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CREB-dependent transcription in astrocytes: signalling pathways, gene profiles and neuroprotective role in brain injuryPardo Fernández, Luis 16 November 2015 (has links)
El estudio de los astrocitos se ha vuelto muy relevante en el ámbito de las neurociencias desde el descubrimiento, a principios de los años 90, de que aquellas “células de soporte” podían responder a la actividad sináptica. Actualmente, está aceptado que los astrocitos poseen la capacidad de modular la transmisión sináptica a través de la liberación de moléculas que actúan tanto en el terminal pre-sináptico como en el post-sináptico, los llamados gliotransmisores. Sin embargo, todavía quedan muchas cuestiones por resolver sobre el papel que juega esta población de células gliales en la fisiología cerebral.
En el presente trabajo, hemos estudiado un campo ampliamente explorado en neuronas pero poco conocido en astrocitos: la transcripción dependiente de CREB. Este factor de transcripción expresado en todos los tipos celulares integra respuestas de todo tipo de estímulos y, por tanto, regula numerosos procesos tanto fisiológicos como patológicos. En neuronas, CREB es un factor clave en los mecanismos de plasticidad sináptica, que son la base para la adquisición de nuevas memorias, y también participa en los procesos neuroprotectores desencadenados por numerosas patologías cerebrales. Dado que los astrocitos participan tanto en procesos de regulación de la actividad sináptica como en neuroprotección, nuestro estudio pretende determinar en qué medida estas funciones están reguladas por CREB. Para ello hemos caracterizado, en cultivos primarios de astrocitos, los mecanismos moleculares de la activación de CREB tras la estimulación con los transmisores ATP y NE, y hemos estudiado los programas genéticos inducidos por la activación de CREB a través de diferentes vías de señalización. Finalmente, hemos determinado el papel protector del CREB astrocitario en un modelo murino de daño cerebral agudo.
Los principales hallazgos de esta tesis son: (i) una nueva vía de señalización que activa CREB en astrocitos, (ii) la asociación de los programas transcripcionales de CREB con el metabolismo oxidativo, la homeostasis y la comunicación celular, (iii) el papel neuroprotector del CREB astrocitario en un modelo de daño cerebral a través de un incremento de la supervivencia neuronal y regeneración axonal, un descenso de la inflamación y un rescate energético a través de la estimulación de vías metabólicas mitocondriales. / The study of astrocytes has become highly relevant in the realm of neurosciences since the discovery in the early 90’s that those “supportive cells” can respond to synaptic activity. Nowadays, it is accepted that astrocytes have the ability to modulate synaptic transmission through the release of molecules that act at both pre-synaptic and post-synaptic sites, the so-called gliotransmitters. However, there are still many questions to be solved about the role of this glial cell population in brain physiology.
In the present work, we studied a field that has been largely explored in neurons, but that is poorly known in astrocytes: the CREB-dependent transcription. This widely-expressed transcription factor integrates the cellular responses of multiple stimuli, thus regulating numerous physiological and pathological functions. In neurons, CREB is a key player in the mechanisms that underlie synaptic plasticity, which is the molecular basis of memory acquisition, and it is involved in neuroprotective processes triggered by several brain disorders. Given the fact that astrocytes also play a role in synaptic activity and neuroprotection, we ought to know whether those functions are regulated by astrocytic CREB. Thus, we studied the molecular mechanisms of CREB activation in cell cultures upon stimulation with the transmitters ATP and NE and characterized the transcriptional programs triggered by CREB activation through different signalling pathways. Finally, we determine the protective roles of astrocytic CREB in a mouse model of traumatic brain injury.
The main findings of this thesis are: (i) a novel signalling pathway for CREB activation in astrocytes, (ii) the functional association of CREB-dependent transcriptional programs with oxidative metabolism, homeostasis and intercellular communication, and (iii) the neuroprotective roles of astrocytic CREB in a model of traumatic brain injury, through an increase in neuronal survival and axonal regeneration, a decrease in inflammation and a rescue of bioenergetic failure by increasing the mitochondrial metabolic pathways.
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Perturbations in the human gut microbiome with antibiotic therapy and intestinal disordersPanda, Suchita 20 November 2015 (has links)
La microbiota intestinal es un factor determinante de la homeostasis intestinal, siendo por lo tanto un agente imprescindible del estado de salud. Su composición podría estar alterada como consecuencia de factores externos tales como tratamientos con antibióticos o causada por enfermedades intestinales como el síndrome del intestino irritable (SII). Esta tesis doctoral se centró en la comprensión de la alteración de esta ecología microbiana con respecto a una terapia con antibióticos y la presencia de movimientos intestinales modificados en personas que sufren de síndrome de intestino irritable. Nuestros resultados mostraron que la baja diversidad surgida después del tratamiento con antibióticos fue asociada, inesperadamente, con un aumento de la carga bacteriana total. Sin embargo, sujetos afectados con SII, particularmente del subtipo diarreico, tenían menor diversidad bacteriana acompañada de una reducción de las bacterias productoras de butirato y de las productoras de metano comparado con sujetos sanos. En general los hallazgos de este estudio son que una administración incontrolada de antibióticos puede causar cambios severos en la composición de la comunidad bacteriana intestinal, favorecer el sobrecrecimiento de microbios resistentes y esta observación puede explicar que las alteraciones microbianas en etapas iniciales de la vida podrían llegar a desarrollar enfermedades intestinales. / The intestinal microbiota is a key determinant of gut homeostasis, thereby being an imperative agent of health status. Its composition could be altered as a consequence of external factors such as antibiotic treatment or as a possible cause of intestinal disorders such as irritable bowel syndrome (IBS). In this doctoral thesis we focused on understanding to which extent antibiotic treatment could modify the gut microbiome and how an alteration of its composition could be associated with IBS. Our results showed that the lower diversity occurring after antibiotic treatment was unexpectedly associated with an increase of the overall microbial load. Furthermore, subjects suffering from IBS, particularly diarrhoea predominant subtype, had lower bacterial diversity accompanied by a reduced relative abundance of butyrate-producing and methanogenic microbes compared to healthy subjects. Altogether the findings of this study are that uncontrolled intake of antibiotics may cause tremendous changes in the gut microbial community composition, favouring the overgrowth of resistant microbes; and this observation may explain that alterations of the microbial composition earlier in life could lead to intestinal disorders.
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Caracterització de l’expressió de klotho en cervell durant l’envelliment. estudi dels efectes de la seva sobreexpressió / inhibició en el desenvolupament de dèficits cognitius associats a l’edatMassó Chacón, Anna 20 November 2015 (has links)
Tenint
en
compte
que
l’edat
és
el
principal
factor
de
risc
per
patir
deteriorament
cognitiu,
elucidar
si
els
factors
que
prolonguen
la
vida
també
poden
prevenir,
retardar
o
contrarestar
la
disfunció
neuronal
associada
a
l’envelliment
o
a
processos
neurodegeneratius
esdevé
un
gran
repte
amb
importants
implicacions
terapèutiques.
Així
doncs,
en
el
context
d’aquesta
tesi
centrada
en
la
búsqueda
de
factors
neuroprotectors
per
retardar
la
progressió
del
deteriorament
cognitiu
associat
a
l’edat,
i
en
particular
hem
caracteritzat
l’expressió
de
Klotho,
un
gen
anti-‐envelliment,
en
cervell.
Per
fer-‐ho,
s’ha
estudiat
el
perfil
d’expressió
de
klotho
en
cervell
tant
en
condicions
d’envelliment
normal
com
en
condicions
patològiques.
En
aquest
sentit,
s’han
analitzat
els
nivells
d’expressió
de
les
dos
isoformes
de
klotho
(m-‐KL
i
s-‐KL)
en
diferents
àrees
cerebrals:
còrtex
prefrontal,
còrtex
cerebral,
hipocamp
i
cerebel.
D’aquesta
manera,
s'ha
pogut
comprovar
que
durant
l’envelliment
cerebral
fisiològic
els
nivells
d'expressió
de
las
dos
isoformes
de
klotho
es
veuen
reduïts
significativament.
També
s'ha
observat
que
aquesta
disminució
es
veu
accelerada
en
condicions
d'envelliment
patològic,
gràcies
als
estudis
fets
en
el
ratolí
3xTg-‐AD.
A
més,
els
resultats
obtinguts
suggereixen
que
donat
que
els
nivells
de
klotho
en
aquest
model
es
troben
disminuïts
significativament
als
6
mesos
d’edat,
en
etapes
primerenques
de
la
progressió
de
la
malaltia,
podria
tenir
un
ús
potencial
com
a
biomarcador
de
diagnòstic
precoç
d'Alzheimer.
Per
contra,
s'ha
vist
que
l'exposició
a
uns
hàbits
de
vida
saludable,
com
la
pràctica
d’
exercici
físic
moderat
continuat
durant
l’etapa
adulta,
alenteix
la
baixada
en
els
nivells
d’expressió
de
klotho
en
cervell.
De
manera
important,
per
primer
cop,
s’ha
detectat
la
proteïna
secretada
de
klotho
produïda
per
splicing
alternatiu
(s-‐KL)
utilitzant
un
nou
anticòs
dissenyat
i
generat
en
aquest
treball
(K113).
S’ha
pogut
observar
que
malgrat
l’mRNA
de
s-‐KL
s’expressa
de
manera
similar
en
cervell
que
en
ronyó,
a
nivell
de
proteïna
s-‐KL
és
9-‐10
vegades
més
abundant
en
cervell
que
en
ronyó,
suggerint
que
el
seu
paper
principal
és
a
SNC.
És
més,
els
resultats
del
nostre
estudi
mostren
que
s-‐KL
presenta
un
perfil
d'expressió
espacio-‐temporal
diferent
del
de
m-‐KL,
suggerint
que
ambdues
isoformes
poden
tenir
funcions
diferents
en
cervell.
Per
últim,
s’han
estudiat
els
efectes
de
la
sobreexpressió/inhibició
de
klotho
en
SNC
(utilitzant
estratègies
de
teràpia
gènica
amb
vectors
adenoassociats
de
tropisme
neuronal)
sobre
les
capacitats
cognitives
de
ratolins
adults
i
ancians.
.
S’ha
vist
que
la
modificació
dels
nivells
de
les
dues
isoformes
de
klotho
(m-‐KL
i
s-‐KL)
també
té
efectes
sobre
els
símptomes
neuropsiquiàtrics
associats
a
la
demència
(BPSD).
A
més,
la
sobreexpressió
de
klotho
(sobretot
m-‐KL)
també
presenta
un
cert
efecte
ansiolític,
i
la
seva
inhibició,
l’efecte
contrari.
Finalment,
destacar
que
també
s'ha
pogut
comprovar
que,
independentment
de
l’edat,
la
sobreexpressió
de
m-‐KL
i
s-‐KL
permet
millorar
les
capacitats
cognitives
dels
animals
en
relació
a
la
memòria
de
treball
(T-‐maze)
i
als
processos
d’aprenentatge
i
memòria
espacial
(Morris
Water
Maze).
Aquests
resultats
suggereixen
que
Klotho
podria
ser
una
diana
amb
potencial
terapèutic
pel
tractament
dels
dèficits
cognitius
associats
a
l’envelliment. / Given
that
the
aging
process
is
susceptible
to
change,
and
taking
into
account
that
age
is
the
main
risk
factor
for
the
development
of
age-‐related
cognitive
decline,
elucidate
whether
the
factors
that
prolong
lifespan
also
can
prevent,
delay
or
counteract
neuronal
dysfunction
associated
to
aging
or
neurodegenerative
processes
becomes
a
challenge
with
important
therapeutic
implications.
For
this
reason,
we
decided
to
focus
in
the
search
for
neuroprotective
factors
to
slow
the
progression
of
cognitive
decline
associated
to
aging
,
particularly
we
have
analyzed
and
characterized
Klotho
brain
expresion
,
an
anti-‐aging
gene.
To
this
end
,
we
have
studied
Klotho
expression
profile
in
brain
both
in
normal
aging
and
in
pathological
conditions
.
In
this
regard,
we
have
characterized
the
expression
levels
of
the
two
isoforms
Klotho
(m-‐KL
and
s-‐KL
)
in
different
brain
areas
:
prefrontal
cortex,
cerebral
cortex
,
hippocampus
and
cerebellum.
Thus,
we
have
seen
that
during
physiological
aging
expression
levels
of
the
two
Klotho
isoforms
in
brain
are
significantly
reduced.
We
have
also
found
that
this
decrease
is
accelerated
during
pathological
brain
aging
in
our
studies
in
the
3xTg
-‐AD
micel.
Since
the
levels
of
Klotho
in
this
model
are
significantly
decreased
at
6
months
of
age,
before
b-‐
amyloid
plaques
formation
,
Klotho
could
be
used
as
a
biomarker
for
early
diagnosis
of
the
disease
Alzheimer.
Conversely
,
exposure
to
healthy
lifestyle
habits
,
such
as
the
practice
of
moderate
continuois
exercise
during
adulthood
significantly
slows
the
decrease
in
t
Klotho
levels
in
the
brain.
Importantly
,
for
the
first
time,
we
have
detected
the
secreted
Klotho
protein
produced
by
alternative
splicing
(s-‐KL)
using
a
new
antibody
designed
and
generated
in
this
work
(K113).
We
have
observed
that
despite
s-‐KL
mRNA
is
expressed
similarly
brain
and
in
kidney,
at
protein
level,
s-‐KL
is
9-‐10
times
more
abundant
in
brain
than
in
kidney,
suggesting
that
its
main
role
could
be
in
Central
Nervous
System.
Furthermore,
the
results
of
our
study
show
that
s-‐
KL
isoform
presents
a
different
spatio-‐temporal
expression
profile
from
m-‐KL,
suggesting
that
both
isoforms
may
have
different
functions
in
the
brain.
We
have
also
studied
the
effects
of
Klotho
overexpresion/
inhibition
in
CNS
(using
gene
therapy
strategies
with
AAV
vectors
with
neuronal
tropism)
on
cognitive
abilities
of
adult
and
old
mice.
We
have
seen
that
modifying
the
levels
of
both
Klotho
isoforms
(m-‐KL
and
s-‐KL)
also
has
effects
on
neuropsychiatric
symptoms
associated
with
dementia
(BPSD).
Thus,
its
overexpression
increased
exploration
activity
in
adult
mice,
while
silencing
it
made
animals
become
less
active.
In
addition,
overexpression
of
Klotho
(especially
m-‐KL
also
has
a
certain
anxiolytic
effect,
and
its
inhibition
the
opposite.
Finally,
it’s
important
to
highlight
that,
regardless
of
the
age,
overexpression
of
m-‐KL
and
s-‐KL
can
improve
cognitive
abilities
of
animals
in
relation
to
both
working
memory
(T
-‐
maze)
and
spatial
learning
and
memory
(Morris
Water
Maze).
These
results
suggest
that
Klotho
could
be
a
potential
therapeutic
target
for
the
treatment
of
age-‐related
cognitve
impairments.
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Nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN) com a sistema d’elecció per a transfecció cel·lular de DNA/RNAFàbregas Fernández, Anna 03 November 2015 (has links)
Davant la necessitat de nous enfocaments en el tractament de determinades malalties, en els darrers anys s’han desenvolupant sistemes nanoestructurats no virals com a vehiculitzadors d’agents terapèutics -entre els que es troben els àcids nucleics- com a alternativa tant a les formes farmacèutiques clàssiques com als sistemes virals, els quals presenten riscos associats que no compensen els eventuals beneficis.
Entre els diversos tipus de sistemes no virals per a transfecció d’àcids nucleics (DNA i RNA) dirigits a la regulació de l’expressió gènica, es troben les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP i les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN). El diàmetre mitjà de les nanopartícules i el potencial superficial obtingut (entès com a potencial Z) són variables clau per determinar la seva idoneïtat per a l’ús previst.
Les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP s’obtenen majoritàriament pel mètode de gelificació ionotròpica. En aquest treball, s’han optimitzat certs paràmetres operacionals del mètode per tal de reduir el temps de síntesi i aconseguir nanopartícules de mida i potencial Z adients.
Enfront la variabilitat que presenta aquesta classe de sistema nanoparticulat, i molt particularment a causa de la puresa i grau de desacetilació de la matèria primera, es proposa l’estudi d’un sistema alternatiu per a transfecció d’àcids nucleics. Aquest sistema d’elecció són les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN), obtingudes pel mètode la microemulsificació en calent. A partir d’una formulació original, i per tal de reduir al màxim els components de la formulació i per tant, els riscos de citotoxicitat, s’avaluen diferents components i la quantitat mínima necessària a la formulació, sense comprometre ni la mida de partícula ni el potencial Z. La caracterització dels components i les seves interaccions, així com la determinació de les propietats de la formulació resultant per mitjà de diverses tècniques instrumentals, indiquen la idoneïtat de les cSLN per a l’ús previst.
Els estudis de citotoxicitat en les línies cel·lulars HEK293T i HeLa demostren que la viabilitat cel·lular no es veu compromesa per la presència de cSLN en determinades quantitats.
A partir de plasmidis d’expressió eucariota, es determina per mitjà d’assajos de retardament en gel la relació òptima cSLN:pDNA per a un 100% d’eficiència d’unió. A partir d’aquesta dada, es porten a terme estudis d’expressió funcional d’un fragment del gen que codifica per al factor de transcripció TCERG1 per mitjà d’immunoblotting, i del gen Luc que codifica per a l’enzim luciferasa per mitjà d’un assaig de bioluminescència, que demostren l’expressió proteica a partir de la transfecció de lipoplexos cSLN:pDNA.
Així mateix, i a partir d’un fragment de siRNA contra TCERG1, s’estableix la relació òptima cSLN:siRNA per a un 100% d’eficiència d’unió. En aquest cas, l’estudi es complementa amb l’avaluació de l’eficiència de transfecció dels lipoplexos cSLN:siRNA. Es pot concloure que el siRNA és capaç d’arribar a la cèl·lula quan s’utilitzen cSLN com a agent de transfecció, obrint la porta a la possibilitat de regulació de l’expressió gènica a partir de lipoplexos cSLN:siRNA. / Nanostructured non-viral delivery systems have recently being developed for transfection of therapeutic agents such as nucleic acids. Cationic polymeric nanoparticles of chitosan-TPP and cationic solid lipid nanoparticles (cSLN) are two of these delivery systems.
In this work, several key operational parameters linked to the ionotropic gelation method were optimized to develop cationic polymeric chitosan-TPP nanoparticles. Because of the variability of the methodology and the raw material in the properties of nanoparticles, cationic solid lipid nanoparticles (cSLN) were chosen as an alternative system for delivery of various nucleic acids such as plasmid DNA. To this goal, the first specific aim was to decrease the components of a starting formulation to minimize the risk of cell toxicity. The components of the formulation were qualitatively and quantitatively assessed to achieve the minimum amount necessary for obtaining cSLN, while maintaining a proper particle size and Z potential. The suitability of the cSLN was studied through the characterization of the components, their interactions, and the properties of the resulting formulation.
The optimal ratio for cSLN:pDNA lipoplexes was determined by using gel retardation assays, with an achievement of 100% binding efficiency. Minimal toxicity of the cSLN was observed in cell cultures using the established HEK293T and HeLa cell lines. More importantly, the cSLN were able to transiently express proteins from transfected DNA, which were detected by using bioluminescence assays. In addition, the optimal ratio for cSLN:siRNA (a 21-oligonucleotide targeting a transcription factor) was established to achieve 100% binding efficiency. The transfection efficiency of the cSLN:siRNA lipoplexes was confirmed in HEK293T and HeLa cells. The results demonstrate the efficacy of the developed cSLN-based lipoplexes for delivery of nucleic acids to regulate gene expression.
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Unraveling new roles and substrates for protein kinase CK2 in arabidopsis thalianaArmengot Martínez, Laia 13 November 2014 (has links)
Aquesta tesi és part d’un projecte d’investigació més general que té com a objectiu estudiar el paper de la serina/treonina quinasa CK2 en el desenvolupament de les plantes, utilitzant Arabidopsis thaliana com a model. Malgrat ser una de les primeres quinases identificades, les vies de senyalització en què participa la CK2 encara no estan completament caracteritzades.
En la primera part d’aquesta tesi es descriu la implicació de la quinasa CK2 en la via de senyalització de l’àcid salicílic (SA) i, el control exercit per aquesta hormona en l’expressió dels gens que codifiquen per les proteïnes PIN (exportadores d’auxina), i per a la quinasa reguladora d’aquests transportadors, la proteïna PINOID (PID). Antics membres del laboratori on s’ha realitzat aquesta tesi havien previament obtingut un mutant dominant negatiu de la CK2 (CK2mut) en Arabidopsis (Moreno-Romero et al., 2008). En aquest treball mostrem que aquestes plantes contenen nivells elevats de SA i que l’acumulació de SA a les arrels és el responsable del fenotip radicular alterat (disminucio de la longitud de l’arrel i absència d’arrels lateral). També demostrem que tractaments amb SA exogen redueixen la transcripció dels gens que codifiquen per als transportadors PIN1-PIN4 i PIN7, mentre que estimulen la transcripció del gen que codifica per la quinasa PID. Aquest efecte és similar a l’observat en les arrels de les plantes CK2mut, exceptuant als gens PIN4 i PIN7 que es mostren sobreexpressats. Aquest resultat, suggereix que l’efecte repressor de SA en l’expressió de PIN4 i PIN7 requereix que la quinasa CK2 sigui funcional. D’altra banda, SA estimula l’expressió de les subunitats de CK2, mentre que la pèrdua d’activitat CK2 a les plantes CK2mut produeix un augment de la transcripció de gens relacionats amb la biosíntesi de SA. Aquests resultats suggereixen l'existència d’un loop de retroalimentació negatiu entre la CK2 i el SA, necessari per mantenir la homeostasi de SA. En aquest capítol també es mostra que la sobreexpressió d’una subunitat CK2α catalíticament activa provoca un increment del sistema radicular de les plantes.
En la segona part d’aquesta tesi, ens hem centrat en la recerca i caracterització de substrats de la CK2 en Arabidopsis. Amb aquest objectiu, vam realitzar un assaig de doble híbrid en llevat, que ens va permetre identificar, entre d’altres, a la proteïna NPH3 com a possible substrat de la CK2. NPH3 és un element essencial de la via de senyalització del fototropisme; la seva activitat en aquesta via depèn del seu estat de fosforilació i del seu paper com a adaptador de substrat d’un complex d’ubiquitinació del tipus Cullin3-Ring E3 lligasa (CRL3NPH3). Aquest complex ubiquitina al fotoreceptor de llum blava phototropin 1, el qual es troba associat a la membrana plasmàtica. En la foscor, la proteïna NPH3 està fosforilada i inactiva, mentre que en condicions de llum, està defosforilada i activa, i dirigeix la ubiquitinació de phot1. Recentment, s’ha proposat que la ubiquitinació de phot1 promou la seva internalització des de la membrana cap al citoplasma. Els resultats obtinguts en aquest treball demostren que la quinasa CK2 fosforila NPH3 in vitro i que l’activitat d’aquesta quinasa és necessària per a la fosforilació in vivo en condicions de foscor. A més, la fosforilació de NPH3 per part de la CK2 és important per a mantenir la proteïna NPH3 inactiva. D’altra banda, la manca d’activitat CK2 provoca l’internalització de phot1, inclús en foscor, fet que podria estar relacionat amb el fenotip no fototròpic de les plantes sense activitat CK2. Aquesta internalització és independent de la presència de NPH3 i, per tant, independent d’ubiquitinació. Sorprenentment, la internalització de phot1 observada en condicions de llum, també és independent de la presència de NPH3. / This thesis is part of a research project that aims to study the role of the serine/threonine protein kinase CK2 in plant development, using Arabidopsis thaliana as a model. Despite being one of the first kinases identified, the signaling pathways in which CK2 is involved are not yet fully characterized.
The first part of this thesis describes the involvement of CK2 in the signaling pathway of salicylic acid (SA), and the control exercised by this hormone in the expression of genes coding for auxin membrane transporters (the PIN proteins) and their regulatory kinase PINOID (PID). Former members of the group where this thesis was carried out had obtained a dominant negative mutant of CK2 (CK2mut plants). These plants showed altered root phenotypes (decrease of the main root length and absence of lateral root formation) and changes in the transcription levels of genes encoding several of the PIN proteins (PIN1-PIN4 and PIN7) and of the kinase PINOID (PID) (Marques-Bueno et al., 2011). Here, we show that CK2mut plants contain high levels of salicylic acid, which are responsible for the root phenotype of CK2mut plants. We also demonstrate that treatment of Arabidopsis wild-type plants with exogenous SA inhibits the transcription of genes coding for proteins PIN1-PIN4 and PIN7, while it stimulates the transcription of the PID encoding gene. This effect is similar to that observed in roots of CK2mut plants, except for PIN4 and PIN7 genes, which are overexpressed, suggesting that the repressive effect of SA on PIN4 and PIN7 expression requires a functional CK2. Moreover, SA stimulates the expression of CK2 subunits, whereas the loss of CK2 activity in CK2mut plants produces an increase in the transcript levels of genes related to SA biosynthesis. We propose the existence of a negative feedback loop between CK2 and SA, needed to maintain the homeostasis of SA. This chapter also shows that overexpression of a catalytically active α subunit of CK2 improves the root system of Arabidopsis plants.
The second part of this thesis focuses on the searching and characterization of plant CK2 substrates. For this purpose, we performed a large scale yeast two-hybrid screen that resulted in the identification of 28 potential CK2 substrates. Among them, we found four members of the same protein family, called NPH3/RPT2 (NRL), including NPH3, the founder member of the family. NPH3 is an essential element of the phototropic signaling pathway, and its activity in this pathway depends on its phosphorylation state and on its role as a substrate adapter within the Cullin3-Ring E3 ligase (CRL3NPH3) ubiquitination complex. CRL3NPH3 ubiquitinates the membrane-associated blue light photoreceptor phototropin 1. In the dark, NPH3 is phosphorylated and inactive, while in light conditions it is defosforilated and active and directs ubiquitination of phot1. Recently, it has been proposed that ubiquitination of phot1 promotes its internalization from the plasma membrane into the cytoplasm. Here we show that CK2 phosphorylates NPH3 in vitro, and that CK2 activity is required for the in vivo NPH3 phosphorylation in darkness. In addition, phosphorylation of NPH3 by CK2 is important to keep the protein inactive. Moreover, we observe that the lack of CK2 activity causes internalization of phot1 even in darkness, which could be responsible for the aphotrotropic phenotype of plants without CK2 activity. This internalization is, however, independent of the presence of NPH3 and therefore independent of ubiquitination. Surprisingly, internalization of phot1 observed in light conditions is also independent of the presence of NPH3.
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El control de la polaridad celular de los neuroblastos por β-Catenina en la génesis del Meduloblastoma WntHerrera Camacho, Antonio 06 November 2015 (has links)
Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB-CSIC) / El meduloblastoma es un tumor cerebral maligno localizado en la fosa posterior del cráneo, con una muy alta incidencia en niños. Hasta cuatro distintos subgrupos de meduloblastomas pueden ser definidos en base a su huella genética y sus características clínicas: Wnt, Shh, Grupo 3 y Grupo 4. El origen celular del meduloblastoma Wnt había sido cuestión de debate hasta recientemente, cuando estudios con modelos animales linaje específicos demostraron que los meduloblastomas del subtipo Wnt, a diferencia de los otros subtipos, surgen de los progenitores del romboencéfalo. En meduloblastomas Wnt, mutaciones en el dominio de fosforilación de GSK-3β de la secuencia de β-Catenina (residuos 33-37), generan formas meta-estables de β-Catenina (sβ-Catenina). La estructura de β-Catenina le confiere la capacidad de ejercer una doble función celular, transcripcional y estructural. Por un lado, β-Catenina regula la actividad de la ruta canónica de Wnt mediante la estimulación de la transcripción dependiente de Tcf (función transcripcional), y por otro lado, forma parte estructural de las uniones adherentes a través de su asociación a Cadherinas clásicas (función estructural). Sin embargo, no está definida la contribución de cada una de estas funciones de β-Catenina en el mecanismo oncogénico del meduloblastoma Wnt. En la presente tesis hemos desarrollado un modelo in vivo para estudiar los estadios iniciales de este tumor que consiste en la electroporación de una forma estable de β-Catenina (sβ-Catenina) en los progenitores del tubo neural de pollo. De esta forma conseguimos reproducir los crecimientos preneoplásicos observados en el modelo de ratón del meduloblastoma Wnt. Tomando ventaja de este modelo in vivo, observamos que en los crecimientos aberrantes inducidos por sβ-Catenina las células se mantienen como progenitores Sox2+ con un ratio de proliferación bajo, debido a una extensión de la fase M del ciclo celular. Estos crecimientos aberrantes comenzaban con una formación excesiva de complejo apical (AC) que causaba una alteración de la mitosis concomitante con el inicio de invaginaciones en la cara apical del neuroepitelio. Mediante diferentes experimentos que nos permitían diseccionar la función estructural y transcripcional de β-Catenina demostramos que mientras la actividad transcripcional de β-Catenina inducía la expresión de aPKC, un componente clave del complejo apical (AC), la interacción entre β-Catenina y N-Cadherina era requerida para conducir el transporte apical de los componentes del AC. Además demostramos que la pérdida del AC era requisito esencial para la diferenciación de los K274W neuroblastos y que la expresión de los mutantes, N-CadherinΔβCat o aPKCι , los cuales desestabilizan el AC, reducían significativamente la aparición de malformaciones inducidas por β-Catenina. Por lo tanto, concluimos que sβ-Catenina mantiene el estado progenitor de los neuroblastos mediante la formación excesiva de AC que conduce a malformaciones en el neuroepitelio que son el origen de las malformaciones preneoplásicas inducidas por β-Catenina durante el desarrollo del SNC. Estos datos ofrecen una novedosa visión de los mecanismos subyacentes a la generación de meduloblastomas. / Medulloblastoma is a highly malignant primary brain tumor located in the posterior fossa, representing the most common malignant brain tumor in childhood. Up to four distinct molecular subgroups of medulloblastomas can be defined by their specific mRNA expression signatures: the WNT, SHH, Group 3 and Group 4. The cellular origin of Wnt-subtype medulloblastoma had remained unclear until recently, when data from lineage-restricted mouse models indicated that WNT-subtype arises from hindbrain progenitors. In Wnt-subtype medulloblastoma, the majority of mutations that activate the Wnt pathway target residues 33-37 of β-Catenin, the GSK-3β phosphorylation domain, rendering meta-stable forms of β-Catenin (sβ-Catenin). β- Catenin mediates canonical Wnt pathway stimulating Tcf dependent transcription (transcriptional function), and also plays structural role in adherens junctions by associating with classic cadherins via its armadillo domains. Accordingly, it remains unclear whether the oncogenic role of β-Catenin in Wnt-type medulloblastomas is due to its transcriptional activity, its structural role, or both. Here we have developed an in vivo model to study the initiation of the Wnt- subtype of medulloblastoma that involves the electroporation of a stable form of β- Catenin (sβ-Catenin) into the chick neural tube. This genetic manipulation largely reproduced the aberrant cell collections previously observed in a mouse model of Wnt-subtype medulloblastoma. Taking advantage of this in vivo model, we observed that cells in the aberrant growths induced by sβ-Catenin maintained the stemness of neuroblasts and showed a low proliferation rate due to an extension in the M phase of cell cycle. These aberrant growths initiated with an excessive formation of apical complex (AC) causing an alteration during mitosis concomitant with the beginning of invaginations in the apical side of the neuroepithelium. Distinct experiments allowed us to dissect the structural and transcriptional function of β-Catenin, and showed that while the transcriptional function of β-Catenin induced expression of aPKC, a key component apical complex (AC), the interaction between β-Catenin and N-Cadherin was required to drive the apical transport of AC components. We also demonstrated that loss of apical complex was essential for neuroblast differentiation and that K274W expression of the mutants, N-CadherinΔβCat or aPKCι , which destabilize the AC, significantly reduced the appearance of malformations induced by sβ-Catenin. Therefore, we conclude that sβ-Catenin maintains the progenitor state of neuroblasts by an excessive formation of AC, which leads to malformations in the neuroepithelium that are the origin of preneoplastic malformations induced by β-Catenin during CNS development. These data offer a novel insight into the mechanisms underlying the generation of medulloblastoma.
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Role of microRNAs in plant innate immunityBaldrich, Patricia 22 October 2015 (has links)
Los pequeños ARNs son ARNs cortos no codificantes que regulan la expresión génica en la mayoría de eucariotas. Las plantas tienen dos clases de pequeños ARNs, los microARNs (miRNAs) y los pequeños ARNs de interferencia (siRNAs), que se diferencian por su biogénesis y su modo de acción.
Actualmente se estima que las pérdidas debidas a patógenos y plagas alcanzan el 50-80%, siendo uno de los factores limitantes de la producción y causando graves pérdidas económicas. Tenemos pues la necesidad de mejorar el conocimiento de los mecanismos de defensa y desarrollar nuevas estrategias para la protección de los cultivos. Con el fin de ampliar los conocimiento en este sector, se han llevado a cabo estudios con Arabidopsis y arroz, los dos sistemas modelo usados en genómica funcional en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.
En el primer capítulo, se analizaron las alteraciones en la acumulación de pequeños ARNs, incluyendo miRNAs, en respuesta al tratamiento con elicitores en plantas de Arabidopsis. Entre los miRNAs regulados por elicitores se encuentra miR168, que regula ARGONAUTE1, el componente principal del complejo RISC (RNA-induced silencing complex) de la maquinaria de funcionamiento de miRNAs. Los microarrays permitieron, además de analizar miRNAs conocidos, la identificación de un pequeño ARN incorrectamente anotado como miRNA en el registro miRBase. Se demostró que este pequeño ARN es un pequeño ARN heterocromático (hc-siRNA) denominado siRNA415.
En el segundo capítulo, se usaron librerías de secuenciación masiva de pequeños ARNs para la identificación global de miRNAs de arroz regulados por elicitores fúngicos. Esto permitió también describir 9 miRNAs no caracterizados previamente. Combinando dichas librerías con el análisis de nuestros degradomas, se identificaron sus respectivos targets y se observó la existencia de redes reguladoras enriquecidas en miRNAs regulados por elicitores. Específicamente, se identificó un número importante de miRNAs y sus genes diana, implicados en las rutas de biosíntesis de pequeños ARNs, incluyendo miRNAs, hc-siRNAs y “trans-acting siRNAs” (ta-siRNAs). Así mismo se presentan evidencias de miRNAs y sus genes diana implicados en la señalización mediada por hormonas así como en la interacción entre rutas hormonales, demostrando así un gran potencial en la regulación de la inmunidad del arroz. Asimismo se describe la regulación de genes de arroz que contienen “Conserved-Peptide upstream Open Reading Frame” (CPuORF) mediada por miRNAs. Esto sugiere la existencia de una red reguladora nueva que integra la función de miRNAs y CPuORF en plantas. El conocimiento adquirido en este estudio ayudará al la comprensión de los mecanismos de defensa mediados por miRNAs, así como a desarrollar estrategias apropiadas a la protección del arroz.
En el tercer capítulo, se uso la combinación de herramientas bioinformáticas y experimentales para el análisis de miRNAs policistrónicos en arroz, observando la existencia de 23 loci con la habilidad de formar la típica estructura de horquilla de los precursores de miRNAs. Se presentan evidencias experimentales de 7 miRNAs policistrónicos que contienen tanto miRNAs homólogos como miRNAs no homólogos. Se demostró también un patrón de conservación en diferentes especies de arroz (Oryza sativa) cuyo genoma es AA, no presente en especies primitivas de arroz.
Conjuntamente, los resultados obtenidos en este trabajo apoyan la idea que los miRNAs pueden ser considerados como componentes de la respuesta de las plantas a la infección por patógenos, posiblemente actuando como nodos de regulación de diferentes procesos fisiológicos durante la adaptación de las plantas a la infección. / Small RNAs (sRNAs) are short non-coding RNAs that guide gene silencing in most eukaryotes. Plants have two main classes of sRNAs, microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs), which are distinguished by their mode of biogenesis and mechanisms of action.
In this day and age, crop losses due to pathogens and pests are estimated from 50% to 80%, factors limiting crop production and causing important economical losses. There is then an imperative need to improve our knowledge in defense mechanisms and to develop novel strategies for crop protection. To improve the understanding in this field, we carried out studies in Arabidopsis and rice plants, the two model systems used for functional genomic studies in dicot and monocot plant species.
In the first chapter, we analyzed alterations on the accumulation of smRNAs in response to elicitor treatment, including miRNAs, in Arabidopsis plants. Among the elicitor-regulated miRNAs was miR168 which regulates ARGONAUTE1, the core component of the RNA-induced silencing complex involved in miRNA functioning. In addition to known miRNAs, microarray analysis allowed the identification of an elicitor-inducible small RNA that was incorrectly annotated as a miRNA in the miRBase registry. We demonstrated that this smRNA, is a heterochromatic-siRNA (hc-siRNA) named as siRNA415.
In the second chapter, we used deep sequencing of small RNA libraries for global identification of rice miRNAs that are regulated by fungal elicitors. We also describe 9 previously uncharacterized miRNAs. Combined small RNA and degradome analyses revealed regulatory networks enriched in elicitor-regulated miRNAs supported by the identification of their corresponding target genes. Specifically, we identified an important number of miRNA/target gene pairs involved in small RNA pathways, including miRNA, heterochromatic and trans-acting siRNA pathways. We present evidence for miRNA/target gene pairs implicated in hormone signaling and cross-talk among hormone pathways having great potential in regulating rice immunity. Furthermore, we describe miRNA-mediated regulation of Conserved-Peptide upstream Open Reading Frame (CPuORF)-containing genes in rice, which suggests the existence of a novel regulatory network that integrates miRNA and CPuORF functions in plants. The knowledge gained in this study will help in understanding the underlying regulatory mechanisms of miRNAs in rice immunity and develop appropriate strategies for rice protection.
In the third chapter, we used a combination of bioinformatic tools and experimental analyses for the discovery of new polycistronic miRNAs in rice, revealing 23 loci with the ability to form the typical hairpin structure of miRNA precursors in which two or more mature miRNAs mapped along the same structure. Evidence is presented on the polycistronic nature of 7 miRNA precursors containing homologous or non-homologous miRNA species. We also demonstrated a pattern of conservation in the genome of rice (Oryza sativa) species that have an AA genome, but not in primitive rice species.
Collectivelly, results obtained in this work support the notion that miRNAs might be considered as components of the plant response to pathogen infection, possible acting as regulatory nodes of different physiological processes during plant adaptation to infection conditions.
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Control de la mitosi pel mecanisme de vigilància de fase SPalou Marín, Roger 21 November 2014 (has links)
A les cèl·lules eucariotes el checkpoint de la fase S, un dels mecanisme de vigilància de la cèl·lula, respon a agressions genotòxiques per protegir la integritat genòmica. Com a part de la resposta a estrès replicatiu i dany al DNA, aquest checkpoint impedeix el pas a mitosi fins que l’agressió hagi estat superada, evitant així la inestabilitat genòmica conseqüència de la segregació de cromosomes danys o que no han acabat de ser replicats.
El cicle cel·lular i els seus mecanisme de control, com el checkpoint de la fase S, han estat identificats i estudiats inicialment en organisme model com Schizosaccharomyces pombe (llevat de fissió) i Saccharomyces cerevisiae (llevat de gemmació). Cal tenir present que els mecanismes identificats i els factors implicats en els organisme model són conservats en humans.
En el llevat de fissió, l’entrada a mitosi en presència d’estrès genotòxic és impedida per la fosforilació inhibitòria de la tirosina 15 de Cdk1 per Wee1. Cdk1 és la única quinasa encarregada de dirigir la cèl·lula a través del cicle cel·lular en llevat de fissió i gemmació. En canvi, en llevat de gemmació, Swe1, l’ortòleg de Wee1, i la fosforilació de la tirosina 19 de Cdk1 semblen ser totalment prescindibles en el control de l’entrada a mitosi en presència d’estrès genotòxic. El model actual en llevat de gemmació pel control de la mitosi en presència d’estrès genotòxic contempla com a únic punt de control l’estabilització de Pds1/Securina, evitant així l’activació de Esp1/Separasa que promou el tall de la cohesina que manté unides les cromàtides germanes. En humans, malgrat Wee1 i la seva fosforilació inhibitòria sobre Cdk1 es conserven, no són suficients per impedir totalment l’entrada a mitosis en una fase S compromesa per estrès genotòxic.
Els nostres resultats mostren que en Saccharomyces cerevisiae, l’activitat Cdk1 que dirigeix la mitosi està inhibida en presència d’estrès genotòxic. La dispensabilitat de Swe1 i de la fosforilació de la tirosina 19 de Cdk1 s’explica per que l’activitat Cdk1 mitòtica és inhibida, en aquestes condicions, de forma redundant per Swe1 i Rad53, la quinasa efectora del checkpoint de fase S. A més, hem observat que Swe1 està controlada pel checkpoint de la fase S en aquestes condicions.
Tanmateix, en presència d’estrès genotòxic, les cèl·lules amb l’activitat Cdk1 mitòtica desregulada o nul·les per Pds1/Securina, segueixen essent competents per impedir la mitosi. Ara bé, quan el control redundant de l’activitat Cdk1 de fase M (necessària per l’elongació del fus mitòtic) és combinant amb la deleció de Pds1/Securina, les cèl·lules són incapaces d’evitar la segregació dels cromosomes no acabats de replicar o danyats. / The S phase checkpoint is a surveillance mechanism in eukaryotic cells that preserve genomic integrity in response to genotoxic insults. This checkpoint inhibits mitosis onset till the stress has been solved, avoiding genomic instability that results from the segregation of damaged or not fully replicated chromosomes.
Eukaryotic cell cycle and its regulation mechanisms, like the S phase checkpoint, have been initially identified and studied in model organisms like Schizosaccharomyces pombe (fission yeast) and Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) and these mechanisms and factors are conserved in humans.
Mitosis control in fission yeast in the presence of replication stress relies on the inhibition of mitotic Cdk1 through tyrosine 15 Wee1 mediated phosphorylation. However, in budding yeast, Wee1 ortholog Swe1 and its phosphorylation over Cdk1, seems unnecessary in this control. The present model for budding yeast control of mitosis in the presence of DNA damage relies on the stabilization of Pds1/securin. This chaperone inhibits Esp1/separase which cleaves cohesin, the protein that keeps sister chromatids together. In humans, Wee1 and its phosphorylation over Cdk1 are conserved but they are not enough to inhibit mitotic Cdk1 activity and completely avoid mitosis onset in the presence of genotoxic stress.
Our results show that in budding yeast, mitotic Cdk1 is inhibited in the presence of genotòxic stress. Swe1 dispensability is explained by a redundant mechanism regulating mitotic Cdk1 mediated by Swe1 and Rad53, the effector kinase of the S phase checkpoint. Moreover, Swe1 levels stabilization in the presence of genotoxic stress is mediated by the S phase checkpoint. Mitotic Cdk1 deregulation or pds1Δ is not enough to observe DNA segregation in the presence of genotoxic stress. Only cells that cannot regulate mitotic Cdk1 activity together with pds1Δ are able to segregate not fully replicated or damaged chromosomes.
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Priming neuroblastoma for cisplatin and etoposide drug therapy: Role of NF-κB in TNFα-induced expression of FasGalenkamp, Koen M.O. 04 December 2015 (has links)
El neuroblastoma (NB) es un cáncer pediátrico que representa ~15% de muertes en cánceres infantiles. Los NBs de alto riesgo se caracterizan por una gran heterogeneidad e agresividad, que conlleva un mal pronóstico para el paciente. A pesar de las mejoras alcanzadas con las estrategias estándar en los últimos 20 años, la prevalencia de supervivencia después de cinco años continua por debajo del 50%. Esta situación pone de manifiesto la necesidad del desarrollo de nuevas estrategias para afrontar este problema.
La activación de los receptores de muerte (DR) se ha propuesto como una alternativa a los tratamientos clásicos de quimio- y radio-terapia en distintos tipos de cáncer. En el caso de los NBs, esta aproximación fue descartada por el hecho de que entre un 50 y 70% de ellos no presentan expresión de caspasa-8. A pesar de ello, un grupo significativo de pacientes de NB se podrían beneficiar de un tratamiento que promoviera la muerte a través de la activación de los DR. Se conoce poco de la vía de señalización activada por los DR (especialmente Fas y TNFR1) y de su regulación en NBs, por ello consideramos básico su estudio antes de testar su posible relevancia terapéutica.
Dado a que se ha descrito que la citoquina TNFα induce la expresión de Fas en diferentes tipos de cáncer, nosotros decidimos abordar el co-tratamiento de TNFα con FasL como estrategia terapéutica para el tratamiento de NB.
Para llevar a cabo nuestro estudio, caracterizamos la señalización intracelular y la inducción de muerte a través de TNFR1 y Fas en ocho líneas celulares clínicamente representativas de NB. Observamos que el tratamiento con TNFα induce la expresión de Fas a través de la activación de la vía NF- κB e sensibiliza a la muerte inducida por FasL. A demás, el tratamiento con TNFα promueve la citotoxicidad de agentes genotóxicos, como cisplatino y etoposido, a través de la activación de la caspasa-8. La caracterización más en detalle que realizamos nos llevó a la conclusión que la heterogeneidad presente en neuroblastomas también se hace patente en los niveles de expresión de Fas y en su modulación por TNFα. La sensibilización a la muerte inducida por FasL, cisplatino o etoposido mediada por TNFα solo se podía observar en aquellos NBs donde TNFα era capaz de inducir la expresión de Fas.
En conclusión, nuestros resultados evidencian que TNFα sensibiliza NBs a la muerte inducida por FasL a través de la inducción de la transcripción de FAS mediada por NF- κB. A demás, el pre-tratamiento con TNFα incrementa la muerte inducida por cisplatino y etoposido. Nuestros resultados revelan un nuevo mecanismo que pude mejorar los tratamientos que actualmente se utilizan para la erradicación de los NBs. / Neuroblastoma (NB) is a pediatric solid tumor that accounts for ~15% of all cancer-related deaths in infants. High-risk NBs are hallmarked by a high degree of heterogeneity and aggressiveness, which results in poor patient outcome. Despite the improvement of standard therapies in the last twenty years, five-year survival rates are still below 50%, which impels the development of new treatment strategies for this condition.
Activation of death receptors (DRs) has been proposed as an alternative to standard chemo- and radio-therapies for various types of cancer. In NB, this approach has been largely disregarded, possibly due to the silencing of caspase-8 in 50-70% of the cases. Nevertheless, a significant group of NB patients could benefit from treatment that induces cell death through DR activation. Characterization of DR signaling (especially Fas and TNFR1) and their regulation in NB has been limitedly studied, but is a prerequisite for assessing their therapeutic relevance.
Given that the cytokine TNFα has been described to induce Fas expression in various types of cancer, we addressed whether TNFα and FasL co-treatment could be a valid therapeutic strategy in NB.
For the purpose of the study, TNFR1- and Fas-mediated signaling and cell death induction was characterized in a set of eight clinically representative NB cell lines. TNFα treatment was shown to induce Fas expression through NF-κB-mediated transcription of FAS and primed for FasL-induced cell death. Moreover, TNFα treatment enhanced the cytotoxic effects caused by DNA-damaging agents (i.e. cisplatin and etoposide) through caspase-8 activation. Further characterization revealed that the high degree of heterogeneity between NBs is also visible at the levels of Fas expression and modulation thereof by TNFα. TNFα-mediated priming for FasL-, cisplatin-, and etoposide-induced cell death was only observed for NBs that induced TNFα-mediated Fas expression.
In conclusion, our findings reveal that TNFα primes NB for FasL-induced cell death through the NF-κB-mediated induction of Fas expression. Moreover, TNFα pre-treatment enhanced cisplatin- and etoposide-induced cell death. These findings unveil a novel mechanism that could improve the efficacy of treatment regimens currently used for the eradication of NB tumors.
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Role of the tumour suppressor pathway p53‐p21 in the regulation of metabolismPulice, Giuseppe 15 December 2014 (has links)
Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Changes in diet and life style caused an alarming increase in the incidence of obesity, which is considered a major risk factor for the onset of the metabolic syndrome. One of the initial events in obesity is adipocyte hypertrophy, a stressful condition that triggers cellular responses like inflammation that eventually lead to insulin resistance (IR) and hyperinsulinemia, which may be the link between obesity and other obesity-associated disorders such as T2D, cardiovascular diseases, atherosclerosis and cancer. The major goal of this thesis was to unravel novel molecular mechanisms underlying the development of obesity and the associated IR and hyperinsulinemia. We pursued this goal performing two different studies:
1. Analysis of the role of the p53/p21 tumour suppressor pathway in obesity.
2. Analysis of the effect of JNK activation in pancreatic beta-cells in obesity-associated systemic IR and hyperinsulinemia.
p21 gene and protein expression was upregulated in the adipose tissue (AT) of different models for obesity: the leptin-deficient (ob/ob) and the diet-induced obese (DIO) mice, whereas p21-deficiency protected from the development of adiposity and IR induced by a high fat diet (HFD).
Functional genomics analysis showed that p21 deficiency did not affect adipogenic genes but highlighted an inverse correlation between p21 and leptin receptor (LepR) expression in the AT of p21-knockout (KO) compared to wild type (WT) mice. Furthermore, mice KO for both p21 and leptin developed obesity to the same extent as the ob/ob mice. Overall, these results indicated that the mechanism by which p21-deficiency protects from obesity depends on a properly working leptin/LepR signalling.
Furthermore, LepR protein levels were also increased in the AT of p53 KO mice. So, our hypothesis to explain at the molecular level the obesity-protective phenotype of the p53 and p21 KO mice on HFD conditions, was that these animals have an increased leptin sensitivity due to increased LepR levels in the AT, considering that the overexpression of LepR specifically in AT protects from diet-induced obesity.
In vivo experiments to investigate leptin sensitivity in p21 KO animals showed a slightly greater percentage of weight decrease compared to WT, with no differences in food intake.
In order to establish a mechanistic link between LepR expression and the p53/p21 pathway, we performed an in silico analysis to identify putative binding sites for the E2F transcription factor in the LepR gene. p21 can modulate gene transcription through the regulation of pRB, which in turn negatively regulates the activity of E2F. Supporting this idea, pRB deletion in AT also protects from DIO. Moreover, E2F has a role in metabolism independently of its function in cell cycle: E2F may regulate metabolic genes and we propose that the LepR gene would be one of them.
Regarding our second study, JNK activation induces IR locally but no systemically in MKK7D mice on HFD. At the same time obesity and obesity-induced inflammation, generated at the AT, did not suffice to induce systemic IR. Preserving skeletal muscle sensitivity to insulin seemed to be sufficient to prevent systemic IR. In addition, our data in the MKK7D mice on HFD suggest that a chronic exposure to increased plasma insulin levels are required for the development of systemic IR. / Cambios en dieta y estilos de vida han causado un incremento en la incidencia de la obesidad, uno de los factores de riesgo para el síndrome metabólico. Uno evento inicial en la obesidad es la hipertrofia de los adipocitos, una condición de estrés que desencadena respuestas celulares como la inflamación que pueden conducir al desarrollo de resistencia a insulina (IR) e hiperinsulinemia, que constituyen la principal conexión de la obesidad a otras patologías asociadas a obesidad como la T2D, enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis y cáncer.
El principal objetivo de esta tesis fue desvelar nuevos mecanismos moleculares a la base del desarrollo de obesidad y de la IR e híperinsulinemia a esa asociadas. Perseguimos este objetivo a través del:
1. Análisis del papel de la ruta supresora tumoral p53/p21 en obesidad.
2. Análisis del efecto de la activación de JNK en células beta- pancreáticas en la IR sistémica e híperinsulinemia asociadas a obesidad.
El déficit de expresión de p21 en ratones (sujetos a dieta grasa) genera resistencia al incremento de peso corporal y grasa, y a la alteración de la homeóstasis glucídica inducidos por obesidad. La dieta grasa desencadena un mecanismo de respuesta relacionado al déficit de p21, conectado a la señalización de leptina: la ausencia de p21 provoca un incremento significativo de los niveles del receptor de leptina. Además, la simple ausencia de p21 no es suficiente para el mejoramiento del fenotipo obeso y tiene que será acompañada por una funcional señalización de leptina.
La activación de JNK induce IR a nivel local pero efectos contrarios en la sensibilidad sistémica a insulina. Al mismo tiempo la obesidad y la inflamación inducida por obesidad, generada a nivel periférico, no son suficientes para inducir IR sistémica. Preservar la sensibilidad a insulina en músculo esquelético es suficiente para prevenir la IR sistémica. Así que es posible que para la IR sistémica se requiera la exposición crónica a incrementados niveles de insulina plasmática.
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