221 |
Nuevos aspectos en las actividades catalíticas de tirosinasaGarcía Molina, María del Mar 24 July 2015 (has links)
Tesis por compendio de publicaciones / Objetivos: el objetivo fundamental de esta Memoria consiste en profundizar en el mecanismo de acción de la tirosinasa. Se centra la atención de este estudio sobre la actividad monofenolasa y se profundiza en el proceso de inactivación suicida. Se investiga la aportación de cada una de las actividades monofenolasa y difenolasa en dicho proceso. Se aborda la caracterización cinética de monofenoles de interés fisiológico. Metodología: 1. Profundizar en el mecanismo cinético de actuación de la enzima en sus actividades monofenolasa y difenolasa. 2. Estudiar la hidroxilación de umbeliferona a esculetina en la ruta de biosíntesis de cumarinas. 3. Establecer una metodología para investigar si un monofenol es inhibidor o sustrato alternativo de la enzima con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 4. Diferenciar las actividades monofenolasa y difenolasa en su implicación en el proceso de inactivación suicida. 5. Profundizar en el estudio del mecanismo de inactivación suicida de la enzima en su acción sobre o-difenoles mediante la determinación del efecto isotópico generado en un medio deuterado. 6. Estudiar y analizar los procesos de catálisis e inactivación en la acción de tirosinasa sobre tres tipos de sustratos: o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas. 7. Estudiar la acción de tirosinasa sobre hidroxihidroquinona en los procesos de catálisis e inactivación. 8. Estudiar la reacción de tirosinasa con hidroquinona, un monofenol, utilizado como despigmentante. 9. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 10. Estudiar la influencia de ácido ascórbico sobre el proceso de hidroxilación de hidroquinona por tirosinasa. 10. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda de cantidades catalíticas de o-difenol y ácido ascórbico. Resultados: 1. Se ha demostrado que tirosinasa podría participar en la ruta de biosíntesis de cumarinas hidroxilando umbeliferona a esculetina. 2. Peróxido de hidrógeno ayuda a demostrar si un monofenol es sustrato o inhibidor de tirosinasa actuando sobre la forma (metatirosinasa) y transformándola en la forma (oxitirosinasa). 3. Los estudios cinéticos con TBF/TBC demuestran que la enzima se inactiva únicamente al actuar sobre o-difenoles. 4. Un conjunto de estudios de efecto isotópico con D2O han puesto de manifiesto que existe una etapa muy lenta en la que se transfiere un protón. Esta etapa podría ser previa a la inactivación suicida. 5. La catálisis de la oxidación de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas, sigue un mecanismo similar: oxidación/ reducción simultánea sobre los dos átomos de cobre. 6. El proceso de inactivación suicida en la acción de la enzima sobre estos sustratos parece seguir un mismo mecanismo, que podría ser la oxidación/ reducción de uno de los átomos de cobre. 7. Los efectos electrónicos de los sustituyentes de C-4 de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas en las etapas de catálisis e inactivación son más importantes en los o-difenoles y o-aminofenles. 8. El producto de hidroxilación de hidroquinona, la hidroxihidroquinona, es un sustrato suicida de la enzima. 9. Se ha puesto de manifiesto que hidroquinona, un agente despigmentante, es un sustrato de tirosinasa. 10. Se ha demostrado que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno, ya que este último pasa metatirosinasa (inactiva sobre hidroquinona) a oxitirosinasa (activa sobre hidroquinona). 11. También se ha puesto de manifiesto que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno y ácido ascórbico a altas concentraciones, por el paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. Del mismo modo, cantidades catalíticas de tert-butilcatecol y ácido ascórbico en concentraciones de orden micromolar consiguen la acción de tirosinasa sobre hidroquinona a través del paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. / Objectives: The main objective of this report is to deepen the mechanism of action of tyrosinase. The focus of this study is on the monophenolase activity and deepened in the process of suicide inactivation. The contribution of each of the monophenolase and diphenolase activities in this process is investigated. In this regard, the kinetic characterization of monophenols with physiological interest is studied. 1. Deepen in the kinetic mechanism of tyrosinase in their monophenolase and diphenolase activities. 2. Study the hydroxilation of umbelliferone to scueltin in the cumarin biosynthesis pathway. 3. Establish a methodology to investigate if one monophenol is inhibitor or alternative substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 4. Discriminate between the monophenolase and diphenolase activities in its involvement on the suicide inactivation process. 5. Deepen the study of suicide inactivation process of tyrosinase in its action on o-diphenols through the determination of isotopic effect generated in a deuterated medium. 6. Study and analyse the catalysis and inactivation processes in the action of tyrosinase on tree types of substrates: o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylendiamines. 7. Study the tyrosinase action on hydroxyhydroquinone in the catalysis and inactivation processes. 8. Investigate the action of tyrosinase on a monophenol, hydroquinone, used as lightening. 9. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 10. Study the ascorbic acid influence on the hydroquinone hydroxylation process by tyrosinase. 11. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the help of catalytic amounts of o-diphenol and ascorbic acid. Results: 1. It has been shown that tyrosinase could be involved in the biosynthesis pathway of the coumarins by the hydroxylation of umbelliferone to esculetin. 2. Hydrogen peroxide helps to demonstrate whether a monophenol is a substrate or an inhibitor of tyrosinase acting on the form (metatyrosinase) and converting it into the form (oxytyrosinase). 3. The kinetic studies with TBF / TBC show that the enzyme is only inactivated when it acts on o-diphenols. 4. A set of studies of the isotopic effect in D2O have shown that there is a very slow step in which a proton is transferred. It could be considered as a previous step of the suicide inactivation. 5. The catalysis of the oxidation of o-diphenols, aminophenols and o-phenylenediamines occurs through a similar mechanism: simultaneous oxidation / reduction of the two copper atoms. 6. The process of suicide inactivation in the action of the enzyme on these substrates seems to follow the same mechanism which could suppose the oxidation / reduction of one of the copper atoms. 7. The electronic effects of the substituents on the carbon atom C-4 of o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylenediamines during the catalytic and inactivation steps are more significant in the case of the o-diphenols and o-aminophenols. 8. The product of the hydroxylation of hydroquinone, hydroxyhydroquinone, is a suicide substrate of the enzyme. 9. It has been shown that hydroquinone, a depigmenting agent, is a substrate of tyrosinase. 10. It has been shown that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and hydrogen peroxide because the latter converts metatyrosinase (inactive on hydroquinone) to oxytyrosinase (active on hydroquinone). 11. It has also been found that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and ascorbic acid at high concentrations, by transforming metatyrosinase to desoxytyrosinase. Similarly, catalytic amounts of tert-butylcatechol and ascorbic acid at micromolar concentrations induce the action of tyrosinase on hydroquinone by the conversion of metatyrosinase to desoxytyrosinase step.
|
222 |
A shared regulatory network allows functional coupling of Pho89 and Ena1 in response to environmental alkalinizationSerra Cardona, Albert 16 July 2015 (has links)
Els microorganismes estan exposats a canvis en l’ambient que poden implicar una situació d’estrès. El llevat Saccharomyces cerevisiae prefereix condicions acides per proliferar; per tant, l’alcalinització del medi extern li empitjora el creixement. Per superar aquest estrès, el llevat activa diverses vies de senyalització que conformen una complexa xarxa reguladora, provocant un remodelament transcripcional. La via de la calcineurina, activada per l’increment de calci citosòlic en condicions alcalines, governa l’expressió gènica a través del factor de transcripció Crz1. Un estrès alcalí és detectat per la proteïna transmembrana Rim21, un component de la via Rim101, que desencadena una cascada de senyalització provocant l’activació per proteòlisi de Rim101. Aquest factor de transcripció reprimeix l’expressió de NRG1, un altre repressor transcripcional, induint així l’expressió de determinats gens indirectament. La quinasa Snf1 també s’activa per estrès alcalí i té varies dianes a través de les quals controla diferents processos. Entre aquestes, Snf1 inhibeix els repressors Mig1/Mig2 i Nrg1/Nrg2, alleugerint la repressió d’un grup divers de gens. Addicionalment, un increment del pH extern activa la via de senyalització PHO, relacionada amb l’escassetat de fosfat, provocant la inactivació del complex Pho80-Pho85 i la subseqüent acumulació de Pho4 al nucli. Aquest factor de transcripció, conjuntament amb Pho2, és responsable de l’expressió del reguló PHO, la funció del qual és mantenir els nivells de fosfat intracel·lular. El gen ENA1, que codifica una Na+-ATPasa, és un clar exemple de coregulació per diferents vies de senyalització. La seva inducció alcalina depèn de Crz1 i de l’alliberament de la repressió de Nrg1, Mig i Mig2, els quals son inhibits per Rim101 i Snf1. Pho89 és un cotransportador de sodi/fosfat d’alta afinitat membre del reguló PHO. Apart de ser induït per Pho4, sota condicions alcalines l’expressió de PHO89 també depèn de Crz1, sent l’únic gen del reguló PHO que mostra aquesta regulació.
En aquest treball ens centrem en la xarxa reguladora que controla la inducció alcalina de PHO89 i el seu possible paper en la resposta a aquest estrès. Mostrem com l’expressió de PHO89 en condicions d’escassetat de fosfat és més feble i retardada en comparació amb l’expressió a pH bàsic. Per altra banda, l’expressió de Pho84, l’altre transportador de fosfat d’alta afinitat, és més potent en condicions de baix fosfat que en condicions d’estrès alcalí. L’efecte de la via de la calcineurina sobre PHO89 es produeix exclusivament a través de Crz1, i aquest factor de transcripció s’uneix al seu promotor poc després de l’estrès alcalí. La via Rim101 també indueix PHO89 en condicions de pH bàsic a través de NRG1. En condicions alcalines, la quinasa Snf1 és fosforilada i és responsable de la fosforilació dels repressors Mig1 i Mig2, que surten del nucli. Tot i això, només Mig2 té un paper rellevant en la repressió de PHO89. A més a més, la mutació reg1, que presenta una Snf1 hiperactiva, provoca un increment dels nivells de PHO89 al llarg del temps.
En aquest treball també mostrem la possible relació entre Pho89 i Ena1 en un ambient alcalí. Tots dos gens comparteixen els mateixos factors reguladors que permeten la seva expressió sincrònica després d’un estrès per pH bàsic. Quan l’adquisició de fosfat depèn exclusivament de Pho89, l’absència de ENA1 confereix un fort fenotip de sensibilitat a pH alcalí. En aquesta mateixa situació, les cèl·lules presenten un increment substancial en la concentració de sodi intracel·lular, suggerint que aquesta pot ser la causa dels seus problemes de creixement. Aquests resultats indiquen que la coregulació entre Ena1 i Pho89 permetria el seu acoblament funcional, ja que la capacitat per expulsar sodi de Ena1 serviria de mecanisme de detoxificació, permetent un continu cotransport Na+/Pi en condicions alcalines. / Microorganisms are exposed to slight changes in the environment, which may imply a stressful situation. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae prefers acidic conditions to proliferate; hence, an alkalinization of the external medium impairs its growth. To cope with this stress, S. cerevisiae activates several signaling pathways that create a complex regulatory network, leading to a profound remodeling of the transcriptional profile. The calcineurin pathway, activated by an increase of cytosolic calcium occurring in alkaline conditions, governs gene expression through the transcription factor Crz1. Moreover, high pH stress is sensed by the transmembrane protein Rim21, a component of the Rim101 pathway, which starts a signaling cascade resulting in the proteolytic activation of Rim101. This transcription factor represses the expression of NRG1, another transcriptional repressor, thus indirectly inducing the expression of certain genes. The Snf1 kinase is also activated by alkaline stress and has several targets through which it controls different processes. Among them, Snf1 inhibits the repressors Mig1/Mig2 and Nrg1/Nrg2, alleviating the repression of a diverse group of genes. Furthermore, an increase of the external pH also triggers the PHO signaling pathway, related to phosphate scarcity, causing the inactivation of the Pho80-Pho85 complex and the subsequent accumulation of Pho4 into the nucleus. This transcription factor, along with Pho2, is responsible for the expression of the PHO regulon, the function of which is to maintain the intracellular phosphate pool. The Na+-ATPase-encoding gene ENA1 is an excellent example of coregulation by different signaling pathways. The alkaline induction of this gene depends on Crz1 and on release from the repression by Nrg1, Mig1, and Mig2, triggered by activation of Rim101 and Snf1. Pho89 is a high-affinity sodium/phosphate cotransporter belonging to the PHO regulon. Apart from being upregulated by Pho4, under alkaline conditions PHO89 expression is also dependent on Crz1, being the only PHO gene to display such regulation.
In this work we focus on the regulatory network driving the alkaline induction of PHO89 and its possible role in the high pH stress response. We show that the transcriptional profiles of PHO89 between alkaline and phosphate starvation conditions differ considerably, with a much weaker and delayed expression on the latter. In contrast, the expression of Pho84, the other high-affinity phosphate transporter, is stronger in low phosphate conditions than under alkaline stress. The calcineurin effect on PHO89 is mediated exclusively through Crz1, and this transcription factor is bound to its promoter shortly after the alkaline induction. The Rim101 pathway also upregulates PHO89 during high pH stress by impinging on NRG1. After the alkaline stress, the Snf1 kinase is phosphorylated and mediates the phosphorylation of the repressors Mig1 and Mig2, which exit the nucleus under these same conditions. However, only Mig2 has a relevant role in repressing PHO89. Furthermore, the reg1 mutation, which leads to a hyperactive Snf1, results in increased Pho89 levels over time, indicating the importance of Snf1 in the alkaline expression of this transporter.
In this study we also show the putative relationship between Pho89 and Ena1 in an alkaline environment. Both genes share several regulatory factors which allow their synchronous expression after high pH stress. Interestingly, when cells rely exclusively on Pho89 for phosphate uptake, the absence of ENA1 confers a strong alkali-sensitive phenotype. In this same situation, cells display a substantial increase in their intracellular sodium concentration, suggesting that this might be the cause of impaired growth. These results point towards the idea that the coregulation exhibited by Ena1 and Pho89 could allow their functional coupling, and that the Na+ extrusion ability of Ena1 could serve as a detoxifying mechanism necessary to support continuous Pho89 Na+/Pi cotransport under alkaline conditions.
|
223 |
Study and characterisation of human HEK293 cell line as a platform for recombinant protein productionListe Calleja, Leticia 21 July 2015 (has links)
El
present
treball
es
centra
en
l’estudi
de
la
producció
de
proteïnes
recombinants
en
línies
cel·∙lulars
de
mamífer.
Concretament,
s’ha
realitzat
l’estudi
de
tres
estratègies
de
bioprocés,
totes
elles
basades
en
el
cultiu
de
cèl·∙lules
HEK293.
Com
a
proteïna
model
per
a
l’expressió
de
proteïnes
heteròlogues
s’ha
triat
la
proteïna
CapPCV2,
la
qual
conforma
la
càpsida
viral
del
Circovirus
porcí
serotip
2
(PCV2).
Aquest
virus
és
l’agent
causal
de
PCVDS
(porcine
circovirus
diseases
o
malaties
derivades
de
circovirus
porcí).
Aquest
terme
engloba
un
conjunt
de
malalties
i
síndromes
que
tenen
un
elevat
impacte
econòmic
en
la
indústria
porcina.
El
projecte
s’ha
enfocat
des
de
la
perspectiva
de
desenvolupament
i
optimització
del
bioprocés
i,
en
conseqüència,
l’increment
de
la
producció
volumètrica
ha
estat
la
força
impulsora
de
tot
el
treball.
En
primer
lloc
es
presenten
els
estudis
per
a
la
selecció
del
medi
de
cultiu
i
suplements
nutricionals.
El
creixement
cel·∙lular
depèn
en
gran
mesura
de
les
característiques
nutricionals
i
fisicoquímiques
del
medi
en
que
se
les
cultiva.
Per
tant,
trobar
el
medi
adequat
és
un
dels
factors
clau
per
a
l’expansió
del
cultiu
cel·∙lular.
L’estudi
inicial
de
medis
de
cultiu
va
permetre
augmentar
sis
vegades
la
densitat
de
cèl·∙lules
viables
en
comparació
al
medi
original
en
que
es
cultivaven.
D’altra
banda,
s’han
explorat
diferents
estratègies
de
cultiu,
i
com
a
resultat
s’ha
implementat
una
estratègia
de
fed-‐batch
que
ha
permès
arribar
a
densitats
cel·∙lulars
de
26.8x106
cell/mL.
En
el
segon
i
tercer
capítol
de
resultats,
s’avaluen
tres
estratègies
diferents
per
a
la
producció
de
la
proteïna
recombinant
CapPCV2
(r-‐CapPCV2).
La
primera
estratègia
ha
estat
la
infecció
de
cèl·∙lules
HEK293
amb
un
vector
adenoviral
que
codifica
el
gen
de
la
CapPCV2
(vector
generat
dins
del
treball
d’aquesta
tesis
doctoral).
Els
paràmetres
d’infecció
s’han
estudiat
en
profunditat
per
tal
de
trobar
els
paràmetres
d’infecció
(medi
de
cultiu,
MOI
(multiplicitat
d’infecció),
TOI
(temps
d’infecció)
i
TOH
(temps
de
recollida))
per
a
la
millora
de
la
producció
de
la
proteïna
i
el
vector
adenoviral.
La
segona
i
tercera
estratègia
estan
basades
en
la
generació
de
línies
cel·∙lulars
estables.
Concretament,
s’ha
generat
una
línia
cel·∙lular
productora
de
r-‐CapPCV2
a
partir
de
la
integració
a
l’atzar
del
vector
plasmídic
en
el
genoma
de
la
cèl·∙lula.
D’altra
banda,
s’han
generat
línies
cel·∙lulars
amb
la
integració
dirigida
del
gen
en
llocs
prèviament
caracteritzats
com
d’altra
transcripció
genètica.
La
integració
dirigida
s’ha efectuat
mitjançant
la
tecnologia
RMCE
(recombinant
mediated
cassette
exchange,
o
bescanvi
de
casset
mitjançada
per
recombinació).
Després
de
la
comparació
de
les
productivitats
específiques
i
volumètriques
aconseguides
amb
cada
estratègia,
el
millor
productor
va
ser
seleccionat.
Nogensmenys,
r-‐CapPCV2
es
produeix
en
quantitats
molt
baixes
i
per
tant
no
ha
sigut
possible
dissenyar
un
procés
de
producció
rentable
i
altres
alternatives
de
producció
s’haurien
d’estudiar
en
un
futur.
Finalment,
l’estudi
d’un
comportament
metabòlic
particular
observat
en
les
cèl.lules
en
cultiu
s’ha
adreçat
des
d’una
perspectiva
fisiològica
i
metabòlica.
A
certes
condicions
extracel·∙lulars,
s’ha
observat
que
les
cèl·∙lules
HEK293
poden
consumir
de
manera
simultània
glucosa
i
lactat
durant
el
seu
creixement
exponencial.
Després
d’un
ampli
estudi
d’aquestes
condicions,
s’ha
determinat
que
el
canvi
de
la
producció
d’àcid
làctic
(que
és
el
principal
problema
dels
cultius
d’alta
densitat
de
cèl·∙lules
de
mamífer)
cap
al
consum
d’aquest
metabòlit
pot
ser
generat
des
de
el
començament
del
cultiu
quan
el
pH
és
de
6.6
i
la
concentració
de
lactat
és
de
4-‐8mM.
En
aquestes
condicions,
ni
el
creixement
cel·∙lular
ni
la
producció
de
proteïna
es
veuen
afectades
negativament.
A
la
llum
d’aquests
resultats,
es
genera
la
hipòtesi
de
que
les
cèl·∙lules
HEK293
poden
co-‐transportar
el
lactat
extracel.lular
i
els
protons
com
un
mecanisme
de
detoxificació
del
pH.
D’altra
banda,
l’aplicació
de
l’anàlisi
de
balanç
de
fluxos
(FBA)
ha
revelat
que
quan
la
glucosa
i
el
lactat
es
consumeixen
simultàniament
s’aconsegueix
un
metabolisme
“equilibrat”,
és
a
dir
els
fluxos
de
la
glicòlisi
i
el
cicle
TCA
esdevenen
similars,
evitant
l’acumulació
de
piruvat
en
el
citosol,
la
seva
transformació
a
làctic
i
finalment
la
secreció
d’aquest
metabòlit.
Aquest
comportament
és
totalment
oposat
al
que
s’observa
de
forma
general
en
els
cultius
de
cèl.lules
de
mamífer
en
creixement
exponencial,
on
els
elevats
fluxos
de
la
glicòlisi
troben
una
limitació
en
els
fluxos
d’entrada
a
la
mitocòndria
(és
a
dir,
del
cicle
TCA)
i
conseqüentment
el
lactat
és
produït
i
secretat
al
medi.
La
construcció
d’un
model
metabòlic
i
l’aplicació
de
FBA
permetrà
fer
prediccions
in
silico
de
comportaments
metabòlics
causats
per
la
sobreexpressió
o
el
silenciament
de
gens
diana.
Aquesta
estratègia
obre
la
possibilitat
de
generar
línies
cel·∙lulars
que
presentin
un
metabolisme
optimitzat
per
tal
d’estudiar
estratègies
de
cultiu
més
eficients
per
a
l’increment
de
la
densitat
cel·∙lular
i
productivitat
de
proteïna
recombinant. / The
thesis
is
focused
on
the
study
of
recombinant
protein
production
in
mammalian
cell
lines.
In
particular,
the
study
of
three
different
approaches
of
different
bioprocesses
based
on
HEK293
cells
has
been
addressed.
As
a
model
protein
for
recombinant
expression,
CapPCV2
has
been
selected.
This
protein
makes
up
the
viral
capsid
of
Porcine
circovirus
serotype
2
(PCV2),
which
is
the
causative
agent
of
PCVDs
(porcine
circovirus
diseases),
a
group
of
diseases
with
major
impact
in
pig’s
industry
worldwide.
This
project
has
been
addressed
from
the
perspective
of
bioprocess
development
and
optimization
and
therefore,
the
increment
of
volumetric
production
of
cells,
virus
and
proteins
have
been
the
driving
force
of
the
research.
Firstly,
cell
culture
media
and
nutritional
supplementation
studies
are
presented.
Cell
growth
relies
in
high
extent
to
the
nutritional
and
physicochemical
characteristics
of
the
media
in
which
cells
are
cultured
and
therefore,
finding
the
proper
cell
media
is
one
of
the
key
factors
for
cell
culture
expansion.
The
initial
media
study
resulted
in
a
6-‐fold
increment
of
the
maximal
viable
cell
achieved
in
the
original
media.
Besides,
different
cell
culture
strategies
have
been
explored,
which
resulted
in
a
fed-‐batch
strategy
that
allowed
reaching
maximal
viable
cell
densities
of
26.8x106
cell/mL,
which
represents
13-‐fold
increment
on
maximal
viable
cell
density
originally
reached.
In
the
second
and
third
chapter
of
results,
three
different
approaches
for
the
expression
of
recombinant
CapPCV2
(r-‐CapPCV2)
are
evaluated
and
discussed.
As
a
first
approach,
a
viral
recombinant
adenovirus
encoding
for
the
gene
CapPCV2
has
been
generated
and
used
as
viral
vector
for
the
production
of
the
recombinant
protein
in
HEK293
cells.
Besides,
a
deep
study
of
the
main
parameters
that
affect
the
infection
performance
has
been
carried
out
and
discussed
in
order
to
find
the
best
media,
MOI
(multiplicity
of
infection),
TOI
(time
of
infection)
and
TOH
(time
of
harvest)
for
adenovirus
and
recombinant
protein
production.
This
study
was
performed
with
an
adenovirus
expressing
the
reporter
gene
GFP
and
thereafter,
the
best
infection
parameters
encountered
were
applied
for
the
production
of
r-‐CapPCV2
(media:
SFMTransFx-‐293
supplemented
with
4mM
glutaMAX,
5%
FBS
and
10%CB5;
MOI:1;
TOI:1x106
cell/mL)
and
TOH:48hpi).
The
second
and
third
strategies
are
both
based
on
the
generation
of
stable
producer
cell
lines,
but
one
strategy
relies
on
illegitimate
(or
random)
integration
of
the
gene
in
the
HEK293
genome
,whereas
the
other
strategy
is
a
site-‐directed
integration
of
the gene
in
previously
characterized
hot-‐spots
(i.e.
high-‐active
transcribed
regions
from
genome).
The
site-‐directed
integration
was
performed
using
RMCE
technology
(Recombinant
mediated
cassette
exchange).
After
the
comparison
of
the
specific
and
volumetric
productivities
achieved
with
each
approach,
the
best
producer
has
been
selected.
Nevertheless,
r-‐CapPCV2
was
poorly
produced
so
it
was
unfeasible
to
develop/design
a
cost-‐effective
industrial
bioprocess
and
other
alternatives
must
be
studied
in
the
future.
Finally,
the
study
of
an
unexpected
metabolic
behaviour
observed
in
HEK293
cells
cultured
in
our
lab
has
been
addressed
from
a
physiologic
and
metabolic
perspective.
HEK293
cells
could
concomitantly
consume
glucose
and
lactate
in
exponentially
growing
cultures
at
particular
environmental
conditions.
After
a
deep
study
of
these
conditions,
it
was
found
out
that
the
switch
from
lactate
secretion
(which
is
the
main
drawback
of
mammalian
high
cell
density
cultures)
to
lactate
consumption
can
be
triggered
from
the
beginning
of
cell
culture
at
pH0=6.6
together
with
the
addition
of
4-‐12mM
of
lactate
to
media.
Remarkably,
under
these
conditions
nor
cell
growth
neither
protein
production
were
negatively
affected.
Form
these
results,
we
hypothesize
that
HEK293
can
co-‐transport
lactate
and
H+
to
the
cytosol
as
a
pH-‐detoxification
mechanism.
Moreover,
the
application
of
flux
balance
analysis
permitted
to
find
out
that
when
lactate
and
glucose
are
consumed
together
a
“more
balanced”
metabolism
is
achieved,
meaning
that
glycolytic
and
TCA
fluxes
became
similar,
avoiding
pyruvate
accumulation
at
the
cytosol
and
consequently,
lactate
formation.
This
is
totally
opposed
to
the
extensively
observed
metabolism
of
exponentially
growing
mammalian
cell
lines,
where
the
high
flux
through
the
glycolytic
pathway
encounters
a
limitation
on
the
fluxes
entering
the
mitochondria
(hence,
the
TCA
cycle)
and
consequently
lactate
is
produced
and
secreted
to
media.
The
construction
of
a
HEK293
metabolic
model
and
the
application
of
FBA
will
allow
making
in
silico
predictions
of
metabolic
beahaviours
after
the
upregulation
or
downregulation
of
target
genes.
This
strategy
may
open
the
possibility
of
generate
engineered
HEK293
cell
lines
with
an
optimised
metabolism
in
order
to
study
more
efficient
cell
culture
strategies
towards
the
achievement
of
higher
cell
densities
and
product
titres.
|
224 |
Caracterització dels ratolins knockin condicional de PDK1 que expressen la mutació L155E a sistema nerviós centralCordón Barris, Lluís 24 July 2015 (has links)
La via de la PI3K/PKB juga un paper molt important en el sistema nerviós central durant el desenvolupament neuronal. PDK1 és la màster quinasa que s’encarrega de coordinar les diverses senyals de la PI3K, regulant diferencialment l’activació de diferents AGC quinases. A fi d’estudiar el paper de PDK1 al sistema nerviós central, vàrem generar dos models de ratolí que presentaven mutats dos dominis funcionals d’aquesta quinasa: el PH-domain i el PIF-pocket.
En aquesta tesi es desenvolupa la caracterització del model de ratolí knock-in condicional que expressa la mutació L155E de PDK1 a sistema nerviós central. Aquesta mutació resulta en la inhabilitació del domini PIF-pocket de PDK1 i per tant en una disrupció del mecanisme d’activació de totes les AGC quinases que no presenten PH-domain, com són RSK, SGK i S6K, però no PKB. La manca d’activació d’aquestes quinases no resulta essencial per les respostes de supervivència i viabilitat cel·lular, però sí que impedeix el correcte desenvolupament neuronal, el que es tradueix en un dèficit de la polarització i diferenciació neuronal. Els defectes en aquests processos neuronals resulten en una reducció de la mida cerebral i en alteracions fisiològiques de regions del cervell com el còrtex o l’hipocamp. Aquestes alteracions impliquen una reducció en la connectivitat neuronal i en la comunicació entre interneurones gabaèrgiques i neurones piramidals, possiblement causada per dèficits en els processos de migració durant el desenvolupament. Tot això condueix a un model de ratolí que presenta alterada la seva conducta davant l’estrès i emula els símptomes negatius i cognitius de trastorns psiquiàtrics com l’esquizofrènia. Aquests resultats mostren la rellevància de PDK1, orquestrant la via de la PI3K, tant durant el desenvolupament neuronal com en la consolidació del correcte funcionament del cervell. / The PI3K/PKB signalling pathway plays an indispensable role in the central nervous system during neuronal development. PDK1 is the master kinase which orchestrates the PI3K signals by regulating the activation of AGC kinases. In order to elucidate the role of PDK1 in the central nervous system, two conditional knockin mice models were generated based on the disruption of two functional domains of PDK1 that are essential for substrate activation: the PH-domain and the PIF-pocket.
In this thesis, I generated and characterized the brain-specific PDK1 conditional knockin mice which express the L155E mutation within the nervous system. This mutation disrupts the PDK1 PIF-pocket domain impairing the activation of RSK, SGK and S6K, whereas PKB activation was not affected. Deficits in the PIF-pocket dependent kinases activation were not translated into a significant deregulation of the neuronal survival, whilst neuronal polarization and differentiation were severely impaired.
The abnormal neuronal development resulted in microcephaly as well as a huge neuronal circuitry reduction in the cortex and hippocampus brain areas. These physiological alterations broke the communication between the gabaergic and the pyramidal neurons, probably due to a deregulation in the neuronal migration process. Mice expressing the PDK1 L155E mutation in the central nervous system were vulnerable in front of stress insults, with behavioural outputs that reproduced a new model for negative and cognitive symptoms related to psychiatric disorders such as schizophrenia.
Altogether, these studies show us the relevance of PDK1, acting as the master kinase involved in PI3K signalling pathway regulation, in neuronal development leading to the appropriate consolidation of cerebral functions.
|
225 |
Functional characterization of REVEILLE 8 and NIGHT LIGHT-INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED interaction in the diurnal regulation of anthocyanin biosynthesisPérez García, Pablo 27 July 2015 (has links)
El reloj circadiano es un mecanismo celular endógeno presente en prácticamente todos los organismos. Una función clave del reloj es la sincronización del metabolismo, fisiología y desarrollo con los cambios medioambientales diurnos y estacionales generados por la rotación de la tierra sobre su propio eje. Se ha propuesto que las oscilaciones circadianas proporcionan una ventaja adaptativa al permitir que los organismos anticipen las transiciones durante el ciclo diurno/nocturno y coordinen procesos simultáneos, secuenciales o temporalmente incompatibles. En los últimos años, numerosos estudios bioquímicos, moleculares y genéticos han proporcionado una visión cada vez más completa de la función y organización circadiana en plantas. Los ritmos circadianos se generan en primera instancia mediante las regulaciones recíprocas entre componentes centrales del reloj que producen una ritmicidad en expresión génica, procesamiento de mRNA, abundancia de proteína y actividad. A pesar de estos avances, aún se dispone de muy poca información sobre los componentes y mecanismos que conectan las señales medioambientales con las rutas de salida del reloj, y en concreto, con los ritmos del metabolismo celular en plantas. El trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio del papel de los componentes circadianos REVEILLE 8 (RVE8) y NIGHT LIGHT-INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED (LNKs) en la regulación de la oscilación rítmica de la biosíntesis de antocianinas a lo largo del día. Al amanecer, RVE8 activa la expresión de genes de la ruta de síntesis de antocianinas mediante la unión directa a los promotores de algunos de los genes de esta ruta metabólica. La regulación positiva de RVE8 es antagonizada hacia la mitad del día por la acción represora de las proteínas LNK, tal y como se deduce del dramático incremento en la expresión de genes de antocianinas en plantas dobles mutantes lnk1/lnk2. Mediante técnicas de inmunoprecipitación de cromatina usando plantas con la expresión de RVE8 y LNKs alterada, se observa que la unión de RVE8 a los promotores disminuye en presencia de los LNK y aumenta en su ausencia, lo que pone de manifiesto un mecanismo mediante el cual las proteínas LNK antagonizan la función activadora de RVE8 sobre los genes implicados en la biosíntesis de antocianinas. Dado que RVE8 y LNKs han sido descritos como co-activadores transcripcionales de genes del reloj, nuestro estudio define un cambio en la actividad reguladora de la interacción RVE8-LNK, desde una función sinérgica activadora de genes de reloj que se expresan por la tarde, a una función represora que modula la expresión de genes implicados en la biosíntesis de antocianinas a mitad del día. / Circadian clocks sustain 24-h rhythms in physiology and metabolism that are synchronized with the day/night cycle. In plants, the regulatory network responsible for the generation of rhythms has been broadly investigated over the past years. However, little is known about the intersecting pathways that link the environmental signals with rhythms in cellular metabolism. Here, we examine the role of the circadian components REVEILLE8/LHY-CCA1-LIKE5 (RVE8/LCL5) and NIGHT LIGHT–INDUCIBLE AND CLOCK-REGULATED genes (LNK) shaping the diurnal oscillation of the anthocyanin metabolic pathway. Around dawn, RVE8 up-regulates anthocyanin gene expression by directly associating to the promoters of a subset of anthocyanin biosynthetic genes. The upregulation is overcome at midday by the repressing activity of LNK proteins, as inferred by the increased anthocyanin gene expression in lnk1/lnk2 double mutant plants. Chromatin immunoprecipitation assays using LNK and RVE8 misexpressing plants show that RVE8 binding to target promoters is precluded in LNK overexpressing plants and conversely, binding is enhanced in the absence of functional LNKs, which provides a mechanism by which LNKs antagonize RVE8 function in the regulation of anthocyanin accumulation. Based on their previously described transcriptional coactivating function, our study defines a switch in the regulatory activity of RVE8–LNK interaction, from a synergic coactivating role of eveningexpressed clock genes to a repressive antagonistic function modulating anthocyanin biosynthesis around midday.
|
226 |
Diseño y caracterización de péptidos específicamente dirigidos al bloqueo de la formación del apresorio en el hongo fitopatógeno Magnaporthe oryzaeRebollar Álvarez, Aarón 04 September 2015 (has links)
La piriculariosis del arroz, causada por el hongo Magnaporthe oryzae, es la enfermedad que más pérdidas genera devastando miles de hectáreas de cultivo anualmente. Los tratamientos antifúngicos frente a esta enfermedad suelen ser de poca utilidad y se vuelven ineficaces en poco tiempo debido a la alta tasa de variación del hongo. Además, dentro del contexto legislativo actual a nivel europeo, se está restringiendo cada vez más la utilización de compuestos antifúngicos de amplio espectro debido a los posibles daños que pueden ocasionar sobre el ecosistema y la salud humana. Una alternativa prometedora al uso de los antifúngicos convencionales son los péptidos antimicrobianos, y más concretamente los péptidos dirigidos capaces de bloquear un proceso esencial para la infección del patógeno. Un paso fundamental en el proceso infectivo del hongo M. oryzae es la formación del apresorio, cuya finalidad es romper la superficie foliar y así penetrar en el mesófilo de la hoja. El desarrollo de compuestos capaces de bloquear específicamente este proceso sin afectar al ciclo vital del hongo constituiría una estrategia ventajosa en el control de la piriculariosis, a priori no tóxica para otros organismos incluido el ser humano. En este trabajo, hemos abordado este objetivo mediante dos aproximaciones, el cribado de una biblioteca combinatoria de péptidos y la modificación de secuencias de AMPs naturales mediante diseño racional. Gracias al conocimiento que se tiene sobre la secuencia y el modo de acción de los péptidos antimicrobianos, hemos diseñado una serie de péptidos capaces de controlar el desarrollo de la piriculariosis mediante inhibición específica de la formación del apresorio en M. oryzae, pero sin afectar a la viabilidad celular. Nuestros resultados indican que péptidos pequeños, como el heptapéptido PAF104, son capaces de reprimir la expresión de los genes MoMSB2 y MoMST11, implicados en la ruta de señalización de la MAPK Pmk1 imprescindible para la formación del apresorio en M. oryzae. Además, demostramos un comportamiento diferencial frente a distintas estructuras infectivas (i.e., apresorio, estructuras similares al apresorio e hifopodios), lo que apoya la idea propuesta por otros investigadores de que los mecanismos moleculares que regulan estás estructuras no son exactamente iguales. Mediante microscopía confocal mostramos que el tratamiento del hongo con MgAPI16 da lugar a apresorios aberrantes y no funcionales. En conclusión la principal aportación de esta investigación es el diseño de una serie de péptidos sintéticos, los heptapéptidos diseñados de novo PAF104, MgAPI24, MgAPI40 y MgAPI47, y el péptido MgAPI16 derivado del péptido antimicrobiano natural CecA, capaces de controlar el desarrollo de la piriculariosis en arroz mediante la inhibición específica de la formación del apresorio. Este trabajo contribuye por tanto al diseño de estrategias de control en protección vegetal basadas en péptidos dirigidos, las cuales deberían ser sostenibles y respetuosas con el medio ambiente. / Rice blast caused by the fungus Magnaporthe oryzae is the most devastating rice disease, causing losses and ravaging thousands of hectares every year. Antifungal treatments are often ineffective and become useless soon due to the high fungus variation rate. Furthermore, within the current legislative framework at European level, it is increasingly restricting the use of broad-spectrum antifungal compounds because of the potential damage that can cause to the ecosystem and human health. One promising alternative to conventional antifungal compounds are the use of antimicrobial peptides, and in particular the target-orientated peptides able to block an essential infective process. A basic step on the development of rice blast diseases is the formation of appressoria, necessary to break the leaf surface and penetrate the mesophyll. To develop novel compounds able to block this process without affecting the life cycle of the fungus could be a promising alternative to control rice blast diseases, a priori no toxic to other organisms including humans. In this work, we board this objective by performing two approaches, the screening of a peptide combinatorial library and the rational design of natural known antimicrobial peptides. We have design a set of peptides able to control the infection caused by M. oryzae by specific inhibition of appressorium formation, but without a lytic effect. Our results show that small peptides, such as the heptapeptide PAF104, represses the gene expression of MoMSB2 and MoMST11, involved in the Pmk1 MAPK pathway essential to M. oryzae appressorium formation. Moreover, the designed peptides showed a differential effect on some infective structures (i.e., appressoria, appressorium-like structures and hyphopodia), supporting that the molecular regulation of these structures is different, an idea previously proposed by other researchers. By confocal microscopy we showed that the appressoria treated with MgAPI16 present aberrant physical and not functional structures. As a conclusion, the main contribution of this work is the design of a set of synthetic peptides, de novo designed heptapeptides PAF104, MgAPI24, MgAPI40 y MgAPI47 and the peptide MgAPI16 derived from the natural antimicrobial peptide Cecropin A, which are able to control rice blast development through the specific inhibition of the appressorium formation in M. oryzae. Therefore, this work contributes to the design of novel strategies based in targeted-orientated peptides for plant protection, which should be environmentally friendly.
|
227 |
Structure, dynamics and interactions of the N-terminal domain of the androgen receptorDe Mol, Eva 26 June 2014 (has links)
Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Prostate cancer (PCa) is the second most common cancer in men after lung cancer. Around 1.1 million men worldwide were diagnosed with PCa in 2012. PCa depends essentially on androgen stimulation for growth and cell survival. The androgen receptor (AR) is a nuclear hormone receptor that is activated by androgenic hormones and the protein through which the physiological effects of androgens are mediated. The AR is necessary for normal prostate development, growth and physiology but also has an important role in the progression of PCa. It is an essential regulator of tumor growth, spread and survival of cancer cells in castration-resistant prostate cancer (CRPC), a stage of the disease that has become resistant to the current therapies, and thus represents a potential therapeutic target.
The AR is composed of four domains: the N-terminal domain (NTD), which is thought to be intrinsically disordered, the DNA-binding domain (DBD) containing two zinc fingers, the hinge region and the ligand-binding domain (LBD) that binds both testosterone and dihydrotestosterone (DHT). The AR NTD plays a crucial role in the constitutive activity of the AR in tumors from patients with castration resistance. Currently, there is no effective treatment for CRPC. The transactivation by the NTD is independent on androgens and therefore circumvents the two current therapeutic strategies that directly target the androgen signaling axis and aim to prevent binding of androgens to the AR LBD. For this reason, we have characterized the conformational properties of the intrinsically disordered NTD, and in particular the activation function 1 (AF1) region, which contains transactivation units Tau-1 and Tau-5 important for AR transactivation. Due to the intrinsically disordered nature of these regions, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy has been used to assign the protein backbone of AF1* (AR 142-448) and to describe its secondary structure and dynamic characteristics. We found that, in vitro, AF1* has a low tendency to self-associate into a dimer. In addition, regions of AF1* with higher secondary structure propensity and less flexibility are also involved in dimerization of AF1* and coincide with regions previously identified to be functional (core Tau-1 and Tau-5).
In this thesis, the role of the AR NTD in transcriptional activation was also investigated at the molecular level. We have studied its interaction with RAP74, a subunit of the general transcription factor IIF (TFIIF). Interaction of the 433WHTLF437 motif of AR, located within the Tau-5 region, with RAP74 enables transactivation in CRPC cells. This novel mechanism could explain aberrant transactivation in cells of castration-resistant patients. Our data suggest that phosphorylation of residues N-terminal to the motif may be necessary for this interaction to occur.
Finally, we wished to understand how the AR NTD can be targeted by small molecules. We have studied the mechanism of interaction of EPI-001, a small molecule that has recently been described as a potent inhibitor of AR interacting with the NTD of AR and causing the regression of CRPC. The results showed a specific recognition mechanism by which EPI-001 interacts with a low populated conformation of Tau-5, a conformation that is possibly related to the dimeric state of AF1. / El cáncer de próstata (PCa) es el segundo tipo de cáncer más común en hombres después del cáncer de pulmón. Alrededor de 1.1 millones de hombres en todo el mundo se les diagnosticó PCa durante el año 2012. El cáncer de próstata depende esencialmente de la estimulación de los andrógenos para el crecimiento y la supervivencia celular. El receptor androgénico (AR) es un receptor de hormonas nuclear que es activado por las hormonas andrógenas y la proteína mediante la cual los efectos fisiológicos de los andrógenos se producen. El AR es necesario para el desarrollo normal de la próstata, su crecimiento y fisiología pero también tiene un papel muy importante en la progresión del cáncer de próstata. Por ello, es un regulador esencial para el crecimiento, diseminación y supervivencia de células cancerígenas en tumores de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC), y por tanto, representa una potencial diana terapéutica.
Desde el punto de vista estructural y functional, el AR está compuesto por cuatro dominios: el dominio N-terminal (NTD) que se piensa que es intrínsicamente desordenado, el dominio de unión a DNA (DBD) que contiene dos dedos de zinc, la región bisagra y el dominio de unión de ligando (LBD) que une tanto testosterona como dihidro-testosterona (DHT). El NTD de AR juega un papel crucial en la actividad constitutiva del AR en tumores de pacientes con resistencia a la castración, el cancer de prostata más avanzado. Actualmente no existe un tratamiento efectivo para CRPC. La transactivación del NTD es independiente de los andrógenos y por tanto evita las estrategias actuales de tratamiento dirigidos al eje de señalización de andrógenos. Por esta razón, se ha realizado la caracterización de las propiedades conformacionales del NTD intrínsecamente desordenado del AR y en particular del AF1, la región más potente para la activación del AR que contiene los regiones Tau-1 y Tau-5. Debido a la naturaleza intrínsecamente desordenada de estos regiones, se ha realizado la caracterización por resonancia magnética nuclear (NMR) midiendo los parámetros de NMR que permiten la asignación del esqueleto proteico de AF1 que permiten describir sus características dinámicas y de estructura secundaria. Hemos encontrado que, in vitro, AF1* (AR 142-448) posee una tendencia reducida pero notable a asociarse a sí misma formando un estado dimérico. Además, las regiones de AF1* con una tendencia mayor de estructura secundaria y menor flexibilidad también están involucradas en la dimerización de AF1* y coinciden con las regiones que fueron previamente identificadas como funcionales (regiones centrales de Tau-1 y Tau-5).
En esa tesis también se ha investigado el papel del NTD del AR en la activación transcripcional a nivel molecular. Se ha estudiado su interacción con RAP74, una subunidad del factor de transcripción general IIF (TFIIF). La interacción del motivo 433WHTLF437 de AR, localizado en la región Tau-5, permite la transactivación por unión con RAP74 en células CRPC. Este novedoso mecanismo podría explicar la transactivación incorrecta en células de pacientes resistentes a la castración. Nuestros datos sugieren que la fosforilación de residuos en el lado N-terminal del motivo puede ser necesario para que se produzca esta interacción.
Por último, se ha buscado una explicación de cómo los compuestos actuales que interaccionan con el AR se unen al NTD. Para ello hemos probado a estudiar el mecanismo de interacción de EPI-001, una molécula pequeña que recientemente se ha descrito como un potente inhibidor de AR que interacciona con el dominio NTD de AR y produce la regresión del proceso cancerígeno durante el estado más avanzado. Los resultados obtenidos muestran un mecanismo de reconocimiento específico por el cual EPI-001 interacciona con una conformación poco poblada de Tau-5, conformación que posiblemente esté relacionada con el estado dimérico de AF1.
|
228 |
Identificació immunològica i caracterització de les propietats biològiques de la proteïna catiònica d'eosinòfilCarreras Margalef, Ester 07 March 2004 (has links)
La proteïna catiònica d'eosinòfil (ECP) és una ribonucleasa que es troba als grànuls secundaris dels eosinòfils. Els nivells d'ECP en fluids corporals s'utilitza com a indicador del número i activació dels eosinòfils. L'ECP és tòxica per diversos patògens com són bacteris, paràsits, virus i per cèl·lules de mamífer.Per identificar immunològicament l'ECP s'ha seleccionat una regió específica de la proteïna (D112-P123) com a possible epítop antigènic. La regió D112-P123 no es troba en l'RNasa A, 1, 4 i 5 i és on s'observa una màxima desviació de l'esquelet de la cadena principal de l'ECP i la neurotoxina derivada d'eosinòfil (EDN) amb la qual comparteix un 67% d'identitat de seqüència. S'han immunitzat conills amb un pèptid sintètic (D112-P123) conjugat a una proteïna transportadora i s'han purificat els anticossos policlonals amb una columna d'afinitat amb l'ECP immobilitzada.L'anticòs D112-P123 reconeix específicament l'ECP en condicions reductores i no reductores i no presenta reactivitat creuada amb l'EDN, l'RNasa A i altres proteïnes control. La immunodetecció per transferència Western amb l'anticòs D112-P123 ha mostrat que hi ha una relació lineal entre la quantitat de proteïna (1-75 ng) i el senyal obtingut. S'ha assajat la reactivitat de l'anticòs D112-P123 en fluids corporals i granulòcits. L'anticòs D112-P123 detecta la forma nadiua no glicosilada i les formes glicosilades de l'ECP en granulòcits, esput i plasma. S'ha obtingut una bona correlació entre els nivells d'ECP determinants amb l'anticòs D112-P123 i amb un anticòs que comercialitza Pharmacia & Upjohn (Uppsala, Suècia).Per estudiar la relació entre l'estructura i les activitats biològiques de l'ECP s'han obtingut variants de la proteïna en residus específics de l'ECP. S'han escollit residus catiònics i aromàtics exposats en la superfície de la proteïna (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A, R101A/R104A) i de la regió del loop D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (_ 115-122) ECP i (115-122 EDN) ECP . S'ha estudiat l'efecte de l'ECP i les seves variants en l'activitat ribonucleasa, la disrupció de membranes, la citotoxicitat per bacteris gramnegatius i grampositius i l'inhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. També s'ha realitzat una predicció de l'estructura tridimensional dels mutants per modelatge molecular. Les variants de l'ECP no modifiquen substancialment ni l'estructura tridimensional de la proteïna ni l'activitat ribonucleasa.L'activitat sobre membranes de l'ECP i les seves variants s'ha analitzat utilitzant vesícules sintètiques. L'ECP mostra una clara preferència per desestabilitzar vesícules acídiques resultat que suggereix que les càrregues positives de la proteïna són importants per la interacció amb les membranes. L'estudi de l'efecte de les mutacions en l'activitat sobre les membranes ha mostrat que aminoàcids catiònics específics i els triptòfans de la proteïna (W10, W35R36 i R101R104) estan relacionats amb la desestabilitazació de la membrana.Aquests resultats correlacionen bé amb l'efecte dels mutants en la inhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. Les regions W35R36 i W10 són essencials per la inhibició de la proliferació. Altres residus catiònics i aromàtics R75F76, R101R104, Y122 tenen un paper secundari en l'inhibició del creixement que es pot explicar per la possible interacció d'aquests residus amb els carbohidrats de la superfície de les cèl·lules de mamífer.La regió W35R36 té un paper essencial en l'activitat bactericida per grampositius i gramnegatius. Els altres residus estudiats tenen efectes diferents en l'activitat bactericida de l'ECP depenent es tracti d' E. coli o S. aureus. Mentre els residus R101R104 i R75F76 són importants per l'activitat bactericida sobre E. coli, els residus W10 i la regió del bucle D115-Y122 són necessaris per l'activitat bactericida sobre S. aureus. Podem concloure que les regions catiòniques i hidrofòbiques estudiades participen en la capacitat de l'ECP per desestabilitzar membranes biològiques i/o en la interacció de la proteïna amb components de la paret bacteriana o amb els carbohidrats de la superfície de cèl·lules de mamífer. / Eosinophil cationic protein (ECP) is a ribonuclease located in the secondary granules of eosinophils. ECP levels in body fluids are used as an indicator of number and activation of eosionophils. ECP is toxic for many pathogens including bacteria, parasites, virus and for mammalian cells.To identify ECP we have selected a specific loop region of the protein (D112-P123) as a putative antigenic epitope. This sequence is absent in RNase A, 1, 4 and 5 and the polypeptide main chain adopts a specific conformation in ECP and also in eosinophil-derived neurotoxin (EDN) which shares 67 % sequence homology with ECP. A synthetic peptide containing the sequence and linked to a carrier protein was used to obtain rabbit polyclonal antibodies which were further purified by an affinity column with ECP as a ligand. D112-P123 antibody specifically recognizes ECP in reducing and nonreducing conditions and does not cross-react with EDN, RNase A or other control proteins. The immunodetection of recombinant ECP by Western blot has shown a lineal relationship between the quantity of protein (1-75 ng) and the signal obtained. The reactivity of the antibody was assayed in different body fluids and granulocytes. D112-P123 antibody detects the glycosylated and nonglycosylated forms of the native ECP in granulocytes, plasma and sputum. A good correlation has been obtained between ECP levels determined by the antibody D112-P123 and by an antibody obtained from a commercial source. To study the relationship between the structure and biological activities of ECP we have obtained variants of the protein in specific amino acids residues. We have chosen cationic and aromatic amino acids located at the protein surface (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A and R101A/R104A) and in the loop region D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (_ 115-122) ECP and (115-122 EDN) ECP.For the wild type form and mutants we have determined the ribonuclease and membrane-lytic activity, the cytotoxicity for gram negative and gram positive bacteria and the mammalian cell growth inhibition. The three dimensional structure of ECP mutants has been predicted by molecular modelling.ECP variants do not show important changes neither on the three dimensional folding nor on the ribonuclease activity of the protein.The lytic-activity of ECP and mutants on cell membranes has been analysed using synthetic lipid vesicles. ECP shows a notable preference to destabilize acidic liposomes which suggests that the electrostatic interaction between membrane and the protein are important for protein binding. The study of the effect of the mutations in the membrane-lytic activity has shown that specific arginine residues and the two tryptophan residues of the protein (W10, W35R36 and R101R104) are related to the membrane destabilization.This results correlate well with the effect of the mutants in the mammalian cell growth inhibition. W35R36 and W10 are essentials for the inhibition of proliferation while other cationic and aromatic residues, R75F76, R101R104 and Y122, play a secondary role which might be explained for the possible interactions of these residues with the carbohydrates on the surface of mammalian cells.W35R36 are essentials for the bactericidal activity for gram positive and negative bacteria. Other amino acid residues have different effects depending on the bacterial strain E. coli or S. aureus. While R101R104 and R75F76 are necessary for the bactericidal activity for E. coli the W10 residue and the loop region D115-Y122 are necessaries for the cytotoxic activity for S. aureus.We can conclude from the studied ECP mutants that specific cationic and hydrophobic residues studied participate on the ability of the protein to destabilize biological membranes and/or in the interaction of the protein with components of the bacterial cell wall or the surface of mammalian cells.
|
229 |
Mechanisms of cytokine release induced by electronegative LDL in monocytes. The role of ceramide and the receptors CD14-TLR4Estruch Alrich, Montserrat 19 September 2014 (has links)
L’LDL electronegativa (LDL(-)) és una LDL modificada present en circulació amb propietats inflamatòries incloent la inducció de l’alliberament de citoquines en cèl·lules relacionades amb l’arteriosclerosi, tals com monòcits i cèl·lules endotelials. Es coneix poc sobre les vies intracel·lulars activades per l’LDL(-), en especial en monòcits. En aquesta tesi s’han estudiat els primers passos a través dels quals l’LDL(-) indueix l’alliberament d’IL-6, IL-10 i MCP-1 en monòcits humans. Concretament, s’han estudiat els components inflamatoris de l’LDL(-) i la seva interacció amb receptors cel·lulars de monòcits.
En relació amb els components inflamatoris, es va observar que la ceramida (CER) és, en part, responsable dels efectes inflamatoris de l’LDL(-). La CER es relaciona amb un augment en la susceptibilitat a l’agregació de l’LDL(-) i a la seva inducció de citoquines en monòcits. Aquestes propietats de l’LDL(-) augmenten a 37ºC i disminueixen per la incubació d’aquesta lipoproteina amb l’HDL. El contingut en CER en l’LDL(-) augmenta per acció de l’activitat tipus fosfolipasa C (PLC), intrínseca en l’LDL(-) i que també es veu inhibida per l’HDL. Aquest fet suggereix que l’activitat PLC de l’LDL(-) participa en les modificacions que tenen lloc en l’LDL nativa (LDL(+)) per a la formació de LDL(-). L’enriquiment d’LDL en CER (CER-LDL)) i el tractament d’LDL amb PLC promouen una LDL que mimetitza l’alliberament de citoquines de l’LDL(-). Tanmateix, l’efecte de la CER-LDL és menor al de l’LDL(-), proposant la possible acció d’altres components en l’LDL(-) que podrien contribuir al seus efectes inflamatoris.
En l’estudi dels receptors involucrats en l’alliberament d’IL-6, IL-10 i MCP-1 induït per l’LDL(-) en monòcits es va determinar que CD14 i TLR4 juguen un paper central. L’adició dels anticossos antiTLR4 i antiCD14 va disminuir un 70%-80% l’alliberament de citoquines, mentre que antiTLR2 va disminuir l’alliberament sols en un 15-25%. L’alliberament de citoquines també va disminuir al tractar les cèl·lules amb un inhibidor específic de TLR4. Aquest alliberament de citoquines va augmentar en la línia de monòcits THP1 que sobreexpressen CD14 (THP1-CD14). Aquests resultats es van confirmar per silenciament gènic de TLR4 i CD14. Experiments d’unió van mostrar que l’LDL(-) presenta una gran afinitat per CD14 i TLR4; la neutralització d’aquests receptors va disminuir la quantitat d’LDL(-) unida a monòcits. Per immunoassaig es va demostrar que CD14 és el principal receptor involucrat en la unió de LDL(-). L’LDL(-) uneix CD14, es forma un complex amb TLR4 i d’aquesta manera s’activa la senyalització intracel·lular que donarà lloc a l’alliberament de citoquines per aquestes cèl·lules. L’LDL(-) pot, d’altrabanda, interaccionar directament amb TLR4 per activar la senyal intracel·lular.
CD14 i TLR4 són receptors que mitjancen l’alliberament de citoquines induït pel lipopolisacàrid (LPS) present en la membrana bacteriana. Els resultats mostren una competència entre LDL(-) i LPS tant per l’efecte inflamatori com per la unió al receptor CD14 de monòcits i de plaques multipou recobertes de CD14. Aquesta competència podria representar una acció compensatòria de l’LDL(-) en casos d’excessiva inflamació.
El contingut augmentat en CER present en l’LDL(-) sembla ser el responsable de l’activació del sistema CD14-TLR4, el qual provoca l’alliberament de citoquines en monòcits. L’alliberament de citoquines induït per la CER-LDL en monòcits va disminuir per l’adició de l’inhibidor de TLR4. La secreció de citoquines induïda per la CER-LDL és similar a la de l’LDL(-), excepte pel fet que la CER-LDL no pot activar l’alliberament de citoquines directament per TLR4 i necessita CD14 per a aquest efecte.
En conclusió, l’augment del contingut en CER per l’LDL(-) exerceix un paper central en l’alliberament d’IL-6, IL-10 i MCP-1 a través de CD14- TLR4 en monòcits. / Electronegative LDL (LDL(-)) is a minor modified LDL present in circulation with pro-inflammatory effects, including the induction of cytokine release in cells involved in atherosclerosis, such as endothelial and mononuclear cells. However, the cellular pathways activated by LDL(-) are scarcely understood, particularly in monocytes. In this thesis, we aimed to determine the first steps of the mechanisms by which LDL(-) induces IL-6, IL-10 and MCP-1 release in human monocytes. We focussed the study on the inflammatory components of LDL(-) and their interaction with cell receptors in monocytes.
Regarding the inflammatory components, we found that ceramide (CER) is, in part, responsible for the inflammation promoted by LDL(-). CER has been related to the increased LDL(-)-susceptibility to aggregation and the induction of cytokine release in monocytes. These properties of LDL(-) are enhanced at 37ºC and diminished by the incubation of this lipoprotein with HDL. CER levels increase in LDL(-) because of the LDL(-)-intrinsic PLC-like activity, which is also counteracted by HDL. This suggests that PLC-like activity of LDL(-) participates in the modifications undertaken in native LDL (LDL(+)) to form LDL(-). The enrichment of LDL with CER (CER-LDL) and its treatment with PLC-like activity mimics the cytokine secretion of LDL(-), although the effect of CER-LDL does not reach that of LDL(-). This suggests that other components linked to LDL(-) could contribute to its inflammatory effects.
The study of the receptors involved in the IL-6, IL-10 and MCP-1 release induced by LDL(-) in monocytes revealed that CD14 and TLR4 were pivotal. The addition of antiTLR4 and antiCD14 antibodies decreased cytokine release by 70%-80%, whereas that of TLR2 inhibited it by 15%-25%. The cytokine release was also diminished when cells were treated with a specific TLR4 inhibitor, but this release increased in a monocytic THP1 cell line overexpressing CD14 (THP1-CD14). These results were confirmed by TLR4 and CD14 gene silencing studies. Binding studies showed that LDL(-) presents high affinity to CD14, and in a lesser extent to TLR4; the neutralisation of these receptors decreased the amount of LDL(-) bound to monocytes. Immunoassay techniques elucidated that CD14 is the main receptor involved in LDL(-) binding. LDL(-) binds to CD14 and, then, form a complex with TLR4 to activate the intracellular signalling leading to cytokine release in these cells. However, LDL(-) can alternatively interact with TLR4 to activate the intracellular signalling.
CD14 and TLR4 are receptors that mediate the cytokine release induced by the lipopolysaccharide (LPS) present in the bacterial membrane. The results showed a competition between LDL(-) and LPS for both the inflammatory effect and the binding to CD14 receptor in monocytes and in CD14-coated microtiter wells. This competition could represent an LDL(-)-counteracting role in cases of overwhelming inflammation.
The increased content of CER present in LDL(-) seems to be responsible for the activation of the CD14-TLR4 system which leads to cytokine secretion in monocytes. The cytokine release induced by CER-LDL in monocytes decreased with the addition of the TLR4 inhibitor. The CER-LDL-induced cytokine secretion in THP1-CD14 cells was much greater than in THP1 cells, which showed almost null cytokine release. This behaviour of CER-LDL is similar to LDL(-), excepting the fact that CER-LDL is not able to induce its cytokine release directly through TLR4 and needs CD14 for this effect.
To sum up, the increased content of CER present in LDL(-) plays a key role in the induction of IL-6, IL-10 and MCP-1 release through CD14-TLR4 in monocytes.
|
230 |
Aplicaciones de la electroforesis capilar en el estudio de errores congénitos del metabolismoCasado Río, Mercedes 10 June 2014 (has links)
En este proyecto de tesis, hemos desarrollado 3 nuevos procedimientos por electroforesis capilar (CZE) para el estudio de pacientes con errores congénitos del metabolismo. Es un proyecto de investigación de base tecnológica, ya que se han aplicado los conocimientos de la doctoranda en Química para un desarrollo de procedimientos complejos, que os han permitido avanzar en la identificación de pacientes con enfermedades metabólicas. Estos avances se han plasmado en 3 publicaciones científicas en revistas internacionales.
En el primer objetivo, hemos aplicado un procedimiento previamente validado en nuestro laboratorio para el diagnóstico de pacientes con defectos congénitos de la glicosilación (CDG). Gracias a este nuevo procedimiento, hemos podido identificar dos nuevos pacientes que habían pasado desapercibidos con los métodos de análisis convencionales (Casado et al, Cerebellum 2012). Además, el mayor grado de automatización de nuestro procedimiento frente al clásico por isoelectroenfoque permite analizar series más largas de pacientes y cuantificar las diferentes forma s de sialotransferrina en función de su grado de glicosilación, que es el biomarcador para los defectos CDG.
En el segundo objetivo, nos propusimos estandarizar la cuantificación del neurotransmisor GABA en líquido cefalorraquídeo de pacientes neuropediátricos, ya que no existían referencias previas que detallaran dicho procedimiento (las disponibles, se basan principalmente en experimentación animal). Conseguimos separar GABA de glutamina, aminoácido que coeluía con el GABA y que está unas 5.000 veces más concentrado. Una vez superados los obstáculos técnicos, establecimos valores de referencia de GABA para una población pediátrica y estudiamos diferentes pacientes con trastornos neurológicos de la infancia. A destacar, que se demostró la utilidad de la determinación de GABA para la monitorización de tratamientos antiepilépticos, ya que muchos de ellos modulan el metabolismo del GABA para reducir las crisis epilépticas. Este trabajo ha sido publicado en la revista Electrophoresis (Casado et al, 2013).
En el último objetivo, nos propusimos desarrollar un nuevo procedimiento para el análisis de oligosacáridos en orina, como herramienta para el estudio de pacientes con enfermedades lisosmales y del metabolismo de carbohidratos. En ese caso, la única alternativa tradicional es la cromatografía en capa fina, método no automatizable, largo y poco sensible. Hemos conseguido desarrollar un procedimiento por CZE y detección de fluorescencia inducida por láser que mejora considerablemente el método utilizado convencionalmente en la mayoría de laboratorios que estudian a este tipo de pacientes. Este nuevo procedimiento ha sido recientemente aceptado para publicación (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014). / In this thesis project, we have developed 3 new capillary electrophoresis (CZE) procedures for the study of patients with inborn errors of metabolism. This project has a technical approach, se we have taken advantage of the Chemistry knowledge of the student candidate, which allowed us to progress in the identification of new patients with inborn errors of metabolism and other neurological conditions in paediatric patients. These advances have been published in 3 different international scientific journals.
In the first aim, we have applied a previously validated procedure in our laboratory for the diagnosis of patients with congenital disorders of glycosylation (CDG). We were able to identify 2 new cases with a very mild phenotype, who were misdiagnosed with the classical diagnostic procedures (Casado et al, Cerebellum 2012). Moreover, this method allows the analysis of large series of patients, since it is automatable. Furthermore, it allows the quantification of the different forms of sialotransferrin according to its glycosylation pattern, which is the more important biomarker for the study of patients with CDG syndromes.
In the second aim, we standardized the quantification of the neurotransmitter GABA in cerebrospinal fluid of neuropediatric patients, since there was not scientific references about this topic (only procedures for the analysis of GABA in animal models were available). We got to separate GABA from glutamine, which co-eluted with GABA and it is about 5,000 times more concentrated than GABA is. Once these technical problems were solved, we established reference values for a paediatric population and we analyzed GABA in a cohort of neuropaediatric patients. As a milestone, we demonstrated that GABA analysis may be useful for the monitoring of antiepileptic therapy, since several antiepileptic drugs modulate GABA metabolism. This work has been published in Electrophoresis journal (Casado et al, 2013).
For the last aim, we planned to develop a new procedure for the analysis of urinary oligosaccharides, as a diagnostic tool for the study of patients under the suspicion of having some lysosomal storage diseases and also those with some carbohydrate metabolism defects. The only diagnostic tool generally accepted for this purpose is a thin layer chromatography method (TLC), which is time-consuming, not automatable and probably no sensitive enough for identification of some patients with mild phenotypes. We have developed a new CZE procedure with laser-induced fluorescence detection which dramatically improves the conventional TLC method. The description and validation of this new procedure has been recently accepted for publication (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014).
|
Page generated in 0.0887 seconds