Les cèl·lules eucariotes estan constantment exposades a dany al DNA i a estrès replicatiu (estrès genotòxic), font d'inestabilitat genòmica. L'anomenat mecanisme de vigilància (checkpoint) de la fase S detecta la presència d'estrès genotòxic i genera una resposta que inclou l'aturada preventiva de la replicació i del cicle cel·lular, per tal de donar temps a la superació del problema, i la protecció de la replicació dels cromosomes. Quan els elements centrals d'aquest mecanisme de control estan mutants, les cèl·lules esdevenen genèticament inestables i, en humans, predisposa al càncer. Malgrat el seu paper crític en la preservació de la integritat del genoma, es desconeix la manera com el mecanisme de vigilància de la fase S executa bona part de la seva resposta. Els elements i vies que constitueixen el checkpoint estan conservats evolutivament. El nostre treball s'ha centrat en el llevat de gemmació Saccharomyces cerevisiae. En aquest organisme la proteïna quinasa efectora principal és Rad53. Amb l'objectiu de descobrir dianes a través de les quals Rad53 regula la fase S, s'han assajat en una reacció quinasa in vitro diferents proteïnes candidates a ser substrat de Rad53. Això ha permès la identificació de la ciclina de fase S Clb6 com a substrat de Rad53 in vitro.Les ciclines són les subunitats activadores de la quinasa dependent de ciclina Cdc28/Cdk1, que promou la progressió del cicle cel·lular. Cdc28/Cdk1 és activada per diferents ciclines específiques de les diferents fases del cicle cel·lular, que li confereixen especificitat de substrat. Clb6 és una de les dues ciclines de fase S (junt amb Clb5), que promouen la replicació del DNA. Mentre que Clb5 és present des del final de la fase G1 fins a anafase, Clb6 és eliminada durant la primera meitat de la fase S. Per tal d'estudiar si Clb6 és diana de Rad53 in vivo, s'ha estudiat el seu comportament en resposta a estrès genotòxic. Interessantment, en una fase S compromesa els nivells de Clb6 es mantenen estables, i aquesta estabilització és dependent de Rad53. Experiments amb l'inhibidor de la traducció proteica cicloheximida mostren que l'estabilització de Clb6 requereix síntesi de novo. Donat que en un cicle cel·lular no pertorbat Clb6 és expressada exclusivament en fase G1, sota el control del factor de transcripció MBF. Els nostres resultats indiquen que MBF es reactiva en una fase S compromesa: la subunitat transactivadora Swi6, exclosa del nucli en una fase S no pertorbada, és nuclear en una fase S compromesa; per altra banda, la sobreexpressió d'una forma hiperestable del repressor d'MBF Nrm1 dóna lloc a la desaparició de Clb6 malgrat la presència continuada d'estrès genotòxic i una resposta checkpoint funcional. Fins ara MBF era considerat un factor de transcripció exclusiu de la fase G1.Per últim hem explorat el paper de l'estabilització de Clb6 en una fase S compromesa. El mutant nul clb6 no presenta cap fenotip detectable, suggerint que Clb6 pot operar en forma redundant dins de la resposta a estrès genotòxic. Per aquest motiu hem optat pel plantejament complementari: estudiar l'efecte de mantenir la presència de Clb6 en una fase S no pertorbada (i per tant en absència de la resta de la resposta checkpoint). En aquestes condicions les cèl·lules repliquen el seu DNA amb aparent normalitat, però queden aturades en un estadi previ a anafase. Aquests resultats suggereixen que Clb6 pot ser un element efector de la branca S-M del mecanisme de vigilància de la fase S, que estaria constituïda per diversos punts de control solapat. Aquest paper justificaria que Clb6 hagi de ser eliminada de forma avançada respecte a Clb5. / Eukaryotic cells are permanently exposed to DNA damage and to replication stress (genotoxic stress), a source of genomic instability. A surveillance mechanism, the S phase checkpoint, detects and responds to genotoxic stress, and elicits a response that includes the arrest of cell cycle progression -to give time to overcome the insult- and the protection of chromosome replication. When the checkpoint central elements are mutated cells become genetically unstable, which in humans results in a high frequency of cancer.Despite such critical role to preserve genomic integrity, much remains unknown about the way how the S phase checkpoint executes its response. Because the checkpoint elements and pathways are conserved, our work has been carried out in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. In this organism Rad53 is the S phase checkpoint effector kinase. To identify novel Rad53 targets, we carried out an in vitro kinase assay with different potential substrate proteins involved in cell cycle control. This approach identified the S phase cyclin Clb6 as an in vitro Rad53 substrate.Cyclins are the activatory subunits for Cdc28/Cdk1, the cyclin dependent kinase that drives cell cycle progression in budding yeast. Cdc28/Cdk1 is activated by different cell cycle phase specific cyclins, that also confer substrate specificity to the kinase. Clb6 and Clb5 are the S phase cyclins, promoting the onset of DNA replication. Interestingly, whereas the presence of Clb5 spans from late G1 to anaphase, Clb6 is eliminated earlier, during S phase.To study whether Clb6 is a target of Rad53 in vivo, we explored the effect of genotoxic stress on the cyclin. When cells are exposed to replication stress or to DNA damage during S phase, the presence of Clb6 is stabilized, and such stabilization depends on Rad53.Experiments with the inhibitor of protein translation cycloheximide show that the stabilization of Clb6 requires de novo synthesis. In an unperturbed cell cycle Clb6 is expressed only during G1 phase, under the control of the transcription factor MBF. Our results show that MBF is reactivated in a compromised S phase: the transactivatory subunit Swi6, excluded from the nucleus in an unperturbed S phase, shows nuclear localization during a compromised S phase; in addition, the overexpression of a hyperstable form of the MBF repressor Nrm1 results in Clb6 elimination, despite the continued presence of genotoxic stress and a functional checkpoint response. To date, MBF was considered a transcription factor operating solely and characteristically during G1 phase.Finally we have explored the role of Clb6 stabilization in response to genotoxic stress. The clb6 null mutant does not present a detectable phenotype, which is compatible with a redundant role in the response to genotoxic stress. We therefore chose to address the question the other way round, and study the effect of keeping the levels of Clb6 stable during an otherwise unperturbed S phase (and therefore in the absence of the vast checkpoint response that could mask the specific role of Clb6). Under such conditions cells replicate normally, but arrest in a stage previous to anaphase. These results suggest that Clb6 may be an effector element in the S-M branch of the S phase checkpoint. One such role would explain why Clb6 must be eliminated in S phase, ahead of Clb5 during mitosis.

Les cèl·lules progenitores endotelials (EPC) derivades de la medul·la òssia tenen capacitat per diferenciar-se a cèl·lula endotelial (EC), contribuint així a la reparació endotelial, no obstant també poden diferenciar-se a altres tipus cel·lulars perpetuant lesions vasculars. En artèries pulmonars de pacients amb malaltia pulmonar obstructiva crònica (MPOC) s'ha relacionat un increment en el nombre de les EPC amb un engruiximent de la capa íntima d'aquestes. L'engruiximent d'aquesta està constituït principalment per cèl·lules musculars llises (SMC), així, aquest treball s'ha centrat en investigar la capacitat de les EPC per diferenciar-se a SMC, i per tant en contribuir en el remodelat vascular i en els mecanismes moleculars que hi intervenen. El factor de creixement transformant beta 1 (TGFß1) modula la migració i la diferenciació de EC a un fenotip mesenquimal mitjançant un procés anomenat "endothelial-to-mesenchymal transition" (EnMT). Per tant, el primer objectiu de l'estudi va ser avaluar la plasticitat de les EPC per diferenciar-se a SMC o EC. I el segon, investigar els mecanismes moleculars, relacionats amb la via del TGFß1, que podrien intervenir en la diferenciació i la migració d'aquestes. Per avaluar la plasticitat de las EPC, es van realitzar co-cultius amb EC i SMC in vitro i per una altra banda es van injectar les cèl·lules progenitores dins d'artèries pulmonars humanes aïllades. El fenotip de les cèl·lules es va caracteritzar morfològicament, per immunofluorescència i mitjançant microscopia electrònica. Per avaluar els mecanismes de diferenciació de les EPC, els co-cultius d'aquestes amb EC o SMC es van tractar amb inhibidors de la via del TGFß1 i es van analitzar per citometria de flux i immunofluorescència. També es va avaluar l'expressió gènica de marcadors endotelials i mesenquimals i l'expressió de factors de transcripció relacionats amb el procés d'EnMT. La migració de les EPC es va avaluar mitjançant assaigs en transweells en les mateixes condicions. Els resultats d'aquest treball mostren en primer lloc la capacitat de les EPC per diferenciar-se a EC, facilitant la reparació de l'endoteli vascular, però també per migrar a la capa íntima de les artèries pulmonars i diferenciar-se a SMC, contribuint així al remodelat vascular d'aquestes. Per últim, els resultats també demostren que les EPC es poden diferenciar a SMC i adquirir un fenotip migratori seguint un procés similar al de EnMT, que pot estar mediat pel factor TGFß1. / Bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPC) have shown in vitro and in vivo their ability to differentiate into endothelial cells (EC) and repair the endothelium. However, some evidences suggest that the plasticity of these cells to differentiate into other cell types might contribute to perpetuate vascular lesions. Studies in pulmonary arteries (PA) of patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) suggest that bone marrow-derived EPC may infiltrate the intima and differentiate into smooth muscle cells (SMC). This study is aimed to evaluate the plasticity of EPC to differentiate into SMC and EC in both cell culture and human isolated PA. The study is also addressed to evaluate whether genes involved in the endothelial-to-mesenchymal transition (EnMT) may contribute to mesenchymal phenotype acquisition of EPC and whether transforming growth factor ß1 (TGFß1) is involved in this process. The in vitro studies demonstrated EPC may acquire the morphology and phenotype of the cells they were co-cultured with. EPC co-incubated with human isolated PA were able to migrate into the intima and differentiate into SMC. The results also show that co-culture of EPC with smooth muscle cells (SMC) increases the expression of the mesenchymal cell markers and decreases the expression of the endothelial cell markers. In the same conditions, we also observed an increase in the gene expression of the EnMT-related transcription factors. Inhibition of TGFß receptor I (TGFßRI) partially blocked the differentiation of EPC into SMC and facilitated their differentiation into endothelial cell lineage.This study provides evidences of plasticity of EPC to differentiate into both EC and SMC, reinforcing the idea of their potential role in remodeling process of PA in COPD. Finally, the results also indicate that EPC may differentiate into SMC-like cells through an EnMT-like process and that TGFß1 plays an important role in the fate of EPC.

La lignificación de la pared de las células del xilema es un proceso extremadamente complejo, sometido a un estrecho control hormonal cuya función principal es la de conferir rigidez e impermeabilidad al sistema vascular. La lignificación es una secuencia de reacciones en cadena que conducen desde un metabolito primario, la fenilalanina, hasta los precursores inmediatos de las ligninas, los alcoholes hidroxicinamílicos (p-cumarílico, coniferílico y sinapílico). Estos alcoholes son oxidados, finalmente, por las peroxidasas para dar lugar a sus correspondientes radicales, que se ensamblan en la pared celular generando un polímero hidrofóbico y fuertemente polidisperso, que da rigidez e impermeabiliza la pared celular, constituyendo uno de los mayores sumideros metabólicos del CO2 fijado durante la fotosíntesis. Las peroxidasas siringilo son las enzimas responsables de la oxidación del alcohol sinapílico, lo que conduce a la formación de monómeros siringilo (S) que se incorporan al polímero de lignina. Estas enzimas han sido descritas como peroxidasas básicas que no presentan restricciones estéricas que impidan la entrada de alcohol sinapílico en el centro catalítico. Hasta el momento, las peroxidasas más estudiadas a nivel estructural han sido la ATP A2 de Arabidopsis y HRP A2 de rábano, las cuales son peroxidasas guaiacilo incapaces de oxidar el alcohol sinapílico. La peroxidasa siringilo mejor caracterizada hasta el momento es la de Zinnia elegans (ZePrx). En el genoma de Arabidopsis existen 73 peroxidasas pero ninguna de ellas ha sido identificada como una peroxidasa de tipo siringilo. Estudios previos buscaron en el genoma de A. thaliana peroxidasas que presentan una gran homología de secuencia con ZePrx, así como de estructura, carga superficial, punto isoeléctrico y regulación de su expresión. Teniendo en cuenta estos criterios se seleccionaron las peroxidasas AtPrx4, AtPrx52, y AtPrx72. En esta tesis, se muestra cómo la supresión de dichas peroxidasas en diferentes líneas mutantes de Arabidopsis afecta al contenido y a la composición de ligninas. En general, todas las líneas mutantes mostraron una disminución en el contenido de ligninas, medido con bromuro de acetilo, entre un 17 y un 37%. Además, la relación S/G, obtenida por tioacidolisis, indica una disminución en las unidades de S en todos los mutantes. Además, como se deduce de las tinciones de Wiesner y de Mäule, esta reducción en el contenido de monómeros S parece estar restringida a las fibras interfasciculares, pero no afecta a los vasos del xilema. Para analizar si este cambio en la composición de lignina era dependiente de la edad de la planta, también se realizaron análisis cualitativos y cuantitativos de ligninas en tallos en diferentes etapas de desarrollo. Nuestros resultados mostraron diferencias significativas en el contenido y la composición de ligninas entre plantas mutantes y WT solamente en las últimas etapas del desarrollo. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el tamaño de las plantas mutantes en comparación con el WT. Los análisis mediante qPCR revelaron que los genes implicados en la biosíntesis de ligninas, así como en la formación de la pared celular secundaria, redujeron su expresión en las plantas mutantes. Por otro lado, la expresión de genes implicados en la biosíntesis de ésteres sinapato y de flavonoides se incrementó en las plantas mutantes con respecto al WT lo cual indica que hay una reorientación de los esqueletos carbonados de la ruta de biosíntesis de las ligninas hacia otras rutas del metabolismo fenilpropanoide. En conjunto, nuestros resultados sugieren que AtPrx4, AtPrx52 y AtPrx72 son peroxidasas siringilo implicados en la síntesis de unidades S en las fibras interfasciculares y además, su represión afecta a toda la ruta fenilpropanoide y puede ser suficiente para alterar el metabolismo de la planta. / The lignification of xylem cell walls is an extremely complex process, under strict hormonal control, whose main function is to confer rigidity and impermeability to the vascular system. Lignification is the result of several reactions from a primary metabolite, phenylalanine, until the immediate precursors of lignin, the hydroxycinnamyl (p-coumaryl, coniferyl and sinapyl) alcohols. These alcohols are finally oxidized by peroxidases to give their corresponding radicals, which will be further assembled in the cell wall, generating a hydrophobic polymer (lignin) which gives rigidity and waterproof cell wall. Lignin constitutes a major metabolic sink for the CO2 fixed during photosynthesis. Syringyl peroxidases are the enzymes responsible for sinapyl alcohol oxidation that eventually lead to syringyl monomers formation. They have been described as basic peroxidases which show no steric restrictions that hinder the entry of sinapyl alcohol into the catalytic centre. So far, the most studied peroxidases at the structural level, such as ATP A2 from Arabidopsis and HRP A2 from horseradish, are guaiacyl peroxidases, unable to oxidize sinapyl alcohol. Unfortunately, little is known regarding structure and catalytic properties of syringyl peroxidases. The best characterized is ZePrx from Zinnia elegans. Since such a peroxidase similar to ZePrx has not been identified in Arabidopsis, a search through A. thaliana genome was performed, in order to identify the peroxidases which showed the highest homology to ZePrx. Based on several structural and molecular characteristics, AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 were determined to be the most likely homologous to ZePrx in Arabidopsis. In this thesis, we show how the suppression of AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 in different mutant lines of Arabidopsis affects lignin content and composition. Overall, all the mutant lines showed a decreased in lignin content, measured with acetyl bromide, ranging from 17 to 37%. Furthermore, the S/G ratio, obtained by both nitrobenzene oxidation and thioacidolysis, indicated a decrease in S units in all the mutants. As deduced from Wiesner and mainly Mäule stainings, this reduction in S monomers content seems to be restricted to the interfascicular fibers, but it does not affect xylem vessels. To assay whether this shift in lignin composition was age-dependent, we also performed qualitative and quantitative analyses of lignins in stems at different stages of development. Our results showed significant differences in both content and composition only in late stages of development of mutant plants. However, no significant differences were found regarding mutant size in comparison with WT when plants reached maturity. qPCR revealed that genes involved in lignin biosynthesis as well as in secondary cell wall formation were down-regulated in mutant plants. On the other hand, expression of genes involved in sinapate esters and flavonoid biosynthesis was up-regulated in mutant plants, which indicates a reallocation of carbon from lignin biosynthetic pathway to other routes of phenylpropanoid metabolism. Taken together, our results indicate that AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 may be syringyl peroxidases involved in the synthesis of S units in interfascicular fibers. Moreover, the suppression of the last step of syringyl lignins biosynthesis affects the whole phenylpropanoid pathway and may be sufficient to alter plant metabolism.

La Enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa cuyos síntomas incluyen no sólo la pérdida de memoria de los pacientes, sino también problemas en la función ejecutiva, cambios de personalidad, etc. Se trata de una enfermedad compleja, son numerosos los factores de riesgo que pueden estar implicados en su desarrollo y se observan también alteraciones a diferentes niveles, tanto neurohistológicas, como genéticas, metabólicas, etc. En los últimos años, se ha estudiado extensamente la implicación de la Diabetes Mellitus y la Resistencia a la Insulina como factores de riesgo para el desarrollo de la AD. Así, numerosos estudios demuestran que la administración de insulina es capaz de mejorar la memoria tanto en personas sanas como en pacientes de AD. También se ha demostrado que los péptidos IGF‐1 y GLP‐1, estrechamente relacionados con la vía de señalización de la insulina, pueden actuar como factores de crecimiento y neuroprotección a nivel del Sistema Nervioso Central. Además, los niveles de expresión de los receptores de insulina, IGF‐1 y GLP‐1, así como su capacidad de activación se encuentran significativamente reducidos en el cerebro de pacientes de AD y esto correlaciona con el avance de la enfermedad, especialmente con el avance de la patología amiloide. En esta tesis doctoral, demostramos que los niveles de mRNA de IGF‐1R aumentan significativamente en animales 3xTgAD de 9 meses, pero los niveles del receptor proteico total y activado se encuentran reducidos en animales 3xTgAD de 9 y 12 meses. Esta reducción coincide en el tiempo con el cambio en la acumulación de los péptidos desde una localización intraneuronal a una localización extraneuronal, y ambos fenómenos podrían estar relacionados. Para demostrar la implicación de IR/IGF‐1R y GLP‐1R en el correcto funcionamiento neuronal y en el desarrollo de los síntomas de la AD, hemos diseñado dos vectores adenoasociados (AAV) que expresan un shRNA‐IGF1R y un shRNA‐IR, respectivamente, y los hemos inyectado conjuntamente en el hipocampo de hembras 3xTgAD de 2 meses de edad. Este silenciamiento de la vía IR/IGF‐1R provocó un aumento en la acumulación intraneuronal de Aβ a los 4 meses de edad en comparación con la encontrada en hembras inyectadas con un shRNA‐scrambled. Por otra parte, también diseñamos dos vectores AAV para sobreexpresar el cDNA de IGF‐1R y GLP‐1R en el hipocampo y córtex prefrontal de animales 3xTgAD de 5 meses de edad. De esta manera hemos demostrado que la sobreexpresión de GLP‐1R, pero no la de IGF‐1R, consigue corregir los síntomas neuropsichiátricos asociados a la demencia (BPSD), así como la flexibilidad cognitiva de los machos 3xTgAD de 12 meses de edad. Esto correlaciona con una reducción en la acumulación de Aβ en el hipocampo, así como una reducción de la neuroinflamación y de la pérdida neuronal en el córtex cerebral. En las hembras, ambos tratamientos tienen efectos moderados sobre los BPSD, pero sólo la sobreexpresión de IGF‐1R consigue mejorar la capacidad de aprendizaje y memoria espacial de las hembras 3xTgAD de 12 meses de edad. Esto correlaciona con una reducción en la neuroinflamación en hipocampo y amígdala, una menor acumulación de la proteína tau fosforilada, así como una reducción de la pérdida neuronal en el córtex. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose symptoms include not only memory loss, but also executive function problems, personality changes, etc. It is a complex disease, there are many risk factors implicated in its development and impairment in many aspects can be observed, as neurohistology, metabolism, genetics, etc. Diabetes Mellitus and Insulin Resistance have emerged in the late years as a risk factor for AD, as several studies demonstrate that insulin administration is able to improve memory in healthy patients as well as in AD patients, and the related peptides IGF‐1 and GLP‐1 can act as growth and neuroprotection factors in the Central Nervous System. Moreover, expression levels of IR, IGF‐1R, GLP‐1R, as well as their activation ability after binding of insulin, IGF‐1 and GLP‐1 to their corresponding receptors are impaired in brains of AD patients and this correlates to the stage of the disease, specially to the amyloid pathology. In this study, we demonstrate that IGF‐1R mRNA levels are significantly elevated in 3xTgAD animals when compared to WT at 9 months‐old, but there is a reduction at protein level and activation of IGF‐1R in 9 and 12 months‐old 3xTgAD animals. This reduction could be related to the change from an intra to an extraneuronal accumulation of Aβ peptides. To demonstrate the implications of IR/IGF‐1R and GLP‐1R for a correct neuronal function and in the developments of AD symptoms, we designed two AAV vectors expressing a shRNA‐IGF1R and a shRNA‐IR respectively, and we jointly injected them in the hippocampus of 2 months‐old 3xTgAD females. This IR/IGF‐1R silencing caused an increase in the intraneuronal Aβ accumulation at 4 months‐old when compared to females injected with a shRNA‐scrambled. We also designed two AAV vectors for the overexpression of IGF‐1R and GLP‐1R in the hippocampus and prefrontal cortex of 5months‐old 3xTgAD animals. We demonstrate that the overexpression of GLP‐1R, but not IGF‐1R, correct Behavioral and Psychiatric Symptoms associated to Dementia (BPSD) and cognitive flexibility in 12 months‐old 3xTgAD males, and this correlates with a reduction of Aβ accumulation in hippocampus, as well as with a reduction of neuroinflammation in amygdala and neuronal loss in cortex. In females, both treatments have moderate effect on BPSD, but only IGF‐1R overexpression improves spatial learning performance and spatial memory in 12 months‐old 3xTgAD females. This correlates with a reduction of neuroinflammation, accumulation of phosphorylated tau and neuronal loss in cerebral cortex.

Esta tesis abarca un análisis estructural y funcional de las ribonucleasas antimicrobianas. Se han analizado los centros de interacción de ligandos nucleotídicos con la RNasa A como referencia. Los estudios estructurales, estadísticos y por cristalografía de rayos X, de complejos de RNasas han permitido definir, junto a la triada catalítica, otros subcentros de interacción secundarios. La superfamilia de la RNasa A incluye miembros con funciones no necesariamente relacionadas con la actividad RNasa. En particular, las propiedades antimicrobianas aparecen en miembros con puntos isoeléctricos elevados , que explican asimismo su elevada afinidad por componentes de membrana y estabilidad. No obstante, se ha observado una baja actividad RNasa, probablemente debido a modificaciones en el alineamiento del sustrato. Se han analizado los patrones de reconocimiento y unión de sustratos nucleotídicos para caracterizar mejor las ribonucleasas citotóxicas de secreción mediante estudios estadísticos generales con complejos estructurales con mono- y dinucleótidos, realizando asimismo una comparativa con las particularidades de familias seleccionadas de endorribonucleasas representativas. Se han establecido modelos generales de interacción entre proteínas y nucleótidos y se han identificado los aminoácidos y átomos presentes en estas interacciones, definiéndose los motivos tridimensionales para los grupos fosfato, ribosa y bases nitrogenadas dentro de la superfamilia de la RNasa A. Junto a la triada catalítica, conservada en el centro activo, se ha visto una variabilidad en los subcentros secundarios, de acuerdo con los patrones de unión preferenciales de las RNasas, alineamiento y especificidad de sustrato o eficiencia catalítica variable. Estos resultados se han completado con predicciones por modelado molecular y comparaciones evolutivas por alineamiento de secuencia y solapamiento estructural. Con una comparación final con la superfamilia de la RNasa T1 (RNasas microbianas) se han analizado las características comunes y particulares para aplicarlas al reconocimiento de biomoléculas polianiónicas y configurar un punto de partida para el diseño de nuevos fármacos. Finalmente, se han estudiado, por cristalografía de rayos X, distintas RNasas recombinantes nativas (RNasa A, RNasa 3, RNasa 6), así como variantes mutantes, expresadas en un sistema procariota de alto rendimiento. Se han resuelto sus estructuras cristalinas. En particular, el estudio estructural de la ribonucleasa 6 humana (RNasa k6), el primero para el enzima, supone el punto de partida para posteriores análisis de interacciones con potenciales sustratos nucleotídicos y otros ligandos relacionados. Por otra parte, se ha cristalizado un mutante de RNasa A (RNasa A/H7H10), en complejo con 3’-CMP, cuyo centro de unión de fosfatos p2 se ha convertido en un segundo centro activo, ocasionando cambios estructurales próximos. Con un segundo complejo de RNasa A con 3’-CMP, obtenido a resolución atómica, se ha realizado un análisis comparativo más detallado, en comparación con complejos similares a menor resolución, junto con un estudio de cada subcentro en relación al complejo de RNasa A mutante, permitiendo explicar las propiedades catalíticas del mutante. La observación del estado de protonación de los residuos del centro activo ha proporcionado información adicional sobre el mecanismo de catálisis. A continuación se han cristalizado dos mutantes de la RNasa 3/ECP (ECP/H15A, H128N). Los estudios estructurales confirman los estudios cinéticos previos sobre la abolición de la actividad catalítica. Adicionalmente, dos cristales de ECP nativa se utilizaron para la comparación estructural de sendas formas cristalográficas, cadenas laterales o centros de reconocimiento de aniones. Además, con las estructuras de RNasa A, RNasa 3/ECP y RNasa 6 con iones sulfato se compararon los centros de reconocimiento del anión, análogo a los grupos fosfato de nucleótidos. Se ha confirmado la mayor afinidad de la ECP, y se han identificado las regiones potenciales de reconocimiento de nucleótidos o derivados heterosacáridos. / This thesis encompasses the structural and functional analysis of antimicrobial ribonucleases. Nucleotide-type ligand interaction sites have been analysed using RNase A as a reference protein. RNase complexes were analysed by statistical structural analysis and X-ray crystallography. Together with the catalytic triad, other secondary interaction subsites were also defined at the protein surface. The RNase A superfamily embraces ribonucleases with diverse functions not necessarily related to RNase activity. In particular, antimicrobial properties are ascribed to members with high isoelectric point values, which also explain their stability and high affinity to membrane components. However, a noticeably lower RNase activity is seen for cationic RNases owing to the lack of key residues important for the correct substrate alignment. The different nucleotide-type substrate binding and recognition patterns were deduced from an overall structure complex statistics’ analysis and compared to the particular traits of selected families of representative endoribonucleases . A large amount of mono- and dinucleotide protein complexes was analysed. The results provided a general model of protein-nucleotide interactions for cytotoxic endoribonucleases. The identification of amino acids and atoms frequently involved in the recognition interactions defined three-dimensional motifs for phosphate, ribose and bases in the RNase A superfamily. Together with the conserved catalytic triad at the active site, residue variability is commonly observed throughout the secondary binding subsites, in agreement with the RNase preferential binding patterns, the different alignment capability, substrate specificity and variable catalytic efficiency. Results were complemented with molecular modelling predictions and evolution comparisons by sequence alignment and structural overlapping. A final side-by-side comparison with the microbial RNase T1 superfamily has allowed an analysis of the common and particular features of substrate recognition processes, thereby building a general interaction architecture applicable to recognition for polyanionic biomolecules that may set a structural basis for the design of new drugs. Additionally, structural studies by X-ray crystallography were carried out. Recombinant wild-type RNases (RNase A, RNase 3, RNase 6) and mutant variants were expressed and purified in a high-yield prokaryotic system andtheir crystal structures were solved. In particular, a crystallisation condition has been discovered for human RNase 6. We report here the first crystal structure of RNase 6, which sets the basis for further analysis of interactions with nucleotide molecules and other putative ligands. On the other hand, the structural analysis of an RNase A mutant (RNase A/H7H10), where the secondary phosphate binding site p2 has been converted into a second active site, in complex with 3’-CMP, enabled the visualisation of induced neighbouring conformational changes. A second RNase A – 3’-CMP complex, obtained at atomic resolution, has enabled a more detailed comparative analysis with lower-resolution protein-nucleotide complexes together with a side-by-side study of subsite environments with the mutant complex, explaining the mutant catalytic properties. The additional visualisation of the protonation state of the active site residues has also provided information about the mechanism of catalysis. Following, two RNase 3/ECP active site mutants (ECP/H15A, ECP/H128N) were crystallised. Structural studies confirmed the conservation of the protein overall three dimensional structure together with previous kinetic experiments related to the abolished catalytic activity. Also, two native ECP crystals obtained by two distinct crystallization conditions were used for a comparison of the different unit cell packing, residue side chain variability and anion recognition sites. Finally, the structures of RNase A, RNase 3/ECP and RNase 6 with bound sulphate anions were compared, and their putative anion recognition sites characterized. The comparison of the binding subsites confirmed the higher affinity of RNase 3/ECP for sulphate/ phosphate anionsand may lead to the identification of protein regions prone to host nucleotides or heterosaccharide compounds.

La apoptosis es un proceso importante en una amplia variedad sistemas biológicos, incluyendo el recambio celular normal, el sistema inmunológico y el desarrollo embrionario. La apoptosis inadecuada está implicada en muchas enfermedades incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como las enfermedades de Alzheimer y Huntington, isquemia, desórdenes autoinmunes y varias formas de cáncer. La familia de proteínas Bcl-2 abarca una clase de estructuras homólogas que sirven para inhibir o para activar la apoptosis en un proceso intrincado y a su vez, bien orquestado. Los estímulos apoptósicos inducen la translocación de miembros pro-apoptósicos de la familia de Bcl-2 a la membrana mitochondrial externa donde forman canales iónicos que pueden contribuir a disipar el potencial transmembrana de la mitocondria y favorecer la liberación de citocromo c. En el citosol, esta proteína se une al factor activador de apoptosis (Apaf-1) para formar el complejo denominado apoptosoma que activa una familia de proteasas denominada caspasas. Las caspasas hidrolizan una serie de proteínas clave para la supervivencia celular y la célula muere de forma no necrótica. Estas moléculas moduladoras podrían ser consideradas como agentes "cabeza de serie" para el desarrollo de compuestos que puedan inhibir el crecimiento de células tumorales y/o paliar o aminorar los daños celulares asociados a las enfermedades neurodegenerativas En la tesis doctoral se utiliza la Química Combinatoria para la identificación de moléculas de interés biomédico moduladoras del apoptosoma. Para ello, en primer lugar es necesario poner a punto un ensayo de alto rendimiento que permita utilizar la diana terapéutica, el apoptosoma, y que permita el cribado funcional de un elevado número de moléculas con el objetivo de identificar efectores artificiales del sistema Apaf-1-caspasas. El trabajo presentado en esta tesis incorpora como novedad la utilización de los componentes básicos recombinantes purificados del apoptosoma y la reconstitución de su actividad in vitro para el cribado. Con este ensayo y formato de cribado, lo que se consigue una mejor definición de la diana molecular de búsqueda de moléculas moduladoras. Por otro lado, la posibilidad de manipulación de los distintos componentes del apoptosoma en las reacciones de reconstitución permite llevar a cabo la caracterización del mecanismo de acción de los compuestos actuvos identificados y su sitio de unión. Finalmente se llevo a cabo unestudio in vivo de los compuestos identificados como moduladores. / Protein-protein interactions represent points of chemical intervention for therapeutic gain in the biological processes associated with disease. Apoptosis is an interesting biological process because its importance in a wide variety of biological systems. Inappropriate apoptosis is involved in many human pathologies, including neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Huntington's, ischaemia, autoimmune disorders and several forms of cancer. Diverse apoptotic stimuli, including activation of cell surface death receptors, anticancer agents, irradiation, lack of survival factors, and ischemia induce signaling cascades that all activate a family of cysteine aspartyl proteases called caspases. It is these proteases that execute the apoptotic process. Effector caspases are responsible for the disassembly of cellular components while initiator caspases are responsible for activation of the effector caspases. Because of the critical consequences of apoptosis malfunctioning, the activation of caspases is scrupulously controlled. Some apoptotic signals activate the mitochondria-mediated or intrinsic pathway that utilizes caspase-9 as its initiator. Caspase-9 activation is triggered by the release to the cytosol of proapoptotic proteins from the mitochondrial inter-membrane space, in particular cytochrome c. The formation of the macromolecular complex named apoptosome is a key event in this pathway. The apoptosome is a holoenzyme multiprotein complex formed by cytochrome c-activated Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor), dATP and procaspase-9. In this macromolecular complex apoptosome-associated caspase-9 is activated and then, in turn, activate effector caspases. To identify molecules that could ameliorate disease-associated apoptosis, drug discovery efforts have initially targeted caspase activity rather than activation. Nevertheless, protein-protein interactions upstream of caspase activation can be also relevant points of intervention for the development of modulators of apoptosis pathways. In particular, recent data propose the formation of the apoptosome as an interesting target for the development of apoptotic modulators. In the absence of detailed structural information, the conventional methods used for the identification of modulators of the apoptosome have been based in indirect measurements of the cytochrome c- and dATP-induced activation of caspase-3-like activity on defined cytosolic extracts. Using this methodology Lademann et al. have identified inhibitors of the apoptosome through the screening of small molecules using cytosolic extracts of selected cells.We have carried out a discovery program employing an in vitro reconstituted active apoptosome assembled from its recombinant constituent proteins. Here we describe the identification of compounds that inhibit the apoptosome-mediated activation of procaspase-9 from the screening of a diversity-oriented chemical library of N-alkylglycines. The active compounds rescued from the library were chemically optimized to obtain molecules that bind to both recombinant and human endogenous Apaf-1 and decrease the apoptotic phenotype in mitochondrial-mediated models of cellular apoptosis.

La histona H1 és una de les proteïnes que participen en la formació de la superestructura de la cromatina. Aquesta proteïna està formada per tres dominis: una regió globular central flanquejada per cues N- i C-terminals hidrofíliques i bàsiques, molt riques en lisina, alanina i prolina. Mitjançant tècniques de dicroïsme circular (DC), ressonància magnètica nuclear de protó de doble dimensió (RMN-2D) i espectroscòpia d'infraroig (FTIR), s'ha estudiat l'estructura de pèptids dels dominis N- i C-terminals dels subtipus H1º i H1e en diverses condicions: en dissolució aquosa, en presència de 2,2,2-trifluoroetanol (TFE) i en presència de DNA.Els pèptids estudiats són: NH-1, de 20 residus, que correspon a tot el domini N-terminal de la H1º, idèntic en ratolí i humà, i NH-2 corresponent als residus 8-30 de la mateixa proteïna. CH-1 correspon als residus 99-121, inclosos en el domini C-terminal de la H1º, idèntics en ratolí i rata. NHe-1 correspon als residus 15-36 del domini N-terminal de la H1e de ratolí. Els estudis de DC i RMN-2D de protó revelen que cap dels pèptids de la histona H1 estudiats es troba estructurat de forma estable en dissolució aquosa. En 90% de TFE, en canvi, els quatre pèptids adquireixen un percentatge substancial d'estructura secundària, especialment hèlix a. Concretament, NHe-1 s'estructura en dues hèlixs a amfipàtiques separades per dues glicines. Aquest doblet de glicines defineix una zona flexible que provoca llibertat de moviments de les dues hèlixs.El domini N-terminal de la histona H1º, segons es desprèn dels nostres resultats amb NH-1 i NH-2, es troba desestructurat en la seva meitat N-terminal i del residu 11 al 23 s'estructura en una hèlix a.CH-1 s'estructura en una hèlix a amfipàtica del residu 100 al 116. Tanmateix, sembla que els primers 4 residus formen una hèlix 310. El motiu TPKK situat en l'extrem C-terminal s'estructura en un gir b/s. S'han estudiat els pèptids NH-1, NH-2 i CH-1 per FTIR. En dissolució aquosa, l'amida I dels tres pèptids presenta un component principal a 1641 cm-1, característic de pèptid desestructurat. En 90% de TFE, apareixen hèlixs i girs en proporcions que s'ajusten als resultats de RMN. També hem estudiat l'estructura dels pèptids units a DNA genòmic de ratolí i a DNAs repetitius com poli[dA-dT]·poli[dA-dT]. No s'observen diferències importants entre els diferents DNAs. A l'interaccionar amb el DNA, els pèptids s'estructuren en hèlix a amb uns percentatges molt semblants als observats en TFE. En el cas de CH-1, els components atribuïts al gir b/s i a hèlix 310 també apareixen en els espectres dels complexos amb DNA. En conclusió, el DNA indueix estructura secundària en regions dels dominis N- i C-terminals de la histona H1, concretament hèlixs a, hèlixs 310 i girs. El TFE revela aquesta estructura i permet el seu estudi a alta resolució. / Histone H1 is one of the proteins that participate in chromatin condensation. This protein has a three domain structure: a globular central region and two N- and C-terminal tails. These tail domains are hydrophilic and basic, very rich in lysine, alanine and proline.Using circular dichroism (CD), double magnetic proton nuclear magnetic resonance (2D-NMR) and infrared spectroscopy (FTIR), we have studied the structure of peptides from the N- and C-terminal domains of H1º and H1e histone subtypes in several conditions: in aqueous solution, in the presence of 2,2,2-trifluoroethanol (TFE) and in the presence of DNA.The peptides studied are: NH-1, of 20 residues, which corresponds to all the N-terminal domain of histone H1º, identical for mouse and rat; and NH-2, corresponding to the residues 8-30 of the same protein. CH-1 corresponds to the residues 99-121, included in the histone H1º C-terminal domain. NHe-1 corresponds to the residues 15-36 of the mouse histone H1e N-terminal domain. The CD and proton 2D-NMR studies show that none of the studied histone H1 peptides present stable secondary structure in aqueous solution. In 90% TFE the four peptides acquire a substantial secondary structure percentage, specially a-helix.In these conditions, NHe-1 become structured in two amphipathic a-helices separated by two glycines. This glycine doublet constitutes a flexible zone that confers a high freedom of movements to the helices. The N-terminal domain of histone H1º, according to our results with NH-1 and NH-2 peptides in 90% TFE, remains unstructured in its N-terminal half, and from the residue 11 to the 23 it is structured in an a-helix.CH-1 is structured in an amphipathic helix from the residue 100 to the 116. The first four residues seem to form a 310 helix and the rest an a-helix. The TPKK motif, localized at the C-terminal end of the peptide forms a b/s turn.We have also studied the peptides NH-1, NH-2 and CH-1 by FTIR spectroscopy. In aqueous solution the amide I' of the three peptides shows a main component at 1641 cm-1 characteristic of an unstructured peptide. In 90% TFE the helix and turn percentages are similar to that of the NMR results. We have used this technique to study the structure of the peptides when bound to mouse genomic DNA and repetitive DNAs like poly[dA-dT]·poly[dA-dT]. There are no important differences between the different DNAs used. Upon interaction with the DNA, the peptides become structured in a-helix in percentages very similar to that observed in 90% TFE. In the spectra of CH-1 / DNA complexes, components attributed to b/s turn and 310 helix also appear.In conclusion, the DNA induces secondary structure in regions of the N- and C-terminal domains of histone H1, mainly a-helices, 310 helices and turns. The TFE also stabilizes these structures and permits their study at high resolution.

La histona H1 es necesaria para la condensación de la cromatina y puede estar implicada en la activación y en la inhibición de genes específicos. La histona H1 está codificada por una familia multigénica. En los mamíferos hay seis subtipos somáticos, H1a-e y H1º, una variante específica de la línea germinal masculina, H1t, y una variante propia de los oocitos, H1ooHemos estimado las afinidades relativas de los seis subtipos somáticos de mamífero, H1a-e y H1º, por la SAR del agrupamiento de los genes de las histonas de Drosophila y por un fragmento de pUC19 de similar longitud, mediante un ensayo de competición de dos subtipos presentes en similar concentración por una cantidad limitada de DNA. El orden de afinidades por la SAR fue H1a (1,0)<H1c (3,9)<H1b (5,4)<H1e (14,4)<H1º (19,5)<H1d (20,0), donde el número entre paréntesis es la afinidad relativa expresada en relación al subtipo de unión más débil, la H1a. El orden de afinidades por el fragmento de pUC19 fue H1a (1,0)<H1c (5,3)<H1b (6,4)<H1e (16,5)<H1º (22,3)<H1d (25,5). Las afinidades relativas de los subtipos por la SAR y el pUC19 son similares. Es posible distinguir tres grupos de afinidad: la H1a de baja afinidad, la H1b y la H1c de afinidad intermedia y la H1d, H1e y H1º de alta afinidad.Experimentos de desplazamiento de un subtipo unido al DNA por otro subtipo añadido posteriormente confirman cualitativamente el orden de afinidades obtenido de los experimentos de equilibrio.Experimentos de competición entre el fragmento SAR y el fragmento de pUC19 por una cantidad limitada de uno de los subtipos de la H1 muestran que todos los subtipos somáticos, H1a-e y H1º, comparten el carácter de proteína de unión a las SAR Las afinidades de cada uno de los subtipos por el DNA están determinadas a la vez por las características de cada subtipo y de las secuencias de DNA a las que se unen.La perturbación del complemento de H1 de la cromatina nativa mediante la adición de subtipos de la H1 exógenos, en presencia de SAR para mantener la estequiometría de la H1 en la cromatina, ha permitido estimar las afinidades relativas de los subtipos H1a-e y H1º por la cromatina. El orden de afinidades expresado en relación a la H1a fue H1a (1.0)<H1b (4.1)<H1c (6.2)<H1e (15.3)<H1º (16.6)<H1d (19.0). Las afinidades relativas son similares a las obtenidas para el DNA. Como en el caso del DNA, es posible distinguir tres grupos de afinidad: la H1a de baja afinidad, la H1b y la H1c de afinidad intermedia y la H1d, H1e y H1º de alta afinidad.Los experimentos de condensación de los fragmentos de la SAR, el PUC19 y el pBR322 con PEG, que condensa el DNA por efecto del volumen excluido, demuestran que las características estructurales y/o mecanoelásticas del propio DNA determinan en gran medida la tendencia a la condensación ordenada que da lugar al espectro y. La condensación mediante ligandos catiónicos, histonas H1c y H1e, que neutralizan la carga de los fosfatos del DNA, confirma esta conclusión, pues la intensidad de los espectros y de los complejos de los diferentes DNA con estos ligandos es proporcional a la observada con PEG.En la condensación por neutralización la naturaleza del ligando también tiene un papel, que se manifiesta por la, en general, mayor intensidad del espectro y con la H1e que con la H1c, esta última con menor afinidad por el DNA. Las curvaturas estables, presentes en la SAR, ejercen un efecto desfavorable sobre la condensación. Este efecto desfavorable puede ser eliminado por la distamicina que "estira" el DNA. / The histone H1 is necessary for the condensation of the chromatin and it can be implied in the activation and in the inhibition of specific genes. The histone H1 is coded by a multigenic family. In mammalians there are six somatic subtypes, H1a-e, H1º, a specific variant of the male germinal line, H1t, and a variant characteristic of the oocytes, H1oo. We have estimated the relative affinities of the six somatic subtypes, H1a-e and H1º, by the SAR cluster of the histones genes of Drosophila and for a fragment of pUC19 of similar length, by means of a competition assay between two subtypes present in similar concentration for a limited amount of DNA. The order of the affinities for the SAR fragment was H1a (1,0)<H1c (3,9)<H1b (5,4)<H1e (14,4)<H1º (19,5)<H1d (20,0), where the number within the parenthesis is the relative affinity expressed in relation to the subtype of weaker union, the H1a. The order of the affinities for the pUC19 fragment was H1a (1,0)<H1c (5,3)<H1b (6,4)<H1e (16,5)<H1º (22,3)<H1d (25,5). The relative affinities of the subtypes for the SAR and the pUC19 are similar. It is possible to distinguish three groups of affinities: the H1a of low affinity, the H1b and the H1c of intermediate affinity and the H1d, H1e and H1º of high affinity. Experiments of displacement of a subtype bound to the DNA for another subtype added later on, confirm qualitatively the order of affinities obtained from the equilibrium experiments.Competition experiments among the SAR and the pUC19 fragments for a limited amount of one of the subtypes of the H1 show that all the somatic subtypes, H1a-e and H1º, are SAR-binding proteins. The affinities of each of the subtypes for the DNA are determined at the same time by the characteristics of each subtype and of the sequences of DNA involved in the interaction.The exchange between the H1 of the native chromatin and an exogenous subtype, in presence of SAR to maintain the stechiometry of the H1 in the chromatin, has allowed to estimate the relative affinities of the subtypes H1a-e and H1º for the chromatin. The order of the affinities expressed in relation to the H1a was H1a (1.0)<H1b (4.1)<H1c (6.2)<H1e (15.3)<H1º (16.6)<H1d (19.0). The relative affinities are similar to those obtained for the DNA. Concerning the DNA, it is possible to distinguish three groups of affinity: the H1a of low affinity, the H1b and the H1c of intermediate affinity and the H1d, H1e and H1º of high affinity. The experiments of condensation of SAR, pUC19 and pBR322 fragments with PEG that condenses the DNA by volume exclusion, show that the structural and/or the mechanical stretching properties of each DNA determine widely the tendency to the ordered condensation that gives place to the y spectrum. The condensation by means of cationic ligands like the histones H1c and H1e, that neutralize the negative charge of the phosphates in the DNA backbone, confirm this conclusion, because the intensity of the y spectra obtained for the complexes of the different DNA fragments and the histones is proportional to the one observed with PEG. In the condensation by charge neutralization, the intrinsic properties of the histone also play an important role, explaining the greater intensity of the y spectrum with the H1e than the one obtained with the H1c, this last protein with lower affinity for the DNA. The sequence-induced DNA curvature, present in the SAR fragment, partially inhibits the induction of the y spectrum. This unfavourable effect can be suppressed by the distamycin that enlarges the DNA.

La histona H1 es la responsable de la condensación de la cromatina en la fibra de 30 nm. Se ha descrito que la H1 tiene preferencia por el DNA tipo SAR. Hemos mostrado que los subtipos H1a-e, H1º y H1t individualmente muestran preferencia por las SAR. La H1 está compuesta por 3 dominios: N-terminal, globular y C-terminal. El análisis independiente de los dominios mostró que el C-terminal determina la preferencia por las SAR de la H1. Las protaminas, relacionadas evolutivamente con la histona H1 y muy ricas en arginina también tienen preferencia por las SAR. La unión preferencial a las SAR del C-terminal y la protamina se pierde en presencia de distamicina, lo que indica que la interacción involucra el surco menor del DNA. La preferencia por las SAR está determinada por los bloques AT homopoliméricos. El dominio C-terminal de las histonas H1º (C-H1º) y H1t (C-H1t) se encuentra desestructurado en disolución acuosa, pero en presencia de DNA y 140 mM de NaCl se estructura completamente. La estructura secundaria obtenida está caracterizada por la presencia de hélice &#945;, estructura &#946;, giros y lazos abiertos. El TFE también induce estructura secundaria en los dominios C-terminales con características similares a las encontradas en los complejos con DNA. La estructura de los dominios C-terminales unidos al DNA es extremadamente estable. La desnaturalización de los dominios C-terminales unidos a DNA es cooperativa. El acoplamiento entre la unión al DNA y la inducción de estructura secundaria en el C-terminal permite incluir este dominio en el grupo de las proteínas intrínsecamente desordenadas que funcionan mediante el reconocimiento molecular.Las elevadas concentraciones de solutos macromoleculares en el interior de la célula hacen que una fracción importante del volumen intracelular no esté disponible. Los dominios C-H1º y C-H1t se estructuran en presencia de Ficoll 70 (30%) y el PEG 6000 (30%) por efectos del volumen excluido. La estructura secundaria inducida es similar a la encontrada en el C-terminal unido a DNA. Los resultados de SAXS indican que la compactación del C-terminal en presencia de aglomerantes macromoleculares es propia de un estado globular. La compactación va acompañada de la aparición de un núcleo hidrófobico. Sin embargo, el dominio C-terminal no está estructurado cooperativamente en presencia de agentes aglomerantes. Estas características indican que el C-terminal en presencia de agentes aglomerantes se encuentra en un estado de glóbulo fundido. La formación del glóbulo fundido en la célula aceleraría el paso al estado nativo o unido al DNA y facilitaría la difusión y el intercambio de la H1 en la cromatina.La histona H1 es fosforilada por las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Esta fosforilación es dependiente del ciclo celular con el máximo de fosfatos en la metafase de la mitosis. La mayoría de las dianas de las CDKs se encuentran en el dominio C-terminal. La fosforilación de los tres motivos TPXK del C-H1º induce un cambio estructural caracterizado por la disminución de la proporción de hélice &#945; y un aumento de la estructura &#946;. La magnitud del cambio depende de la relación proteína/DNA. A relaciones cercanas a la saturación la conformación de la proteína es del tipo todo-&#946;. La fosforilación de uno o dos de los tres sitios TPXK presentes en el C-H1º tiene efectos estructurales específicos. La fosforilación en T118 es la que afecta más profundamente la estructura con una disminución importante de la hélice &#945;, acompañada de la aparición de un porcentaje significativo de ovillo estadístico. La neutralización de la carga positiva de las lisinas por los grupos fosfato del DNA puede ser una de las causas principales de la estructuración del dominio C-terminal en los complejos con el DNA. A pH alcalino se induce estructuración en el C-H1º no fosforilado y trifosforilado, la cual refleja los cambios dependientes de fosforilación encontrados en los complejos con DNA. / H1 linker histones are thought to be primarily responsible for the condensation of the 30 nm chromatin fibre. Histone H1 preferentially binds to scaffold-associated regions (SARs). Here we show that the mammalian somatic subtypes H1a,b,c,d,e and H1_ and themale germline-specific subtype H1t, all preferentially bind to SARs. Experiments with the isolated domains show that whilst the C-terminal domain maintains strong and preferential binding, the N-terminal and globular domains show weak binding and poor specificity for the SAR. The preferential binding of SAR by the H1 molecule thus appears to be determined by its highly basic C-terminal domain. Salmine, a typical fish protamine, which could have its evolutionary origin in histone H1, also shows preferential binding to the SAR. The interaction of distamycin, a minor groove binder with high affinity for homopolymeric oligo(dA).oligo(dT) tracts, abolishes preferential binding of the C-terminal domain of histone H1 and protamine to the SAR, suggesting the involvement of the DNA minor groove in the interaction.The carboxyl-terminal domain of linker histone H1 subtypes H1º (C-H1º) and H1t (C-H1t) has little structure in aqueous solution but becomes extensively folded upon interaction with DNA. The secondary structure elements present in the bound carboxylterminal domain include &#945;-helix, &#946;-structure, turns, and open loops. The addition of TFE also induces secondary structure in the C-terminal domain that is very similar to the structure of the DNA bound. Examination of the changes in the amide I components in the 20-80 °C temperature interval showed that the secondary structure of the DNA-bound C-H1t is for the most part extremely stable. The H1 carboxyl-terminal domain appears to belong to the so-called disordered proteins, undergoing coupled binding and folding.In the cellular environment macromolecules and small molecule solutes are present at high concentrations so that a significant fraction of the intracellular space is not available to other macromolecules.The C-terminal domains C-H1º and C-H1t are significantly structured in the presence of Ficoll 70 (30%) and PEG (30%) The proportions of secondary structure motifs were comparable to those of the DNA-bound domain. The small-angle X-ray scattering showed that in crowding agents the C-terminus had the compaction of a globular state. Progressive dissipation of the secondary structure and a lineal increase in partial heat capacity (Cp) with temperature together with increased binding of ANS indicated that the C-terminus is not cooperatively folded in crowded conditions. These results indicate that the C-terminus in crowding agents is in a molten globule state. Folding of the C-terminus in crowded conditions may increase the rate of the transition toward the DNA bound state and facilitate H1 diffusion inside cell nuclei.Histone H1 is phosphorylated in a cell cycle-dependent manner by cyclin-dependent kinases (CDKs). The highest number of phosphorylated sites is found in mitosis. The majority of the phosphorylation sites for CDKs are located on the C-terminal domain. Complete phosphorylation of C-H1º is associated to a major structural change. This structural rearrengement implies the loss of almost all the &#945;-helix and a large increase in &#946;-structure. The extent of the conformational change appears to be dependent on triphosphorylation and the protein/DNA ratio. The final state of the structural change consists in an all-&#946; protein at ratios near saturation. Phosphorylation of one or two site have distintic structural effects. Phosphorylation of T118 affects the secondary structure the most, with a decrease of the &#945;-helix and the appearence of random coil.Charge neutralization provided by DNA phosphate groups is an important factor in the folding of the C-terminal domain of histone H1 when bound to DNA. Alkaline pH induces secondary structure in C-H1º unphosphorylated and triphosphorylated that reflects the structural changes associated to phosphorylation.

Els diferents subtipus de la histona H1 tenen un paper molt important en la condensació de la cromatina i en la regulació gènica. En mamífers s’han identificat sis subtipus somàtics, H1a-e, dos subtipus específics de línies germinals, H1t i H1oo i dos subtipus associats a diferenciació H10 i H1x. L’H1 està formada per tres dominis, un domini globular flanquejat per un domini amino-terminal i un domini carboxi-terminal. Es va caracteritzar l’efecte de la fosforilació sobre la interacció amb el DNA del domini C-terminal de l’H10. El domini fosforilat continua mantenint la preferència d’unió per les seqüències SAR i la cooperativitat d’unió a DNA. Es va analitzar per dicroisme circular el domini i les seves espècies fosforilades amb diferents fragments de DNA. Les espècies fosforilades són capaces d’induir un espectre ψ més intens que el domini no fosforilat, mostrant una major capacitat d’agregació ordenada del DNA. Experiments de competició varen determinar que l’afinitat relativa pel DNA en fosforilar-se el domini disminueix aproximadament en un factor de 3. Es va estudiar l’estructura secundària del domini C-terminal de l’ H1e i de l’H1e sencera per espectroscòpia d’infraroig de transformada de Fourier (FTIR). La fosforilació de l’H1e provoca un canvi estructural en la proteïna: la disminució d’hèlix α i l’augment de fulla β. El grau d’estructuració secundària depèn de la posició i del nombre de fosfats. La fosforilació de la histona H1e té efectes diferencials sobre les afinitats relatives pel DNA i la capacitat d’agregació del DNA de les seves espècies fosforilades. Les espècies amb més grau de fosforilació mostren una menor afinitat pel DNA però també una major capacitat d’agregació d’aquest. A la vegada, aquestes mateixes espècies són les que contenen més estructuració en forma de fulla β, fet que afavoriria la formació d’agregats DNA-proteïna. / Linker histone H1 plays an important role in chromatin folding and genic regulation. In mammals has been identified 6 somatic subtypes, H1a-e, 2 germline-specific subtypes, H1t i H1oo and 2 subtypes related to diferenciation, H10 i H1x. H1 linker histones present a tripartite structure consisting of a central globular domain flanked by N- and C-terminal tail-like domains. We characterize the effect of phosphorylation of C-terminal domain of H10 upon the interaction with DNA. The phosphorilated domain maintains the preferential binding to SAR sequences and the cooperative binding to DNA. We analyze by circular dicroism the domain and its phosphorilated species with different DNA fragments. The phosphorilated species induces an intense ψ spectrum than the non-phosphorilated domain, showing a higher organized aggregation capacity of the DNA. Competition experiments determined that relative affinity for DNA when the domain is phosphorilated decrease approximately 3-fold. We studied the effects of phosphorylation on the secondary structure of H1e and its carboxy-terminal domain by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Phosphorilation of H1e leads to a structural change in the protein: a decrease of α-helix and an increase of β-sheet. The secondary structuration grade depends both of position and number of phosphate groups. Histone H1e phosphorylation has different effects in its phosphorilated species upon relativity affinities for DNA and aggregation capacity of DNA. The species with more grade of phosphorilation shows less affinity for DNA but more aggregation capacity of DNA. Furthermore, these same species are which contains a more β-sheet structure, favoring the formation of DNA-protein aggregates.