En la actualidad existe un creciente interés en el desarrollo de procesos industriales biocatalíticos eficientes desde el punto de vista económico y medioambiental. Uno de los procesos más prometedores para la industria es la biocatálisis de la formación de enlaces C-C para la producción de compuestos de estereoquímica definida, de aplicación en diversos campos y, en especial, en la industria farmacéutica.El presente trabajo de Tesis Doctoral es una aportación al desarrollo de un bioproceso catalítico empleando ramnulosa-1-fosfato aldolasa recombinante como biocatalizador para la producción estereoselectiva de un compuesto precursor de inhibidores de glicosidasas de acción terapéutica mediante adición aldólica de dihidroxiacetona fosfato y (S)-Cbz-alaninal.En primer lugar, se ha procedido a la obtención de un modelo cinético de la reacción catalizada por la enzima soluble en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente para permitir la disolución simultánea de ambos reactivos. Este modelo cinético incluye la reacción secundaria de degradación enzimática de dihidroxiacetona fosfato que tiene lugar paralelamente a la reacción de síntesis.En segundo lugar, y con el fin de aumentar la estabilidad de la enzima y mejorar la operación en biorreactor, se estudió la inmovilización de la enzima en dos tipos de soportes: soportes de afinidad metálica y nanopartículas de oro. El primer soporte permite realizar la purificación e inmovilización en un solo paso de la enzima, con el consiguiente ahorro de etapas y aumento del rendimiento global del proceso. El segundo tipo de soporte permite reducir las limitaciones difusionales que aparecen con frecuencia en los soportes porosos convencionales y obtener elevadas cargas enzimáticas específicas. Los biocatalizadores inmovilizados por ambas técnicas se emplearon en la catálisis de la adición aldólica de interés en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente, evaluando su estabilidad en el medio.Por último, se estudiaron otras estrategias de reacción para mejorar la solubilidad simultánea de los reactivos de la reacción. Por un lado se analizó el empleo de novedosos medios de reacción, los líquidos iónicos, como alternativa al empleo de cosolventes orgánicos en la biocatálisis de interés. Por otro lado, se evaluó la aplicación de un biorreactor de membrana empleando un medio bifásico acuoso/orgánico en el mismo sistema biocatalítico. / Nowadays, there is a growing interest in the development of efficient industrial bioprocesses from an economic and environmental point of view. One of the most promising processes for the industry is the biocatalytic C-C bond formation that yields compounds with defined stereochemistry for diverse applications, especially in the pharmaceutical industry.This PhD Thesis is a contribution to the development of a catalytic bioprocess for the production of precursors of compounds with therapeutic potential as inhibitors of glycosidases for a wide range of diseases. The biocatalytic reaction employed was the aldol addition between dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal using recombinant rhamnulose-1-phosphate aldolase as biocatalyst.First, a kinetic model for the aldol addition catalyzed by soluble enzyme was obtained. The reaction was carried out in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent in order to achieve a suitable solubility of both reactants. This kinetic model includes the secondary reaction of enzymatic degradation of dihydroxyacetone phosphate that takes place simultaneous to the synthetic reaction.Secondly, enzyme immobilization was studied with the aim of increasing enzyme stability and improving bioreactor operation. Two types of supports were used: metal-chelated supports (IMAC) and gold nanoparticles. The use of metal-chelated supports allows simultaneous purification and immobilization in only one-step, reducing the number of steps of the process and increasing the global yield. Gold nanoparticles as supports for enzyme immobilization allow obtaining high enzymatic loads due to its high surface-to-volume ratio. Moreover, the diffusional limitations that frequently appear while working with conventional porous supports can be also reduced. Immobilized biocatalysts were produced by both immobilization techniques and they were applied in the biocatalysis of the selected aldol addition in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent. The stability of these biocatalysts in the reaction conditions was determined as well.Finally, other reaction strategies were employed in order to improve the simultaneous solubility of dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal. Ionic liquids, considered as promising reaction solvents, were assessed as an alternative to organic cosolvents in the selected biocatalysis. On the other hand, a membrane bioreactor with an aqueous/organic biphasic medium with high solubility of both substrates was studied with the same biocatalytic system.

En aquest treball hem investigat el rol de la p120-catenina en la via de senyalització de Wnt. Hem demostrat per primera vegada la importància d’aquesta catenina en l’activació de la GTPasa Rac1 i en la translocació de la β-catenina al nucli en resposta a la via canònica de Wnt. La via de Wnt ha estat àmpliament estudiada degut a la seva forta implicació en funcions essencials de cèl·lules epitelials normals i patològiques. Tot i que s’han descrit moltes proteïnes implicades en la via de Wnt, queden encara molts detalls per descriure sobre la regulació de l’activitat d’aquestes. Recentment, s’ha descrit que Rac1 és essencial per la translocació de la β-catenina al nucli (Wu X, et al. Cell 2008,133:340-53). El Rac1 actiu controla la localització nuclear de la β-catenina durant la via canònica de Wnt. Tot i així, el mecanisme d’activació d’aquesta GTPasa no ha estat investigat. En aquest treball es demostra que la p120-catenina és necessària per l’activació de Rac1, actuant com a proteïna acobladora de Rac1 i el seu activador Vav2. La interacció de les dues proteïnes amb la p120-catenina és estimulada per la fosforilació de CK1 i la defosforilació en residus tirosina, dues modificacions post-traduccionals que són activades pel factor Wnt3a. Quan sobre-expressem en cèl·lules diferents mutants de la p120-catenina que no uneixen ni Vav2 ni Rac1, o específicament Rac1, aquests no són capaços d’estimular l’activitat de Rac1. A més a més, sabent que la depleció de la p120-catenina en Xenopus produeix defectes en el procés de gastrulació, hem analitzat la capacitat dels diferents mutants de p120-catenina en rescatar aquest fenotip. Al contrari que la proteïna salvatge, els mutants de la p120-catenina que no uneixen Rac1 i Vav2, o que només uneixen Vav2, no són capaços de rescatar la depleció de p120-catenina. Així doncs, els nostres resultats indiquen que la p120-catenina és necessària per l’activació de Rac1 estimulada per Wnt, a través de la unió de Vav2 i de Rac1. Mitjançant la combinació d’experiments in vitro, transfeccions de cultius cel·lulars i anàlisis in vivo en embrions de Xenopus, proposem un mecanisme detallat del control de l’activitat transcripcional de la β-catenina i la via de senyalització de Wnt. / In this work we have investigated the involvement of p120-catenin in Wnt signaling. We demonstrate for the first time the relevance of this catenin in the activation of Rac1 GTPase and in the translocation of β-catenin to the nucleus in response to canonical Wnt signals. The Wnt pathway has been broadly studied due to its involvement in essential functions in normal and pathological epithelial cells. Although the involvement of many proteins in the process has been genetically demonstrated, many details of its activation remain to be clarified yet. Recently, Rac1 has been shown to be essential for β-catenin translocation to the nucleus (Wu X, et al. Cell 2008,133:340-53). Rac1 activation controls the nuclear localization of β-catenin during canonical Wnt signaling. However, the mechanism of activation of this GTPase has not been investigated. Here we report that p120-catenin is required for Rac1 activation, acting as an anchor protein for both Rac1 and its activator Vav2. The interaction of both proteins with p120-catenin is stimulated upon phosphorylation by CK1 and dephosphorylation in tyrosine residues, two p120-catenin post-translational modifications promoted by Wnt3a. When over-expressed, p120-catenin point mutants unable to bind Rac1 and Vav2, or specifically Rac1, fail to stimulate Rac1 activity. Moreover, since p120-catenin depletion disrupts gastrulation in Xenopus, we analyzed p120-catenin mutants for their ability to rescue such phenotype. In contrast to the wild-type protein, p120-catenin point mutants unable to bind Rac1 and Vav2, or to bind Vav2 alone, failed to rescue p120 depletion. Therefore, our results indicate that p120-catenin is required for Rac1 activation upon Wnt signaling, through binding to Vav2 and Rac1 proteins. Combining in vitro binding experiments, cell culture transfections and in vivo analysis in Xenopus embryos, we provide a more detailed picture of the mechanism controlling β-catenin transcriptional activity and Wnt signaling.

Les tècniques proteòmiques basades en l’espectrometria de masses (MS) permeten la caracterització de la complexa i dinàmica natura del proteoma. Aquestes eines han contribuit a entendre millor certes funcions biològiques i respostes cel·lulars i a obtenir biomarcadors específics per a l’estudi d’algunes malalties. En aquest treball, es van utilitzar tècniques proteòmiques de quantificació i validació, basades en l’espectrometria de masses (MS), en diferents estudis de recerca biomèdica. En el primer estudi es va comparar el perfil de proteïnes del fluid vitri de pacients diabètics amb retinopatia diabètica proliferativa (PDR) amb el de pacients no diabètics amb forat macular idiopàtic (MH). L’anàlisi proteòmica comparativa es va fer amb el sistema d’electroforesi diferencial en gel bidimensional basat en el marcatge fluorescent (2D-DIGE). Per MS es van identificar 11 proteïnes diferencials entre els pacients amb PDR i els individus no diabètics. Cinc de les proteïnes diferencials és van validar per western blot en fluids vitris i per RT-PCR en retines. L’anàlisi proteòmica 2D-DIGE va servir per a identificar potencials candidats involucrats en la patogènesis de la PDR. En el segon estudi es va estudiar l’efecte del gen REgulador AutoImmune (AIRE) mitjançant la comparació dels proteomes de cèl·lules epitelials transfectades o no amb AIRE. L’anàlisi comparativa es va realitzar combinant dues tècniques de proteòmica quantitativa: la 2D-DIGE i l’etiquetatge isotòpic codificat de proteïna (ICPL) en combinació amb cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS). Els resultats van mostrar un nivell incrementat de varies xaperones en les cèl·lules que expressaven AIRE, mentre que diferents proteïnes de interacció del citoesquelet es van trobar disminuïdes. A més, algunes proteïnes relacionades amb apoptosi tenien abundàncies diferencials entre unes cèl·lules i les altres. Aquests resultats es van confirmar per western blot i citometria de flux. Finalment, assajos d’apoptosi amb annexin V i etopòsid van demostrar que les cèl·lules positives en AIRE patien més apoptosi espontània i eren menys resistents a la inducció d’apoptosi. Els resultats obtinguts van corroborar el paper d’AIRE com a inductor d’apoptosi. En el tercer estudi, amb l’objectiu de identificar possibles proteïnes biomarcadores de l’activitat TGFβ en gliomes es van analitzar les proteïnes secretades en els cultius cel·lulars primaris derivats de tumors (PCTCs), tractats o no amb TGFβ, mitjançant experiments quantitatius de LC-MS sense marcatge i ICPL. Es van identificar varies proteïnes candidates per a les que es van desenvolupar mètodes d’anàlisi de seguiment d’una reacció seleccionada (SRM) per a poder validar-les en mostres de líquid cefaloraquidi (CSF) i plasma de pacients amb glioma. Per l’anàlisi dels CSFs els resultats van mostrar una clara correlació entre les proteïnes candidates i els nivells de TGFβ en aquestes mostres. Igualment, al analitzar les proteïnes candidates per SRM en mostres de plasma de pacients amb glioma en fases alternades de tractament amb un inhibidor de TGFβ es va observar que els nivells de les proteïnes d’interès eren modulades pel tractament. Aquestes proteïnes conformarien una firma proteica que podria ser útil per al diagnòstic i el seguiment del tractament dels pacients. En conjunt, els resultats obtinguts en cada un dels tres estudis demostren la utilitat de l’anàlisi proteòmica en diferents aspectes de la investigació biomèdica. / Proteomic techniques based on mass spectrometry (MS) allow the characterization of the complex and dynamic nature of the proteome. These tools have contributed to better understand certain biological functions and cellular responses and to obtain specific biomarkers useful for the management of some diseases. In this work, quantitative and validation proteomic techniques, based on mass spectrometry, were applied to different biomedical research projects. In the first study, the protein profile of the vitreous fluid of diabetic patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) and non diabetic patients with macular hole (MH) was compared. Comparative proteomic analysis was performed using differential in gel electrophoresis based on fluorescent labeling (2D_DIGE). Eleven differential proteins between PDR and non diabetic patients were identified by MS. Five differential proteins were validated by western blot analysis of vitreous fluid and by RT-PCR of retinas. 2D-DIGE proteomic analysis allowed the identification of potential candidates involved in the pathogenesis of PDR. In the second study, the effect of AutoImmune Regulator (AIRE) gen was studied by comparison of the proteomic profile of epithelial cells transfected or not with AIRE. The comparative analysis was done using to proteomic techniques: 2D-DIGE and Isotopic Coded Protein Labeling (ICPL) in combination with liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). Results showed an increased level of some chaperons in the cells expressing AIRE, while some cytoskeleton interacting proteins were decreased. Moreover, proteins related wit apoptosis had differential abundances between samples. These results were confirmed by western blot and flow cytometry. Finally, apoptosis assays with annexin V and etoposide demonstrated that AIRE-positive cells suffer more spontaneous apoptosis and are less resistant to apoptosis induction. These results confirm the role of AIRE as an inducer of apoptosis. In the third study, the main objective was the identification of biomarker proteins of TGFβ activity in gliomas. Secreted proteins from primary cultures of tumor cells (PCTCs), treated or not with TGFβ, were analyzed by label free and ICPL LC-MS quantitative experiments. Some candidate proteins were identified. Selected reaction monitoring (SRM) methods were designed to analyze these candidate proteins in cerebrospinal fluid (CSF) and plasma of glioma patients. CSF analysis showed a clear relationship between the protein levels and the TGFβ concentration. When the SRM methods were applied to the plasma of glioma patients under alternate periods of treatment with a TGFβ inhibitor, the levels of proteins of interest were observed to be modulated by the treatment. These proteins can thus constitute a protein signature useful for diagnostic and treatment monitoring. Overall, the results obtained in each of the projects show the usefulness of the proteomic analysis in different aspects of de biomedical research

El plegament de la cromatina a l’interior dels cromosomes metafàsics segueix sent un dels problemes més difícils de resoldre de la biologia estructural. La majoria dels models de plegament més acceptats, que presenten la fibra de cromatina com a unitat bàsica, van ser proposats en condicions de molt baixa força iònica. Mitjançant múltiples tècniques microscòpiques, es va observar que els cromosomes metafàsics contenen un nou element bàsic de plegament: la placa de cromatina. Com a objectiu general, el treball experimental realitzat en aquesta tesi pretén ampliar el coneixement sobre l’estructura interna dels cromosomes metafàsics utilitzant condicions iòniques properes a les observades a la metafase. En primer lloc, s’ha estudiat l’estructura dels cromosomes dins les cèl·lules mitjançant microscòpia de polarització. Per altra banda, s’ha realitzat un ampli estudi de la capacitat d’autoassociació de fragments de cromatina de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes en condicions properes a la metafase. Mitjançant microscòpia de polarització, s’ha vist que els cromosomes metafàsics en medi aquós dins els sacs cel·lulars, són estructures òpticament isotròpiques. L’isotropia observada permet concloure que els cromosomes metafàsics no estan formats per piles paral·leles de nucleosomes. Aquesta possibilitat no exclou però l’associació de les cares laterals dels nucleosomes, que podrien donar lloc a piles amb diferents orientacions. Els resultats obtinguts mitjançant microscòpia electrònica de transmissió de fragments de cromatina obtinguts per digestió amb nucleasa micrococal de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes, mostren que únicament adopten una conformació estesa quan la concentració iònica del medi és molt baixa (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). En condicions iòniques properes a la metafase (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), els fragments de cromatina obtinguts tenen la capacitat intrínseca de formar estructures laminars per autoassociació. A més, no s’observen fibres de cromatina. Les plaques formades per autoassociació presenten les mateixes característiques que les emanades directament de cromosomes metafàsics: són estructures compactes, de superfície llisa i multilaminars. L’alçada de les plaques formades per autoassociació de fragments de cromatina metafàsica determinada a partir de mostres platinades unidireccionalment és de 6.8 ± 1.0 nm per làmina. Aquest valor coincideix amb l’alçada de les plaques emanades de cromosomes parcialment desnaturalitzants, observades al grup. L’aparició d’estructures laminars de gruix superior en mostres sotmeses a incubacions llargues a 25 i 37ºC, indica l’elevada tendència de les làmines de cromatina d’apilar-se i formar estructures multilaminars. Els cossos circulars compactes de 30 nm observats als voltants de les plaques obtingudes, sumat a la presència d’altres estructures circulars més petites sobre les plaques, suggereix que els cossos de 30 nm són estructures intermediàries durant el procés de formació de plaques. Tenint en compte que l’alçada d’un nucleosoma és de 11 nm i que no hi ha evidències que suggereixin una col·locació en columnes dels nucleosomes a les plaques, els resultats indiquen que els nucleosomes es distribueixen de forma parcialment inclinada a l’interior de les plaques. A partir dels resultats obtinguts, es pot suggerir que els nucleosomes a les plaques estan orientats irregularment. La interdigitació entre les làmines successives permet la interacció entre les cares laterals dels nucleosomes i dóna estabilitat a les plaques. La tendència a l’autoassociació de fragments de cromatina metafàsica per formar estructures multilaminars molt estables, suggereix que les cromàtides contenen cromatina plegada en una forma laminar al seu interior. / The three-dimensional organization of the chromatin filament in metaphase chromosomes is one of the most challenging problems of structural biology. The most accepted structural models for chromatin organization in the metaphase chromosome are those that present the chromatin fibber as a basic unit. However, they were proposed by the use of low ionic strength buffers. Through the use of several microscopy techniques, it was observed that metaphase chromosomes were built by a new structural element: the chromatin plate. The main goal of this thesis was to gain further insight on internal structure of metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Firstly, it was analysed the entire chromosome structure within the cell using polarizing microscopy; and secondly, it was analysed the assembly process of digested chromatin fragments from human metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Through the use of polarizing microscopy, it was observed that metaphase chromosomes in aqueous solutions under different ionic conditions are optically isotropic. These results exclude the possibility that nucleosomes are oriented regularly forming parallel columns inside metaphase chromosomes. Despite of this, it does not exclude the face-to-face and lateral side-by-side interactions of different nucleosomes, that can already generate columns with several orientations. The results obtained in the self-assembly process of chromatin fragments obtained after the digestion of micrococcal nuclease of human metaphase chromosomes observed with transmission electron microscopy, showed that they appear to be in an extended conformation just under low ionic strength condition (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). When fragments are treated under metaphase ionic conditions (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), it was observed that chromatin filaments generate laminar structures. In addition, there is no presence of chromatin fibbers. Self assembled plates show the same structural properties than the ones that emanate directly from metaphase chromosomes (i.e., flat and smooth surface, well-defined edges, stacking of several layers). Furthermore, the height of the plates obtained by self-assembly determined in unidirectional shadowing experiments is 6.8 ± 1.0 nm. This value is equal to the height of the plates emanated from partially denatured chromosomes, which was observed previously in our group. The presence of thick plates in the experiments performed at 25 and 37ºC indicate that the self assembled plates can be formed by stacked layers. Circular structures of 30 nm were observed surrounding the plates but also closely associated with them. Their presence suggested that these structures are intermediates of the plate generation process. Taking into account that the nucleosome height is 11 nm and that there are no evidences that suggest the presence of nucleosome columns inside the plates, results indicate that nucleosomes are slightly inclined in the chromatin plates. In conclusion, the results obtained in this thesis suggest that there is an irregular orientation of the nucleosomes inside the chromatin plates. The interdigitation of adjacent layers allows face-to-face and lateral side-by-side interactions between nucleosomes of successive layers, which confers stability and compactness to the laminar structure. The metaphase chromatin tendency to generate multilayered stable structures after a self-assembly process suggests that chromatids are composed of chromatin folded in a laminar way

En el presente trabajo se han determinado las propiedades de la lipasa recombinante de Rhizopus oryzae contenida en un extracto proteico obtenido mediante el cultivo de Pichia pastoris (rROL). Posteriormente, se ha estudiado la inmovilización de la lipasa recombinante en soportes de diferente naturaleza, como son el polvo de polipropileno (EP100) y el Eupergit®. Con el objetivo de realizar una comparación, se realizaron los mismos estudios de caracterización e inmovilización con la lipasa nativa contenida en un extracto proteico obtenido del cultivo de Rhizopus oryzae (nROL). Los análisis de caracterización revelaron dos isoformas de la lipasa recombinante con idéntico N-terminal y con masas muy similares. Por otra parte, el extracto nativo mostró tres isoformas de nROL. En cuanto a los estudios de especificidad frente a triacilglicéridos, se determinó un comportamiento igual de nROL y rROL, mientras que con los análisis frente a ésteres de p-nitrofenol se dedujo la presencia de la esterasa en el extracto nativo. En los estudios de inmovilización, tanto nROL como rROL fueron hiperactivadas a ciertas relaciones de actividad ofrecidas por miligramo de soporte. Además, la estabilidad en función de la temperatura y el pH reveló que nROL es más estable que rROL tanto inmovilizada como en solución. Se estudió la síntesis de un aromatizante utilizándose tres derivados inmovilizados: rROL-EP100, rROL-Eupergit®CM y rROL-Sepabeads. Se analizó el efecto de diversas variables sobre la velocidad inicial de reacción y conversión final. El derivado que mostró unos mejores resultados fue el obtenido a partir del EP100 aunque rROL-Sepabeads fue el derivado inmovilizado más estable. Mediante la metodología de la superficie de respuesta, pudo analizarse el efecto de la concentración de ácido butírico y la relación molar butírico:etanol sobre la velocidad inicial de síntesis, la conversión y la producción. Los resultados de velocidad inicial y conversión mostraron un claro efecto inhibidor e inactivación a elevadas concentraciones de butírico. De igual modo un exceso de etanol también resultaba inhibidor. Las condiciones óptimas se determinaron en base a un modelo para maximizar la producción de butirato de etilo. Finalmente, rROL mostró capacidad catalítica en otras reacciones de interés industrial como son, la síntesis de la cortexolona-21-acetato, lípidos estructurados de baja carga calórica además de triacilglicéridos sustitutivos de las grasas presentes en leches maternas. / Extracts of mature Rhizopus oryzae lipase overexpressed in Pichia pastoris (rROL) and commercial ones from the native microorganism (nROL) have been characterized. Specific activity of rROL extract was more than 40 fold higher than nROL. The presences of multiple bands of lipases around 34 kDa were both extracts. The influence of ionic strength on optimum temperature and pH was also determined from both extracts, significant differences were observed. Finally, the specificity against triacylglycerol esters and p-nitrophenols esters was also analyzed. Similar behaviour was obtained in front of triacylglycerol esters; however rROL shown an opposite behaviour compared to nROL in front of p-nitrophenol esters with preferences for long chain derivatives because of the presence of an esterase in the commercial product. Two different kinds of support, the polypropylene powder EP100 and Eupergit®C, were tested to immobilize the enzymes. The study of the stability of soluble and immobilized enzymes was performed by means of the Box-Hunter experiment design. The stability of a soluble extracts as well as immobilized derivatives was analyzed and the studies showed higher stability or nROL. In order to apply rROL a flavour synthesis, it was immobilized in three different kinds of support (EP100, Eupergit®CM and Octadecyl-Sepabeads) with the aim of using it in the production of ethyl butyrate. The effect of different parameters on initial reaction rate and yield has been studied for each biocatalyst. The results showed the EP100 derivative as the best choice in terms of initial rate and yield but Sepabeads derivative was the most stable. Moreover, by means of a response surface methodology, the effect of butyric acid concentration and molar ratio butyric acid:ethanol on yield, initial synthesis rate and production was studied. An inhibitory effect as well as inactivation of the enzyme was detected at high concentration of butyric acid. The ethanol also showed an inhibitory effect. The optimum conditions were selected in order to maximise the production. Finally, rROL was used to synthesize cortexolone-21-acetate as well as different kinds of structured lipids, obtaining good results

La incidència d’infeccions gonocòciques i pneumocòciques roman alta en països en vies de desenvolupament i està augmentant a moltes parts del món. La necessitat de tractaments per a l’individu i per al control de la malaltia a nivel comunitàri és punyent però escollir el tractament adequat ha esdevingut complex com a conseqüència de la capacitat de Neisseria gonorrhoeae i Streptococcus pneumoniae de desenvolupar resistència envers antibiòtics. Aquesta tesi de doctorat investiga mecanismes relacionats amb la transferència genética horitzontal i amb l’arrest del creixement a N. gonorrhoeae and S. pneumoniae. La primera part de la tesi està dedicada a l’estudi de la transformació natural a N. gonorrhoeae i descriu els procediments que han portat a l’expressió, purificació i caracterització bioquímica de ComE, ComA i DprA, tres proteïnes que tenen un paper en la presa i el processament de DNA ambiental. La segona part de la tesi descriu la caracterització estructural mitjançant cristal·lografia de rajos X de RelBE2 de S. pneumoniae, un sistema toxina-antitoxina cromosòmic de tipus II que s’ha relacionat amb la moderació de la traducció i amb l’arrest del creixement en condicions d’escassetat de nutrients, i proposa un model per a la seva regulació. / The incidence of gonococcal and pneumococcal infections remains high in developing countries and is increasing in many parts of the world. The need not only for treatment of the individual but also for control of the diseases at a community level is acute but the selection of appropriate treatments has become a complicated issue by the ability of Neisseria gonorrhoeae and Streptococcus pneumoniae to develop resistance to antibiotics. This PhD thesis investigates mechanisms related to horizontal gene transfer and growth arrest in N. gonorrhoeae and S. pneumoniae. The first part of the thesis is devoted to the study of natural transformation in N. gonorrhoeae and describes the procedures that have lead to the expression, purification and biochemical characterization of ComE, ComA and DprA, three proteins involved in the uptake and processing of environmental DNA. The second part of the thesis describes the structural characterization by X-ray crystallography of S. pneumoniae RelBE2, a chromosomally-encoded type II toxin-antitoxin system that has been linked to translation moderation and growth arrest under starvation conditions, and proposes a model for its regulation.

Los inhibidores de peptidasas representan un mecanismo fisiológico para la regulación de las enzimas proteolíticas. Mientras que mayoría de los inhibidores monodominio tienen un único sitio reactivo mediante el cual interaccionan con sus peptidasas dianas de un tipo catalítico específico, algunos de ellos inhiben dos moléculas de peptidasa simultáneamente, dando lugar a la formación de complejos ternarios. Para estudiar este tipo de inhibidores se analizó la función de uno de ellos, sermetstatina. Este inhibidor forma un dímero que une fuertemente serín peptidasas y metalopeptidasas. La estructura del dímero de inhibidor fue determinada revelando que sermetstatina presenta una conformación en α/β-sándwich alargado constituido por cinco hebras β antiparalelas conectadas entre sí (β3-β2-β1-β4-β5; conectividad -1, -1, +3, +1) que dan lugar a una hoja β girada ∼30o, en cuya cara cóncava se acomodan dos hélices α (α1 y α2) y una hélice 310. Además, las estructuras de los complejos heterotetraméricos de sermetstatina con la serín peptidasa subtilisina y la metalopeptidasa esnapalisina fueron también determinadas, mostrando que la inhibición ocurre a través de lazos reactivos distales independientes. La interacción entre subtilisina y sermetstatina se produce mediante el lazo reactivo 2, posicionado adecuadamente por su hélice de anclaje, y la hendidura del centro activo de la enzima. El lazo se inserta a modo de cuña mimetizando un substrato en conformación extendida y canónica en la hendidura del centro activo de la enzima, siguiendo el mecanismo estándar de inhibición. Por otro lado, la interacción entre esnapalisina y sermetstatina se produce mediante el extremo N-terminal, el lazo reactivo 1, la hélice α1 y la región Lβ4β5 del inhibidor; y la hendidura del centro activo de la enzima y exositios presentes en la superficie de la proteasa. Este modo de inhibición sigue un mecanismo novedoso en inhibidores de metalopeptidasas, siendo este una reminiscencia distante del modo inhibitorio de los TIMPs en su unión con MMPs así como del modo inhibitorio del inhibidor de serralisina sobre la metalopeptidasa serralisina. Estas estructuras y el modelo del complejo heterohexamérico proporcionan por primera vez una visión detallada del mecanismo molecular de la inhibición simultánea de peptidasas pertenecientes a dos clases mecanísticamente diferentes por un inhibidor monodominio. En resumen, en el presente trabajo se ha determinado que sermetstatina es un inhibidor de doble faz genuino monodominio que ha evolucionado a partir de inhibidores de serín peptidasas de la familia MEROPS I16 con un único sitio reactivo que siguen el mecanismo estándar de inhibición. Dicha evolución ha dado lugar a una proteína bifuncional capaz de inhibir simultáneamente diferentes serín peptidasas y una metalopeptidasa específica a través de dos sitios reactivos distales compatibles. / Protein inhibitors provide a physiological mechanism for the regulation of proteolytic enzymes. While most single-domain inhibitors have one reactive site with which they target peptidases of a specific catalytic class, selected specimens inhibit two peptidase molecules simultaneously, thus giving rise to ternary complexes. To study such inhibition, the function of one of these proteins, sermetstatin, was analyzed. This inhibitor strongly binds as a dimer to serine peptidases and a metallopeptidase. The structure of the isolated inhibitor dimer was determined revealing that sermetstatin is an elongated α/β-sandwich. It consists of a five-stranded antiparallel β-sheet (β3-β2-β1-β4-β5; connectivity -1,-1,+3,+1) twisted by ∼30o, whose concave face accommodates two α-helices (α1 and α2) and a 310-helix. In addition, the structures of the heterotetrameric complexes with the serine peptidase subtilisin and the metallopeptidase snapalysin were equally determined, showing that inhibition occurs through two independent distal reactive sites. The subtilisin-sermetstatin interaction is made by reactive-site loop 2, adequately positioned by its scaffold helix, and the active-site cleft of the enzyme. The loop is inserted wedge-like mimicking a substrate in extended, “canonical” conformation in the active-site cleft of the enzyme following the “standard mechanism”. On the other hand, the snapalysin-sermetstatin interaction involves the N-terminal tail, reactive site loop 1, helix α1 and Lβ4β5 of the inhibitor; and the active-site cleft of the enzyme and some exosites on the protease surface. This inhibition modus follows a novel mechanism for metallopeptidase inhibitors only distantly reminiscent of the inhibitory mode of tissue inhibitors of metalloproteinases on their target matrix metalloproteinases and of serralysin inhibitors on their cognate serralysin MPs. These structures and the derived model for the heterohexameric complex provide for the first time a detailed view of the molecular mechanism of simultaneous inhibition of proteinases belonging to two distinct mechanistic classes by a single-domain protein. In summary, it was determined that sermetstatin is a genuine Janus-faced single-domain inhibitor which has evolved from single-site standard-mechanism serine peptidase inhibitors of family I16 to give a protein capable of simultaneous inhibition of serine peptidase in general and a specific metallopeptidase through distinct but compatible sites.

Progression through the cell cycle is directed by cyclin dependent kinases (CDKs), which are essential for normal and cancer cell proliferation. CDKs are activated by association with cyclins specific to each cell cycle phase (G1, S, G2, and M). Thus, CDK associated with G1 phase cyclins promote the expression of proteins necessary for DNA replication, but is unable to activate it. CDK associated with S phase cyclins, in turn, triggers the activation of chromosomal origins of replication, but is unable to promote chromosome condensation and segregation of sister chromatids, which is carried out by CDK associated with mitotic cyclins. Despite the essential role of CDKs in cell cycle progression, how the different cyclins promote specifically the various processes of the cell cycle was still an open question by the time this thesis was initiated. Since the discovery of cyclins by Nobel laureate Tim Hunt [Evans et al. (1983) Cell 33:389] it was assumed that cyclins confer substrate specificity. However, later on, fellow Nobel laureate Paul Nurse proposed an alternative quantitative model, [Stern & Nurse (1996) Trends Genet 12:345], based on the observation that successive waves of cyclins result in increased levels of CDK activity. While low levels of activity (CDK associated with G1 cyclins) are sufficient promote progression through the G1 phase and start the pro-S phase transcription program, would be unable to trigger replication. Moderate levels of activity (CDK associated with S phase cyclins) would be able to activate replication but not mitosic events, which would require the high CDK activity associated with M phase cyclins. If correct, the quantitative model should fulfill two predictions, but only one was demonstrated by the Nurse lab. Eukaryotic unicellular yeast cells are able to survive with a single mitotic cyclin, which is notwithstanding able to orderly drive the cell through the different cell cycle phases [Fisher & Nurse (1996) EMBO J 15:850]. Therefore M-CDK activity is able to promote the previous phases of the cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe However, if a purely quantitative mechanism applies, the complementary prediction should be true as well: an early cyclin to be able to trigger later events if expressed at levels high enough. To test such prediction we generated a budding yeast Saccharomyces cerevisiae strain carrying a G1 cyclin G1 resistant to degradation, under a strong inducible promoter, and fused to a nuclear localization signal. Our results show that one such cyclin is capable of firing chromosome replication conditions in which the S phase cyclins, G2 and M are suppressed. Therefore, our results support the quantitative model against the requirement of substrate specificity. How eukaryotic cells prevent premature activation of the critical cell cycle processes that lead to genomic instability, seems therefore trust in the regulation of activity levels and limiting the presence of cyclin at specific time and space.

La polineuropatia diabètica (PND) és una de les complicacions secundàries més freqüents de la diabetis mellitus. Provoca un empobriment de la qualitat de vida dels malalts, causa dolor i úlceres i, en última instància, amputació de l’extremitat afectada. La patogènia és multifactorial, hi ha alteracions estructurals en els nervis perifèrics i els tractaments actuals són simptomàtics, no específics i poc efectius. El ratolí transgènic RIP/INFβ és un model de diabetis, que mimetitza la diabetis autoimmune humana, provocant la destrucció de les cèl·lules β pancreàtiques, que s’intensifica amb l’administració de dosis baixes repetides d’estreptozotocina (STZ). Partint de la base de que els processos biològics implicats en la degeneració i regeneració dels nervis perifèrics estan controlats pels ganglis de les arrels dorsals (GAD), l’objectiu d’aquesta tesi ha estat analitzar l’expressió gènica i els processos biològics que esdevenen en els GAD del nervi ciàtic després d’un traumatisme, en el ratolí transgènic RIP/INFβ tractat amb dosis baixes i repetides de STZ (Tg-STZ). S’ha treballat amb els GAD del nervi ciàtic de ratolins, en diferents condicions experimentals: controls ICR (ICR) atès que els ratolins transgènics presenten aquest fons genètic; ICR tractats amb STZ (ICR-STZ); transgènics RIP/INFβ (Tg); i Tg tractats amb STZ (Tg-STZ). Quatre setmanes després de considerar-ne instaurada la diabetis en els Tg-STZ, tots els animals van ser sotmesos a una lesió per aixafament en el nervi ciàtic de l’extremitat esquerra, mantenint la dreta intacta. Quatre setmanes desprès de la lesió es van prendre mostres dels GAD del nervi ciàtic d’ambdues extremitat. Es va extreure el RNA dels GAD per realitzar els estudis de microarrays (Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array). Per validar els valors de l’expressió gènica es va realitzar una PCR quantitativa en temps real (RT-qPCR). Es van realitzar comparacions dels perfils gènics entre les diferents condicions experimentals: 1) ICR-STZ lesionades vs ICR lesionades; 2) ICR lesionades vs ICR no lesionades; 3) Tg-STZ no lesionades vs ICR no lesionades; i 4) Tg-STZ lesionades vs ICR lesionades. Les mostres de referència van ser els GAD de l’extremitat no lesionada dels ratolins ICR (baseline) amb un fold change (FC) de 1. Un cop obtinguts els perfils de les comparatives es van analitzar els gens sobrerregulats i infrarregulats, i els processos biològics implicats, amb diferents bases de dades (Database for Annotation, Visulaization and Integrated Discovery; Center for Quantitaive Biology; Gene Home). L’absència de diferències en l’expressió gènica entre els GAD de les extremitats lesionades dels animals ICR-STZ vs ICR, indica que, en aquests òrgans, la STZ no té un efecte neurotòxic. En animals control ICR a les 4 setmanes després d’una lesió en el nervi ciàtic, encara es sobrexpressen gens relacionats amb la regeneració nerviosa, que participen en les vies de senyalització (Gpr151, Nts), transmissió sinàptica (Npy), projeccions neuronals i guia de l’axó (Sox11, Atf3, Tnc, Sema6a, Sprr1a, Gal), el que indicaria que la lesió encara no està totalment resolta. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, la infrarregulació de gens relacionats amb vies metabòliques (Vgf) i la sobrerregulació de gens implicats en el metabolisme de hidrats de carboni (Car3) i lípids (Gdpd3), indicaria que a les 8 setmanes d’iniciar el procés diabètic els GAD estarien afectats per la hiperglucèmia. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, 8 setmanes després de començar la hiperglucèmia, la infrarregulació de gens implicats en desenvolupament del sistema nerviós (Gal, Bdnf, Erg3), regeneració axonal (Sprr1a, Lingo1), transmissió sinàptica (Calb1, Snapin), transducció de senyals (Nts, Rgs2), canals de potassi (Kcns1, Kcnq5, Knj13, Kcna6, Kcnt1) i apoptosi (Tfnaip, Ctsb, E2f1, Crh), indicaria l’existència de canvis degeneratius en els GAD deguts a la neuropatia diabètica. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, 4 setmanes després d’una lesió per aixafament del nervi ciàtic, la sobreexpressió de gens relacionats amb guia de l’axó (Foxd1), regeneració axonal (Sprr1a), projeccions neuronals (Mapk8), supervivència de les neurones dels GAD i elongació de les neurites (Gal, Sox11), o de vies de senyalització nerviosa (Npy1r, Igf1, Rgs18, Gpr151), transmissió sinàptica (Gabrb3, Neto1, CcKbr) i apoptosi (Crh), assenyalaria que en els GAD hi ha processos de regeneració posttraumàtica. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, 4 setmanes després d’una lesió per aixafament del nervi ciàtic, la infraexpressió de gens relacionats amb l’axogènesi (Nptx1, Cxcr4), transmissió sinàptica neuromuscular (Egr3) i transport de substàncies (Htr3a, Tnpo, Mlc1, Slc15a2, Slc6a4), mostraria un alentiment de la regeneració nerviosa. En animals control ICR a les 4 setmanes després d’una lesió en el nervi ciàtic, la sobreregulació de gens implicats en reorganització o remodelació de la matriu extracel·lular (MEC) i del microambient local a la part lesionada (Mmp16, Col18a1, Col3a1, Col5a2, Loxl2) i d’adhesió cel·lular (Lmo7, Flrt3), i transport de substàncies (Cacna2d1, Slc15a3, Slc15a9, Slc6a4) i apoptosi (Phb, Comp), indicaria que hi ha regeneració i remodelació a la part lesionada. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, els processos de reorganització i remodelació de la MEC quasi no estan sobrerregulats, excepte Mmp16 i Tgfbi amb un FC>2, el que confirmaria que la regeneració estaria retardada, i encara no s’haurien iniciat els fenòmens de remodelació local. En animals control ICR a les 4 setmanes després d’una lesió en el nervi ciàtic, hi ha sobrexpressió de gens relacionats amb el dolor neuropàtic (Npy, Npy2r, Gal) i en animals transgènics (Tg-STZ) no hi ha expressió de Npy, i el gen Gal està infrarregulat. Això podria estar relacionat amb la pèrdua de la sensibilitat al dolor que s’observa en els pacients amb PND. El coneixement dels gens i els processos biològics involucrats en la degeneració i regeneració nerviosa en ratolins sans ICR i en ratolins transgènics Tg-STZ diabètics, obre noves vies de recerca per aprofundir en el coneixement de la patogènia de la PND i per l’estudi de molècules diana en el tractament de la PND i del dolor neuropàtic. / Diabetic neuropathy (PND) is the most frequent secondary complication of diabetes mellitus (DM). The most important contributors to reduction in the quality of life of patients with DM are neurological pain and foot ulcerations and, ultimately, non-traumatic amputation of the affected limb. The pathogenesis is multifactorial, there are structural changes in the peripheral nerves and current treatments remain largely symptomatic, non-specific and not uniformly effective. Transgenic diabetic RIP/INFβ mice when treated with low doses of streptozotocin (STZ) present with pancreatic β-cell destruction, mimicking autoimmune diabetes in humans. On the basis that mechanisms governing peripheral nerve degeneration and regeneration are controlled by dorsal root ganglion (GAD), the aim of this thesis was to characterize gene expression, and thus the biological processes that take place in the GAD of injured sciatic nerve, of transgenic RIP/INFβ mice treated with multiple low doses of STZ (Tg-STZ). Gene expression in GAD was studied in four different groups of mice: wild type ICR (ICR) as a wild type genetic background control; ICR treated with STZ (ICR-STZ); transgenic RIP/INFβ mice (Tg); and Tg mice treated with STZ (Tg-STZ). Four weeks after diabetes was established in Tg-STZ mice, a left sciatic nerve crush injury was performed in all groups, the right limb was left intact. Four weeks after sciatic nerve injury GAD samples were collected from both hind limbs. GAD RNA was extracted to perform microarray study (Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array). Real time PCR (RT-qPCR) was performed to validate some of gene expression values obtained. Comparisons were made between the gene profiles from the different experimental conditions: 1) ICR-STZ injured vs ICR injured, 2) ICR injured vs ICR uninjured, 3) Tg-STZ uninjured vs ICR uninjured and 4) Tg-STZ injured vs ICR injured. Baseline samples were the uninjured limbs from ICR mice with a Fold Change value of 1. Once the compared profiles were obtained, upregulated and downregulated genes were analysed, as well as their related biological process, using different databases (Database for Annotation, Visulaization and Integrated Discovery; Center for Quantitaive Biology; Gene Home). The absence of differences in gene expression between injured limbs GAD from ICR-STZ mice vs ICR mice showed that STZ administration had no toxic effect in GAD. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with nerve regeneration were still upregulated in ICR mice, particularly those involved in signalling (Gpr151, Nts), synaptic transmission (Npy), neuronal projection and axonal guidance (Sox11, Atf3, Tnc, Sema6a, Sprr1a, Gal). This finding indicates that the lesion was not completely resolved. Transgenic diabetic mice (Tg-STZ) showed downregulation of genes related to metabolic pathways (Vgf) and upregulation of genes implicated in carbohydrate (Car3) and lipid metabolism (Gdpd3), indicating that 8 weeks after DM onset, a sustained hyperglycaemia affects GAD. Transgenic diabetic mice (Tg-STZ) showed, after 8 weeks of sustained hyperglycaemia, downregulation of genes associated with nervous system development (Gal, Bdnf, Erg3), axonal regeneration (Sprr1a, Lingo1), synaptic transmission (Calb1, Snapin), signal transduction (Nts, Rgs2), potassium channel (Kcns1, Kcnq5, Knj13, Kcna6, Kcnt1) and apoptosis (Tfnaip, Ctsb, E2f1, Crh). Reflecting GAD degenerative changes due to PND. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with nerve regeneration were still upregulated in diabetic transgenic mice (Tg-STZ) such as those involved in axon guidance (Foxd1), axonal regeneration (Sprr1a), neuronal projection (Mapk8), GAD neurons survival and neurite elongation (Gal, Sox11), or signalling (Npy1r, Igf1, Rgs18, Gpr151), synaptic transmission (Gabrb3, Neto1, CcKbr) and apoptosis (Crh). Suggesting ongoing posttraumatic GAD regeneration processes. Four weeks after sciatic nerve injury, several genes were downregulated in diabetic transgenic mice (Tg-STZ) involved in axogenesis (Nptx1, Cxcr4), neuromuscular synaptic transmission (Egr3) and transport (Htr3a, Tnpo, Mlc1, Slc15a2, Slc6a4), evidencing delayed nerve regeneration. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with nerve regeneration were still upregulated in ICR mice, involved in extracellular matrix (MEC) reorganization and local microenvironment (Mmp16, Col18a1, Col3a1, Col5a2, Loxl2), cell adhesion (Lmo7, Flrt3), transport (Cacna2d1, Slc15a3, Slc15a9, Slc6a4) and apoptosis (Phb, Comp) indicating reorganization and regeneration of the injured site. Transgenic diabetic mice (Tg-STZ) only showed upregulation of 2 genes (Mmp16, Tgfbi) related to MEC reorganization. The remaining genes were barely upregulated. This finding is in accordance with a delayed regeneration, and with the fact that local remodelling is yet to be started. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with neuropatic pain were upregulated in ICR mice (Npy, Npy2r, Gal). However, in diabetic transgenic mice Tg-STZ, no Npy expression was found and, moreover, Gal was downregulated. This finding could be related to PND loss of pain sensitivity. Our findings regarding genes and biological processes involved in nerve degeneration and regeneration mechanisms in ICR mice and in diabetic transgenic mice Tg-STZ lead to new research lines aimed to understanding PND pathogenesis and to the study of target therapeutic molecules for PND and diabetic pain.

La presente tesis estudia los sitios alostéricos desde una perspectiva estructural y evolutiva. La regulación alostérica es un aspecto fundamental de la vida a nivel molecular, ya que es el mecanismo más potente y frecuente en la regulación de la actividad proteica: mediante la unión de un ligando a un sitio que no es el sitio activo. Este fenómeno fue descrito por primera vez hace más de 50 años y desde entonces no ha dejado de captar la atención de la comunidad científica, llegando incluso a ser calificado como `el segundo secreto de la vida', después del código genético. Sin embargo, la comprensión cabal de los mecanismos involucrados continúa siendo un gran desafío científico. Actualmente, los sitios alostéricos han despertado un creciente interés por parte de expertos en química medicinal y compañías farmacéuticas, dado su potencial para el desarrollo de nuevos fármacos. La tesis se presenta como un `compendio de publicaciones'. El primer artículo fue publicado a principios del año 2010 y describe la primera etapa del proyecto, una serie de análisis computacionales a gran escala para caracterizar sitios de unión a ligando integrando información referente a secuencia, sitios activos y estructura para más de mil familias proteicas. Mediante la identificación de sitios de unión comunes en distintas estructuras de la misma familia proteica, se desarrolló un método para medir la conservación estructural de dichos sitios. Esta metodología permitió realizar una caracterización de sitios de unión considerando distintos aspectos, como la conservación evolutiva a nivel de secuencia, flexibilidad estructural, potencial electrostático y conservación estructural. El descubrimiento más significativo fue la inesperada falta de correlación entre las medidas de conservación de secuencia y estructura para muchos de los sitios de unión predichos. Este hallazgo es válido también para casos específicos de proteínas alostéricas, donde el sitio activo está conservado tanto a nivel de secuencia como de estructura, pero el sitio alostérico sólo presenta conservación a nivel estructural y no de secuencia. El segundo artículo fue publicado a fines del año 2012 y explora la relación entre la flexibilidad proteica y la regulación alostérica, definiendo una metodología computacional para la predicción de sitios alostéricos en estructuras proteicas. Más allá de los aspectos dinámicos que fueron estudiados mediante el análisis de modos normales, el método también incorpora la medida de conservación estructural desarrollada en el primer artículo. El sistema predictivo fue puesto a prueba utilizando un extenso conjunto de proteínas alostéricas de estructura conocida, obteniendo un valor predictivo positivo de 65%. Después de la segunda publicación, el método se ha implementado como servidor web para brindar apoyo a la investigación de la regulación alostérica, tanto para extender el conocimiento de esta forma fundamental de regulación de la actividad proteica, como para ayudar en la aplicación de dichos conocimientos al desarrollo de nuevos fármacos con objetivos terapéuticos. / This thesis studies protein allosteric sites from a structural and evolutionary perspective. Allostery is a fundamental aspect of life at the molecular level, the most common and powerful mechanism of protein activity regulation: through binding of a ligand to a site which is not the active site. This phenomenon was first described more than 50 years ago and it still captures the attention of researchers, while fully understanding its mechanisms remains a grand scientific challenge. Furthermore, allosteric sites have been increasingly calling the attention of medicinal chemists and pharmaceutical companies, given their potential for the development of novel therapeutics. The thesis is presented as a `compendium of published articles'. The first article was published at the beginning of 2010 describing the first stage of the thesis, a series of large-scale computational analyses to characterize putative small-molecule binding sites by integrating publicly available information on protein sequences, structures and active sites for more than a thousand protein families. By identifying common pockets across different structures of the same protein family a method was developed to measure the pocket's structural conservation. Characterization of putative ligand-binding sites followed using different measures such as sequence conservation, structural flexibility, electrostatic potential and structural conservation. The most relevant finding was the unexpected lack of correlation between the two conservation measures, of sequence and structure, for many of the predicted cavities. This general finding was also observed in specific cases of allosteric proteins, where the active site was conserved both in terms of structure and sequence but the allosteric site was conserved only from the structural perspective and did not show conservation at the sequence level. The second article was published at the end of 2012, it explores the relationship between protein flexibility and allosteric effects defining a computational methodology to predict the presence and location of allosteric sites on protein structures. Besides the dynamical aspects assessed through normal mode analysis, the method also incorporates the structural conservation measure defined in the first article. The predictive approach was benchmarked against a large data set of allosteric proteins of known structure obtaining 65% positive predictive value. After the second publication, the method has been implemented in the form of a freely available web-server aimed to support the work of researchers in the field of allosterism, both to improve the understanding of this fundamental form of protein function regulation and to serve applied purposes in the area of drug design and discovery.