Aquesta tesi examina els determinants sociodemogràfics i d'estil de vida del consum d’aliments funcionals i el consum de begudes entre els adults i adolescents de la població de les Illes Balears. La població adulta preferí consumir aliments funcionals com llet baixa en greix, el cafè i el té, probiòtics i els cereals per a l’esmorzar. De la mateixa manera, la població adolescent també preferí consumir llet modificada (baixa en greixos o llet enriquida en omega-3), probiòtics i els cereals per a l’esmorzar. El consum de molts aliments funcionals s’associà positivament amb la ingesta de certs components funcionals. L’aigua és la principal font de fluid en la població adolescent i adulta. Mentre que una major proporció de la població adulta consumí begudes com la llet baixa en greix, el cafè i el té, la majoria dels adolescents preferiren consumir begudes com el suc de fruita natural o la llet sencera. La ingesta de begudes contribueix d’un 6 a un 13% de la ingesta energètica diària total (TEI) en adolescents, mentre que en els adults el consumo de begudes proporciona del 9 al 18% de la TEI diària. / La presente tesis fue estudiar los determinantes socio-demográficos y de estilo de vida del consumo de alimentos funcionales i consumo de bebidas entre los adultos y adolescentes de la población de las Islas Baleares. La población adulta prefirió consumir alimentos funcionales como leche baja en grasa, el café y el té, probióticos y los cereales para el desayuno. Del mismo modo, la población adolescente también prefirió consumir leche modificada (baja en grasas o leche enriquecida en omega-3), probióticos y los cereales para el desayuno. El consumo de muchos alimentos funcionales se asoció positivamente con la ingesta de determinados componentes funcionales. El agua es la principal fuente de fluido en la población adolescente y adulta. Mientras que una mayor proporción de la población adulta consume bebidas como la leche baja en grasa, el café y el té, la mayoría de los adolescentes prefirieron consumir bebidas como el zumo de fruta natural o la leche entera. La ingesta de bebidas contribuye de un 6 a un 13% de la ingesta energética diaria total (TEI) en adolescentes, mientras que en los adultos el consumo de bebidas proporciona del 9 al 18% de la TEI diaria. / The present thesis examined the socio-demographic and lifestyle determinants of the functional food (FF) and beverage consumption among adult and adolescent population in the Balearic Islands. Adult population preferred to consume FFs like low-fat milk, coffee and tea, probiotics and breakfast cereals. Similarly, adolescent population also preferred to consume modified milk (low-fat or omega-3 enriched milk), probiotics and breakfast cereals. Consumption of many FFs was positively associated with the intake of several functional components. Water was found the main fluid source in adolescent and adult population. While a higher proportion of adult population consumed beverages like low-fat milk, coffee and tea, the majority of adolescents were preferred to consume beverages like natural fruit juice or whole fat milk. Beverage intake contributed 6 to 13% of the daily total energy intake (TEI) of adolescents, while in adults beverage consumption provided 9 to 18% of the daily TEI.

Els actuals mètodes ab initio per a la resolució d'estructures macromoleculars estan generalment limitats a casos de proteïnes petites que difracten a resolució atòmica (1.2Å màxim) llevat que continguin àtoms pesats. ARCIMBOLDO1 és un mètode general per a la resolució d'estructures amb dades de difracció de fins 2Å que s'executa en un entorn de multiso lució. Està basat en l'ús del programa Phaser2, per a la localització de petits fragments model com α-hèlixs (la seva presència es pot predir per endavant) combinat amb els algoritmes de modificació de la densitat implementats en el programa SHELXE. ARCIMBOLDO va ser especialment dissenyat per funcionar en un supercomputador o en un grid d'ordinadors coordinat per Condor3. A part d'explotar la presència d'α-hèlixs com informació de partida, a l'ARCIMBOLDO es poden incorporar també altres fonts d'informació, per exemple, es poden proposar com a models de recerca fragments més complexos que la ubiqua cadena principal de l'α-hèlix mitjançant el modelatge de cadenes laterals sobre la cadena principal. També es poden utilitzar estructures macromoleculars amb baixa homologia per extreure petits fragments de recerca, perquè tot i que les estructures en general no siguin prou semblants com per fer un ús convencional del mètode de reemplaçament molecular, les similituds locals es poden explotar amb èxit. Per a aquests casos el programa executa en paral•lel una bateria de prova amb models alternatius i selecciona el més prometedor d'acord amb una determinada figura de mèrit. Una altra font d'informació de partida pot ser la informació experimental, la mateixa pot incorporar-se al mètode de les dues maneres següents: • Localització d'un fragment anòmal explotant les diferències anòmales o dades de l'experiment de MAD5. • Localització d'un fragment model quan una subestructura anòmala ha estat previament determinada per un altre programa. Les dues fonts d'informació poden combinar-se en el procés d'expansió, però en qualsevol dels casos anteriors, la clau de l'èxit consisteix en el control del flux de treball per maximitzar les probabilitats d'èxit, mentre s'evita la creació d'un nombre intractable de processos paral•lels. Referències: 1 DD Rodrguez, C Grosse, S Himmel, C Gonzalez, IM de Ilarduya, S Becker, GM Sheldrick, and I Uson. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature methods, 6(9):651{653, 2009. 2 AJ McCoy, RW Grosse-Kunstleve, PD Adams, MD Winn, LC Storoni, and RJ Read. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography, 40(4):658{674, 2007. 3 GM Sheldrick. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallographica Section D, 66(4): 479{485, 2010. 4 D Thain, T Tannenbaum, and M Livny. Distributed computing in practice: The condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience, 17(2-4):323{356, 2005. 5 WA Hendrickson and CM Ogata. Phase determination from multiwavelengthanomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology, 276:494{523,1997. / ARCIMBOLDO, un método de supercomputación para la determinación cristalográfica ab initio de estructuras de proteínas con resolución inferior a la atómica. RESUMEN: Los actuales métodos Ab initio para la resolución de estructuras macromoleculares están generalmente limitados a casos de proteínas pequeñas que difractan a resolución atómica (1.2Å máximo) a menos que contengan átomos pesados. ARCIMBOLDO1 es un método general para la resolución de estructuras con datos de difracción de hasta 2Å que se ejecuta en un entorno de multisolución. Está basado en el uso del programa Phaser2, para la localización de pequeños fragmentos modelos como α-hélices -cuya presencia puede predecirse de antemano- combinado con los algoritmos de modificación de la densidad implementados en el programa SHELXE3. ARCIMBOLDO fue especialmente diseñado para funcionar en un supercomputador o en un grid de computadoras coordinado por Condor4. Aparte de explotar la presencia de α-hélices como información de partida, en ARCIMBOLDO se pueden incorporar también otras fuentes de información, por ejemplo, se pueden proponer como modelos de búsqueda fragmentos más complejos que la ubicua cadena principal de la α-hélice mediante el modelado de cadenas laterales sobre la cadena principal. También se pueden utilizar estructuras macromoleculares con baja homología para extraer pequeños fragmentos de búsqueda, porque aún cuando las estructuras en general no sean suficientemente parecidas como para hacer un uso convencional del método de reemplazo molecular, las similitudes locales pueden explotarse exitosamente. Para estos casos el programa ejecuta en paralelo una batería de prueba con modelos alternativos y selecciona el más prometedor de acuerdo con una determinada figura de mérito. Otra fuente de información de partida puede ser la información experimental, la misma puede incorporarse al método de las dos siguientes maneras: • Búsqueda de un fragmento anómalo explotando las diferencias anómalas o datos del experimento de MAD5. • Búsqueda de un fragmento modelo cuando una subestructura anómala ha sido previamente determinada por otro programa. Ambas fuentes de información pueden combinarse en el proceso de expansión, pero en cualquiera de los casos anteriores, la clave del éxito radica en el control del flujo de trabajo para maximizar las probabilidades de éxito, a la vez que se evita la creación de un número intratable de procesos paralelos. Referencias: 1 DD Rodrguez, C Grosse, S Himmel, C Gonzalez, IM de Ilarduya, S Becker, GM Sheldrick, and I Uson. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature methods, 6(9):651{653, 2009. 2 AJ McCoy, RW Grosse-Kunstleve, PD Adams, MD Winn, LC Storoni, and RJ Read. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography, 40(4):658{674, 2007. 3 GM Sheldrick. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallographica Section D, 66(4): 479{485, 2010. 4 D Thain, T Tannenbaum, and M Livny. Distributed computing in practice: The condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience, 17(2-4):323{356, 2005. 5 WA Hendrickson and CM Ogata. Phase determination from multiwavelengthanomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology, 276:494{523,1997. / Ab initio macromolecular phasing has been so far limited to small proteins diffracting at atomic resolution (beyond 1.2Å) unless heavy atoms are present. ARCIMBOLDO1 is a general ab initio phasing method for 2Å data, that works in a multosilution framework, based on the combination of localizing predicted small model fragments (like α-helices) with Phaser2, and density modification with SHELXE3. The method was designed to perform in a grid of computer or a supercomputer running Condor. Further than the use of α-helices as starting information, other sources of stereochemical or experimental information can be exploited as well, fragments that are more sophisticated than the ubiquitous main-chain α-helix can be proposed by modelling side chains onto the main-chain or extracted from low-homology models -even if the conventional molecular-replacement approach has been unsuccessful- since locally their structure may be similar enough to the unknown one. In such cases, the program may test a set of alternative models in parallel against a specified figure of merit and proceed with the selected one(s). Experimental information can also be incorporated to the method in two ways: • Searching within ARCIMBOLDO for an anomalous fragment against anomalous differences or MAD5 data. • Finding model fragments when an anomalous substructure has been determined with another program. Both sources of information may be combined in the expansion process. In any of the above cases the key is to control the workflow to maximize the chances of success while avoiding the creation of an intractable number of parallel processes. KEYWORDS: ab initio phasing, fragment search, molecular replacement, density modification, supercomputing. References: 1 DD Rodrguez, C Grosse, S Himmel, C Gonzalez, IM de Ilarduya, S Becker, GM Sheldrick, and I Uson. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature methods, 6(9):651{653, 2009. 2 AJ McCoy, RW Grosse-Kunstleve, PD Adams, MD Winn, LC Storoni, and RJ Read. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography, 40(4):658{674, 2007. 3 GM Sheldrick. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallographica Section D, 66(4): 479{485, 2010. 4 D Thain, T Tannenbaum, and M Livny. Distributed computing in practice: The condor experience. Concurrency and Computation: Practice and Experience, 17(2-4):323{356, 2005. 5 WA Hendrickson and CM Ogata. Phase determination from multiwavelengthanomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology, 276:494{523,1997.

All clinically relevant Enterobacteriaceae strains isolated between 1994 and 1996 without inducible chromosomal b-lactamase, that showed decreased susceptibility to broad-spectrum cephalosporins and/or aztreonam, were selected. The mechanism implicated in the decreased susceptibility was determined by analytical isoelectric focusing, PCR and/or sequenciation. The results obtained showed that the most frequent mechanism implicated in the decreased susceptibility to broad-spectrum cephalosporins and/or aztreonam in E. coli and K. oxytoca was the hyperproduction of the chromosomal b-lactamase, followed by the SHV-1 hyperproduction in E. coli and K. pneumoniae. In our hospital, the incidence of plasmid-mediated extended-spectrum b-lactamases (ESBLs) between 1994 and 1996 was low (0.14%). The b-lactamase that couldn't be identified by the techniques previously described, was characterised by conjugation studies, clonation, and sequenciation experiments, allowing us to describe a new b-lactamase, CTX-M-9, that was the most frequent ESBL detected in our laboratory. The CTX-M-type b-lactamases has been described in various species of the family Enterobacteriaceae in geographically and temporally widely distant areas, most of them being plasmid-encoded. To know more about the dissemination of these enzymes around the world, we decided to study the environment of blaCTX-M-9. This study suggested us that blaCTX-M-9 is contained in a new complex integron, In60. This integron has the common 5'-CS and 3'-CS conserved sequences of class 1 integron and two gene cassettes encoding for a dihydrofolate reductase (dfrA16) and aminoglycoside-adenylytransferase (aadA2). Downstream of the first sul1 gene is present the orf513. Following this region there is the blaCTX-M-9 and an orf3-like region showing both about 80% identity with blaKLUA-1 and orf3 of K. ascorbata, respectively. Downstream of the orf3-like region, a new insertion sequence designated IS3000, is found. This IS is flanked by two imperfect inverted repeats and its deduced amino acid sequence presents the DD(35)-E motif highly conserved in the transposases. Close to the downstream IS3000 inverted repeat the second 3'-CS, is found. The presence of In60 was evaluated in a total of 37 enterobacteria isolated between 1994 and 1999 carrying a b-lactamase compatible with CTX-M-9. The results obtained showed that 33 strains had the environment compatible with In60 and four strains showed modifications or did not share this environment.

Davant la impossibilitat econòmica i física de controlar enginyerilment tots els paràmetres involucrats en la pèrdua de viabilitat en cultius in vitro de cèl·lules animals quan es dóna una limitació en el subministrament de nutrients, així com per la presència d'elevades concentracions de subproductes tòxics del metabolisme, en aquest treball s'ha explorat la modificació tant de la formulació del medi com genètica de cèl·lules d'hibridoma amb l'objectiu de perllongar la seva supervivència dins els bioreactors i rendibilitzar el procés d'obtenció d'anticossos monoclonals. La reformulació del medi va permetre alentir la proliferació cel·lular i retardar l'exhauriment de nutrients essencials. Tanmateix, aquests canvis induïen la mort cel·lular per apoptosi.El bloqueig de l'apoptosi mitjançant l'ús d'inhibidors peptídics específics de Caspases va permetre no només retardar la pèrdua de viabilitat dels cultius si no també recuperar-los 36 hores després d'haver induït la mort per manca de glutamina. Resultats similars es van obtenir en la inhibició genètica de l'activació de les Caspases sobreexpressant gens protectors de la família de Bcl-2, tant d'origen endogen com víric. A més a més, els cultius d'aquestes noves línies cel·lulars d'hibridoma poden ser recuperats després d'haver estat sotmesos fins a 48 hores sota condicions inductores de l'apoptosi.Aquests resultats demostren la viabilitat d'incorporar una vàlvula de seguretat genètica que permet retardar el procés de mort per apoptosi de cèl·lules que, en altres circumstàncies, moririen i s'acumularien en el bioreactor. A més a més, la sobreexpressió de gens antiapoptòtics fa les cèl·lules més resistents i permet recuperar cultius que, per causes accidentals inherents a la metodologia emprada en el monitoratge i control del bioprocés o per limitacions físiques de subministrament de nutrients, factors de creixement i oxigen, es vegin sotmeses a condicions inductores de l'apoptosi. D'aquesta manera, aquest treball de tesi contribueix a la creació d'un sistema de cultiu més robust que evitaria l'enorme pèrdua de rendibilitat en els processos d'obtenció del producte desitjat quan els cultius entren en la fase de mort per apoptosi / Due to the economical and physical unavailability to control a number of parameters involved in the loss of viability of animal cell cultures as a result of a limitation in nutrient supply, as well as high levels of toxic byproducts, we have explored the effect of medium modification on cell viability as well as the genetic manipulation of hybridoma cells with the aim of prolonging the life span of these cultures in bioreactors and therefore optimize the productivity of monoclonal antibodies.Reformulation of culture medium allowed a decrease in cellular proliferation and therefore delay nutrient exhaustion. However, these changes induce cell death by apoptosis.The use of caspase inhibitors has enabled to mantain cell viability during a significant period of time, when glutamine depletion was maintained in the culture. Two caspase inhibitors partially suppressed the progress of PCD under glutamine deprivation: Ac-DEVD-cho and z-VAD-fmk. Indeed, as a consequence of this protection, the number of viable cells decreased by 10% (for z-VAD-fmk) and by 80% (for Ac-DEVD-cmk) after 36 hours of culture, while it decreased by 90% for a control culture in absence of protective compounds. However, when the culture was exposed to non-apoptotic conditions after this period of time under apoptosis protection conditions, normal growth pattern was not recovered. Interestingly, the simultaneous use of both inhibitors made the recovery of the cell culture possible even after a period of 36 hours under glutamine depletion, indicating that the inhibition of the effector caspases occurs upstream of the point in which hybridoma cells enter into the commitment step of the death programme.Similar results were obtained by genetic inhibition of the Caspase cascade activation by means of overexpression of protector genes of the Bcl-2 family: Bcl-2, Bcl-XL, and viral homolgues BHRF-1 and KSBcl-2. Moreover, cultures of these genetically modified hybridomas could be rescued from cell death phase after a significant period of time (i.e., 24 and 48 h) under apoptosis inducing conditions.These results show the viability of the incorporation of a security valve that could delay the cell death process by apoptosis in cell cultures which, under other circumstances, would die and be accumulated in the bioreactor. Moreover, overexpression of Bcl-2 homologues make hybridomas more resistant to apoptosis and allow the recovery of viability of cultures deprived from glutamine after 48 hours of apoptosis inducing conditions. Thus, the present work help towards the creation of a more robust culture system that will avoid tremendous loss of cost-effectiveness of biotechnological processes when cultures of animal cells trigger apoptosis.

En S. cerevisiae, al igual que en células de mamífero, el principal control durante el ciclo celular está situado al final de la fase G1, en un punto llamado START (Cross 1995). En START se coordina el crecimiento con la división celular la célula solo entrará en un nuevo ciclo celular si ha alcanzado un tamaño crítico y las condiciones medioambientales son apropiadas. Un proceso clave en START es la activación de un programa de transcripción específico de la fase G1 tardía. Dos factores de transcripción similares, SBF y MBF, son los responsables de esta regulación de la expresión génica. Con el objeto de un mejor conocimiento de los mecanismos moleculares que controlan START y la transición G1/S en el ciclo celular, se inició una estrategia de rastreo genético diseñada para identificar genes cuya mutación sea letal en combinación con una deleción en el gen SWI4 (Igual et al. 1996). De dicho rastreo se aislaron 14 mutantes rsf ("requiring SWI four"). La caracterización preliminar de estos mutantes puso de manifiesto que Swi4p interviene en muchas y variadas funciones además, e independientemente, de la regulación de las ciclinas CLN1,2 (Igual et al. 1997). Durante el presente trabajo se han caracterizado dos de estos mutantes rsf. En el caso del mutante clb5swi4, se ha demostrado la conexión funcional de la ciclina Clb5p, de la ruta PKC y del factor de transcripción SBF en procesos de metabolismo del DNA y en el mantenimiento de la integridad celular. También se ha demostrado que la inactivación del gen CLB5 provoca defectos en la integridad celular siendo un mutante clb5 sensible al tratamiento con SDS, CFW, latrunculina B, cafeína o a la digestión con enzimas que degradan la pared celular como la zimoliasa. Estos resultados indican que la ciclina Clb5p está implicada en el metabolismo de la pared celular y en el mantenimiento de la integridad celular. Por otro lado, se ha descrito que el gen ROT1, al cual se le había relacionado con la ruta PKC por estudios de interacciones genéticas, participa en la salida de mitosis y en citoquinesis. Se ha demostrado que Rot1p presenta funciones antagónicas a la ciclina Clb2p en el control de la salida de mitosis y participa en la regulación del citoesqueleto de actina. En el segundo caso, la caracterización del mutante msn5swi4 realizada durante los últimos años ha permitido identificar una relación funcional entre el factor de transcripción de ciclo celular SBF y la carioferina Msn5p. También se ha demostrado que Msn5p participa en el control de Start regulando la transcripción dependiente de SBF y no la de MBF. Msn5p es una carioferina que se requiere para la exportación de Swi6p al citoplasma en la transición G2/M del ciclo celular. Este mecanismo de exportación de Swi6p al citosol es esencial para su funcionalidad y es un proceso de regulación que actúa en cada ciclo celular. Nuestros resultados son un buen ejemplo de la importancia de la regulación espacial en el control del ciclo celular. En el caso de Swi6p el concepto de regulación espacial va más allá en el sentido de que un interruptor funcional de la proteína se acopla a cambios en la localización subcelular. En el curso del trabajo se observaron algunas diferencias funcionales entre las ciclinas Cln1p y Cln2p. Estas ciclinas son proteínas muy similares, su niveles se regulan por los mismos mecanismos moleculares y la actividad quinasa asociada fluctúa con la misma periodicidad. Además, numerosos estudios han puesto de manifiesto el solapamiento funcional entre estas dos ciclinas lo cual ha conducido a considerarlas como proteínas equivalentes. Sin embargo, diversas observaciones nos han permitido esclarecer el diferente papel que para la célula de levadura juegan Cln1p y Cln2p en la progresión en la transición G1/S del ciclo celular, concretamente en el proceso de gemación. / In S. cerevisiae, similarly with mammals cells, the major control point during cell cycle appears at late G1 phase, in a process called Start. In that moment cells decide to initiate or not a new round of cell division. In Start, when enviromental conditions are appropiate and cells reach a critical size, different processes begin such as DNA replication, bud emergence and spindle pole body duplication. One of the mechanisms contributing to cell cycle regulation is the control of transcription. In the budding yeast expression of some 250 genes is thougt to fluctuate throug the cell cycle. The transcription factors responsible for the periodic gene expression in late G1 phase are SBF (Swi4p-Swi6p) and MBF (Mbp1-Swi6p). To further understand Swi4p function, we step up a synthetic lethal screen for genes interacting with SWI4 (Igual et al. 1996). Fourteen conditional mutations which resulted in lethality only in the absence of SWI4 have been isolated. Two of these mutants, rsf12 and msn5swi4, were characterized in details in that work. In rsf12 mutant we were demonstrated a functional link between cyclin Clb5p, PKC pathway and SBF transcription factor in DNA metabolism and cell integrity. Moreover, we were characterized that ROT1 gen is functionally linked to the PKC pathway and is required for proper mitotic exit. In msn5swi4 mutant, we were identified that Msn5p is involved in control of Start, being required specifically for SBF activity but is not affecting MBF function. The karyopherin Msn5p is essential for the export of Swi6p to the cytoplasm during G2-M phases and this regulatory mechanism is acting in every cell cycle.

Estructura Tridimensional de Granzima B humanaGranzima B es la proteina prototípica de la familia de serina proteasas que se encuentran en células NK y CTLs. GzmB induce apoptosis mediante activación de las caspasas, y está implicada en la etiología de la artritis reumatoidea. Hemos cristalizado y resuelto la estructura 3D de la GzmB humana a una resolución de 3.1Å. GzmB muestra un plegamiento similar al de catepsina G y quimasa humanas. GzmB exhibe una especificidad de substrato muy inusual ya que corta tras Asp, debido a la presencia de Arg226 en bolsillo de especificidad S1. El sitio de unión del substrato está diseñado para acomodar y cortar hexapéptidos, i.e. IETD_SG, secuencia presente en el lugar de activación de la caspasa-3 y de Bid, sus substratos fisiológicos. Esta estructura ayudará en el diseño de inhibidores que podrian ser usados en la cura de enfermedades inflamatorias crónicas.Granzyme B y el Receptor Manosa-6-Fosfato Independiente de CationesGzmB cristalizó como dímero, mediante la interdigitación de las cadenas de azúcares unidas a Asn65 en los dos monómeros. GzmB es captada por las células mediante el Receptor Manosa-6-Fosfato Independiente de Cationes. Sugerimos que la GzmB dimérica sea la forma internalizada por las células diana. Hemos modelado cómo posiblemente GzmB se une a su receptor celular.Estructura Tridimensional de pro-Granzyme K humanaHemos determinado la estructura 3D de la pGzmK a una resolución de 2.2Å. pGzmK se parece más a una serina proteasa activa, a pesar de ser un zimógeno. Esta proteina carece de triada zimogénica y utiliza un nuevo mecanismo de estabilización de la forma inactiva.Estructura Tridimensional de una Procarboxipeptidasa de Helicoverpa armigera. H. armigera es un insecto cuya plaga afecta a un gran número de países. Hemos determinado la estructura 3D de una nueva carboxipeptidasa (PCPAHa) de larvas de H. armigera, la primera resuelta de un insecto hasta la fecha. El zimógeno de PCPAHa muestra una estructura similar a las ya resueltas de mamífero. Su sitio de activación presenta el motivo (Ala)5Lys. Es curioso apreciar similar motivo ((Ala)6Lys) cerca del extremo N-terminal del enzima activo. Ser255 agranda el bolsillo S1´de especificidad y influencia las preferencias de substrato de ésta enzima. Hemos modelado el extremo C-terminal del LCI dentro del sitio activo de PCPAHa. / Crystal Structure of Human Granzyme BGranzyme B is the prototypic member of the granzymes, trypsin-like serine proteinases localized in activated NK cells and CTLs. GzmB triggers apoptosis by activating the caspases, and is implicated in the etiology of rheumatoid arthritis. Human GzmB has been crystallized and its structure has been determined to 3.1 Å resolution. GzmB overall fold is similar to that found in cathepsin G and human chymase. GzmB exhibits an unusual substrate specificity as it cleaves after Asp residues due to the presence of Arg226 at the back of the S1-specificity pocket. GzmB substrate binding site is designed to fit and cleave hexapeptides, i.e. IETD_SG, sequence present in the activation site of caspase-3 and Bid, physiological substrates of GzmB. This structure would help in the design of inhibitors for a treatment of chronic inflammatory disorders.Granzyme B and the Cation-Independent Mannose-6-Phosphate ReceptorOur crystal structure of GzmB unexpectedly revealed a dimer, mediated by the interdigitation of the sugar chains attached to Asn65 in the two monomers. The uptake of GzmB is effected by the cation-independent mannose-6-phosphate (M6P) receptor. We suggest that the GzmB dimer would be the form preferentially recognized by its receptor. To investigate the probable binding mode of GzmB to its cell receptor we have modeled the binding of the GzmB dimer to the M6P-receptor. Crystal Structure of Human Pro-Granzyme KWe have determined the crystal structure of human pGzmK at 2.2 resolution. The overall fold of pGzmK is most similar to that found in active serine proteinases rather than in zymogens. An unusual feature of pGzmK is that the residues Ser32, His40 and Asp194 do not form a zymogen triad, while pGzmK uses a novel mechanism for zymogen stabilization.Crystal Structure of a Procarboxypeptidase from Helicoverpa armigeraH. armigera is one of the most serious insect pests worldwide. We present the 2.5 Å crystal structure from this novel procarboxypeptidase (PCPAHa) from H. armigera larvae, the first one reported for an insect. PCPAHa zymogen has a 3D structure similar to the corresponding mammalian digestive carboxypeptidases. The activation site contains the motif (Ala)5Lys. It is noteworthy the occurrence of the same (Ala)6Lys near the C-terminus of the active enzyme. Ser255 enlarges the S1' specificity pocket and influences the substrate preferences of the enzyme. The C-terminal tail of LCI was modeled into PCPAHa active site.

Els Defectes Congènits de la Glicosilació (CDG) y les deficiències de Piruvat Deshidrogenasa (PDH) són dos grups de malalties que afecten a vies molt importants pel correcte funcionament de l'organisme. En tots dos casos, petits defectes ja mostres manifestacions clíniques, que en aquests casos lleus poden arribar a sobreposar-se. Per aquest motiu l'objectiu d'aquesta tesi ha estat millorar i implementar metodologies, tant bioquímiques com genètiques, per l'estudi d'aquests dos grups de malalties, per tal de poder descartar o confirmar aquests defectes, agilitzant el diagnòstic dels pacients.Per això hem millorat les tècniques de cribratge pels CDG, primer implementant l'estudi de les isoformes de la transferrina en gels d'agarosa y finalment, posant al punt dos mètodes semi-automàtics i quantitatius: HPLC i CZE. Aquests nous mètodes permeten una interpretació més objectiva dels patrons d'isoformes de la transferrina i faciliten la detecció de mostres lleument alterades.Hem ampliat les tècniques per l'estudi dels pacients CDG-II, implementant l'anàlisi de les isoformes d'apolipoproteïna C-III.L'aplicació d'aquestes tècniques a l'estudi de pacients ha permès diagnosticar 14 nous pacients amb defectes congènits de la glicosilació. I també definir dues noves causes d'alteració secundària del patró de sialotransferrines: la sepsis bacteriana i la fructosa-1,6-bisfosfatasa. Volem ressaltar la importància de descartar causes secundaries per tal d'evitar un retard en el correcte diagnòstic dels pacients.Degut a la gran importància de la via de la glicosilació, una activitat residual zero és incompatible amb la vida, és per això que hem ampliat el cribratge a fetus amb malformacions ecogràfiques o avortaments espontanis, per intentar detectar les formes més severes de la malaltia. Però estudi de 238 individuos no ha mostrat cap individu afecte de CDG. Per altra banda, hem incrementat i millorat l'estudi molecular de les deficiències de PDHA1, el subtipus més freqüent de deficiència de PDH, y ampliat l'estudi a altres subunitats del complex PDH. Això ens ha permès finalitzar el diagnòstic de 10 pacients amb deficiència en PDH-E1α i diagnosticar els primers pacients espanyols amb deficiències de PDH-E1β i PDH-E3.En conclusió, aquesta tesi ha contribuït a ampliar i millorar del diagnòstic dels CDG i de les deficiències de PDHc, a incrementar el seu coneixement tant bioquímica com genètic i alhora ha desvelat formes clíniques no conegudes d'aquests defectes. / Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) and Pyruvate Dehydrogenase (PDH) deficiencies are two groups of diseases which affect very important pathways for the correct organism working. In both cases, slight changes in these pathways can have pathologic significances with overlapped clinical features. For these reasons, the aim of this thesis has been the implementation of biochemical and genetic methodologies in order to improve their diagnosis.We have improved the CDG screening techniques, first we have implemented the study of transferrin isoforms in agarose gels, and finally we have changed the screening techniques for CDG to semi-automated and quantitative methodologies: HPLC and CZE. Both methods allow a more objective sialotransferrin pattern interpretation and they permit an easier detection of slight altered patterns.We have implemented the apolipoprotein C-III isoform analysis in order to improve the CDG-II patient studies.With the application of these techniques to the patient studies we have diagnosed 14 new CDG patients. And we have also described two unknown secondary causes of sialotransferrin altered pattern: bacterial meningitis and fructose-1,6-bisphosphatase deficiency. We would emphasised the importance of role out secondary alterations in order to avoid a delay in the correct patient diagnosis. The glycosylation pathway is very important, and defects with no residual activity are incompatible with life. For this reason we have extended our screening for CDG to foetus with ecographic abnormalities and sporadic miscarriages, in order to detect the most severe forms of these diseases. But the study of 238 samples has shown no CDG patient.On the other hand, we have increased and improved the molecular study for PDHA1 (PDH-E1α) deficiencies, the most frequently affected subunit, and we have also extended the molecular analysis to other PDH complex subunits. These works have permit us finishing the molecular diagnosis in 10 patients with PDHA1 deficiency, and describing the first Spanish patient with PDH-E1β deficiency and PDH-E3 deficiency respectively.In conclusion, this thesis has contributed to improve the CDG and PDH deficiency diagnosis, has increased their biochemical and genetic knowledge, and has reported new clinical features.

Des del descobriment de la insulina per Banting i Best el 1922 s'ha fet un gran progrés en el coneixement i la comprensió de la seva química, fisiologia i mode d'acció (1). Totes les accions que du a terme aquesta hormona pancreàtica, tant les metabòliques com les mitogèniques, es donen a través del seu receptor. Aquest és un receptor de membrana, constituït per dues subunitats a que són extracel·lulars i que uneixen la insulina, i dues subunitats b, amb una regió transmembrana i una regió intracel·lular que té activitat tirosina quinasa intrínseca (2). Ja que el receptor és el primer pas en la senyalització iniciada per la insulina, ha estat considerat com un candidat a patir mutacions que serien les responsables de la disrupció del senyal de la insulina i conseqüentment donarien lloc a la resistència a la insulina.S'han descrit tres síndromes genètiques de resitència a la insulina associades a mutacions en el gen del receptor d'insulina: Síndrome de Leprechaunisme, Síndrome de Rabson-Mendenhall i Síndrome de Resistència Tipus A a la insulina, encara que també s'han descrit algunes mutacions en alguns pacients afectes de Lipodistròfia i Obesitat.En el present treball s'han estudiat 18 pacients amb síndromes associades a resistència a la insulina. L'estudi molecular dels receptors mitjançant amplificació per PCR i seqüenciació automàtica, va permetre detectar tres noves mutacions en heterozigosi en tres pacients afectes de resistència a la insulina Tipus A (A1 Leu140/acceptor d'spicing-1239Aturada, A2 acceptor d'spicing-1239Aturada i A3 Val1028), dues mutacions prèviament descrites en un pacient afecte de la Síndrome de Rabson-Mendenhall (RM1 Lys15 i Aturada1000), i una variació en un individu control (Val985Met), a més de diferents polimorfismes. L'estudi funcional dels receptors portadors de les noves mutacions va concloure que la mutació Leu140 s'expressa menys que els receptors WT, en conseqüència uneix menys insulina i presenta una activitat tirosina quinasa disminuïda. La mutació Val1028 afecta a la seqüència consens d'unió de l'ATP i per tant aboleix l'activitat tirosina quinasa. Per últim la mutació d'splicing-1239Aturada dóna com a resultat dos mRNAs anòmals i deferents, però que al ser traduïts donen lloc a la mateixa proteïna: al receptor li manca l'extrem C-terminal (l'exó 22). Aquest receptor mutat s'expressa normalment, uneix un 50% d'insulina comparat amb els WT i no presenta activitat tirosina quinasa.Per tant es pot concloure que la resistència a la insulina que pateixen els pacients portadors d'aquestes mutacions, és deguda a l'efecte que les mutacions exerceixen sobre la funcionalitat dels receptors. / Insulin was discovered by Banting & Best in 1922, since then a great progress has been made in the knowledge and comprehension of its chemicals, physiology and function (1). All the insulin actions, including the metabolic and mitogenic ones, take place through its receptor. Insulin receptor is a heterotetrameric membrane protein with two extracellular a subunits that bind insulin, and two transmembrane b subunits. The intracellular portions of these b subunits have an intrinsic enzymatic tyrosine kinase activity (5).Insulin binding to its receptor is the first step in insulin signalling and it has been considered that insulin receptor mutations are responsible for disrupting the insulin signal and consequently giving rise to insulin resistance.There are three insulin resistant genetic syndromes associated with insulin receptor mutations: Leprechaunism, Rabson-Mendenhall syndrome and Type A Insulin Resistance syndrome, although some mutations in obese and Lipodystrophic patients have been described.Eighteen insulin resistant patients have been studied in the present work. The molecular study of its insulin receptor gene by means of PCR and automatic sequencing revealed three novel mutations in heterozigote state in three Type A insulin resistant patients (A1 patient Leu140/splicing acceptor-1239Stop, A2 patient splicing acceptor-1239Stop/WT and A3 patient Val1028/WT). Two previously described mutations in a Rabson Mendenhall patient (Lys15/Stop1000), and a variation in a control subject (Val985Met), as well as some polymorphisms. Functional studies of the mutant receptors showed that the Leu140 receptor expresses less than the Wt receptor, binds less insulin and has a decreased tyrosine kinase activity. Val1028 mutation affects the consensus sequence for ATP binding and abolishes tyrosine kinase activity. The splicing acceptor-1239Stop mutation gives rise to two abnormal and different mRNAs, but the resultant protein of both is the same: the receptor lacks the C-terminal domain (exon 22). This mutant receptor expresses as a WT receptor, binds a 50% less insulin than WT and lacks tyrosine kinase activity.In conclusion we can say that the insulin resistance of the patients is due to the mutations present in their insulin receptors.

Les deplecions de DNA mitocondrial (mtDNA) i les alteracions de NFU1 són dos grups de malalties que afecten vies molt importants dins de la mitocòndria i que alteren el metabolisme energètic. Clínicament, els pacients afectes de depleció de mtDNA es caracteritzen per mostrar un ampli ventall de símptomes, depenent del gen afectat. Els símptomes clínics són molt greus i la majoria de vegades porten a la mort del pacient. Els pacients amb mutacions en el gen NFU1, descrits per primera vegada en aquest treball, presenten una clínica més homogènia, caracteritzada sobretot per presentar una encefalopatia infantil fatal i/o hipertensió pulmonar i un fenotip bioquímic molt particular però ben definit, caracteritzat principalment per presentar acidosi làctica, hiperglicinèmia i deficiència de l’activitat piruvat deshidrogenasa. L’objectiu principal d’aquesta tesis ha consistit en millorar i implementar metodologies per a contribuir al diagnòstic, i millorar la comprensió de la fisiopatologia d’aquestes deficiències. Per a tal fita s’ha posat a punt una tècnica de PCR a temps real per estudiar el número de còpies de mtDNA i poder relacionar-lo amb l’activitat citrat sintasa. A més, la depleció s’ha pogut estudiar en biòpsies incloses en parafina, una important font de material biològic arxivat mai utilitzat fins al moment. D’aquesta forma s’han pogut estudiat 50 pacients amb sospita clínica de depleció de mtDNA i cercar mutacions en els gens relacionats; DGUOK, MPV17, C10orf2, SUCLG1, SUCLA2 i POLG. L’estudi molecular ens ha permès identificar 4 mutacions no descrites prèviament, c.70+5G>A en el gen MPV17, c.1048G>A i c.1049G>T en el gen SUCLA2, i c.531+4A>T en el gen SUCLG1. A més s’han identificat 7 mutacions prèviament descrites en un total de 10 pacients (8 famílies). Quan va ser possible, es va quantificar el ràtio mtDNA/nDNA i la activitat citrat sintasa en la mateixa mostra de teixit, proveint noves dades per l’estudi de les MDS. La depleció relacionada amb la citrat sintasa, (mtDNA/nDNA)/CS, ha donat resposta a certes discrepàncies observades entre els resultats de depleció i els resultats de la cadena respiratòria mitocondrial en alguns pacients. Per altra banda, utilitzant el mapatge per homozigositat, es va identificar una mutació de canvi de sentit en homozigositat en el gen NFU1 (c.622G>T, p.Gly208Cys), que codifica per una proteïna altament conservada en totes les espècies i que està implicada en la biogènesis dels clústers de sulfur de ferro (Fe-S). Aquesta ha esta la primera vegada que s’ha associat mutacions en aquest gen a patologia humana. El fenotip bioquímic dels pacients suggeria una activitat deficient de l’enzima lipoic àcid sintasa (LAS), una proteïna que necessita clústers de Fe-S com a cofactor. Es va poder constatar una disminució del grau de lipoilació de les proteïnes dependents d’àcid lipoic, el que suggeria una manca d’ activitat LAS. Utilitzant models cel·lulars hem demostrat que la proteïna NFU1 és necessària com a donadora de sulfur per la biosíntesi d’àcid lipoic i també ens ha permès conèixer la funció específica en la biosíntesi dels clústers de Fe-S i en la maduració de proteïnes Fe-S, concretament LAS i la succinat deshidrogenasa (SDH). La descripció clínica, bioquímica y genètica d’aquesta malaltia és molt important pel diagnòstic de nous pacients i obre les portes a la cerca d’altres gens implicats en la biosíntesi de l’àcid lipoic, així com al disseny futur de noves estratègies terapèutiques. / Mitochondrial DNA (mtDNA) depletion syndromes (MDS) and NFU1 defects are two groups of diseases affecting crucial mitochondrial pathways of energetic metabolism. Clinically, patients affected of mtDNA depletion displayed a wide range of symptoms, depending on the altered gene. The clinical symptoms are severe and in most cases lead to death of the patient. Patients with NFU1 mutations, described for the first time in this paper, present a more homogeneous clinical phenotype, characterized by fatal infantile encephalopathy and / or pulmonary hypertension. NFU1 patients also showed a peculiar, but well defined, biochemical phenotype, presenting with lactic acidosis, hyperglycinemia and deficiency of pyruvate dehydrogenase activity. The main objective of the present thesis is to improve and to implement new methods for the diagnosis and understanding of the pathophysiology of these deficiencies. To this goal, a real-time PCR technique has been developed to study the mtDNA copy number and its relationship to citrate synthase activity in MDS patients. In addition, mtDNA depletion has been studied in formalin-fixed paraffin-embedded tissues, an important source of biological material never used for this purpose. We studied 50 paediatric individuals suspected to have mtDNA depletion and the appropriate MDS genes have been screened according to their clinical and biochemical phenotypes. Mutational study of DGUOK, MPV17, SUCLA2, SUCLG1 and POLG allowed us to identify 4 novel mutations; c.70+5G>A in MPV17, c.1048G>A and c.1049G>T in SUCLA2 and c.531+4A>T in SUCLG1, and 7 already known mutations in 10 patients (8 families). When possible, we quantified mtDNA/nDNA and CS activity in the same tissue sample, providing an additional tool for the study of MDS. The ratio (mtDNA/nDNA)/CS has shed some light in the discrepant results between the mtDNA copy number and the enzymatic respiratory chain activities of some cases. Using homozigosity mapping, we identified a homozygous missense mutation in NFU1 gene (c.622G> T, p.Gly208Cys), which encodes a conserved protein suggested to participate in Fe-S cluster biogenesis. This is the first time that a clinical phenotype has been associated with mutations to NFU1. The biochemical phenotype suggested an impaired activity of the Fe-S enzyme lipoic acid synthase (LAS), a protein that requires Fe-S cluster as a cofactor. Direct measurement of protein-bound lipoic acid in individual tissues indeed showed marked decreases, which suggested a lack of LAS activity. Human cell models studies showed that NFU1 protein is required as sulfur donor for the biosynthesis of lipoic acid and it performs a specific function in mitochondrial Fe-S proteins maturation, particularly succinate dehydrogenase and LAS (SDH). Clinical, biochemical and genetic description of NFU1 disease is very important for the diagnosis of new patients and will allow us to find other genes involved in the biosynthesis of lipoic acid, and provided the basis for the future design of new therapeutic strategies.

En païssos industrialitzats, el càncer de pròstata (CP) és la neoplasia més comunment diagnosticada en homes i la segona causa de mort relacionada amb càncer, donat que els nivells de mortalitat en aquesta població són molt més baixos que els que es troben en els païssos en desenvolupament, es veu un clar benefici en els avenços tant en el diagnòstic precoç com el desenvolupament de teràpies eficients. No obstant, la disseminació metastàtica més que el tumor primari en sí és la responsable dels problemes de mortalitat i morbiditat associats al CP. Les metàstasis esquelètiques estan presents en més d’un 70% dels casos de CP avançat i confereixen alts nivells de morbiditat, un 25% de supervivència als 5 anys i una mitjana de supervivència de 40 mesos després de ser diagnosticats. Tot i que les fractures patològiques i la compressió de la columna vertebral són les complicacions més probables pel pacient metastàtic, el major símptoma és el dolor. Les metàstasis òssies del CP comporten un estat d’acceleració de la remodelació òssia que es caracteritza per una activació patològica tant dels osteoblasts com dels osteoclasts. Aquesta elevada activació dels osteoclasts està directament correlacionada amb un increment en la incidència de les complicacions òssies, de la progressió tumoral i la mort. A més, una vegada el tumor metastatitza a os, la malaltia esdevé incurable i les teràpies actuals són solament pal·liatives i principalment es dirigeixen a les cèl·lules tumorals o als osteoclasts. Per tant, per entendre millor la biologia de les metàstasis òssies del PC i poder investigar noves teràpies és important desenvolupar nous models animals. En aquesta tesi, s’han establert nous models experimentals de metàstasis del CP mitjançant la inoculació de cèl·lules humanes en ratolins immunodeficients per diferents vies, intraòssia, intracardíaca o intratibial. Finalment, diferents estratègies s’han dut a terme per descriure noves dianes moleculars involucrades en el mecanisme de les metàstasis i poder desenvolupar un model adequat per la evaluació de possibles compostos candidats a ser futures aproximacions terapèutiques. Per concloure, aquests models proporcionen una fiable reproducció de la situació clínica i permeten tant la caracterització com el diseny de tractaments efectibles per compendre millor els mecanismes moleculars de les metàstasis òssies del CP. / In industrialized countries, prostate cancer (PCa) is the most common malignancy in men, but mortality rates are much lower than those recorded in developing countries, reflecting benefits from advances in early diagnosis and effective treatment. However, the metastatic disease rather than the primary tumor is responsible for much of the resulting morbidity and mortality. Skeletal metastases occur in more than 70% of cases of late-stage of PCa and they confer a high level of morbidity, a 5 year survival rate of 25% and median survival of approximately 40 months. Though fractures and spinal cord compression are potential complications, the most common symptom of bone metastases is pain. Bone metastases from PCa lead to an accelerated bone turnover state that features pathological activation of both osteoblasts and osteoclasts. Raised activation of osteoclasts is directly correlated with an increased incidence of skeletal complications, cancer progression and death. Further, once tumor metastasizes to bone, the metastatic disease become incurable and current therapies are palliative and mostly target either tumor cells or osteoclasts. Thus, to better understand the biology of PCa bone metastasis and to investigate new therapy options it is crucial to develop new animal models. In this thesis, we have established new experimental models of PCa bone metastasis by intraosseous (i.o.), intracardiac (i.c.) or intratibial (i.t.) inoculation of human PCa cells in immunodeficient mice. Extensive bone metastasis were monitored by in vivo bioluminescence imaging. Different strategies were performed to describe new molecular targets involved in the mechanisms of PCa bone metastasis and to make a suitable model for evaluating novel compounds as future therapeutic approaches. To conclude, these models provide a reliable reproduction of the clinical situation and allows characterization and design effective treatments by better understanding the molecular mechanisms of PCa bone metastasis.