Els test de resistència al antiretrovirals són utilitzats en la pràctica clínica per la personalització del tractament antiretroviral (TARV) de les persones infectades pel VIH-1. La seqüenciació poblacional (SP) és la tècnica més emprada pel genotipat del VIH-1 obtenint una bona correlació amb la resposta clínica dels pacients. No obstant, la baixa sensibilitat de la SP pel que fa a la detecció de mutacions de resistència als antiretrovirals (DRM) o soques X4-tròpiques presents en baixes prevalences pot comprometre l’eficàcia del TARV. L’aplicació de noves tècniques de seqüenciació massiva pel genotipat del VIH-1 (genotipat ultrasensible) permetria una caracterització de la població viral amb major resolució optimitzant el TARV. L’objectiu d’aquesta tesi era avaluar el valor clínic del genotipat ultrasensible pel maneig clínic de pacients infectats pel VIH-1 que han estat exposats a TARV. Durant la utilització de 454 sequencing per la determinació del tropisme viral, 454 sequencing va obtenir una major concordança amb ESTA (Enhanced Sensitivity TrofileTM Assay) en l’anàlisi de l’ARN viral. Tot i que la SP tenia una menor sensibilitat respecte 454 sequencing, la seva elevada especificitat li va permetre obtenir una millor precisió. Anàlisis filogenètics a partir de dades obtingudes per 454 sequencing van revelar que, encara que les determinacions eren equivalents entre amdós compartiments, en alguns pacients es va observar compartimentalització de seqüències pel que fa als haplotips i a la seva prevalença. Aquesta compartimentalització podria comprometre la determinació del tropisme viral en funció del compartiment que s’analitzi. Durant aquest treball també es va fer la validació de la SP per determinacions del tropisme a partir d’ADN proviral en un assaig clínic prospectiu i aleatoritzat. Aquest assaig va demostrar ser útil per guiar canvis de tractament antiretroviral que incloguin antagonistes de CCR5. De tota manera, 454 sequencing va ser capaç de detectar variants X4 tròpiques en dos pacients prèviament classificats com a R5 tròpics per SP. Pel que fa a la detecció de DRM en el gen pol, 454 sequencing va demostrar ser no-inferior a la SP durant l’avaluació de la susceptibilitat al tractament antiretroviral. Cal destacar que 454 sequencing va aportar informació genotípica addicional en la majoria dels pacients, encara que aquesta modifiqués poques prediccions de susceptibilitat. A més, aquesta tecnologia va ser utilitzada per explorar l’origen de les DRM en el gen de la integrasa del VIH-1, demostrant que virus mutants detectats durant el fracàs virològic poden ésser originats a partir de virus mutants minoritaris preexistents. En resum, aquesta tesi ha mostrat la utilitat clínica del genotipat ultrasensible del VIH-1 en pacients experimentats al TARV. 454 sequencing ha permès una profunda caracterització de la diversitat viral dins l’hoste, facilitant l’estudi l’evolució viral i la seva patogènesi del VIH-1. A més, l’estandarització i automatització dels protocols de 454 sequencing permetria la implementació d’aquesta tecnologia pel diagnòstic del VIH-1. / Los ensayos de resistencia a los antiretrovirales son utilizados en la práctica clínica para la personalización del tratamiento antirretroviral (TARV) de las personas infectadas por el VIH-1. La secuenciación poblacional (SP) es la técnica más utilizada para el genotipado del VIH-1 obteniendo una buena correlación con la respuesta clínica de los pacientes. Asimismo, la baja sensibilidad de la SP para la detección de mutaciones de resistencia a los antiretrovirales o variantes X4-trópicas presentes en baja prevalencia puede comprometer la eficacia de la TARV. El objetivo de esta tesis era evaluar el valor clínico del genotipado ultrasensible para el manejo clínico de pacientes infectados por el VIH-1 que han estado expuestos a TARV. Durante la utilización de 454 sequencing para la determinación del tropismo viral, 454 sequencing obtuvo una mayor concordancia con ESTA (Enhanced Sensitivity TrofileTM Assay) en el análisis del ARN viral. Aunque la SP mostró una menor sensibilidad que 454 sequencing, su elevada especificidad le permitió obtener una mayor precisión. La información genotípica generada por 454 sequencing fue utilizada para evaluar la compartimentalización. Aunque las determinaciones del tropismo viral eran equivalentes entre los compartimentos, en algunos pacientes se observó compartimentalización de secuencias, lo que puede comprometer la determinación del tropismo viral en función del compartimento que analizado. Durante este trabajo también se hizo la validación de la SP para determinaciones del tropismo a partir de ADN proviral en un ensayo clínico prospectivo y aleatorizado. Este ensayo demostró ser útil para guiar cambios de tratamiento antirretroviral que incluyan antagonistas de CCR5. De todos modos, 454 sequencing fue capaz de detectar variantes X4 trópicas en dos pacientes previamente clasificados como R5 trópicos por SP. En cuanto a la detección de DRM en el gen pol, 454 sequencing demostró ser no inferior a la SP durante la evaluación de la susceptibilidad al tratamiento antirretroviral. Cabe mencionar que 454 sequencing aportó información genotípica adicional en la mayoría de los pacientes, aunque esta modificara pocas predicciones de susceptibilidad. Además, esta tecnología fue útil para explorar el origen de las DRM en el gen de la integrasa del VIH-1, mostrando que los mutantes detectados durante el fracaso virológico pueden ser originados a partir de mutantes pre-existentes. En resumen, esta tesis ha mostrado la utilidad clínica del genotipado ultrasensible del VIH-1 en pacientes experimentados al TARV. 454 sequencing ha permitido una profunda caracterización de la diversidad viral dentro del huésped, facilitando el estudio de la evolución viral i la patogénesis del VIH-1. Además, la estandarización i automatización de los protocolos de 454 sequencing permitiría la implementación de esta tecnología para el diagnóstico clínico del VIH-1. / Drug resistance testing is utilized in the clinical routine to personalize ART of HIV-1 infected people. Population sequencing is employed for HIV-1 genotyping obtaining good correlations with clinical outcomes. However, its lack of sensitivity to detect minority DRM mutations or minor CXCR4-using viruses can compromise the efficacy of antiretroviral therapy (ART). The use of next generation sequencing technologies for ultrasensitive HIV-1 genotyping might allow deep characterization of the viral population optimizing the ART. The objective of this work was to evaluate the clinical value of ultrasensitive HIV-1 genotyping obtained by 454 sequencing for the management of ART-experienced HIV- 1 subjects in different treatment situations. During the utilization of 454 sequencing for viral tropism determinations, this technology achieved the closest diagnostic accuracy to ESTATM in plasma ARN. Although population sequencing had lower sensitivity than 454 sequencing, its highest specificity led to obtain closest accuracy to ESTA. Even though tropism determinations were equivalent between plasma and cellular compartments, phylogenetic analyses from data generated by 454 sequencing revealed sequence compartmentalization in some subjects. We also validated triplicate population HIV-1 genotyping from PBMC-associated DNA for viral tropism determinations in a prospective and randomized clinical trial. Here, genotypic tropism testing in proviral DNA demonstrated to become a suitable tool to guide treatment switches to CCR5 antagonists in aviremic individuals. In this study, 454 sequencing was capable to detect non-R5 viral strains in two subjects previously classified as harboring R5 HIV-1 strains by population sequencing. This compartmentalization might compromise viral tropism determinations depending on the compartment analyzed. Furthermore, the absence of evolution observed during prolonged periods of aviremia suggested that testing of stored plasma sample would be generally safe and informative. Regarding the detection of minority DRM in pol gene, 454 sequencing for ultrasensitive HIV-1 genotyping was technically non-inferior than population HIV-1 genotyping during the assessment of antiretroviral drug susceptibility. However, although this technology provided additional genotypic information beyond population sequencing in most of heavily pre-treated individuals tested, only few antiretroviral susceptibility predictions were modified. This technology was also useful to explore the origin of DRM in integrase gene, revealing that mutants detected at the time of virological failure can be originated from pre-existing minority drug resistance variants. In summary, this thesis has shown the clinical utility of ultrasensitive HIV-1 genotyping in ART-experienced HIV-1 infected individuals. However, further studies should extend our findings. 454 sequencing allowed a deep characterization of the HIV-1 diversity within a host helping to understand viral evolution and HIV-1 pathogenesis. Moreover, the standardization and automation of 454 sequencing protocols for HIV-1 sequencing would allow the implementation of this technology for HIV-1 diagnosis.

Los tumores cerebrales se desarrollan dentro del sistema nervioso central y pueden ser originados por células del mismo sistema nervioso, o bien tratarse de una metástasis con origen en un órgano distinto. Representan menos de un 2% del total de casos de cáncer diagnosticados cada año a nivel mundial, pero a pesar de ello, constituyen una fuente importante de mortalidad y discapacidad. El diagnóstico de este tipo de tumores generalmente se lleva a cabo mediante técnicas de imagen (IRM) y espectroscopía (ERM) por resonancia magnética nuclear (RMN) gracias a sus características morfológicas y aspectos bioquímicos diferenciales. La ERM está considerada como el método no invasivo que permite estudiar más adecuadamente el metabolismo de los seres vivos ya que puede determinar cualitativa y cuantitativamente una gran variedad de metabolitos en el tejido intacto, proporcionando una información extensa sobre su composición. Sin embargo queda limitada por una baja resolución espectral, en comparación con la resolución que se puede llegar a obtener con los análisis in vitro. En ese sentido, la evaluación in vitro de biopsias de tumores cerebrales mediante la técnica de espectroscopía de alta resolución “high resolution magic angle spinning spectroscopy” (HRMAS) complementa la información bioquímica obtenida in vivo y en muchos casos puede contribuir a mejorar el diagnóstico no invasivo y manejo de la enfermedad. La espectroscopía HRMAS consiste en hacer girar una muestra a altas velocidades en un ángulo de 54,7o respecto al campo magnético principal. Este tipo de adquisición reduce la anchura de las señales detectados en el espectro de RMN que viene principalmente causada por las interacciones dipolares entre núcleos de la muestra, con contribuciones adicionales de la heterogeneidad de la muestra y parámetros residuales anisotrópicos. Los métodos de manipulación de muestras de tejido para su análisis por HRMAS son relevantes y pueden interferir en los resultados. La obtención, conservación y temperatura a la que están sometidas las muestras pueden ser determinantes y desencadenar el metabolismo post mortem. A ese respecto, el uso de la irradiación por microondas focalizadas (FMW) puede ser una opción eficiente, actuando rápidamente y causando la inactivación de dicho metabolismo postmortem. Este método es ampliamente utilizado para el sacrificio de animales y capaz de preservar el metaboloma de muestras o tejidos. En esta tesis se han desarrollado distintas optimizaciones y estudios alrededor de la irradiación por FMW. En un primer momento, se estudió la influencia del método de sacrificio (sobredosis de anestesia vs. irradiación por FMW) en el patrón espectral HRMAS de tejidos obtenidos de modelos preclínicos de tumor glial de alto grado (GL261) y de isquemia cerebral en rata. Luego, se ha desarrollado una estrategia para minimizar los cambios en el patrón espectral de tejido cerebral y patológico mediante protocolos de fijación por irradiación FMW previa al análisis HRMAS, en muestras que habían sido sometidas a la congelación. Dicho método se desarrolló con vistas a su aplicación a biopsias de tumores cerebrales humanos. Paralelamente, se llevaron a cabo estrategias de reconocimientos de patrones espectrales con espectros HRMAS adquiridos de muestras de tumores cerebrales humanos. Estas estrategias, aparte de validar el uso del programa SpectraClassifier (desarrollado en el grupo de investigación) como herramienta para reconocimiento de patrones, en el caso de espectros HRMAS también estudió la posible influencia de la temperatura y secuencias de adquisición sobre el rendimiento de los clasificadores desarrollados. Se ha comprobado además que la irradiación por FMW de las biopsias de tumores, aunque no se refleja en una mejora sustancial en el rendimiento del clasificador, no parece tener una influencia negativa sobre éste y puede ser utilizada como método de preservación del patrón espectral de las biopsias investigadas. / Brain tumors develop within the central nervous system and could originate from nervous system itself or they can be due to a metastasis originating from a different organ. They represent less than 2 % of all diagnosed cases of cancer each year worldwide, but despite this, they are a major source of mortality and disability. Their diagnosis is generally carried out by nuclear magnetic resonance (NMR) techniques, both imaging (MRI) and spectroscopy (MRS) due to their differential morphological and biochemical characteristics. MRS is considered one of the best noninvasive methods to study metabolism of living beings, due to its ability for assessing both qualitatively and quantitatively a panoply of metabolites in the intact tissue, providing extensive information on its composition. However, there are limitations related to the relatively low spectral resolution achieved, in comparison with the in vitro studies resolution. In this sense, the in vitro evaluation of brain tumor biopsies using the high resolution magic angle spinning spectroscopy (HRMAS) technique could complement the biochemical information obtained through in vivo studies, and could help to improve diagnosis and management of disease. The HRMAS spectroscopy technique consists in spinning the sample at high speeds with an angle of 54.7o respect to the main magnetic field. This type of acquisition reduces the width of the spectral signals which are due mainly to the dipolar interactions, which are caused, in turn, by intrinsec factors of the sample and residual anisotropic parameters. The handling methods for tissue samples which will be used in HRMAS analysis are relevant and could interfere with the final result. The collection, storage and temperature conditions of the samples could be determining and could also induce post mortem metabolism. In this respect, the use of focused microwave irradiation (FMW) could be an efficient option, acting in a fast way and inactivating any postmortem metabolism. FMW fixation is a widely used method for animal sacrifice, in order to preserve the metabolome of tissue samples. In this thesis we have developed different studies around the FMW irradiation. First, we have studied the influence of the method used for animal sacrifice (anaesthesia overdose vs. FMW irradiation) in the spectral pattern of tissue samples from preclinical high grade tumors (GL261) and samples from preclinical models of ischaemic rat brain. Afterwards, we have developed a strategy to minimize spectral pattern changes of normal and pathological brain tissue through FMW irradiation prior to HRMAS analysis in previously frozen samples. This method was developed with the objective of its application to human brain tumor biopsies. In parallel, pattern recognition studies were carried out with HRMAS spectra acquired from those human brain tumor biopsies. These studies, besides of making possible the validation of SpectraClassifier software (developed in house within the research group where this thesis was performed) as a pattern recognition tool for HRMAS spectra, also assessed the influence of temperature and acquisition sequence in the performance of the developed classifiers. It has been proved, in addition, that although the FMW irradiation of the biopsies does not have a substantial impact in the classifier performance, it does not seem to have a negative influence over it, and could be used as a spectral pattern preservation method for studies of human brain tumors biopsies.

El desenvolupament de la capacitat metastàtica és deguda a l’adquisició de característiques específiques que acompanyen a la cèl·lula tumoral durant la progressió tumoral, tant en el microentorn local com en llocs distants. El nostre grup s’ha centrat en la identificació de proteïnes que intervenen en la patogènesi de la òrgan-especificitat de la metàstasi del càncer de mama (1,2,3). Basant-nos en resultats genòmics i proteòmics previs que indicaven una sobreexpressió de la proteïna ERp57 en cèl·lules amb habilitat per metastatitzar a l’os, vam analitzar el caràcter òrgan-específic d’aquest fenotip funcional i la seva implicació en la patogènesis de la metàstasi òssia. La modulació dels nivells d’aquesta proteïna podria mediar l’adaptació metabòlica al microentorn ossi, ja que la seva expressió pot regular-se pels baixos nivells de glucosa i d’oxigen d’aquest microentorn (4). La sobre-expressió d’ERp57 intervé en la fallida del reconeixement immunitari de les cèl·lules metastàtiques a os, dificultant el transport de molècules d’HLA I a la membrana cel·lular i afavorint la retenció en el Golgi. Per una altra banda, ERp57 remodela el citoesquelet de vimentina. Aquest fet suggereix un paper en la transició mesènquima-epiteli, imprescindible per a l’establiment de la cèl·lula metastàtica en el nou òrgan. La infra-expressió d’ERp57 és suficient per interrompre el procés metastàtic a os, indicant la rellevància de la seva funció en la reprogramació metabòlica que facilita l’adaptació de les cèl·lules de càncer de mama que metastatitzen a l’os. La combinació de l’espectroscòpia de Raman (RS) amb tècniques d’anàlisi multivariat ens ha proporcionat un mètode quantitatiu poderós per a la discriminació de fenotips metastàtics, basant-nos en les seves característiques metabòliques (5). L’ús de RS ens ha permès distingir un fenotip lipídic associat a la òrgan-especificitat de la metàstasi. La determinació de les bandes dels àcids grassos totals o TFA (2845 cm-1) i dels àcids grassos insaturats o TUFA (3015 cm-1) distingeix les cèl·lules de càncer de mama amb capacitat per metastatitzar a l’os d’altres amb capacitat per a metastatitzar a cervell o pulmó. L’anàlisi de dades genòmiques de pacients va corroborar aquest fenotip amb una sobre-expressió de gens del metabolisme lipídic en metàstasi cerebral de càncer de mama. Aquestes cèl·lules presenten un augment òrgan-específic en els nivells de síntesi lipídica i en la presència d’àcids grassos saturats, així com en la capacitat oxidativa d’àcids grassos. Aquest fenotip confereix major supervivència en situacions d’hipoglucèmia. L’autofàgia col·labora amb aquests processos afavorint la degradació de proteïnes malplegades i aportant intermediaris per al cicle de Krebs. Finalment, estudis de morfologia i dinàmica mitocondrial recolzen les dades metabòliques i suggereixen que aquestes característiques poden ser conseqüència de l’expressió diferencial de proteïnes que regulen el mitocondri en cada microentorn. Aquestes noves troballes indiquen nous fronts terapèutics per combatre la progressió metastàtica en el càncer de mama. / The development of the metastatic capacity is owed to the acquisition of specific features that accompany the tumoral cell during the tumoral progression, in the local microenvironment or in distant places. Our group has focused on the identification of proteins that take part in the pathogenesis of the organ-specificity of breast cancer metastasis (1,2,3). We based our study on previous genomic and proteomic results, which showed an over-expression of ERp57 in cells metastatic to bone. We analyzed the organ-specificity of this functional phenotype and its implication in the pathogenesis of bone metastasis. The modulation of this protein could favor the metabolic adaptation to the bone, as ERp57 expression is regulated by the low glucose and oxygen levels found in this microenvironment (4). ERp57 over-expression is involved in the failure of immune recognition of bone metastatic cells, hampering the transport of HLA I molecules to the cell membrane and contributing to Golgi retention. On the other hand, ERp57 reorganizes the vimentin cytoskeleton. This fact suggests a role in the mesenchimal-epithelial transition, which is an essential step for the establishment of the metastatic cell in the new organ. ERp57 under-expression blocks bone metastasis formation suggesting the importance of this protein in the metabolic reprogramming that mediates bone metastatic breast cancer cells adaptation. The combination of Raman spectroscopy (RS) with multivariate analysis techniques has provided a powerful quantitative method for the discrimination of metastatic phenotypes based on metabolic features (5). RS allowed us to distinguish a lipid phenotype associated to the organ-specificity of the metastasis. The determination of total fatty acids or TFA band (2845 cm-1) and total unsaturated fatty acids or TUFA band (3015 cm-1) could distinguish breast cancer cells with the ability to metastasize to bone from those metastatic to brain or lung. The analysis of patients’ genomic data confirmed this phenotype, showing an over-expression of genes related to lipid metabolism in breast cancer brain metastasis. These cells present an organ-specific increase in lipid synthesis and in saturated fatty acids, as well as an increase in the lipid oxidative capacity. This phenotype confers a greater survival advantage in hypoglycemic conditions. Autophagy collaborates with these processes facilitating the degradation of misfolded proteins and providing intermediaries for the Krebs cycle. Finally, studies of morphology and mitochondrial dynamics confirm the metabolic data and they suggest that these features could be a consequence of the differential expression of proteins that regulate the mitochondrion in each microenvironment. These findings point to new therapeutic options to fight against metastatic progression in breast cancer.

El trabajo descrito en esta tesis doctoral se enmarca dentro del proyecto MELOGEN (GEN2013‑ 20237, 2004‑2007) uno de cuyos objetivos era la construcción de una plataforma de TILLING en melón. La disponibilidad de recursos genéticos y genómicos para el melón se ha incrementado a lo largo de los últimos años e incluso la secuencia del genoma está disponible. Sin embargo, las herramientas genómicas para determinar la funcionalidad de los genes en esta especie son todavía limitadas. El TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) es un método de genética inversa mediante el cual se pueden crear e identificar nuevas mutaciones en genes candidatos y observar su efecto fenotípico. Además, también se pueden detectar fenotipos de interés para posteriormente identificar la mutación responsable de los mismos. En este trabajo se ha desarrollado una población de TILLING en Cucumis melo a partir de la línea doble haploide del tipo “Piel de Sapo” M62‑113. Aplicando inicialmente el mutágeno químico EMS (Etil Metano Sulfonato) sobre 17.000 semillas se ha desarrollado una colección de mutantes compuesta por 3.268 familias M2. A partir de 400 familias M2 se observaron diversos fenotipos mutantes en las diferentes etapas de crecimiento de la planta. Algunos de estos mutantes se han descrito con detalle generando un catálogo de los fenotipos observados en cada familia, algunos de los cuales pueden tener interés comercial. Para medir la tasa de mutación de la población se han analizado cuatro genes, la fitoeno desaturasa PDS, los factores de iniciación de la traducción eIF4E y eIF(iso)4E y el receptor de etileno ETR1. Los mutantes detectados han permitido calcular la tasa de mutación de la población, una mutación cada 1,5 Mb. En el caso de PDS se ha podido obtener un mutante con fenotipo albino, demostrando así la efectividad del método TILLING en melón. Además, paralelamente se analizaron los mismos genes en otra población mutagenizada independiente. También se realizó un estudio de EcoTILLING con 113 accesiones de melón y se identificaron 19 haplotipos distintos en el gen eIF4E, uno de ellos, con un SNP que provoca un cambio de aminoácido y que sólo se encuentra en la accesión PI 505602 y dos haplotipos en el gen ETR1, uno de los cuales también contiene un SNP que provoca un cambio de aminoácido. El TILLING facilitará los estudios de genética inversa en melón y abre la puerta a futuros estudios de genómica funcional en un genoma recientemente secuenciado. Este trabajo ha representado también el primer paso para poder desarrollar nuevas poblaciones de TILLING en melón con mayores tasas de mutación y en otros fondos genéticos. / The work described in this thesis is part of the MELOGEN project (GEN2013‑20237, 2004‑2007) one of whose goals was to build a melon TILLING platform. The availability of genetic and genomic resources in melon has increased over recent years, and even the sequence of the genome is available. However, genomic tools to determine the functionality of genes in this species are still limited. TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) is a reverse genetics method by which you can create and identify new mutations in candidate genes and observe their phenotypic effect. Furthermore, it is also possible to detect phenotypes of interest in order to identify their responsible mutation. In this project we developed a TILLING population in Cucumis melo L. in the double haploid M62‑113 line from the ʺPiel de Sapoʺ type. Applying the chemical mutagen EMS (Ethyl methane sulfonate) over 17,000 seeds we have developed a collection of mutants consisting of 3268 M2 families. Phenotypic mutants were observed in 400 M2 families in different stages of plant growth during the development of the population. Some mutant phenotypes have been described and identified in detail by generating a catalogue of phenotypic changes. Some of these phenotypes may have a commercial interest. We have analysed four genes to identify the rate of mutation in the population: Phytoene desaturase (PDS), Eukaryotic translation initiation factors (eIF4E and eIFiso4E) and the Ethylene receptor (ETR1). Mutants detected allowed to calculate the mutation rate of the population, one mutation per 1.5 Mb. For PDS we were able to obtain a mutant with an albino phenotype, demonstrating the effectiveness of TILLING method in melon. Moreover, in parallel the same genes were analyzed in another independent mutagenized population. A study of Ecotilling was also performed in 113 melon accessions and 19 different haplotypes in the eIF4E gene were obtained. One of them contained a SNP that causes an amino acid change and was only found in the accession PI 505602 and two other haplotypes were found in the ETR1 gene, one of which also contains a SNP that causes an amino acid change. TILLING will facilitate reverse genetics studies in melon and opens the possibility of performing future functional genomics studies in a newly sequenced genome. This work has also represented the first step to developing new melon TILLING populations with higher rates of mutation and in other genetic backgrounds.

Los tumores del sistema nervioso central (SNC) abarcan menos de un 2 % del total de casos de cáncer diagnosticados cada año a nivel mundial (aproximadamente 175.000) representado entre 0,4 y 25,4 de casos por 100.000 adultos. A pesar de ello, constituyen una fuente importante de mortalidad y discapacidad. Actualmente los conocimientos que se tienen sobre el desarrollo de los tumores es reducido, porque en la mayor parte de los casos los tumores cerebrales se detectan en estado avanzado de desarrollo (como consecuencia, principalmente, de la aparición de síntomas que llevan al paciente a indagar sobre su estado). Es por esto que se tienen pocos datos de las fases iniciales de desarrollo de estos tumores. Por tanto, es necesario esclarecer el fenotipo molecular de la progresión de tumores cerebrales in vivo, con el objeto de conocer mejor su evolución y poder así mejorar su detección, ya que cuanto más se tarde en alcanzar el diagnóstico correcto, más se reducen las posibilidades de la persona afectada de sobrevivir al tumor. El trabajo de esta tesis, se ha centrado en intentar comprender los lípidos móviles. Cuando se habla de lípidos móviles (ML, en la abreviatura clásica anglosajona) visibles por espectroscopía de RMN, se hace referencia básicamente a las resonancias provenientes de las cadenas de ácidos grasos de lípidos neutros en triacilgliceroles, apareciendo las más características a 0,9, 1,3, 2,0 y 5,3 ppm. El interés por entender el origen celular de estas resonancias proviene de su aparición en numerosas muestras biológicas, tanto asociadas con malignidad y muerte celular como con procesos benignos como diferenciación y variación de la velocidad de proliferación. Actualmente no se conoce el significado celular de los cambios vistos en espectroscopia de resonancia magnética en los lípidos móviles, aunque se cree que se trata más bien de cambios biofísicos más que bioquímicos, ya que se ha comprobado que su concentración no varía, lo que varía es la detección mediante MRS. Para obtener más información sobre el origen celular de los lípidos móviles, se trabajó con cultivos celulares de células de glioma de rata (C6) que se estudiaron con HR-MAS a diferentes velocidades para estudiar el efecto de dicha velocidad en la “visualización” de dichos lípidos móviles. Así mismo, se desarrollaron modelos in vitro de gotículas celulares y se inmovilizaron dichos modelos para ver cómo afectaba a la “visualización” de lípidos móviles. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón (¹H MRS) se presenta como una posible alternativa para la caracterización de tumores cerebrales, ya que es una técnica que permite obtener información, de forma no invasiva, de la presencia de algunos productos del metabolismo celular. Con estos datos se pretende esclarecer el fenotipo molecular de tumores cerebrales in vivo, lo que nos permitiría reconocer patrones que nos ayuden a identificar los diferentes tipos de tumores cerebrales. Siguiendo este objetivo, en esta tesis se trabajó con modelos preclínicos de ratón con glioblastoma, oligodendroglioma de grado II y III y parénquima cerebral sano y se desarrollaron cuatro clasificadores de tipo y grado tumoral nuevos para tumores cerebrales preclínicos en ratón mediante el uso del programa Spectra Classifier aplicado a matrices de datos de imagen espectroscópica (IERM). / Central nervous system tumors (CNS) represent less than 2% of all cases of cancer diagnosed each year worldwide (approximately 175,000), which means between 0.4 and 25.4 cases per 100,000 adults. Despite this, they constitute an important source of mortality and disability. Current knowledge about the etiology of these tumors is scarce, because in most cases they are detected when they are already in an advanced state, when symptoms appear. Due to this fact, there is not much information about the early stages of development of those tumors. Therefore, it is necessary research on the progression of the molecular phenotype of brain tumors in vivo, in order to better understand their evolution and improve their detection, because the time spent to achieve the correct diagnosis may reduce the survival possibilities of the person afflicted by the pathology. Work in this thesis has mostly focused on mobile lipids. Mobile lipids (ML), visible by NMR spectroscopy, are resonances from fatty acyl chains of neutral lipids in triacylglycerols, the most characteristic of them resonating at frequencies of 0.9, 1.3, 2.0 and 5.3 ppm. The interest in understanding the cellular origin of those resonances arises from their presence in many biological tissues, associated with malignancy and cell death, as well as with benign processes such as differentiation or with changes in the proliferation rate. Currently, the cellular meaning of the changes observed with magnetic resonance spectroscopy in ML remains unknown. One hypothesis is that it could be associated to biophysical rather than biochemical changes, since it is not the concentration of ML that changes, but their detectability by MRS. In order to obtain more information about the cellular origin of ML, the work of this thesis was performed on rat glioma cells (C6) and High-resolution, Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy, at different spinning rates, to evaluate how such spinning rate affects the "visualization" of ML. Also, an in vitro model of artificial liipid droplets was developed. These artificial lipid droplets were than immobilized into a solid support to see how this would perturbate their NMR "visibility". Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (¹ H MRS) in vivo, is also a feasible alternative for the preoperative characterization of brain tumors, since it is a technique that allows to obtain information, in a non-invasive way, about the presence of products of cellular metabolism. In vivo ¹ H MRS data were also used in this thesis to clarify the molecular phenotype of brain tumors in vivo, thus allowing to recognize patterns that may be of help to identify the different types of brain tumors. To reach this goal, magnetic resonance spectroscopic imaging data from preclinical mouse models with glioblastoma, grade II and III oligodendroglioma and healthy brain parenchyma were used to develop four tumor type and grade classifiers using the program Spectra Classifier.

Actualment, el cribratge virtual juga un paper central en el món del descobriment de fàrmacs. L’anàlisi in silico permet el cribatge de milions de molècules petites i la tria de les més prometedores per a les proves experimentals. Per trobar candidats que puguin esdevenir fàrmacs, és crucial reunir una sèrie d’eines computacionals individuals i complementàries. En aquesta tesi, es descriu un procediment automatitzat de cribatge virtual que combina el modelat de farmacòfors i el seu ús en cerques, mètodes d’alt rendiment d’acoblament molecular, puntuació de consens i estimació d'energia lliure d'unió mitjançant el mètode d’energia d'interacció lineal (LIE) a partir de simulacions de dinàmica molecular. Un dels objectius d'aquesta tesi ha estat el de construir una metodologia flexible i versàtil de cribratge virtual, que permeti la integració de diferents eines en les diferents etapes de l’estudi. El procediment, que es va iniciar com la combinació d'un senzill filtre per tamany, la simulació de l’acoblament molecular i una puntuació de consens, ha derivat en un procediment computacional elaborat i automatitzat amb l'addició de cerques basades en farmacòfor i l'estimació de l'energia lliure d'unió mitjançant el mètode LIE. Aquest mètode integrat té l’objectiu de compensar les debilitats individuals de les diferents tècniques usades i permet avaluar i comparar el rendiment i la l’exactitud d'aquestes tècniques. Una altra fita important ha estat l'aplicació del procediment computacional a proteïnes diana concretes per tal d’avaluar-ne la capacitat de trobar molècules que puguin ser candidats a fàrmacs. Tests experimentals realitzats per a la β-Glucosidasa àcida i la hidrolasa de Bleomicina humanes indiquen que diverses molècules petites seleccionades pel procediment computacional tenen activitat inhibitòria micromolar. El mètode LIE emprat en aquest treball es va aplicar sobre més de deu mil complexos proteïna-lligand per a tres proteïnes diana diferents, el que és, al nostre entendre, la primera aplicació del mètode LIE a aquesta escala. / Virtual screening plays a central role in the world of drug discovery today. In silico testing allows to screen millions of small molecules and to choose only the most promising ones for experimental testing. To find potential drug candidates, it is crucial to bring together individual and complementary computational tools. In this thesis, I describe an automated virtual screening procedure that combines pharmacophore modeling and searches, high-throughput molecular docking, consensus scoring and binding free energy estimation with the linear interaction energy (LIE) method through molecular dynamics simulations. One goal of this thesis was to build an evolving and versatile virtual screening methodology, which enables integration of different tools at different steps. The procedure that started as a combination of a simple size filter, molecular docking and consensus scoring, advanced into an elaborate and automated computational workflow with the addition of pharmacophore searches and binding free energy estimation with LIE. This integrated method intends to compensate for weaknesses of individual structure-based techniques and allows the evaluation and comparison of the performance and accuracy of these techniques. Another important goal was to apply the computational workflow to target proteins and find hits that could be drug candidates. Experimental testing performed for human acid β-Glucosidase and bleomycin hydrolase indicate that several small molecules selected by the computational workflow display micromolar inhibitory activity. The standard LIE method used in this work was applied to more than ten thousand ligand-protein complexes for three different targets, which is, to our knowledge, the first time application of LIE at such large scale.

Aquesta tesis s’emmarca en el camp de les carboxipeptidases citosòliques de mamífers, centrant-­‐se particularment en els membres 2 i 3 d’aquesta subfamília de metalocarboxipeptidases. Aquest treball constitueix el primer estudi sobre la funció d’aquests enzims a través d’aproximacions in silico, in vitro i in vivo. Aquesta tesis consta de les parts descrites a continuació. El primer capítol introdueix el camp de les matalocarboxipeptidases, els microtúbuls, les modificacions post-­‐traduccionals de la tubulina i estableix els objectius de la tesi. El segon capítol és una compilació dels procediments experimentals i materials utilitzats en el treball experimental. El tercer capítol presenta la caracterització funcional de la carboxipeptidasa citosòlica 3 humana. Els resultats d’aquest estudi han estat la base pel quart capítol, on es descriu la funció de la CCP2. Ambdues CCP2 i CCP3 isoformes de ratolí s’estudien mitjançant enginyeria de proteïnes i utilitzant els models de ratolí knockout de CCP2 i CCP3. Els capítols III i IV es subdivideixen en un resum del capítol, els resultats que descriuen el detall dels descobriments i una discussió. A continuació es presenta una discussió general sobre CCP2 i CCP3, el seu rol en la cèl·∙lula i en el context de la subfamília de carboxipeptidases que, en mamífers, consta de sis gens codificants per enzims amb activitat deglutamilasa. La tesis finalitza amb un resum de les conclusions. El capítol IV juntament amb els experiments de modelat estructural del capítol III són la base de la següent publicació científica: Tort O, Tanco S, Rocha C, Bièche I, Seixas C, Bosc C, Andrieux A, Moutin MJ, Avilés FX, Lorenzo J, Janke C. The cytosolic carboxypeptidases CCP2 and CCP3 catalyze posttranslational removal of acidic amino acids. MBoC. doi:10.1091/mbc.E14-­‐06-­‐1072 / This thesis is situated in the field of the mammalian cytosolic carboxypeptidases, particularly focusing in members 2 and 3 from this subfamily of metallocarboxypeptidases. This work gives insight for the first time into the role of those enzymes by in silico, in vitro and in vivo approaches. The thesis is divided in parts as described below. The first chapter introduces the fields of metallocarboxypeptidases, microtubules, tubulin posttranslational modifications and settle the objectives of the thesis. The second chapter is a compilation of the experimental procedures and materials used for the experimental work. The third chapter presents the functional characterization of human cytosolic carboxypeptidase 3. The results from this study were the basis for chapter four, where the function of CCP2 is described and both CCP2 and CCP3 mouse isoforms are studied by protein engineering and using CCP2 and CCP3 knock-­‐out mouse models. Chapters III and IV are subdivided into a summary of the chapter, the results describing the findings in detail and a discussion. The following chapter sets a general discussion on CCP2 and CCP3, their role in the cell and in the context of a family, in mammals, of six genes coding deglutamylating enzymes. A final section includes a summary of the conclusions. Chapter IV together with the modeling experiments form Chapter III is the basis of the following scientific paper: Tort O, Tanco S, Rocha C, Bièche I, Seixas C, Bosc C, Andrieux A, Moutin MJ, Avilés FX, Lorenzo J, Janke C. The cytosolic carboxypeptidases CCP2 and CCP3 catalyze posttranslational removal of acidic amino acids. MBoC. doi:10.1091/mbc.E14-­‐06-­‐1072

La via canònica de Wnt és essencial pel desenvolupament embrionari i per la proliferació cel·lular. A més, la desregulació d’aquesta via causa diferents malalties, com per exemple el càncer. La unió del lligand Wnt als receptors específics promou la fosforilació de Dvl-2 per una quinasa directament associada a p120-catenina, la CK1ε, i indueix una cascada d’activació que inhibeix l’activitat de la quinasa GSK-3 sobre la β-catenina. Com a resultat, la β-catenina s’estabilitza i es transloca al nucli on activa l’expressió de gens diana. Els nostres resultats expliquen com la CK1ε és activada ràpidament en Wnt i permet els diferents esdeveniments que acumulen la β-catenina. Prèviament s’havia descrit que la CK1ε presenta un domini autoregulador que inhibeix l’activitat quinasa de la CK1ε quan aquest està fosforilat, suggerint que es necessita una fosfatasa encara no descrita perquè s’activi la senyalització de Wnt. En aquest treball es mostra que la PP2A permet la defosforilació de la CK1ε en Wnt, i també s’ha identificat la PR61ε com la subunitat reguladora de la PP2A que controla l’activació de CK1ε. A més, la PR61ε interacciona directament amb el receptor Fz i s’associa al complex LRP5/6-p120-catenina-CK1ε després de l’activació de Wnt. En global, aquests resultats suggereixen que la PR61ε regula específicament la defosforilació de la CK1ε mediada per la PP2A, i té un paper essencial en la senyalització de Wnt. Un altre pas determinant de l’activació de la via de Wnt és la inhibició de l’activitat de la GSK-3, tot i que el mecanisme pel qual s’inactiva la quinasa encara és matèria de debat. S’han proposat dos models per explicar-ho, un dependent del reclutament de la GSK-3 al correceptor LRP5/6 fosforilat, que crea un lloc d’inhibició, i l’altre basat en el segrest de la quinasa dins de cossos multivesiculars (MVBs). Degut a que el nostre grup ha descobert una connexió directa entre les cadherines i la p120-catenina (dues proteïnes involucrades en les unions adherents) amb el correceptor LRP5/6, es va hipotetitzar que les cadherines podrien estar involucrades en l’endocitosi de la GSK-3 dependent dels factors Wnt. Els nostres resultats demostren que el complex receptor de Wnt que conté la GSK-3, s’internalitza dins de MVBs, i que aquesta endocitosi depèn de la dissociació prèvia de la p120-catenina-cadherina del correceptor LRP5/6. La disrupció de la interacció cadherina-LRP5/6 és regulada per la fosforilació de la cadherina i requereix de la separació prèvia de la p120-catenina. D’aquesta manera, mutants de la p120-catenina i de la cadherina que no es dissocien del complex bloquegen el segrest de la GSK-3 dins de MVBs. Aquests mutants inhibeixen l’acumulació de β-catenina, tot i que no de forma total. Aquests resultats expliquen com es segresta la GSK-3 dins dels MVBs i suggereixen que aquest mecanisme d’internalització, juntament amb la inhibició de la GSK-3 per la interacció directa amb l’LRP5/6 fosforilat, són necessaris per la completa estabilització de la β-catenina en Wnt. / Canonical Wnt signalling is essential for embryonic development and cell proliferation. Deregulation of this pathway leads to some diseases, such as cancer. Binding of extracellular Wnt ligands to specific receptors induces the phosphorylation of Dvl-2 protein by CK1ε- associated-p120-catenin kinase, and a cascade of events that inhibit the activity of GSK3 kinase on β-catenin. As a result, β-catenin is stabilized and translocated to the nucleus where it activates the expression of target genes. Our results explain how CK1ε is quickly activated in Wnt signalling, allowing the cascade of events that accumulate β-catenin. It was previously described that CK1ε presents an autoregulation domain which strongly inhibits CK1ε kinase activity when it is phosphorylated, suggesting that a phosphatase is required to activate Wnt signalling. However, which phosphatase dephosphorylates CK1ε in Wnt and how this phosphatase regulates the pathway were not clear. In this study, we have described that PP2A permits the dephosphorylation of CK1ε upon Wnt, and we have also identified PR61ε as the regulatory subunit of PP2A that controls this CK1ε activation. PR61ε directly interacts with Fz receptor, and associates with LRP5/6-p120-catenin-CK1ε complex upon Wnt activation. Taken together, these results suggest that PR61ε specifically regulates PP2A-mediated CK1ε dephosphorylation and plays an essential role in Wnt signaling. Another key step in the pathway is the local inhibition of GSK3 activity on β-catenin, although the mechanism of this inactivation remains unclear. Two models have been proposed, one dependent on the recruitment and subsequent block of GSK3 by phosphorylated LRP5/6 coreceptor that creates an inhibitory site, and another one based on its sequestration into multivesicular bodies (MVBs). Since our group has uncovered a physical link between cadherins and p120-catenin (two proteins involved in adherens junctions) with the Wnt coreceptor LRP5/6, we wonder whether cadherins may be involved in the endocytosis of GSK3 triggered by Wnt factors. Our results demonstrate that Wnt receptor complexes containing GSK3 are internalized into multivesicular bodies and this endocytosis depends on the previous dissociation of p120-catenin and cadherin from LRP5/6 coreceptor. Thus, disruption of cadherin-LRP5/6 interaction is regulated by cadherin phosphorylation and requires the previous release of p120-catenin. Accordingly, p120-catenin and cadherin mutants unable to dissociate from the complex block GSK3 sequestration into MVBs. These mutants substantially inhibit, but do not completely prevent, the β-catenin accumulation caused by Wnt. These results elucidate how GSK3 is sequestered into MVBs and suggest that this mechanism of internalization together with the inhibition of GSK3 by direct interaction with phosphorylated LRP5/6, are both required for complete β-catenin stabilization upon Wnt stimulation.

Les metal·lotioneïnes (MT) constitueixen una superfamília de metal·loproteïnes de baix pes molecular que es caracteritzen pel seu elevat contingut en residus Cys, els quals els confereixen les seues propietats coordinants i reductores. És com a conseqüència d’aquestes propietats que se’ls atribueixen funcions d’homeòstasi i destoxicació de metalls, així com de regulació i protecció en processos redox. Les MT són ubíqües i les seues seqüències són molt diverses. En la present Tesi Doctoral hem tractat d’ampliar els coneixements actuals sobre aquestes metal·loproteïnes i aprofundir en la seua relació estructura-funció. Així, d’una banda s’han analitzat les preferències metàl·liques envers metalls mono- i divalents de les dues isoformes de MT presents en l’eriçó de mar (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA i SpMTB, les quals presenten patrons de Cys alineables. S’ha determinat que SpMTA mostra millors habilitats per a coordinar Zn(II) i Cd(II) que SpMTB i que, en canvi, SpMTB mostra millors propietats per a coordinar Cu(I) que SpMTA. Aquestes preferències metàl·liques s’han relacionat amb una diferenciació funcional en l’organisme. D’altra banda, s’han estudiat els sistemes MT de les plantes de soja (Glycine max) i gira-sol (Helianthus annuus), les quals s’ha vist que sintetitzen representants de les quatre subfamílies en què es divideix la família de les MT de planta, que presenten patrons de Cys no alineables. Així, s’ha determinat que les MT1 i MT2 de gira-sol estudiades (HaMT1 i HaMT2) presenten una major capacitat de coordinació de Cd(II) que les MT1 i MT2 de soja (GmMT1 i GmMT2), probablement a causa del seu major contingut en Cys. A més, s’ha vist que les His C-terminals que ambdues MT3 (GmMT3 i HaMT3) contenen i que es troben semiconservades en la subfamília participen en l’enllaç al Cd(II). MT4 de soja (GmMT4) presenta la mutació natural His54Tyr que trenca amb el patró de Cys i His conservat en la subfamília MT4, la qual s’ha demostrat que suposa una disminució en la capacitat de coordinació de Zn(II). En canvi, tant GmMT4 com MT4 de gira-sol (HaMT4), que presenta el patró típic de Cys i His, presenten capacitats de coordinació de Cd(II) anàlogues, donat que cap de les seues His no participa en l’enllaç al Cd(II). A més, l’estudi de capacitats antioxidants i/o de captadors de radicals lliures de les quatre MT de soja ha permés proposar que la llargària de l’espaiador (regió lliure de Cys) és determinant per a la protecció enfront de l’oxidació de les Cys provocada per l’exposició a peròxid d’hidrogen, així com que Zn-GmMT1 és el complex que ha mostrat les millors propietats per a protegir les cèl·lules davant l’atac de les espècies reactives d’oxigen. / Metallothioneins (MT) constitute a low molecular weight metalloprotein superfamily characterised by their high Cys residue content, which confers them their coordinative and reducing properties. As a result of these properties, MTs are proposed to be involved in homeostasis and metal detoxification functions, as well as in regulation and protection during redox processes. MTs are ubiquitous and their sequences are extremely variable. In this PhD Thesis we have tried to expand the current knowledge about these metalloproteins and to deepen into their structure-function relationship. Thus, on the one hand, the metallic preferences towards mono- and divalent metal ions of the two MT isoforms present in sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA and SpMTB, which display alignable Cys patterns, have been analysed. It has been determined that SpMTA shows better Zn(II)- and Cd(II)-binding abilities than SpMTB, and that, on the contrary, SpMTB shows better Cu(I)-binding abilitites than SpMTA. These metallic preferences have been related to a functional differentiation within the organism. On the other hand, the MT systems from the soybean (Glycine max) and sunflower (Helianthus annuus) plants have been studied, which have been proven to synthesise representatives of the four subfamilies in which the plant MT family is divided, and that show non-alignable Cys patterns. Thus, it has been shown that sunflower MT1 and MT2 (HaMT1 and HaMT2) display a greater Cd(II)-binding capacity than MT1 and MT2 from soybean (GmMT1 and GmMT2), probably due to their higher Cys content. In addition, it has been shown that the C-terminal His present in both MT3 (GmMT3 and HaMT3), which are semiconserved within this subfamily, are involved in Cd(II) coordination. Soybean MT4 (GmMT4) presents the natural His54Tyr mutation that breaks the highly conserved Cys and His pattern in MT4 subfamily, which has been shown to provoke a decrease in its Zn(II)-binding capacity. However, both GmMT4 and sunflower MT4 (HaMT4), which presents the typical MT4 Cys and His pattern, show analogous Cd(II) coordination capacities, since none of their His are involved in Cd(II) binding. In addition, the study of the antioxidant and/or free radicals scavenging capacities of the four soybean MTs has allowed to propose that the length of the spacer (Cys-free region) is crucial to protect Cys from the oxidation caused by hydrogen peroxide exposure, and that the Zn-GmMT1 complex has been the best suited to protect the cells against the attack by reactive oxygen species.

El VIH és un patogen intracel·lular obligat i per tant està totalment subjecte als recursos intracel·lulars disponibles. El tractament antiretroviral actual suprimeix la replicació viral però no evita la persistència i la proliferació de les cèl·lules infectades de forma latent, posant en evidència la necessitat de desenvolupar noves estratègies que aconsegueixin eliminar de forma definitiva el virus. El descobriment de nous factors cel·lulars del VIH pot aportar noves dianes per al desenvolupament d’aquestes estratègies. Diversos estudis de cribatge i d’identificació de gens han identificat un número molt elevat de factors cel·lulars del VIH. Per poder traslladar el coneixement científic a la clínica cal un estudi més acurat que defineixi els mecanismes funcionals i la regulació de cadascun d’aquests factors. Partint de l’estudi sobre la dependència del VIH al complex proteic Mediator (MED) i per altra banda de la restricció del VIH mitjançada pel factor antiviral SAMHD1, en aquesta tesi demostro com en les interaccions virus-hoste sovint hi ha un comú denominador en quant a la seva implicació en el metabolisme cel·lular. Aquest tret comú suggereix que els factors cel·lulars del VIH, tot i que en la seva relació estreta amb el virus el potenciïn o l’inhibeixin, alhora sempre són modulats per mecanismes complexes associats a la regulació cel·lular que finalment són els què governen la replicació viral. S’inclou una avaluació de l’activitat MED sobre la replicació del VIH amb la identificació de 9 sobre 28 proteïnes del complex MED que de forma significativa afecten la replicació del VIH, sempre en una etapa posterior a la integració. D’entre les subunitats MED identificades algunes tenen un rol predominant en la transcripció de gens virals inicials i d’altres en la generació de transcrits virals més tardans, però totes comprometen la transcripció del VIH que és induïda per la proteïna viral Tat. Els assaigs de coimmunoprecipitació, a més, han suggerit que aquesta dependència passa per una interacció física entre MED i Tat. D’entre l’ampli grup de proteïnes cel·lulars que modulen el VIH, només algunes inhibeixen el virus. SAMHD1 ho aconsegueix bloquejant l’enzim del VIH transcriptasa inversa. La seva regulació sobre els nivells de dNTPs intracel·lulars s’investiga al llarg del segon capítol. L’activitat de SAMHD1 influencia la potència dels inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs a nucleòtids, de manera que una reducció intracel·lular dels nivells de SAMHD1 porta a una disminució significativa de la sensibilitat del VIH enfront els inhibidors anàlegs a Timidina. Un estudi molecular més extens ha permès identificar que en els limfòcits T CD4+ proliferants i en els macròfags s’expressa una forma fosforilada de SAMHD1 que correspon amb la susceptibilitat a la infecció. Específicament s’ha identificat CDK6 i ciclina D3 com un complex regulador de CDK2, que alhora controlaria la progressió a cicle cel·lular i la fosforilació de SAMHD1 per tal d’inactivar-lo en cèl·lules T i en macròfags, fent-los susceptibles a la infecció. La inhibició de CDKN1A (ó p21) porta a un alleujament en la restricció de VIH modulada per SAMHD1, generant més replicació viral. L’inhibidor de CDK6 palbociclib confirma la via de senyalització proposada ja que bloqueja efectivament la fosforilació de SAMHD1, els nivells intracel·lulars de dNTP, la transcripció inversa i l’activació de CDK2. En els propers anys l’estudi acurat del factors cel·lulars del VIH-1 permetrà el desenvolupament d’estratègies terapèutiques “anti-VIH” basades en fer diana a l’hoste més que en el virus, donant noves propostes que facin front a les limitacions del tractament antiretroviral. / HIV is an obligate intracellular pathogen and its replication is entirely reliant on intracellular resources, depending on its capacity of recruitment and utilization of a wide array of host proteins to complete the viral life cycle. Current antiretroviral treatments generally suppress viral replication but do not avoid persistence and proliferation of latently infected cells over time, thus not curing HIV/AIDS and evidencing the need to develop new strategies that may finally converge in eliminating the virus. The discovery of human cellular factors could provide new targets for the development of these strategies. Previous siRNA-based screenings and whole-genome studies published a high amount of alleged HIV-1 host factors but their functional mechanisms need to be addressed to translate scientific knowledge into the clinic. By studying both the HIV dependency on a protein complex from the cellular transcriptional machinery called Mediator (MED) and the HIV restriction mediated by the antiviral factor SAMHD1 whose mechanism of regulation is still under debate, I show how viral-host interactions usually converge in their implication on cell metabolism, suggesting that identified host factors that either enhance or inhibit HIV-1 are in turn modulated by cell regulation-associated mechanisms that finally govern viral replication. Concretely, we provide an evaluation of the MED complex activity on HIV replication identifying nine out of 28 human MED proteins significantly affecting HIV replication, all pointing at a post-integration step. Moreover, the identified MED proteins modulating the generation of new viral transcripts were differentially affecting early or late stages of HIV-1 transcription, apart from compromising particularly the HIV transcription induced by the HIV-1 protein Tat. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments also suggested physical interaction between MED and Tat. Among the high number of cellular proteins modulating HIV, only a few actively inhibit viral replication. SAMHD1 achieves it by blocking the viral reverse transcriptase. Here, the regulation modulating the intracellular dNTP levels is investigated. The influence of SAMHD1 activity on nucleoside reverse transcriptase inhibitors was demonstrated, showing that a reduction of SAMHD1 levels significantly decreased HIV sensitivity solely on thymidine-analogue inhibitors. Proliferating primary CD4+ T cells or macrophages were then observed to express a phosphorylated form of SAMHD1 that corresponded with susceptibility to infection in cell culture and that was not present in non-cycling cells. Identified phosphorylation sites in cycling cells are mainly driven by cyclin-dependent kinases (CDK). In fact, we identified CDK6 and cyclin D3 as an upstream regulator of CDK2 induces SAMHD1 phosphorylation in primary T cells and macrophages. CDK2 is strongly linked to cell cycle progression and coordinates SAMHD1 phosphorylation and inactivation. Knockdown of the cellular CDK2 inhibitor CDKN1A (p21) led to a relief of the SAMHD1 restriction, increasing virus replication. The CDK6 inhibitor palbociclib blocked SAMHD1 phosphorylation, intracellular dNTP levels, HIV-1 reverse transcription and reduced CDK2 activation and its antiviral activity was lost when SAMHD1 was degraded by Vpx. Altogether, our results reinforce the idea that in the following years the deeper study of HIV-1 cellular factors will probably raise the possibility of a new class of “anti-HIV” therapeutics targeting the host rather than the virus, collectively giving new proposals to the unresolved challenge of curing HIV infection and AIDS.