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Estudo da interação de porfirinas com melanina por espectroscopia óptica / Study of the interaction of porphyrin with melanin by optical spectroscopySilva, Sebastiao Claudino da 18 May 1992 (has links)
No presente trabalho estudou-se os processos de interação entre uma série de porfirinas catiônicas e a melanina. Utilizou-se as porfirinas (Zn-(tetra(4-N-Metilpiridil)porfina): (\'ZN\'-(tetra(4-\'N\'-Metilpiridil)porfina): \'ZN\'-\'T\'\'M\'\'PY\'\'P\', (\'ZN\'-(tetra(4-\'N\'-Benzilpiridil)porfina): \'ZN\'-\'T\'\'BZ\'\'PY\'\'P\', as respectivas porfirinas de base livre (\'T\'\'M\'\'PY\'\'P\' e \'T\'\'BZ\'\'PY\'\'P\') e a melanina sintética obtida a partir da auto-oxidação da dihidroxifenilalanina (L-DOPA). O trabalho baseou-se em três técnicas espectroscópicas complementares: espectroscopia eletrônica (absorção na região do ultravioleta-visível), fluorescência e espalhamento Raman ressonante. Demonstrou-se a formação de complexos estáveis como resultado da interação porfirina-melanina. A partir dos dados de espectroscopia Raman fez-se uma atribuição de bandas vibracionais para as porfirinas, comparando-se com os dados disponíveis na literatura para porfirinas semelhantes. Discutiu-se as possíveis mudanças de estruturas provocadas pela melanina na porfirina, baseadas nas diferenças entre os espectros Raman das porfirinas puras e dos complexos porfirina-melanina. Sugeriu-se uma nova interpretação para os espectros eletrônicos das porfirinas baseada no modelo de Gouterman (modelo de quatro orbitais). A partir dessa interpretação do espectro eletrônico analisou-se a perturbação causada pela melanina nos orbitais moleculares da porfirina fazendo=se uma discussão dos espectros de emissão fluorescente das mesmas. Estimou-se a taxa de transferência de energia da porfirina para melanina através da supressão da fluorescência da porfirina, usando-se medidas de fluorescência com resolução temporal. Demonstrou-se que a fluorescência do complexo porfirina-melanina tem um tempo de vida menor que 5 ps. Utilizou-se as medidas de supressão de fluorescência em regime estacionário para determinar as constantes de dissociação do complexo porfirina-melanina e os possíveis sítios de ligação da melanina. Os resultados evidenciam a importante propriedade do polímero de melanina em atuar como eficiente meio para a dissipação não radiativa de estados eletrônicos excitados. / In this work we studied the interaction between some cationic porphyrins and melanin. The porphyrins used were (\'ZN\'-(tetra(4-\'N\'-Metilpiridil)porfina): \'ZN\'-\'T\'\'M\'\'PY\'\'P\', (\'ZN\'-(tetra(4-\'N\'-Benzilpiridil)porfina): \'ZN\'-\'T\'\'BZ\'\'PY\'\'P\', and their respective free bases porphyrins (\'T\'\'M\'\'PY\'\'P\' e \'T\'\'BZ\'\'PY\'\'P\'). Synthetic melanin was obtained from the auto-oxidation of the 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA). From resonance Raman spectra an attribution is made to the vibrational bands of the porphirins, analyzing the effects of the substituents. The possible changes in the porphyrin structure due to the interaction with melanin are discussed based on the modifications of the resonance Raman spectra of the porphyrins in the presence of melanin. From optical absorption and fluorescence measurements it is suggested a new interpretation to the eletronic spectra of the porphyrins based on the Goutermans model. The perturbation due to the melanin in the molecular orbitals of the porphyrins is also analysed. An estimation of the energy transfer rate to the melanin by time resolved fluorescence measurements of the porphyrin-melanin solution is made. It is demonstrated that the fluorescence lifetime of the porphyrin-melanin complexes are lesser than 5ps. The dissociation constants of the porphyrin-melanin complexes and possible sites of binding of the melanin are determined by fluorescence quenching of the porphyrins as observed by steady state measurements. The results show clearly the important role of the melanin to act as an efficient way to the non-radiative dissipation of the excited electronic states of the porphyrins.
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Implicación de SIRT1, una desacetilasa dependiente de NAD+, en la regulación de la transcripción por TGFβ.García Vizcaíno, Eva María 20 June 2006 (has links)
TGFβ produce numerosas respuestas en células eucarióticas. Los principales mediadores de la señalización de TGFβ son las Smad. Proteínas accesorias que interaccionen con las Smads pueden ser responsables de parte de las respuestas de TGFβ. En una búsqueda de nuevas proteínas que interaccionan con Smad2, utilizando el Sistema Doble Híbrido Cyto-Trap, hemos hallado 110 proteínas diferentes. Entre ellas, encontramos Sirt1, una desacetilasa de histonas de tipo III dependiente de NAD+. Hemos realizado un estudio del papel del Sirt1 en la señalización de TGFβ. Hemos mostrado la interacción Smad2/Sirt1 in vivo e in vitro. Hemos realizado un amplio estudio molecular y funcional de la interacción Smad2/Sirt1. Determinamos que Sirt1 no desacetila a Smad2, pero está involucrada en la regulación dependiente de TGFβ de cierto grupo de genes. Finalmente, asociamos el papel de Sirt1 en la regulación de la transcripción por TGFβ a genes específicos que quedan agrupados en funciones celulares concretas. / TGFβ is able to generate a numerous responses in eukaryotic cells. The main mediators in TGFβ signalling are the Smad proteins. Accessory Smad interacting proteins could be responsible for a fraction of the TGFβ-dependent responses. In a search for new Smad2 interacting proteins by using the Cyto Trap Two Hybrid System, we have found 110 different proteins. Among them, we found Sirt1, a type III histone deacetylase dependent on NAD+. We have studied the role of Sirt1 in TGFβ signalling. We have showed that Smad2 and Sirt1 interact both in vivo and in vitro. We did a deep molecular and functional study of the Smad2/Sirt1 interaction. We have shown that Sirt1 does not deacetylase Smad2 but it is involved in TGFβ-dependent transcription of certain set of genes. Finally, we have linked Sirt1 role to TGFβ dependent regulation of genes associated to specific cell processe
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Caracterización de la MAP kinasa ERK5 en células neuronales: papel en la isquemia cerebral e identificación de proteínas asociadas mediante tandem affinity purificationMoreno Iglesias, Ana 27 February 2009 (has links)
La vía de señalización celular MEK5-ERK5 juega un papel importante en sistema nervioso, dado que se activa frente a neurotrofinas, frente al estrés oxidativo producido por reactive oxygen species (ROS), tras la isquemia cerebral y tiene un papel en la especificación de fenotipo neuronal. Sin embargo, poco se conoce sobre los sustratos y proteínas que interaccionan con ERK5. En este trabajo se han identificado proteínas que interaccionan con ERK5 en células de neuroblastoma SH-SY5Y mediante el método TAP (Tandem-Affinity Purification). Se han obtenido diversas proteínas que incluyen proteínas de citoesqueleto, chaperonas y proteínas de metabolismo celular. Entre las proteínas identificadas destacan la proteína chaperona Hsp90β y la piruvato kinasa PKM2. Por otro lado, se ha determinado el papel que juega ERK5 en la isquemia cerebral, utilizando el modelo de privación de oxígeno y glucosa (OGD) en cultivos mixtos de neuronas corticales. ERK5 se degrada rápidamente en respuesta a la OGD en cultivos mixtos de neuronas corticales. Esta degradación es mediada por calpaína. ERK5 también se degrada rápidamente in vivo (4 horas) en córtex de cerebros de ratas Sprague-Dawley sometidas a isquemia por oclusión de la arteria cerebral media. En este trabajo se establece que tras la isquemia, la entrada masiva de calcio a través de los receptores de NMDA y la consiguiente activación de calpaína conlleva la degradación de ERK5, produciéndose así una disminución de los niveles totales de esta kinasa. / MEK5-ERK5 pathway plays an important role in nervous system. This pathway is activated in response to neutrophins, oxidative stress induced by reactive oxygen species (ROS), after cerebral ischemia and plays an important role in neuronal fate determination. However, little is known about substrates and proteins that interact with ERK5. This work describes the search for proteins which interact with ERK5 in the cell line SH-SY5Y using Tandem-Affinity Purification (TAP). Using this technique, we obtained different proteins that include citosqueleton components, chaperons and cell metabolism proteins, among which it is worth highlighting Hsp90β and piruvate kinase PKM2.On the other hand, we have established the role of ERK5 in cerebral ischemia, using oxygen and glucose deprivation model (OGD) in rat mixed neuronal cortical cultures. Using this model we observed that ERK5 is quickly degraded in response to OGD, and that calpain is responsible for ERK5 degradation. ERK5 is also quickly (4 hours) degraded in vivo in cerebral cortex from Sprague-Dawley rats subjected to middle cerebral artery occlusion. On this work we establish that after cerebral ischemia, massive income of calcium mediated by NMDA receptors and resulting activation of calpain entails ERK5 degradation, producing a decrease in total levels of this kinase.
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Characterization of intracellular protein aggregatesVillar i Piqué, Anna 12 June 2013 (has links)
Durant les últimes dècades, l'agregació de proteïnes ha esdevingut un tema d’investigació molt dinàmic que s'estén transversalment per diferents camps de recerca, incloent la bioquímica, la biotecnologia, la biomedicina i la nanotecnologia. D'una banda, l'acumulació de proteïnes en dipòsits amiloids insolubles constitueix una característica comuna de molts trastorns humans, coneguts com a malalties conformacionals. D'altra banda, des d'un punt de vista biotecnològic, l’agregació proteica representa un obstacle habitual en la producció de proteïnes recombinants, que en general s'acumulen en forma de cossos d’inclusió intracel·lulars. Malgrat que els cossos d’inclusió han estat tradicionalment considerats partícules desestructurades i amb molt poc interès, nombroses evidències indiquen que aquests agregats contenen estructura de tipus amiloid, la qual cosa aplana el camí per a emprar-los en l'estudi de l’agregació amiloid.
La tesi que aquí es presenta recapitula la feina pertanyent a una sèrie de publicacions relatives a l’agregació amiloid de proteïnes en l'espai intracel·lular. En tres d'aquests treballs, s'utilitzen tres models cel·lulars diferents filogenèticament distants (bacteris, llevats i plantes) per abordar l’estudi de la formació de dipòsits proteics amb l'objectiu de caracteritzar-los i analitzar-ne el seu impacte en el metabolisme cel·lular. En una publicació complementària, explotem els agregats bacterians per tal de desenvolupar un assaig de screening in vitro per trobar moduladors de l’agregació amiloid. Finalment, també s'inclouen dues obres de revisió sobre la deposició de proteïnes en bacteris i el paper d’aquest organisme com a model per a l'estudi de l'agregació amiloid.
Les dades obtingudes de tots aquests estudis indiquen que l'agregació en conformació amiloid és una propietat genèrica dels polipèptids i un fenomen omnipresent a la natura. No obstant, l'aparició d'aquests dipòsits en l'entorn cel·lular pot anar acompanyada d'un cert grau de toxicitat. Aquí, analitzem l'efecte d'envelliment promogut pels cossos d'inclusió intracel·lulars en cèl·lules bacterianes. A més, descrivim com les cèl·lules procariotes i eucariotes estan dotades d'una poderosa maquinària de qualitat proteica que permet fer front a aquesta situació perjudicial. Addicionalment, la caracterització en profunditat dels agregats proteics en bacteris i del seu procés de formació permet utilitzar-los com a eina en la recerca d'inhibidors de l'agregació amiloid amb potencial interès biomèdic i farmacèutic.
En general doncs, aquesta tesi aprofundeix en l'estudi de l'agregació amiloid de proteïnes i amplia el coneixement per a emprar organismes simples com models cel·lulars rellevants. / During the last decades, protein aggregation has become a dynamic research topic extending across distinct investigation fields, including biochemistry, biotechnology, biomedicine and nanotechnology. On one side, the accumulation of proteins into insoluble amyloid deposits constitutes a common hallmark of many human disorders, known as conformational diseases. On the other side, from a biotechnological point of view, protein deposition is regarded as a usual hindrance in the production of recombinant proteins, which generally assemble into intracellular inclusion bodies. Although inclusion bodies were traditionally considered unstructured particles lacking of interest, the increasing number of evidences indicating that these aggregates contain amyloid-like structure pave the way for employing them in the study of amyloid deposition.
The thesis presented here recapitulates the work belonging to a set of publications concerning amyloid protein aggregation in the intracellular space. In three of these works, we use three distinct cellular models phylogenetically distant (bacteria, yeast and plants) to address the formation of protein deposits with the aim to characterize them and to analyze their impact in the cellular metabolism. In a complementary publication, we exploit bacterial aggregates to develop an in vitro screening assay for amyloid modulators. Finally, we also include two revision works about protein deposition in bacteria and its role as model in the study of amyloid aggregation.
The data collected from these studies indicate that aggregation into amyloid structures is a general property of polypeptides and a ubiquitous phenomenon in Nature. However, the apparition of these deposits in the cellular environment can be accompanied by a certain degree of toxicity. Here, we analyze the aging effect promoted by intracellular inclusion bodies in bacterial cells. In addition, we report how both prokaryotic and eukaryotic cells are endowed with a powerful protein quality machinery to challenge this damaging scenario.
Moreover, the deep characterization of bacterial protein aggregates and their formation process permits their use as a tool in the searching for amyloid aggregation inhibitors with putative biomedical and pharmaceutical interest.
Overall, this thesis delves into the study of amyloid protein aggregation and adds insights to employ simple organisms as relevant cellular models.
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The structure and function of maize scutellum during early stages of germinationTnani, Hédia 18 July 2012 (has links)
The embryo in grasses, at grain maturity, comprises the embryonic axis and the scutellum. The scutellum is supposed to be the single cotyledon in the monocotyledoneus embryos and is attached to the embryo axis in the scutelar node. The embryo has the highest concentration of lipid and lipid soluble vitamins in cereal grains. The embryo in grasses, at grain maturity, comprises the embryonic axis and the scutellum. The scutellum is supposed to be the single cotyledon in the monocotyledoneus embryos and is attached to the embryo axis in the scutelar node. The embryo has the highest concentration of lipid and lipid soluble vitamins in cereal grains.
The embryonic axis originates the root, leaves and stem of the new plant. In the mature seed, the embryo axis is formed by the primary root, protected by the coleorhiza, and the stem tip with five or six short internodes and leaf primordia which, as a whole, form the plumule that is surrounded by the coleoptile.
The name scutellum (small shield, in latin) derives from its shield-like shape and it liesbetween the embryonic axis and endosperm. Dissected scutellum constitutes 11% or the kernel mass, and about 90% of the embryo.
During germination, scutellar epithelial cells suffer an elongation that increases the contact surface between the endosperm and the scutellum and facilitates the transport of the nutrients from the endosperm to the embryo. Scutellar cell elongation is inhibited by ABA and salicylic acid, basic and acid pH and high concentrations of sorbitol. Exogenous gibberellins stimulate elongation, but a reduction in gibberellin synthesis or perception does not inhibit it. Elongation is inhibited by sucrose, but not glucose. Transcription and translation inhibitors reduce scutellar cell elongation, indicating that transcription and translation are necessary for the elongation process.
Scutellar epithelium cells play specific roles during germination different to parenchymal cells. So, we expect some differences in the gene expression pattern of this tissue. That’s why we construct a cDNA library using RNA extracted from scutellar epithelial cells 1 day after imbibition and selected them using array hybridization comparing the mRNA accumulated in epithelial cells with the mRNA accumulated in the other scutellar tissues. We identified 30 genes up-regulated in the epithelium. A high proportion of these genes are involved in metabolic processes, the production of energy or in the transport of peptides into the embryo. The roles of 43% of these genes remains undetermined, 27% of them are involved in metabolic processes, 13% in protein synthesis or processing and 7% in cell structure.
One of the identified genes from the macroarrays is a peptide transporter: ZmPTR1. It encodes a non-characterized maize peptide transporter protein which has 587 amino acids with a calculated molecular mass of 64.52 kDa. This maize transporter is predominantly expressed in the scutellar epithelium during germination. ZmPTR1 is also expressed to a less extent in the radicle and the hypocotyl. ZmPTR1 is located in the tonoplast and has high sequence similarity with tonoplast di- and tripeptide transporters AtPTR2, AtPTR4 and AtPTR6 from Arabidopsis thaliana. ZmPTR1 is able to transport at least Ala-Ala dipeptide across the membrane and could have a role in the intracellular transport of di- and tripeptides.
Seed germination is a complex process that requires cell division, expansion and differentiation. It involves the activation of many metabolic pathways and signal transduction processes, which require a great quantity of energy and stored materials which are provided by seed reserves (oil, storage proteins and starch) and the synthesis and/or activation of many proteins. Plant seeds store triacylglycerols (TAGs) into oil bodies (OBs), specialized organelles which serve as an energy reserve during germination and post-germinative growth.
Protein composition analysis of oil bodies from maize embryos during germination identified, in addition to the previously characterized OB-associated proteins, other proteins of diverse function: an embryonic protein DC-8, a globulin 2, 4 proteins with enzymatic activity (protein disulfide isomerase, xylose isomerase, strictosidine synthase and precursor and ATP synthase beta chain), a protein similar to karyopherin- beta-3 (Kap) and a stress induced membrane pore protein involved in membrane transport.
Quantitative subproteomic analysis of germinating related changes in the oil bodies of maize scutellum between dry seeds and 2 dai seeds allowed the identification of new proteins interacting with oil bodies in dry seeds or in germinating seeds. In dry seeds: oleosins, cupins, disulfide isomerases, a nucleoside phosphate kinase, a class IV heat shock protein, an embryonic protein DC-8, a 60S acidic ribosomal protein P0 and a rubber elongation factor protein. In germinating seeds: oleosins, mitochondrial protein Tim17, prohibitin-2 and a manganese superoxide dismutase (Mn-SOD). / ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL ESCUTELO DE MAÍZ DURANTE LAS PRIMERAS ETAPAS DE LA GERMINACIÓN
Durante la germinación, las células epiteliales del escutelo sufren una elongación que aumenta la superficie de contacto entre el endospermo y el embrión y facilita el transporte de los nutrientes del endospermo al embrión. La elongación de las células del escutelo es inhibida por ABA y ácido salicílico, pH básico y ácido y altas concentraciones de sorbitol. Las giberelinas exógenas estimulan la elongación, pero una reducción en la síntesis de giberelinas o percepción no la inhiben. La elongación es inhibida por la sacarosa, pero no la glucosa. Los inhibidores de la transcripción y traducción reducen el alargamiento de las células escutelares, lo que indica que la transcripción y la traducción son necesarias para el proceso de alargamiento.
Se identificaron 30 genes que muestran una expresión diferencial significativa en las células epiteliales del escutelo de un día después de la imbibición. Las funciones de un 43% de estos genes no se conoce, el 27% de ellos están involucrados en los procesos metabólicos, el 13% en la síntesis o la transformación de proteínas y el 7% en la estructura celular.
ZmPTR1 codifica un transportador de maíz péptido no ha sido previamente caracterizado, se expresa predominantemente en el epitelio escutelar durante la germinación. ZmPTR1 se expresa también en menor medida en la radícula y del hipocotilo. La proteína ZmPTR1 se localiza en el tonoplasto y es homóloga a las otras proteínas transportadoras de di-y tripéptidos AtPTR2, AtPTR4 y AtPTR6 de Arabidopsis thaliana. ZmPTR1 es capaz de transportar al menos el dipéptido Ala-Ala.
El análisis proteómico de las proteínas asociadas a los cuerpos lipídicos en escutelo de maíz durante la germinación ha permitido la identificación de, además de proteínas previamente caracterizadas asociadas OB, otras proteínas de funciones diversas.
El Análisis cuantitativo subproteómico de los cambios relacionados con los cuerpos lipídicos en el escutelo de maíz entre semillas secas y semillas 2 dias después de la germinación permitieron la identificación de nuevas proteínas que interactúan con los cuerpos lipídicos en las semillas secas o en la germinación de las semillas.
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Control hormonal i genètic de la síndrome de fugida de l’ombra en "Arabidopsis thaliana"Salla i Martret, Mercè 03 September 2012 (has links)
Les plantes disposen d’una sèrie de fotoreceptors que informen de manera contínua sobre les característiques lumíniques ambientals, permetent optimitzar el seu creixement i desenvolupament. Els fitocroms són els fotoreceptors millor caracteritzats, que absorbeixen en la regió del roig (R) i del roig llunyà (FR). De tots els processos que regulen, la síndrome de fugida de l’ombra o SAS (de l’anglès shade avoidance syndrome) és probablement el més important en plantes crescudes en llum. La SAS es refereix al conjunt de respostes induïdes en plantes creixent en alta densitat o sota una coberta vegetal. Malgrat la complexitat d’aquestes respostes, la SAS s’indueix per un sol senyal ambiental, que és la disminució de la raó R:FR, la percepció de la qual pels fitocroms inicia una xarxa transcripcional. En el nostre laboratori ens hem centrat en un grup de gens l’expressió dels quals està ràpida i directament alterada per llum de baixa raó R:FR o ombra simulada, anomenant-los gens PAR (de l’anglès phytochrome rapidly regulated). En la present tesi s’ha aprofundit en l’estudi de la cadena de transducció de la senyal en la SAS en Arabidopsis thaliana, emfatitzant en els punts de connexió amb les rutes transcripcionals hormonals.
Resultats d’aquesta tesi, que es complementen amb d’altres obtinguts anteriorment en el grup, demostren que un dels gens PAR, ATHB4, que codifica per un factor de transcripció del tipus Homeo-Domain Leucine-Zipper (HD-ZIP subfamília II), té un paper en la senyalització de la SAS com a un modulador complex en aquestes respostes, involucrant diferents hormones en la seva acció. Per dur-ho a terme es van fer aproximacions amb mutants de guany de funció (de sobreexpressió constitutiva amb activitat induïble) i de pèrdua de funció. Particularment s’ha caracteritzat fisiològica, molecular i histològicament el doble mutant athb4hat3, resultats que mostren una disminució de la resposta a diferents estímuls (hormonals i de llum) d’aquest doble mutant. També hem investigat el paper d’ATHB4 com a regulador del desenvolupament vegetal coactuant amb HAT3 a través d’estudis histològics i moleculars del doble mutant ahb4hat3, el qual mostra fortes alteracions morfològiques relacionades amb la polaritat en el desenvolupament.
Per aprofundir, hem investigat el paper dels quatre membres més propers (pertanyents a HD-Zip II) en les respostes SAS i al control hormonal a nivell molecular i/o fisiològic utilitzant línies de sobreexpressió i de pèrdua de funció, englobant els resultats en un possible mòdul regulador de determinades respostes de la planta.
Aquesta hipòtesi ve recolzada pels resultats que els identifiquen com a gens reguladors complexos d’aquesta resposta.
En paral•lel, hem estudiat l’expressió de SAUR15, un gen de resposta a auxines, BRs i ombra simulada; el qual està regulada per ATHB4 de manera directa. S’han identificat elements E-box i AREs, i s’ha estudiat el seu paper en les respostes a ombra i a hormones. Els nostres resultats mostren que aquests elements no són imprescindibles per a la correcta resposta del promotor als estímuls aplicats.
Una altra aproximació fou l’estudi de la resposta SAS de mutants específics de brassinosteroides i auxines (els quals estan relacionats amb la modulació de l’expressió de SAUR15), on resultats de la tesi suggereixen una connexió entre BRs i la resposta a ombra simulada.
Els resultats obtinguts en quant a components moleculars involucrats en les respostes SAS provenen de l’anàlisi de tota la plàntula sencera. Donat que els llocs de percepció de la llum i de l’acció poden estar físicament separats a la planta, vam estudiar la importància de la comunicació a llarga distància per entendre com la planta creix i es desenvolupa regulada per la llum durant la SAS, obtenint com a resultat que tant els cotilèdons com el meristem apical són importants, però no imprescindibles, en aquesta resposta. / "Hormonal and genetic control of shade avoidance syndrome in Arabidopsis thaliana "
Plants sense the presence of competing neighboring vegetation as a change in light quality: i.e. they sense the reduced ratio of red light to far-red light. The responses to shade are generally referred to as the shade avoidance syndrome (SAS), and involve various developmental changes intended to outgrow or outcompete the neighboring plants.
In this thesis we analyzed the function of ATHB4, a gene encoding a homeodomain-leucine zipper (HD-Zip) class-II transcription factor from Arabidopsis thaliana, the expression of which is rapidly and directly upregulated after proximity perception by the phytochrome photoreceptors. Our results, altogether with previous studies in my group, suggest that some members of this small gene subfamily can modulate SAS responses by controlling auxin, brassinosteroid and gibberellin molecular and/or physiological responsiveness.
In particular, we propose ATHB4 as a new shade signaling component that participates in integrating shade perception and hormone-mediated growth. To get this conclusion we perform experiments with overexpression and loss-of-function lines. We specially characterized double mutant athb4hat3, which has strong morphological alterations, and which let us find a connection point between light and development concerning polarity.
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Estudio del proceso de sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR).Cerezo Fernández, David 19 September 2013 (has links)
INTRODUCCIÓN: La adquisición del fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) en células tumorales las convierte en resistentes a fármacos antineoplásicos y es una de las principales causas del fracaso de la quimioterapia en algunos tumores. La expresión de glicoproteína P (MDR-1, P-gp, ABCB1) contribuye a esta resistencia expulsando los fármacos o regulando la muerte celular programada. Por otro lado, la sobreexpresión de miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 observada en tumores sanguíneos se ha asociado a la resistencia a quimioterapia en varios cánceres humanos. También es importante estudiar alteraciones en las rutas de señalización de MAPKs y la secreción de citocinas en las células con fenotipo MDR. OBJETIVOS: El propósito de este trabajo fue encontrar un estímulo capaz de inducir sensibilidad colateral en células leucémicas murinas y humanas con fenotipo MDR, y caracterizar el tipo de muerte celular inducida. El segundo propósito fue estudiar la contribución de MDR-1, caspasas, proteínas de la familia Bcl-2, MAPKs y citocinas al proceso de sensibilidad colateral. MATERIALES Y MÉTODOS: Para alcanzar nuestros objetivos, usamos células leucémicas murinas L1210 y su sublínea celular resistente L1210R, así como una línea celular procedente de la línea L1210 transfectada con un plásmido que contenía el gen MDR-1 (CBMC-6). Se realizó western-blot para estudiar la expresión de proteínas, inhibición de MAPKs y caspasas y silenciamiento de ARN de MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 y Bax para estudiar el papel de estas proteínas. RESULTADOS: Se encontró que las células leucémicas resistentes con sobreexpresión de P-gp, pero no sus parentales sensibles, son hipersensibles a estrés hipotérmico produciéndose apoptosis a temperaturas por debajo de 4ºC. La transfección de la línea celular parental con un plásmido que contiene P-gp las convierte en sensibles a estrés hipotérmico, demostrando la asociación entre la expresión de P-gp y la muerte celular provocada por el frío. También observamos un incremento de la expresión basal y actividad del fragmento activo de caspasa 3 a temperatura fisiológica (37ºC) en las células MDR. La inhibición de caspasa 3 rescató parcialmente a las células leucémicas MDR de la apoptosis inducida por el frío, lo que sugiere que el mecanismo de muerte celular depende de caspasa 3. Esto demuestra que la expresión de P-gp juega un papel importante en la supervivencia de las células MDR y es acompañada por un proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico. Se observó que la línea parental leucémica (L1210) y la línea celular CBMC-6 presentan una alta expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL, mientras que la expresión de Bcl-2 es baja. Por el contrario, en las células L1210R se observó una disminución de la expresión de Bcl-xL y un aumento de Bcl-2. La inhibición de dirigida de proteínas anti-apoptóticas confirma que la expresión de Bcl-xL es un regulador clave de la supervivencia de las células leucémicas. En contraste, el silenciamiento de Bcl-2 muestra que la supervivencia de las células L1210R no depende del nivel de expresión de Bcl-2. Así, nuestros datos demuestran que la supervivencia de la línea celular parental depende de la expresión de Bcl-xL, pero la adquisición del fenotipo MDR elimina esta dependencia y podría depender de varios miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. Además, los resultados obtenidos en las células CBMC-6 demuestran que P-gp tiene poca influencia sobre las proteínas de la familia Bcl-2. Resultados similares se obtuvieron bajo condiciones de estrés hipotérmico y exposición al fármaco daunomicina. En relación a la ruta de señalización de MAPKs, demostramos su importancia en el desarrollo del fenotipo MDR, así como en el desarrollo de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico, demostrando que la inhibición de ERK y JNK puede proteger, parcialmente, de la muerte celular inducida por el frío en las células L1210R y CBMC-6. CONCLUSIONES: El proceso de sensibilidad colateral a estrés hipotérmico está asociado al fenotipo MDR en células murinas, y ocurre a través de un proceso de apoptosis dependiente de caspasas. La expresión y funcionalidad de MDR-1 está asociada a la sensibilidad a hipotermia en células murinas. El desarrollo del fenotipo MDR está acompañado de cambios en la expresión de proteínas Bcl-2, pero éstas no influyen en la sensibilidad colateral. La señalización a través de ERK y JNK está implicada en la sensibilidad colateral observada en las células MDR. La señalización a través de citocinas podría tener un papel importante en la respuesta a estrés de las células MDR. / INTRODUCTION: The acquisition of a multidrug-resistant (MDR) phenotype by tumor cells that renders them unsusceptible to anti-neoplasic agents is one of the main causes of chemotherapy failure in human malignancies. The increased expression of P-glycoprotein (MDR1, P-gp, ABCB1) in tumor cells contributes to drug resistance by extruding chemotherapeutic agents or by regulating programmed cell death. In the other hand, over-expression of anti-apoptotic Bcl-2 family members has been reported in hematologic malignancies and has been associated with chemotherapy resistance in various human cancers. As these findings, it is important to study alterations in MDR cells on MAPKs pathway and citokines secretion. OBJECTIVES: The aim of this work was to find a stimulus able to induce collateral sensitivity in murine and human leukemic MDR cells, and to characterize the type of death induced. The second aim was to study the contribution of MDR-1, caspases, family Bcl-2 proteins, MAPKs and citokines to this collateral sensitivity process. MATERIALS AND METHODS: To reach our objectives we used L1210 murine leukemia cells and its resistant derived cell line L1210R, as well as a transfected with a plasmid containing MDR-1 cell line obtained from L1210 (CBMC-6). It was used western-blot to study proteins expression, inhibition of MAPKs and caspases and RNAm silencing of MDR-1, Bcl-xL, Bcl-2 and Bax family to study the role of this proteins. RESULTS: It was found that resistant leukemic cells with P-gp over-expression, but not their sensitive counterparts, are hypersensitive to cold-induced cell death when exposed to temperatures below 4ºC. Transfection of parental cells with a P-gp-expressing plasmid makes these cells sensitive to cold stress, demonstrating an association between P-gp expression and cell death at low temperatures. Furthermore, we observed increased basal expression and activity of effector caspase-3 at physiological temperature (37ºC) in MDR cells. Treatment with a caspase-3 inhibitor partially rescues MDR leukemic cells from cold-induced apoptosis, which suggests that the cell death mechanism may require caspase-3 activity. Taken together, these findings demonstrate that P-gp expression plays a role in MDR cell survival, and is accompanied by a collateral sensitivity to cold stress. We demonstrate that parental leukemic (L1210) and CBMC-6 cells display high constitutive expression of anti-apoptotic Bcl-xL protein, while Bcl-2 protein expression was very low. By contrast, leukemic cells L1210R display a decrease of Bcl-xL and up-regulation of Bcl-2 protein expression levels. Furthermore, targeted inhibition of individual anti-apoptotic proteins by RNA silencing confirms that Bcl-xL expression is a key regulator of leukemic cells survival. In contrast, the silencing of Bcl-2 shows that L1210R survival doesn’t depend on Bcl-2 expression level. Together, our data demonstrate that parental leukemic cells survival are largely dependent on Bcl-xL protein expression, but acquisition of MDR phenotype by such cells abrogate such survival dependence and suggests that resistant cells became probably dependent on more than one anti-apoptotic protein for survival at physiological conditions. Additionally, the results obtained with CBMC-6 cells demonstrate that P-gp exert slight influence in the expression level of Bcl-2 family members. Similar results were obtained under cold stress and drug exposure. Related to MAPKs signaling pathway, we have addressed it importance in MDR phenotype development, as well as in hypothermia collateral sensitivity, showing that ERK and JNK inhibition can protect, partially, against stress-cold induced-death in L1210R and CBMC-6 cell lines. CONCLUSIONS: Collateral sensitivity to cold stress is associated to MDR phenotype in murine cells, and it occurs by a caspase-dependent apoptosis process in murine cells. Expression and functionality of MDR-1 is strongly associated to hypothermia sensitivity in murine cells. MDR phenotype development is accompanied by changes in Bcl-2 family proteins expression, but it is not shown an association with collateral sensitivity. ERK and JNK signaling pathways are implicated in collateral sensitivity process observed in MDR cells. Citokines signaling could play an important role on MDR cells stress response.
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Identificación de interactores del regulador de la homeostasis lipídica AtArv1: caracterización del factor de transcripción anclado a membrana maMYB de ArabidopsisCaudepón Giménez, Daniel 15 December 2014 (has links)
Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenómica (CRAG) / Los estudios realizados sobre la proteína Arv1 en levaduras y animales indican que estaría involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica intracelular, aunque se desconoce su función bioquímica concreta. A. thaliana posee los genes ARV AtARV1 y AtARV2, que codifican las proteínas funcionales AtArv1 y AtArv2, respectivamente, ancladas a la membrana del RE. Partiendo de la hipótesis de que las proteínas AtArv interaccionan con otras proteínas para poder ejercer su función biológica, este trabajo se inició con el cribado de un banco de cDNA de plántulas de Arabidopsis empleando AtArv1 como cebo y la técnica de doble híbrido en levadura (MbYTH), donde se identificó que la proteína maMYB interacciona con AtArv1. La proteína maMYB, codificada por un único gen en Arabidopsis, tiene características de un MTTF de la familia MYB, puesto que contiene un dominio citosólico R2R3-MYB en la región C-terminal y dos DTMs en la región N-terminal. En este sentido, se determinó que maMYB se localiza en las membranas del RE y presenta ambos extremos proyectados hacia el citosol. Además, se demostró que la versión truncada maMYB91-309, que contiene el dominio citosólico R2R3-MYB, se localiza en el núcleo y preferentemente en el nucléolo. El análisis del patrón de expresión de la proteína maMYB reveló que lo hace mayoritariamente en raíz y parte aérea de plántulas de Arabidopsis. Empleando una estrategia de silenciamiento inducible basada en el uso de microRNAs artificiales (amiRNA), se obtuvieron líneas mutantes de maMYB condicionales en donde se observó una reducción pronunciada en los niveles de mRNA y proteína maMYB y una alteración severa del desarrollo de las plántulas de Arabidopsis, que se caracterizó por una reducción del tamaño general de la plántula, una disminución de la longitud de la raíz primaria, una inhibición de la formación de raíces laterales y pelos radiculares, una alteración en la forma, el tamaño y el número de las células de las diferentes capas de la raíz, una desestructuración de las células epiteliales de los cotiledones y una alteración en los niveles de los productos finales de la ruta de esteroles y de sus precursores inmediatos. Mediante el estudio de la expresión génica global con la tecnología RNA‐seq se determinó que el silenciamiento de maMYB provoca la desregulación de grupos de genes involucrados en el desarrollo y el crecimiento de la planta, que son coherentes con el fenotipo observado. Tanto en la raíz como en la parte aérea se identificaron genes desregulados involucrados en la elongación celular y relacionados con la pared celular. En la raíz se identificaron genes desregulados relacionados con la síntesis de chalconas, el transporte de auxinas y la morfogénesis de los pelos radiculares. En la parte aérea se identificaron genes desregulados implicados en la síntesis de fenilpropanoides y auxinas y la respuesta a auxinas. Además, los genes desregulados como consecuencia del silenciamiento de maMYB presentan un alto enriquecimiento de genes regulados epigenéticamente a través de la trimetilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3), lo que sugiere que maMYB podría estar relacionado con este proceso necesario para el correcto desarrollo de la planta. Por otro lado, se observó que la sobreexpresión de maMYB91-309 revierte (en mayor o menor medida) el fenotipo causado por el silenciamiento de maMYB, lo cual avala la funcionalidad in vivo del dominio citosólico y el papel de maMYB como MTTF, cuyo dominio R2R3-MYB citosólico necesitaría liberarse por acción de proteasas intramembrana y trasladarse al núcleo donde ejercería su función. Las alteraciones observadas en el desarrollo de los mutantes de silenciamiento de maMYB sugieren que éste sea un MTTF que se libere en respuesta a estímulos de desarrollo. / In yeast and animals, Arv1 protein is involved in the intracellular lipid homeostasis, although its particular biochemistry function remains unknown. A. thaliana has the ARV genes AtARV1 and AtARV2, which codify the functional proteins AtArv1 and AtArv2, respectively, tethered to the ER membrane. Assuming that AtArv proteins need to interact with other proteins to carry out its biological function, this work was initiated with a screening of a cDNA library from Arabidopsis seedlings using AtArv1 as a bait and the yeast two hybrid version MbYTH, where we identified maMYB as an interactor of AtArv1. maMYB protein, codified by a unique gene in Arabidopsis, has characteristics of MYB family MTTF, since it contains a citosolic R2R3-MYB domain at the C-terminal region and two TMDs at the N-terminal region. In this way, we demonstrated that maMYB is localized in the ER membrane facing both extremes to the citosol, and the truncated form maMYB91-309, which contains the R2R3-MYB domain, is localized in the nucleus and preferentially in the nucleolus. The analysis of the expression pattern of maMYB protein revealed that the highest levels were found in the root and the shoot of Arabidopsis seedlings. Using an inducible silencing strategy based on the artificial microRNAs (amiRNAs) technology, we obtained maMYB inducible silencing mutants that showed a strong alteration in the root and shoot development of Arabidopsis seedlings. Through a global expression study using RNA-seq technology, we determined that maMYB silencing causes the deregulation of gene groups involved in plant development and growth, which is coherent with the observed phenotype. Interestingly, we observed that the maMYB91-309 overexpression revert (at more or less extent) the phenotype caused by maMYB silencing, which support the functionality of the citosolic R2R3-MYB domain in vivo and the role of maMYB as a MTTF, whose R2R3-MYB domain may be released by the action of intramembrane proteases and be transported to the nucleus where it may develop its function. The developmental alterations observed in the maMYB silencing mutants suggest that maMYB might be a MTTF released in respond to developmental cues.
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Exploring the mechanism of action of human antimicrobial ribonucleasesSalazar Montoya, Vivian Angélica 04 September 2015 (has links)
Las ribonucleases humanas son un grupo heterogéneo de proteínas pertenecientes a la
superfamilia de la Ribonucleasa A. Estas proteínas se caracterizan por su capacidad de
hidrolizar ácidos ribonucleicos y por la presencia de actividad antimicrobiana frente
diversos organismos patógenos como bacterias, hongos, parásitos y virus.
El primer objetivo del presente estudio doctoral se centra en la caracterización de la
actividad antimicrobiana y en modelos de membrana de las formas nativas de la
ribonucleasa 3 purificadas a partir de eosinófilos. Las distintas formas nativas presentan
modificaciones postraduccionales dadas por diversos grados de glicosilación que se
correlacionan con la activación de los eosinófilos durante los procesos inflamatorios. El
estudio establece la capacidad antimicrobiana de las formas nativas y su actividad en
modelos de membrana. Los resultados indican que las modificaciones
postrasduccionales modulan la actividad biológica de la RNasa 3, sugiriendo una
contribución in vivo en su función fisiológica.
Como segundo objetivo de esta tesis, se evaluó por primera vez en nuestro grupo de
investigación la actividad antimicótica de las ribonucleasas 3 y 7 frente al hongo
Candida albicans, el cual fue elegido como modelo patógeno eucariota. Se determinó y
caracterizó la presencia de actividad frente a Candida por parte de ambas ribonucleasas
humanas.
Por último, el tercer objetivo de esta tesis se centra en la purificación y caracterización
de la ribonucleasa 8, la más reciente ribonucleasa humana descrita, identificada
inicialmente en placenta. La RNasa 8 presenta un patrón inusual de enlaces disulfuro
respecto a sus proteínas homólogas. Este cambio estructural modifica la estabilidad de
la proteína y expone regiones que facilitan el proceso de agregación proteica. Fue
necesaria la previa optimización de un protocolo alternativo de purificación. Se
analizaron sus propiedades antimicrobianas, sugiriendo su posible participación en la
respuesta inmunitaria innata.
Los resultados del presente estudio corroboran las propiedades antimicrobianas de
diversas ribonucleasas humanas miembros de la familia de la RNasa A, sugiriendo una
función ancestral en el sistema de defensa innato. El estudio contribuye a la
comprensión de su mecanismo de acción y plantea su potencial uso como herramientas
terapéuticas. / Human ribonucleases are a heterogeneous group of proteins belonging to the
superfamily of RNase A. These proteins are characterized by their ability to hydrolyse
ribonucleic acids and the presence of antimicrobial activity against various pathogens
including bacteria, fungi, parasites and viruses.
The first objective of this doctoral study is focused on the antimicrobial characterization
of native Ribonuclease 3 forms purified from eosinophils. Native forms present posttranslational
modifications giving different glycosylation grades that modulate their
activity during inflammatory processes. This study aims to establish the antimicrobial
properties of native forms purified from eosinophils and their activity in a membrane
model system. Results indicate that post-translational modifications contribute to the the
protein biological activities, suggesting a related physiological role.
As a second objective, we evaluated for the first time the antifungal activity of the
antimicrobial RNase 3 and RNase 7 against Candida albicans, an eukaryotic pathogen
selected as a simple model to test the antimicrobial mechanism of action. Both human
ribonucleases displayed a high antifungal activity. Results highlighted a dual
mechanism of action, where cell lysis takes place at high protein concentration, while
depolarization, cell internalization and cellular RNA degradation is achieved at
sublethal doses.
Finally, the last objective is focused on the characterization of ribonuclease 8, also
called the placental RNase, the most recent human ribonuclease described. RNase 8 has
gained and lost one cysteine residue in non-conserved positions in a mechanism called
"disulphide shuffling". The protein tendency to aggregate required the design of an
alternative purification protocol. We analysed its antimicrobial abilities, suggesting a
possible role in innate defence.
The results of this study confirmed the high antimicrobial activity of several human
ribonucleases from the RNase A superfamily suggesting an ancestral role in the host
immune defence response. The study contributed to the understanding of their
mechanism of action and set the basis for applied drug design.
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Analysis of the functional roles of Mammary Serum Amyloid A3 proteinDomènech Guitart, Anna 30 September 2013 (has links)
La Serum Amiloide A3 (M‐SAA3) mamària és una proteïna de fase aguda expressada
principalment a la glàndula mamària. Els nivells d’expressió de la M‐SAA3 varia en diferents
situacions fisiològiques, el que suggereix un rol important a nivell funcional. Per tal d’analitzar
les propietats de la proteïna, es van dur a terme quatre estudis. En el primer, la M‐SAA3 va ser
expressada de forma recombinant en un sistema bacterià. Aquest pas és important ja que ens
proporciona una font de proteïna, en casos en que la purificació de fonts naturals representa
clarament un coll d’ampolla. Es va obtenir la seqüència de dues isoformes, però només una va
ser expressada recombinantment. La principal diferència entre les dues formes era una deleció
en la regió del motiu SNARE, el que suggeria que aquest motiu pot estar implicat en una
activitat antibacteriana directe. A més, en el primer estudi es va analitzar la primera
funcionalitat. La M‐SAA3 activava la fagocitosi mediada per macròfags, incrementant el
nombre de macròfags actiu i la seva capacitat fagocítica. En el segon estudi es va analitzar
l’efecte protector a nivell gastrointestinal. La M‐SAA3 clarament reduïa la translocació de
bacteris enteropatògens en cèl∙lules CaCo‐2, una línia d’epiteli intestinal comercial. La M‐SAA3
també afectava la expressió de MUC3 i IL‐8, incrementant els seus nivells, el que connecta de
forma directa la proteïna amb la resposta immune innata. En el tercer estudi, es va
desenvolupar un model intestinal en boví a partir de cultius ex vivo de Plaques de Peyer.
Aquests cultius ex vivo ofereixen un ambient únic on coexisteixen diferents tipus cel∙lulars i
una aproximació més realista a la situació in vivo. En aquest context la infecció també va ser
disminuïda i la M‐SAA3 incrementava els nivells de IL‐8 i INFγ. Per contra, les mucines no es
van veure afectades, i la protecció va ser assolida per sobre‐expressió de Occludina i Claudina‐
2, proteïnes que formen les tight junctions, encarregades de segellar la barrera epitelial. A
més, es va demostrar que la M‐SAA3 activa cèl∙lules dendrítiques, incrementant l’expressió de
citoquines i marcadors de maduració, migració i presentació d’antigen. En el quart i últim
estudi, es va avaluar la possible aplicabilitat a nivell de la industria lletera. La M‐SAA3 va ser
infosa intra‐mamàriament durant el secat, un període on es deixa de munyir les vaques per tal
d’afavorir la regeneració cel∙lular i augmentar la seva productivitat. La M‐SAA3 va incrementar
paràmetres relacionats amb una activació de l’involució tals com les metaloproteinases. Els
nivells de proteïna i greix també eren augmentats i es va observar un augment numèric del
recompte de cèl∙lules somàtiques. També es va observar que la proteïna incrementava
l’expressió de IL‐8 i TNFα en cultius primaris de glàndula mamària, i també inhibia la infecció
bacteriana. Finalment, les cèl∙lules dendrítiques també eren activades en absència d’infecció / Mammary Serum Amyloid A3 (M‐SAA3) is an acute phase protein mainly expressed in the
mammary gland. The levels of the protein vary in different physiological situations, indicating
that may play an important functional role. In order to analyze the protein properties four
studies were performed. In the first study, the protein was recombinantly produced in a
bacterial expression system. This was important, as difficulty in protein purification from
natural sources is a clear bottleneck for functional studies. Two M‐SAA3 isoforms were
obtained, but only one succeeded in the recombinant expression. Interestingly, the main
difference was in a 3 amino acid deletion in the SNARE motif, which could be implicated in the
direct bacterial killing. Moreover, the first functional role was evaluated. M‐SAA3 clearly
enhanced macrophages phagocytosis, increasing both the number of active macrophages and
the phagocytic capacity. In the second study, the protective effect at a gastrointestinal level
was assessed. M‐SAA3 protein inhibited the translocation of enteropathogenic bacteria in
CaCo‐2 cells, a commercial intestinal epithelial cell line. In addition, M‐SAA3 protein increased
the expression of MUC3 and IL‐8, which directly connected the protein with the innate
immune response activation. In the third study, a bovine intestinal model was developed using
ex vivo Peyer’s Patches cultures. The ex vivo methodology offered a unique environment
where different cell types coexist, and indeed, represent a more similar approach to an in vivo
situation. In this context, the infection was also prevented, and a clear innate immune
response was activated. M‐SAA3 clearly activated the expression of IL‐8, INFγ but in this case,
mucins were not up‐regulated. The bacterial translocation was achieved by an increase in the
Occludin and Claudin‐2 expression, tight junction genes that directly participate in the sealing
of the epithelial barrier. Furthermore, the M‐SAA3 directly activated dendritic cells functions,
increasing their cytokine expression profile and cellular markers related to maturation,
migration and antigen presentation. In the fourth and last study, the potential applicability in
dairy industry was evaluated. M‐SAA3 was infused in the mammary gland at dry off, a period
of milking cessation which permits the mammary gland regeneration for an optimal production
in following lactations. M‐SAA3 increased parameters related to an increased involution of the
mammary gland, such as metalloproteinases. Also protein and fat were increased and a
numerical increase in the somatic cell count was observed. In addition, M‐SAA3 raised the IL‐8
and TNFα levels in primary mammary gland cultures, and inhibited bacterial infection. Finally,
dendritic cells were also activated by M‐SAA3 in absence of infection.
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