 |
β-catenina, una proteïna amb diverses funcions en l'acoblament de factors transcripcionals i factors d'unions adherentsSolanas Fuste, Guiomar 03 March 2008 (has links)
La β-catenina és una proteïna acobladora de factors transcripcionals i també de factors involucrats en la formació de les unions adherents en cèl·lules epitelials. En la primera part del treball es presenta un estudi de β-catenina i placoglobina,en el que s'ha caracteritzat la interacció d'aquestes proteïnes amb els seus cofactors. La β-catenina i la placoglobina estan composades per dos extrems N-i C-terminals i un domini central de repeticions armadillo, per on interaccionen amb la majoria de cofactors. De la mateixa manera com passa amb la β-catenina, els extrems de placoglobina també interaccionen amb el domini armadillo i regulen la capacitat de la placoglobina per unir-se als diferents factors. A més, els extrems terminals, i no el domini armadillo, són els que confereixen l'especificitat d'interacció a la β-catenina i a la placoglobina amb els seus cofactors. En la segona part de la tesi s'ha aprofundit en la interrelació entre dues vies de senyalització, la de β-catenina i la ruta de NF-κB. S'havia descrit una regulació negativa de β-catenina sobre l'activitat transcripcional del factor NF-κB. Per primera vegada s'ha detectat la formació de complexes de NF-κB amb E-cadherina i amb altres components implicats en adhesió cel·lular, amb una colocalització d'aquests factors en la membrana plasmàtica de la cèl·lula. De manera similar a com passa amb β-catenina, l'activitat transcripcional de NF-κB també estaria regulada per E-cadherina, evitant així la transcripció de gens mesenquimals. / β-catenin is a coupling protein for transcription factors and proteins involved in adherent junctions formation in epithelial cells. In the first chapter a study of β-catenin and plakoglobin is presented. The interaction of these two proteins with their cofactors has been characterized. βcatenin and plakoglobin are composed of two N-and C-terminal tails and an armadillo-like repeat containing central domain, surface that interacts with most of the cofactors. As it has been described for β-catenin, plakoglobin terminal tails interact with the armadillo domain and regulate the binding with different factors. Moreover, the terminal tails, and not the armadillo domain, are the domains responsible for determining β-catenin and plakoglobin specificity of interaction with their cofactors. In the second chapter of this thesis the crosstalk between β-catenin and NF-κB signaling pathways has been studied in deep. For the first time the complexes formed by NF-κB and E-cadherin, among other intercellular adhesion molecules, have been detected. These complexes were localized at the cellular membrane. As it has been described for β-catenin, NF-κB transcriptional activity is controlled by E-cadherin, avoiding the expression of mesenchymal genes.
|
265 |
Propietats aterogèniques de l'LDL electronegativa: inducció de l'expressió de citoquines, activitats enzimàtiques associades i unió a proteoglicansBancells Bau, Cristina 01 April 2009 (has links)
L'LDL electronegativa (LDL(-)) és una fracció modificada d'LDL present a la circulació. Hi ha varies evidències que suggereixen el seu paper aterogènic ja que es troba augmentada en patologies d'alt risc cardiovascular, com en la hipercolesterolèmia familiar o en la diabetis mellitus. A més, presenta propietats inflamatòries, una major susceptibilitat a l'agregació i afinitat disminuïda pel receptor d'LDL. En la present tesi s'han estudiat algunes propietats aterogèniques d'aquesta partícula modificada, en concret s'han avaluat els següents aspectes:1) Propietats inflamatòries. L'LDL(-) va induir una major expressió de citoquines (IL-6), quimioquines (IL-8, MCP-1 i GRO) i factors de creixement (GM-CSF) en cèl·lules endotelials de vena i d'artèria, i monòcits i limfòcits. La resposta de les cèl·lules endotelials arterials va ser major a nivell de producció total de citoquines i, a més, també van alliberar PDGF-B. No obstant, els monòcits i limfòcits, en resposta a l'LDL(-) també van expressar la citoquina anti-inflamatòria IL-10 la qual va disminuir la secreció de les altres citoquines pro-inflamatòries, modulant la resposta inflamatòria.2) Activitat fosfolipolítica tipus fosfolipasa C associada. S'han descrit noves activitats enzimàtiques presents en l'LDL(-) que degraden eficientment fosfolípids amb colina. S'ha relacionat aquesta activitat fosfolipolítica amb la major susceptibilitat a l'agregació de l'LDL(-). Es desconeix l'origen d'aquesta activitat enzimàtica, tot i que s'ha descartat que sigui deguda al contingut augmentat en apoE, apoC-III o PAF-AH, i s'ha suggerit que en podria ser responsable una proteïna encara no identificada o la pròpia apoB-100.3) Unió a proteoglicans de la matriu extracel·lular. Una subfracció de partícules d'LDL(-) van presentar una major unió a proteoglicans aïllats d'artèria humana. Aquesta subfracció de partícules estaven més agregades i tenien una elevada activitat fosfolipolítica. Fets que es van relacionar i, en conseqüència, es va hipotetitzar que la major activitat fosfolipolítica podria provocar l'agregació de les partícules i, al mateix temps, que aquestes s'unissin amb major afinitat als proteoglicans.En conclusió, l'LDL(-) sembla una partícula potencialment aterogènica degut a que té la capacitat d'induir l'alliberament de molècules inflamatòries en diferents tipus cel·lulars, i presenta una major agregació i afinitat pels proteoglicans, fent-la propensa a la retenció subendotelial. / Electronegative LDL (LDL(-)) is a modified fraction of LDL present in circulation. Growing evidence suggests an atherogenic role. LDL(-) proportion is increased in diseases with high cardiovascular risk, as familial hypercholesterolemia or diabetes mellitus. Furthermore, it presents inflammatory properties, high susceptibility to aggregation and decreased LDL receptor affinity. In the current thesis some atherogenic properties of this modified particle have been studied, specifically, the following points have been evaluated:1) Inflammatory properties. LDL(-) induced increased expression of cytokines (IL-6), chemokines (IL-8, MCP-1 and GRO) and grown factors (GM-CSF) on venous and arterial endothelial cells, monocytes and lymphocytes. Arterial endothelial cells produced a high amount of cytokines and, moreover, they also stimulated PDGF-B. On the other hand, monocytes and lymphocytes also expressed the anti-inflammatory cytokine IL-10, who decreased the secretion of the other pro-inflammatory cytokines, thereby counteracting the inflammatory response.2) Phospholipase C-like phospholipolytic activity associated to LDL(-). Novel enzymatic activities present on LDL(-) that hydrolyze choline-containing phospholipids have been described. These activities have been involved in increased susceptibility to aggregation. A role for apoE, apoC-III and PAF-AH has been ruled out and our results suggest that apoB-100 could be involved. However, the exact origin remains unknown.3) Binding to proteoglycans from the extracellular matrix. A subfraction of LDL(-) presented increased binding to proteoglycans isolated from human artery. This subfraction has increased aggregation and phospholipolytic activity. Both properties are related, suggesting that phospholipolytic activity promotes aggregation and favours binding to proteoglycans.In summary, LDL(-) is a potentially atherogenic particle since promotes inflammatory molecules release in several cell types and its increased aggregation and binding to proteoglycans suggests increased subendothelial retention.
|
266 |
p120-catenina: un element essencial de la ruta de senyalització de WntCasagolda Vallribera, David 16 December 2009 (has links)
L'E-cadherina és una proteïna transmembrana que constitueix el nucli de les unions adherents, aquesta uneix proteïnes idèntiques en cèl·lules epitelials veïnes. La funció de l'E-cadherina és controlada per una altra família de proteïnes anomenades catenines. Dins d'aquesta família, β-catenina és necessària pel reclutament del citoesquelet d'actina. A part de ser un component estructural de les unions adherents, β-catenina és un element central de la ruta de senyalització de Wnt. Quan s'allibera de les unions adherents, β-catenina es transloca al nucli on interacciona amb factors de transcripció de la família Tcf i regula l'expressió de diferents gens. Aquesta translocació al nucli de β-catenina és estimulada pels lligands Wnt, que prevenen la degradació citoplasmàtica de β-catenina. La ruta de Wnt té diferents papers en el desenvolupament embrionari així com també en malalties humanes tals com el càncer.Una altra proteïna associada a l'E-cadherina és la p120-catenina. Aquesta catenina uneix el domini citoplasmàtic d'E-cadherina en una regió diferent de β-catenina i és necessària per a l'estabilització d'E-cadherina a la membrana plasmàtica. A més, p120-catenina està també involucrada en la regulació de la transcripció. Aquesta catenina interacciona amb el repressor transcripcional Kaiso i allibera la repressió causada per Kaiso en gens diana de Wnt. Tot i que la modificació de varis residus tirosina, serina i treonina han estat descrits en p120-catenina, només en uns pocs casos es coneix la rellevància d'aquestes modificacions en la interacció de p120-catenina amb diferents cofactors.En aquest treball es descriu com CK1ε es troba constitutivament unida i fosforila a p120-catenina. CK1ε fosforila les serines 268 i 269 de p120-catenina, disminuint-ne l'afinitat per E-cadherina. Aquesta fosforilació de CK1ε en el residu Ser268 de p120-catenina s'estimula pels lligands de Wnt. Aquest estudi també mostra com p120-catenina esta involucrada en la formació del signalosoma de Wnt, degut a que aquesta proteïna interacciona amb LRP5/6 i és necessària per a l'activació de CK1ε induïda per Wnt. Aquesta interacció està mitjançada per E-cadherina, establint-se així una unió física inesperada entre les unions adherents i el receptor de Wnt. La depleció de p120-catenina impedeix la unió de CK1ε a LRP5/6 i disminueix l'activació d'aquesta quinasa en resposta a l'estimulació per Wnt. L'eliminació de p120-catenina també bloqueja les respostes primerenques de Wnt, tals com la fosforilació de Dvl-2, així com també l'estabilització de β-catenina.En aquest treball es descriu com aquesta modificació també incrementa l'associació de p120-ctn a Kaiso, impedint els efectes d'aquest repressor transcripcional en els seus gens diana. A més, la fosforilació de p120-catenina induïda per Wnt incrementa la unió a Kaiso, prevenint la interacció i inhibició de Kaiso sobre el factor de transcripció Tcf4. Tot i així, p120-catenina no modifica la unió de Kaiso al DNA metilat. L'efecte de la sobreexpressió de p120-catenina en la localització subcel·lular de Kaiso és depenent de la línia cel·lular; mentre que algunes línies responen amb l'export nuclear de Kaiso, en altres aquest export no es troba alterat. La localització de Kaiso al nucli és sensible als lligands Wnt en les cèl·lules que responen a p120-catenina; per exemple, en la línia cel·lular SW480 l'estímul de Wnt provoca una translocació gairebé completa de Kaiso al citoplasma; aquesta translocació és sensible a la depleció de p120-catenina o CK1ε. Aquests resultats indiquen que l'efecte repressor de Kaiso sobre el factor de transcripció Tcf4 és regulat per Wnt a través de la fosforilació de p120-catenina per CK1ε. Es mostra doncs un paper nou i crucial de p120-catenina en la senyalització de Wnt descobrint punts addicionals de regulació per aquest factor de l'activitat transcripcional de β-catenina diferents de l'estabilitat d'aquesta catenina. / The transmembrane protein E-cadherin constitutes the core of adherens junctions, through its interaction with identical proteins from neighbor cells. E-cadherin function is controlled by a family of proteins named catenins that bind to its cytosolic domain. Among these, β-catenin is required for recruiting the actin cytoskeleton. In addition to its function in cell adhesion, β-catenin is a central player in the Wnt pathway. When released from the junctional complex, β-catenin translocates to the nucleus, where it interacts with the Tcf-family of transcriptional factors and regulates the expression of a variety of genes. The translocation of β-catenin to the nucleus is stimulated by Wnt ligands that prevent the degradation of cytosolic β-catenin. The Wnt pathway plays diverse roles in embryonic development and is implicated in human diseases including cancer.Another E-cadherin-associated protein, p120-catenin, binds to a distinct site of the cytosolic E-cadherin domain than β-catenin and is necessary for the stabilization of E-cadherin in the cell membrane. Moreover, p120-catenin is also involved in the regulation of transcription. p120-catenin interacts with the transcriptional repressor Kaiso and relieves the repression caused by Kaiso on Wnt target genes. Although the modification of many different tyrosine, serine and threonine residues has been described, only in a few cases the relevance of these modifications in the interaction of p120-catenin with the different cofactors is known. We have described that CK1ε is constitutively bound and phosphorylates p120-catenin. CK1ε phosphorylates p120-catenin in serines 268 and 269, decreasing its affinity for E-cadherin. Phosphorylation of p120-catenin Ser268 by CK1ε is stimulated by Wnt ligands. We also show that p120-catenin is necessary for the formation of the Wnt signalosome since it interacts with LRP5/6 and is required for CK1ε activation by Wnt. This interaction is mediated by E-cadherin, showing an unexpected physical link between adherens junctions and the Wnt receptor. Depletion of p120-catenin abolishes CK1ε binding to LRP5/6 and greatly decreases CK1ε activation upon Wnt stimulation. Elimination of p120-catenin also prevents some early responses to Wnt, such as Dvl-2 phosphorylation, as well as β-catenin stabilization.We have also reported that this modification increases binding of p120-catenin to Kaiso, preventing part of the effects of this transcriptional repressor on target genes. Therefore, Wnt-induced phosphorylation of p120-catenin up-regulates its association with Kaiso, preventing Kaiso interaction and inhibition of Tcf-4 transcriptional factor. However, p120-catenin does not modify Kaiso binding to methylated DNA. The effect of p120-catenin over-expression on Kaiso subcellular localization is cell dependent and some cell lines respond with a Kaiso translocation to the cytosol, whereas others are not affected. Kaiso localization in the nucleus is sensitive to Wnt ligands in p120-catenin-responsive cells; for instance SW-480 cells respond to this stimulus with an almost complete translocation of this factor, sensitive to CK1ε or p120-catenin depletion. These results indicate that Kaiso repressive effect on Tcf-4 transcriptional factor is regulated by Wnt ligands through the phosphorylation of p120-catenin by CK1ε. Therefore, these results demonstrate a novel and crucial function of p120-catenin in Wnt signaling and unveil additional points of regulation by this factor of β-catenin transcriptional activity different of β-catenin stability.
|
267 |
Ribonucleotidil reductases bacterianes: estudi enzimàtic, genètic i evolutiuTorrents Serra, Eduard 20 July 2001 (has links)
Les Ribonucleotidil Reductases (RNR) són metal·loenzims que catalitzen la reducció dels ribonucleòtids (NTP) als seus corresponents desoxiribonucleòtids (dNTP), que són els monòmers principals per a la síntesi del DNA. S'han descrit tres classes de RNR (I, II i III) atenent la seva estructura, metall, radical i cofactors necessaris per a la síntesi del DNA.En aquest treball s'ha dut a terme l'estudi de diverses RNR bacterianes pertanyent a les tres classes d'RNR des del punt de vista enzimàtic, genètic i evolutiu.Les RNR de classe III (NrdDG) tant sols són actives en condicions d'anaerobiosis estricta, estudiant-se en Escherichia coli i Lactococcus lactis. En ambdós casos mutants pels gens nrdD i nrdG, resulten ser imprescindibles en condicions d'anaerobiosi estricta. La sobreexpressió i purificació de les proteïnes NrdDG de Ll ha posat de manifest que la reducció dels NTPs es du a terme en dos etapes, una primera produint-se l'activació de NrdD i una segona on es produeix la reducció del ribonucleòtid. Per primera vegada s'ha observat que la unió de l'ATP segueix una cinètica sigmoidal amb un alt grau de cooperativitat entre els dos llocs involucrats en la regulació al·lostèrica de l'enzim.Les RNR de classe II (NrdJ) s'han purificat i seqüenciat els seus gens en bacteris filogenèticament primitius com Thermotoga maritima i Deinococcus radiodurans presentant aquestes proteïnes, tots els aa relacionats en la regulació al·lostèrica i activitat catalítica. Podem hipotitzar que ha d'existir una gran relació estructural entre les proteïnes d'aquesta classe amb les de classe I. El gen nrdJ de Dr presenta una inteïna en l'extrem 5' que es processada durant la traducció del gen i absent en la proteïna madura.En els anys 80 es va caracteritzar parcialment la RNR de Corynebacterium ammoniagenes assignant-la a una nova classe (IV), ja que depenia la seva activitat de manganès. En aquest treball hem purificat i seqüenciat la RNR activa, classificant aquesta RNR la ja descrita classe Ib (nrdHIEF). L'anàlisi transcripcional d'aquesta regió demostra l'existència de dos promotors independents pels trànscrits nrdHIE i pel nrdF. Mitjançant RT-PCR semiquantitativa es va detectar la presència de 10 vegades més trànscrit nrdF que de nrdHIE. Aquests gens veuen incrementada la seva expressió en presència d'hidroxiurea, peròxid d'hidrogen y de manganès en el medi, involucrant d'aquesta manera un possible paper de reguladors transcripcionals que regulen el cicle cel·lular, FUR/DtxR y per reguladors que responen a l'estrès oxidatiu.Per primera vegada s'ha observat l'existència de les tres classes de RNR (I, II i III) en un mateix organisme com passa en Pseudomonas aeruginosa, detectant-se l'expressió simultània de les RNR de classe I i II.L'estudi filogenètic i evolutiu a partir d'un alineament de totes les seqüències proteiques disponibles en la base de dades revela que la RNR més ancestral és la classe III que per divergència evolutiva hauria donat lloc a la classe II i posteriorment a la classe I. / Deoxyribonucleotides (dNTP) are synthesized in all organisms from ribonucleotides (NTP), in a reaction catalyzed by the enzyme Ribonucleotide Reductase (RNR). There are three classes of RNR that differ in their protein structure. All operate via a free radical mechanism involving protein radicals but differ in the way in which the protein radical is generated. Class I enzymes require oxygen and are coded either by the nrdAB genes (class Ia) or nrdEF genes (class Ib). Class II enzymes are independent of oxygen and depend on adenosyl cobalamin (B12). Class III enzymes are poisoned by oxygen and are coded by the nrdD and nrdG genes.In the present work we studied diverse RNR classes from different bacterial species from the enzymatic, genetic and evolution point of view.We show that knock-out mutants of either nrdD and nrdG from E. coli and L.lactis were essential during anaerobic growth. The LL nrdD and nrdG were sequenced, cloned and overproduced in E. coli. NrdD and NrdG catalyze the reduction of NTP to the corresponding dNTP in the presence of SAM, a reducing system, potassium ions, DTT and formate. EPR experiments demonstrated a [4Fe-4S] cluster in NrdG and a glycyl radical in NrdD. Allosteric effectors bound to two separate sites on NrdD. The two sites showed an unusually high degree of cooperativity.RNR from the ancient eubacteria, Thermotoga maritima, Deinococcus radiodurans and Chloroflexus. aurantiacus were found to belong a class II enzyme. TM and DR genes were cloned by PCR using peptide sequence information. From the conservation of substrate- and effector-binding residues between class I and this class II sequences we propose that class II enzymes contain a similar 3D structure in the active site.We have purified the active RNR of Corynebacterium ammoniagenes, (CA) previously claimed to represent a fourth RNR class. Peptide and gene sequence analyses clearly indicate that the active RNR is a generic class Ib enzyme, with a diferric metal cofactor.Transcriptional analysis of this nrd region shows the presence of three different mRNA (nrdHIE, nrdF and the ORF). Presence of manganese in the medium stimulate the transcription of both nrdHIE and nrdF genes through a DtxR-like system. Furthermore, oxidative stress and hidroxiurea induce the expression of these genes. Surprisingly, the genomic sequence of Pseudomonas aeruginosa (PA) contains sequences for each of the three classes. Extracts from PA grown aerobically or microaerobically contain active class I and II enzymes simultaneously. The occurrence of the different classes among species of the g-Proteobacteria. Class III are present in all species tested, but the presence of the other classes varies. Phyllogenetic analyse of all known RNR sequences support the hypothesis that the three RNR classes diverged from a common ancestor currently represented by the anaerobic class III.
|
268 |
Caracterización de la reacción citoquímica de Mycobacterium tuberculosis con rojo neutro. Correlación con el contenido de sulfolípidoSoto Ospina, Carlos Yesid 21 January 2003 (has links)
CARACTERIZACIÓN DE LA REACCIÓN CITOQUÍMICA DE Mycobacterium tuberculosis CON ROJO NEUTRO. CORRELACIÓN CON EL CONTENIDO DE SULFOLÍPIDOLa virulencia de M. tuberculosis se ha relacionado con diversas características fenotípicas y entre las menos exploradas se encuentran las reacciones citoquímicas con diferentes colorantes básicos. Los estudios más prometedores en este campo han sido los que describen la tinción de las cepas virulentas de M. tuberculosis con rojo neutro (RN). El principal objetivo de este trabajo ha sido evaluar el papel desempeñado por los glicolípidos de pared, especialmente sulfolípidos (SL), en la tinción de las cepas virulentas de M. tuberculosis con RN. Además, se planteó conocer la región genómica de la cepa virulenta H37Rv implicada en la fijación de RN (RN+).Se compararon los perfiles glicolipídicos de la superficie de cepas RN+ y RN- de M. tuberculosis mediante cromatografía en columna de intercambio iónico (DEAE) y de capa fina (CCF). También se purificaron diferentes fracciones glicolípidicas de la superficie y se analizó su capacidad de fijar RN (NRA). No se encontró una relación directa entre el contenido de SL, PL y PIM, y el carácter RN+ de M. tuberculosis. Simultáneamente se buscaron las condiciones óptimas para la tinción de micobacterias con RN en tubo de ensayo, y se desarrolló un método para fijar colonias de micobacteria en placas de agar Middlebrook 7H10-OADC modificado. Una combinación de los dos anteriores permitió desarrollar una técnica para la tinción con RN de colonias de micobacteria en placa de cultivo. Adicionalmente se desarrolló un método para la detección rápida de SL en cepas de M. tuberculosis por medio de cromatografía en capa fina de dos dimensiones (CCF-2D), y otro para diferenciar M. tuberculosis H37Ra, de H37Rv y aislados clínicos mediante tinción citoquímica.Por otra parte se construyó una genoteca M. tuberculosis H37Rv en el cósmido "shuttle" pYUB18, la que se transformó en la cepa RN- Mycobacterium smegmatis mc2155 y se cribó mediante tinción con RN en placas de cultivo. Se identificaron tres colonias RN+ de M. smegmatis mc2155, a partir de las cuales se dedujo mediante secuencia nucleotídica, complementación de M. smegmatis mc2155 y análisis de restricción, que la región del genoma de M. tuberculosis H37Rv comprendida entre los marcos abiertos de lectura Rv0570 a Rv0577 estarían posiblemente implicados en el carácter RN+ de las cepas de M. smegmatis mc2155 que fijaron RN. / The M. tuberculosis virulence has been correlated with different phenotypic markers, being the cytochemical reactions with basic dyes the less explored. In this field, the most promising studies have been the staining of M. tuberculosis virulent strains with neutral red (RN).The main objective of this work has been to study the role of cell-surface glycolipids, mainly sulfolipids (SL) in the staining of the virulent strains of M. tuberculosis with NR. Additionally, the genomic region possibly involved in the RN+ phenotype of M. tuberculosis H37Rv was searched.The glycolipidic cell-surface profiles of M. tuberculosis strains that fix or not RN (RN+, or RN-) were compared through ionic interchange column chromatography (DEAE) and thin layer chromatography (CCF). Also, different cell-surface glycolipidic fractions were purified, and their ability for NR fixation (NRA) was analyzed. No direct correlation between the RN+ phenotype and the SL, phospholipids and phosphatidilinositolmannosides (PIM) content were found.The best conditions for NR staining of M. tuberculosis cells in screw-cap tubes were optimized. At the same time a method for fixation of mycobacterial colonies in Middlebrook 7H10-OADC modified agar was developed. These results allowed the design a technique for NR staining of colonies growth in agar plates. In addition, a method for rapid detection of SL in M. tuberculosis strains by two-dimensional thin layer chromatography (CCF-2D), and other for the differentiation between M. tuberculosis H37Ra from H37Rv and clinical isolates, were developed.By the other hand, a library of M. tuberculosis H37Rv was constructed in the "shuttle" cosmid pYUB18 and transformed in the (RN-) Mycobacterium smegmatis mc2155 strain. Three RN+ colonies of M. smegmatis mc2155 (pYUB18::H37Rv) were found by NR staining. Using DNA sequence, complementation of M. smegmatis mc2155, and enzyme restriction analysis, that the M. tuberculosis H37Rv genomic region within the open reading frames Rv0570 to Rv0577 could be possibly involved in the RN+ phenotype of the M. smegmatis mc2155 (pYUB18::H37Rv) that fixed NR.
|
269 |
Proteïnes petites i riques en ponts disulfur com a models de producció recombinant i plegamentBronsoms i Fabrellas, Sílvia 30 August 2002 (has links)
El PCI, la hirudina i el LCI formen part de la família de proteïnes petites i riques en ponts disulfur, que conté un gran nombre de biopèptids amb potencials aplicacions biotecnològiques, com són els factors de creixement, les toxines, els inhibidors de proteases o desintegrines.A causa de la presència dels ponts disulfur l'expressió recombinant d'aquestes proteïnes és complexa. En el primer treball de la tesi s'estudien tres sistemes de producció recombinant: un sistema eucariota (Pichia pastoris) i dos sistemes procariotes (Escherichia coli). S'optimitzen diversos paràmetres per tal de millorar el seu nivell de producció i es busquen sistemes que permetin simplificar el seu procés de purificació. S'aconsegueix desenvolupar un sistema en E.coli amb una producció final de proteïna que és 10 cops superior al sistema de partida.En el segon treball s'analitza el paper de les regions precursores del PCI en el plegament de la forma madura. S'analitza el procés de replegament oxidatiu in vitro de les diverses pro-formes del PCI per tal de caracteritzar la seva influència sobre la velocitat o la eficiència del plegament de la forma madura. També s'estudia la influència de la pro-regió N-terminal sobre el procés de plegament in vivo en E.coli del PCI madur i d'una sèrie de mutants que presenten un mal plegament o un baix nivell d'expressió recombinant. Finalment es duu a terme una caracterització estructural de la forma corresponent al PCI amb la pro-regió N-terminal a través d'estudis de bescanvi protó/deuteri, exoproteòlisi limitada, espectroscopia de dicroïsme circular i ressonància magnètica nuclear.En l'últim treball s'analitza el procés de plegament proteic de la hirudina i del LCI a través de l'estudi de les reaccions de bescanvi protó/deuteri seguides per espectrometria de masses MALDI-TOF. Es caracteritza l'adquisició d'estabilitat conformacional al llarg del procés de plegament de les dues proteïnes. S'aïllen una sèrie d'intermediaris de plegament i es determina la seva estabilitat; la qual cosa ens permet estudiar les diferències existents entre les vies de plegament de les dues proteïnes. Finalment s'estima la contribució de les interaccions covalents i no-covalents en l'estabilitat final de la proteïna nativa. / PCI, hirudin and LCI belong to the familly of small disulfide-rich proteins, which also contains other biologically important biopeptides like growth factors, desintegrins, toxins or protease inhibitors.These proteins cannot be usually produced at high levels by recombinant DNA approaches due to the presence of the disulfide bridges. To deal with this, we selected three different systems for heterologous expression: one based in external secretion by the yeast Pichia pastoris and two others based in the periplasmic secretion in Escherichia coli, using powerful promoters in all cases. Several parameters were optimized to improve PCI production and to simplify the purification protocol. Finally, a new method was developed, which lead to a final PCI production 10-fold higher than the previously described system. In the second work of the thesis, the role of the PCI pro-regions on the mature peptide folding was analyzed. The in vitro oxidative refolding of mature PCI was compared with that of the pro-forms to characterize their influence on mature PCI folding rates and folding efficiency, using RP-HPLC to analyze the acid-trapped disulfide intermediates collected during the refolding process. The influence of the N-terminal pro-region on the expression or folding of several PCI variants reported to give a low expression yield or a low folding efficiency in vivo in E.coli was also studied. In addition, the presence of ordered structural elements in the N-terminal extension of PCI was investigated by deuteron to proton exchange, limited exoproteolysis, circular dicroism spectroscopy and nuclear magnetic ressonance. In the last work, the folding process of hirudin and LCI was analyzed by deuteron to proton exchange monitored by MALDI-TOF mass spectrometry. The comparison of the number of slow exchanging protons of different samples along the folding pathway provided an easy and fast way to follow the protein folding process. Additionally, the deuteron to proton exchange experiments on purified folding intermediates allowed us to characterize the differences between the two folding pathways and to measure the contribution of the disulfide bonds versus the non-covalent forces to the stability of the native protein.
|
270 |
Ingeniería de anticuerpos aplicada al desarrollo y caracterización de biosensores enzimáticosAlcalá Morales, Pilar Lucía 28 February 2003 (has links)
Una de las aplicaciones de la ingeniería de proteínas es el desarrollo de biosensores moleculares como herramientas para la detección de sustancias mediante la interacción de una macromolécula y su ligando. De acuerdo a este principio se han generado una serie de prototipos de biosensores enzimáticos que han surgido a partir de la ingeniería de proteínas tales como la fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, b-lactamasa y la proteína TSP del bacteriófago P22. En todas estas enzimas modificadas se han insertado péptidos inmunoreactivos que actúan como sondas, en aquellos sitios permisivos de las superficies expuestas al solvente de cada enzima. La unión con anticuerpos anti-péptido da como resultado un aumento o una disminución en la actividad enzimática en una forma dependiente del título, lo que a su vez constituye un método simple para la detección y cuantificación de especies moleculares dentro de una mezcla compleja.Hasta el momento los únicos activadores descritos de los biosensores basados en enzimas son los anticuerpos y aún se desconoce el mecanismo por el cual se produce esta regulación enzimática. El principal objetivo de este trabajo ha sido determinar el tipo de interacciones moleculares que son necesarias para que se lleve a cabo la modulación de la actividad b-galactosidasa. Especialmente, se pretendía evaluar la necesidad de una unión bivalente para la reactivación y explorar la adaptación de los biosensores b-galactosidasa a la detección de ligandos monovalentes, como antígenos.Se evaluó la interacción molecular entre un péptido RGD recombinante del virus de la fiebre aftosa, expuesto en la superficie de una proteína portadora y sus receptores en la superficie celular. Como ligandos se utilizaron las integrinas avb3 y a5b1 solubles, así como células BHK21. Los resultados indicaron que ni las integrinas solubles ni aquellas expuestas en las células son capaces de modificar la actividad de sensores enzimáticos que por el contrario son activados por la unión de anticuerpos dirigidos contra el motivo RGD. Adicionalmente, se realizaron otros ensayos para determinar el impacto que podía tener la presentación múltiple de péptidos sobre la eficiencia de la unión a células. En este caso se observó que aumentando el número de segmentos virales mejoraba la unión de las proteínas recombinantes a las células.Se llevó a cabo el clonaje y producción en Escherichia coli de un fragmento scFv recombinante del anticuerpo monoclonal SD6, dirigido contra un péptido vírico antigénico, expuesto en un modelo de biosensor basado en la enzima b-galactosidasa. Los resultados indicaron que la unión del scFv no causaba ninguna respuesta enzimática mientras que la presencia simultánea del scFv y del fragmento Fab del SD6 daba como resultado una respuesta eficiente pero no aditiva del sensor, cuya actividad enzimática aumentaba hasta en un 200%. Este efecto cooperativo que también se pudo observar cuando se combinaban el scFv y el fragmento Fab de un anticuerpo no homólogo denominado 4C4, nos permitió postular que la reactivación enzimática requiere contactos múltiples y probablemente heterogéneos entre el sensor molecular y los analitos, y que no es necesaria la interacción con ligandos moleculares bivalentes para que se produzca dicha modulación de actividad.Por último, se evaluaron diferentes sitios tolerantes de la enzima b-galactosidasa para generar enzimas híbridas funcionales que presentaran el fragmento recombinante scFv del anticuerpo monoclonal SD6. La caracterización de las proteínas híbridas obtenidas indicó que al fusionar dicho fragmento al extremo amino-terminal de la enzima, la proteína era estable, mantenía su actividad específica e interactuaba con el antígeno hacia el cual estaba dirigido el fragmento de anticuerpo fusionado. Además la quimera scFv-enzima era activa aún cuando se encontraba unida al antígeno y por lo tanto, se demostró su utilidad como reactivo en ELISA. / One of the applications of protein engineering is the development of molecular biosensors as tools for the detection of substances by means of the interaction between a macromolecule and its ligand. According to this principle, a series of prototypes of enzymatic biosensors have been generated through the engineering of proteins such as alkaline phosphatase, b-galactosidase, b-lactamase and TSP protein from P22 bacteriophage. In all these modified enzymes, immunoreactive peptides acting as probes have been inserted in those permissive sites of solvent-exposed surfaces of each enzyme. Binding with anti-peptide antibodies gives rise to an increase or a decrease in the enzymatic activity in a titre dependent way, what in turn constitutes a simple method for the detection and quantification of molecular species within a complex mixture. Until now, antibodies are the only described activators of enzyme based biosensors and the mechanism by which this enzymatic regulation takes place is still unknown. The main objective of this work was to determine the type of molecular interactions necessary for the up-regulation of b-galactosidase activity. Specially, it was sought to evaluate the need of a bivalent union for activity modulation and to explore the adaptation of b-galactosidase biosensors to the detection of monovalent ligands, as antigens. The molecular interaction between a recombinant RGD peptide from foot-and-mouth disease virus displayed on the surface of a carrier protein and its receptors on the cell surface was evaluated. Soluble integrins avb3 and a5b1, as well as BHK21 cells were used. The results indicated that both soluble integrins and cell linked ones were not able to modify the activity of enzymatic sensors that on the contrary are activated by binding of antibodies directed against the RGD motif. Additionally, other assays were carried out to determine the impact that multiple peptide presentation could have on cell-binding efficiency. In this case it was observed that increasing the number of viral segments cell binding to recombinant proteins was improved.Cloning and production in Escherichia coli of a recombinant SD6 scFv fragment directed against a sensing peptide, displayed on a model b-galactosidase-based biosensor was carried out. The results indicated that scFv-binding did not cause any enzymatic response while the simultaneous presence of scFv and the SD6 Fab fragment results in a non-additive, efficient sensor response, enhancing the enzyme activity up to about 200%. This cooperative effect, which also could be observed by combining SD6 scFv and the non-homologous anti-peptide 4C4 Fab fragment, allowed us to postulate that enzyme up-regulation requires multiple and probably heterogeneous contacts between the sensor molecule and the analytes, and that interaction with bivalent molecular ligands is not necessary for activity modulation to take place. Lastly, different permissive sites in b-galactosidase enzyme were evaluated to generate functional hybrid enzymes displaying the SD6 scFv antibody fragment. Characterization of the resultant hybrid proteins indicated that when fusing this fragment to the amino terminus of the enzyme, the protein was stable, it maintained its specific activity and interacted with the target antigen against which the fused antibody fragment was directed. The scFv-enzyme chimera was enzymatically active while bound to the antigen and therefore, it was demonstrated its possible application as single-molecule reagent in ELISA.
|
Page generated in 0.0742 seconds