Sugarcane holds great potential as a biofactory for the tailored production of novel products of commercial value. In many cases however, the accumulation of an alien product within the cytoplasm interferes with essential cell metabolism. To avoid potential interference, targeting the accumulation of biofactory products into vacuoles may be beneficial. Vacuoles represent one endpoint of the plant endomembrane system where proteins destined for inclusion must contain appropriate targeting peptide signals. However, targeting peptide signals used previously to direct heterologous proteins to the vacuole have not yet been shown to function efficiently in sugarcane. The emphasis of the work described in this thesis was first to characterise the diversity of vacuole types in selected sugarcane tissues, and second to identify and test the function of putative vacuolar targeting signals identified in vacuolar proteins of sugarcane. In order to investigate vacuole diversity in sugarcane cells, a series of membrane-permeable fluorescent probes were used to assess both the acidity and proteolytic properties of vacuolar compartments. It is clear that even from early in development, large vacuoles filled most of the volume of storage parenchyma cells within the developing sugarcane stem. These vacuoles were intensely acidic and contained active aminopeptidases. In leaf cells, vacuoles labelled by chromogenic indicators and enzyme substrates appear much more diverse in pH and proteolytic intensity owing to the multiple functions that leaf cells participate in. As the predominant sugarcane vacuole in vegetative tissues appears to be proteolytic, sugarcane sequences showing homology to proteases and protease inhibitors in other plant species were aligned and compared to identify potential vacuolar targeting signals. This analysis revealed the presence of several candidate vacuolar targeting motifs which displayed high conservation across plant homologues. One such motif, represented by the sequence IRLPS, was identified in the N-terminal region of a legumain protein from sugarcane, which was homologous to known vacuolar processing enzymes in other species. To test the efficacy of the legumain targeting signal and to compare with other motifs, a series of GFP reporter constructs was synthesised and expressed in sugarcane. The sugarcane legumain vacuole targeting signal was particularly efficient at directing an otherwise secreted GFP fusion protein into a large acidic and proteolytic vacuole in sugarcane callus cells as well as in diverse plant species. In mature sugarcane transgenic plants, the stability of GFP fusion proteins in the vacuole appeared to be dependent on cell type, suggesting that the vacuolar environment can vary in its ability to degrade introduced proteins. The legumain vacuole targeting signal was further tested for its ability to direct an avidin protein and a fructosyltransferase enzyme into the lytic vacuole of transgenic sugarcane plants. Avidin, derived initially from chicken egg white, is a glycoprotein that displays a high affinity to the vitamin biotin. For this reason it has been investigated for use in sugarcane as a biocontrol agent against cane grub species. For the production of avidin in planta careful targeting to an appropriate subcellular location is required to avoid a detrimental depletion of available plant cell biotin reserves. When the legumain targeting signal was fused to avidin and expressed as a stably integrated transgene, the avidin protein was detected by immunoblotting but appeared to be proteolytically cleaved within the lytic vacuole in all sugarcane tissues analysed. These plants were phenotypically indistinguishable from controls, indicating that avidin did not appreciably deplete cellular biotin reserves while in transit through the endomembrane system. In contrast, when avidin was designed for either retention in the endoplasmic reticulum or for transit to a different type of vacuole using a heterologous targeting signal, stably transformed plants exhibited a biotin deficient phenotype. This suggests that the legumain vacuole targeting signal was efficient at directing heterologous proteins to a lytic type vacuole where they can be degraded and inactivated if susceptible to proteolysis. When the fructosyltransferase (ftf) gene from Streptococcus salivarius was stably transformed into sugarcane and directed into the lytic vacuole using the legumain vacuole targeting signal, no fructan product could be detected. The low pH and proteolytic environment of this vacuole together with low expression of this bacterial transgene most likely resulted in minimal Ftf activity. Taken together, evidence is presented that the legumain vacuolar targeting signal functions efficiently in directing transgene products such as GFP, avidin and a fructosyltransferase enzyme into a lytic type vacuole. This vacuole has been demonstrated to be both acidic and proteolytic and therefore strategies to improve the stability of heterologous proteins targeted to this vacuolar environment are required and may be specific to the product in question.

O setor sucroenergético brasileiro vem apresentando baixos índices de incremento na produtividade agrícola em seus canaviais nos últimos anos. Existem alguns fatores que se relacionam a essa problemática, dentre eles destaca-se o lento processo de adoção e implantação de novos cultivares de cana-de-açúcar em áreas comerciais. Isso se deve em menor escala à falta de informação e, em maior escala, às estratégias adotadas para inserção e multiplicação do material vegetativo desses novos cultivares. Deste modo, a micropropagação - através da extração do meristema apical de plantas do cultivar de interesse e da utilização dos métodos de multiplicação de biofábrica - possibilita alcançar rapidamente uma quantidade significativa de novas plantas para atender plantios de viveiros de novos cultivares, agilizando, assim, a inserção dos cultivares em áreas de viveiros e, posteriormente, em áreas comerciais. Este trabalho teve por objetivo verificar a melhor estratégia de irrigação (E) para atender às necessidades hídricas das mudas recém-plantadas de cana-de-açúcar provenientes do processo de biofábrica, com diferentes volumes de substrato (VS). A variedade estudada foi a RB93509. O sistema de irrigação utilizado foi o tipo de gotejamento, e as estratégias de irrigação (E) foram determinadas com base na evapotranspiração acumulada (EToAc) dentro da estufa, com separação em duas condições iniciais: lâminas de irrigação após plantio e mantidas em solo seco após plantio, até a primeira lâmina pré-determinada. Com isso, a umidade do solo em E1 foi mantida na capacidade de campo através da tensiometria por todo experimento; E2, E3 e E4 receberam a lâmina inicial de irrigação inicial de 30 mm; e E5, E6, E7 e E8 mantidas inicialmente em solo seco até a sua primeira lâmina de 30 mm para diferentes intervalos de EToAc. Essa lâmina foi adotada, uma vez que na grande maioria das usinas de cana-de-açúcar o sistema de irrigação predominante é o carretel enrolado. Através deste sistema a lâmina mínima recomendada para garantir umidade em profundidade e uniformidade da área é de 30 mm. O segundo fator de variação foi o volume de substrato (VS) com que as mudas foram transplantadas, sendo: 125 cm³, 93 cm³, 73 cm³ e 56 cm³. Deste modo, combinando as 8 estratégias de irrigação e os 4 volumes de substratos, obteve-se 32 tratamentos implementados com três repetições casualizadas em 3 blocos, totalizando 96 parcelas experimentais. Observam-se diferenças significativas para as diversas estratégias de irrigação implementadas em todas as características avaliadas. Por outro lado, para o fator volume de substrato (VS) não houve nível de significância na maioria das características avaliadas. Considerando-se a característica \"porcentual de plantas mortas\" como informação fundamental para a garantia do stand do viveiro, observou-se que as lâminas de irrigação de 30 mm não devem ocorrer em intervalos superiores a 30 mm de EToAc, pois apenas E1 e E2 garantiram 100% de sobrevivência e E5, com exceção do VS 56 cm³, apresentou uma taxa de 50% de plantas mortas. / The Brazilian sugarcane sector has been facing low indices of productivity in their fields. There are some factors correlated to this issue, such as the slow process to increase new sugarcane cultivars on commercial areas, due to the lack of information related to the new cultivars and mainly because of the few strategies adopted to input and multiply the vegetative material from the new cultivars. Thus, through the utilization of micropropagation process by means of the extraction of apical meristem from the cultivar of interest and utilization of biofactory multiplying methods it is possible to reach an amount of new sugarcane seedlings to provide the nurseries with new cultivars, improving therewith the insertion of cultivars. This work aimed at checking the best irrigation strategy (E) to supply water needs of sugarcane seedlings recently planted from the biofactory process with different substrate volumes (VS).The variety used was the RB93509. The irrigation system used was the dripping system and the irrigation strategies were established based on periods of cumulative reference evapotranspiration (EToAc) inside the greenhouse separated in two different initial conditions: initial irrigation after planting and kept on dry soils up to the first predetermined irrigation. Therewith, the soil moisture on E1 was kept on soil available water capacity by the tensiometry throughout the experiment; E2, E3, E4 were supplied by an initial irrigation with 30 mm, and E5, E6, E7 and E8 were kept initially on dry soil, up to the first irrigation with 30 mm in different intervals of EToAc. Such amount of water was chosen, because the majority of sugarcane mills (growers) have a water reel travelling sprinkler as a predominant irrigation system. Using this system, 30 mm is the minimum of water recommended to guarantee depth moisture and uniformity of the planting area. The second variation factor was the substrate volume (VS) in which the seedlings were transplanted: 125 cm³, 93 cm³, 73 cm³ and 56 cm³. So, crossing 8 irrigation strategies and 4 substrates volumes, 32 treatments with repetition randomized in three blocks (a total of 96 plots) were obtained. It was observed statistical difference concerning the irrigation strategy factor for all assessed characteristics. On the other hand the VS factor did not show any statistical difference for the majority of assessed characteristics. Considering the percentage of dead seedlings, as fundamental information to warranty 100% of nurseries stand, it was observed that the irrigation supplement (30 mm) must not occur at intervals above 30 mm of EtoAc, once only E1 and E2 reached 100% of seedlings survival, and E5 (except for VS 56 cm³) resulted in 50% of seedlings death rate.

O setor sucroenergético brasileiro vem apresentando baixos índices de incremento na produtividade agrícola em seus canaviais nos últimos anos. Existem alguns fatores que se relacionam a essa problemática, dentre eles destaca-se o lento processo de adoção e implantação de novos cultivares de cana-de-açúcar em áreas comerciais. Isso se deve em menor escala à falta de informação e, em maior escala, às estratégias adotadas para inserção e multiplicação do material vegetativo desses novos cultivares. Deste modo, a micropropagação - através da extração do meristema apical de plantas do cultivar de interesse e da utilização dos métodos de multiplicação de biofábrica - possibilita alcançar rapidamente uma quantidade significativa de novas plantas para atender plantios de viveiros de novos cultivares, agilizando, assim, a inserção dos cultivares em áreas de viveiros e, posteriormente, em áreas comerciais. Este trabalho teve por objetivo verificar a melhor estratégia de irrigação (E) para atender às necessidades hídricas das mudas recém-plantadas de cana-de-açúcar provenientes do processo de biofábrica, com diferentes volumes de substrato (VS). A variedade estudada foi a RB93509. O sistema de irrigação utilizado foi o tipo de gotejamento, e as estratégias de irrigação (E) foram determinadas com base na evapotranspiração acumulada (EToAc) dentro da estufa, com separação em duas condições iniciais: lâminas de irrigação após plantio e mantidas em solo seco após plantio, até a primeira lâmina pré-determinada. Com isso, a umidade do solo em E1 foi mantida na capacidade de campo através da tensiometria por todo experimento; E2, E3 e E4 receberam a lâmina inicial de irrigação inicial de 30 mm; e E5, E6, E7 e E8 mantidas inicialmente em solo seco até a sua primeira lâmina de 30 mm para diferentes intervalos de EToAc. Essa lâmina foi adotada, uma vez que na grande maioria das usinas de cana-de-açúcar o sistema de irrigação predominante é o carretel enrolado. Através deste sistema a lâmina mínima recomendada para garantir umidade em profundidade e uniformidade da área é de 30 mm. O segundo fator de variação foi o volume de substrato (VS) com que as mudas foram transplantadas, sendo: 125 cm³, 93 cm³, 73 cm³ e 56 cm³. Deste modo, combinando as 8 estratégias de irrigação e os 4 volumes de substratos, obteve-se 32 tratamentos implementados com três repetições casualizadas em 3 blocos, totalizando 96 parcelas experimentais. Observam-se diferenças significativas para as diversas estratégias de irrigação implementadas em todas as características avaliadas. Por outro lado, para o fator volume de substrato (VS) não houve nível de significância na maioria das características avaliadas. Considerando-se a característica \"porcentual de plantas mortas\" como informação fundamental para a garantia do stand do viveiro, observou-se que as lâminas de irrigação de 30 mm não devem ocorrer em intervalos superiores a 30 mm de EToAc, pois apenas E1 e E2 garantiram 100% de sobrevivência e E5, com exceção do VS 56 cm³, apresentou uma taxa de 50% de plantas mortas. / The Brazilian sugarcane sector has been facing low indices of productivity in their fields. There are some factors correlated to this issue, such as the slow process to increase new sugarcane cultivars on commercial areas, due to the lack of information related to the new cultivars and mainly because of the few strategies adopted to input and multiply the vegetative material from the new cultivars. Thus, through the utilization of micropropagation process by means of the extraction of apical meristem from the cultivar of interest and utilization of biofactory multiplying methods it is possible to reach an amount of new sugarcane seedlings to provide the nurseries with new cultivars, improving therewith the insertion of cultivars. This work aimed at checking the best irrigation strategy (E) to supply water needs of sugarcane seedlings recently planted from the biofactory process with different substrate volumes (VS).The variety used was the RB93509. The irrigation system used was the dripping system and the irrigation strategies were established based on periods of cumulative reference evapotranspiration (EToAc) inside the greenhouse separated in two different initial conditions: initial irrigation after planting and kept on dry soils up to the first predetermined irrigation. Therewith, the soil moisture on E1 was kept on soil available water capacity by the tensiometry throughout the experiment; E2, E3, E4 were supplied by an initial irrigation with 30 mm, and E5, E6, E7 and E8 were kept initially on dry soil, up to the first irrigation with 30 mm in different intervals of EToAc. Such amount of water was chosen, because the majority of sugarcane mills (growers) have a water reel travelling sprinkler as a predominant irrigation system. Using this system, 30 mm is the minimum of water recommended to guarantee depth moisture and uniformity of the planting area. The second variation factor was the substrate volume (VS) in which the seedlings were transplanted: 125 cm³, 93 cm³, 73 cm³ and 56 cm³. So, crossing 8 irrigation strategies and 4 substrates volumes, 32 treatments with repetition randomized in three blocks (a total of 96 plots) were obtained. It was observed statistical difference concerning the irrigation strategy factor for all assessed characteristics. On the other hand the VS factor did not show any statistical difference for the majority of assessed characteristics. Considering the percentage of dead seedlings, as fundamental information to warranty 100% of nurseries stand, it was observed that the irrigation supplement (30 mm) must not occur at intervals above 30 mm of EtoAc, once only E1 and E2 reached 100% of seedlings survival, and E5 (except for VS 56 cm³) resulted in 50% of seedlings death rate.

Submitted by biblioteca unifenas (biblioteca@unifenas.br) on 2016-07-06T20:33:59Z No. of bitstreams: 1 Domicio Pereira da Costa JuniorDissertacao.pdf: 1369630 bytes, checksum: 4e4dd1f99195d8559cc26002937d5d72 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-06T20:34:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domicio Pereira da Costa JuniorDissertacao.pdf: 1369630 bytes, checksum: 4e4dd1f99195d8559cc26002937d5d72 (MD5) Previous issue date: 2015-12-16 / One of the main causes of loss in production Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae) in biofactories is the attack of a ectoparasitoid of larvae, the Bracon hebetor (Hymenoptera: Braconidae). The production of Anagasta kuehniella eggs in a biofactory can be reduced by 69% due to the attack of this ectoparasitoid. What can totally destroy an creation of these insects. The aim of this study was to evaluate a new method of creating the moth-the-flour (Anagasta kuehniella), aimed at isolating the parasitoid Bracon hebetor and compare the production of the creation method, already used (conventional), with the production of proposed method (experimental). To this end, it used sulfite role in trying to isolate the parasitoid Bracon hebetor, of creating Anagasta kuehniella, which it obtained 100% efficiency, while all plots of conventional treatment were attacked. With regard to production, there was no significant difference in the production of adult and eggs of Anagasta kuehniella in both the treatments. Both methods were efficient in the production and productivity. The proposed method was considered the most efficient in this work by effectively isolating the said parasitoid attacks da mass rearing of insect host. / Uma das principais causas de perda na produção de Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae), Traça-da-farinha, em biofábricas é o ataque de um ectoparasitoide de larvas, o Bracon hebetor (Hymenoptera: Braconidae). A produção de ovos de Anagasta kuehniella em uma biofábrica pode ser reduzida em 69% devido ao ataque deste ectoparasitoide, podendo chegar à destruição total da criação desse inseto. O objetivo do presente trabalho foi avaliar uma nova metodologia de criação da Traça-da-farinha (Anagasta Kuehniella) visando o isolamento do parasitoide Bracon hebetor e a comparação da produção entre o método de criação já utilizado (convencional) e o método proposto (experimental). Para tanto, foi utilizado papel Sulfite na tentativa de isolar o parasitoide Bracon hebetor frente à criação de Anagasta kuehniella, do qual se obteve 100% de eficiência, enquanto que todas as parcelas do tratamento convencional foram atacadas. Em relação à produção, não houve diferença significativa na produção de adultos e de ovos de Anagasta Kuehniella em ambos os tratamentos avaliados. Ambos os métodos foram considerados eficientes, quanto à produção e produtividade. O método proposto foi o mais eficiente neste trabalho por isolar com eficiência os ataques do referido parasitoide, da criação massal do hospedeiro.

Submitted by Adriana Martinez (amartinez@unoeste.br) on 2018-03-22T23:31:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Bruno Melo.pdf: 4288894 bytes, checksum: aec64cf47aa72456333e7b24515e37ae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-22T23:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Bruno Melo.pdf: 4288894 bytes, checksum: aec64cf47aa72456333e7b24515e37ae (MD5) Previous issue date: 2017-04-26 / The Brazil is the world's largest producer of sugar cane and sugar, also the largest producer of ethanol from sugarcane. The use of pre-budded seedlings for the installation of sugarcane cultivation presents numerous advantages over the traditional method, since it allows the increase of the number of tillers and the uniformity in the planting lines, minimizes the flaws verified in the conventional system , Reduces the mass of seedlings and the volume of cargo to be transported to the field, improves the phytosanitary quality of the seedlings and, mainly, favors the increase in the production of clean energy, due to the increase of productivity and decrease in the consumption of fossil fuel for the Planting, harvesting and transport operations, by increasing agricultural productivity. It reduces the environmental impact caused by the crop by providing reduced cultivated area. Another technology of environmental interest is the use of water-repellent polymers, since it has contributed greatly to increase the water retention capacity in the soil, reducing the frequency of irrigation, when applicable, and allowing more effective use of soil and water resources. Water, contributing to improve agricultural productivity of the crop, promoting reductions in the areas, consumption of agricultural inputs (agrochemicals) and also bringing enormous environmental and agricultural advantages. The main objective of this research was to produce, in greenhouse conditions, pre-sprouted sugarcane seedlings, free of pests and agricultural pathogens, without the use of any type of agrochemical, using different doses of Hydrotherapeutic polymers, and later application of in vitro culture method of meristems, in order to obtain clones of healthy seedlings in a large scale, allowing the reduction of cultivated area and consequently the reduction of environmental impacts. The sugar cane culture is known as a great culture, because only with planting scale does it obtain financial return, so the industrial units occupy large areas of monoculture. New cultivars with genetic traits to increase productivity and sugar content, resistance to pests and diseases can provide a significant reduction in plantings, provided they can be deployed quickly and with technical feasibility. Smallholder associations can make biofactories viable, which can produce pre-sprout seedlings in order to speed up the replacement of old cultivars, providing social and cultural improvement. Due to the biometric and physiological parameters analyzed, there is great potential in the use of water-repellent polymer for faster growth with water saving. The in vitro culture presented fantastic results, so the use can be recommended in MPB production. There is a relation between the genetic load (cultivar) in biometric and physiological variables, in the growth of MPB seedlings. New experiments that accompany the harvesting of the material produced must be carried out to determine if there are increases in productivity, which could lead to reductions in crop areas and consequently reduction of environmental impacts. The creation of biofábricas by small producers or settlers is totally possible, demanding public policies and sensitization of entrepreneurs of the sector, through fiscal incentives and specific legislations. / O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar e de açúcar, também sendo o maior produtor de etanol oriundo da cana-de-açúcar. A utilização de mudas pré-brotadas para a instalação do cultivo de cana-de-açúcar apresenta inúmeras vantagens em relação ao método tradicional, pois possibilita o aumento do número de perfilhos e a uniformidade nas linhas de plantio, minimiza as falhas verificadas no sistema convencional, diminui a massa de mudas e o volume de carga a serem transportadas ao campo, melhora a qualidade fitossanitária das mudas e, principalmente, favorece o aumento na produção de energia limpa, devido ao aumento de produtividade e diminuição no consumo de combustível fóssil para as operações de preparo, plantio, colheita e transporte, pelo aumento da produtividade agrícola. Reduz o impacto ambiental causado pela cultura por proporcionar a redução da área cultivada. Outra tecnologia de interesse ambiental é a utilização de polímeros hidrorretentores, pois tem contribuído muito para aumentar a capacidade de retenção de água no solo, reduzindo a freqüência de irrigação, quando for o caso, e permitindo a utilização mais efetiva dos recursos do solo e da água, contribuindo para melhorar produtividade agrícola da cultura, promovendo reduções nas áreas, consumo de insumos agrícolas (agrotóxicos) e também trazendo enormes vantagens ambientais e agrícolas. O objetivo principal da presente pesquisa foi produzir, em condições de estufa, mudas pré-brotadas de cana-de-açúcar, livre de pragas e patógenos agrícolas, sem que haja a utilização de qualquer tipo de agroquímico, com o emprego de diferentes doses de polímeros hidrorretentores, e posteriormente, aplicação da metodologia de cultivo in vitro de meristemas, com intuito de obter clones de mudas sadias em larga escala, possibilitando a redução da área cultivada e conseqüentemente a diminuição dos impactos ambientais. A cultura canavieira é conhecida como uma grande cultura, pois apenas com escala de plantio é que se consegue retorno financeiro, portanto as unidades industriais ocupam grandes áreas de monocultura. Novos cultivares com características genéticas para aumentar a produtividade e o teor de açúcar, resistência a pragas e doenças pode proporcionar uma significativa redução nas plantadas, desde que consigam ser implantadas rapidamente e com viabilidade técnica. Associações de pequenos produtores podem viabilizar biofábricas, as quais poderão produzir mudas pré-brotadas com intuito de agilizar a substituição de cultivares antigas, proporcionando a melhoria social e cultural. Pelos parâmetros biométricos e fisiológicos analisados, tem-se grande potencial na utilização de polímero hidrorretentores para crescimento mais rápido com economia de água. O cultivo in vitro, apresentou resultados fantásticos, portanto a utilização pode ser preconizada, em produção de MPB. Existe uma relação entre a carga genética (cultivar) nas variáveis biométricas e fisiológicas, no crescimento das mudas de MPB. Novos experimentos, que acompanhem até a colheita do material produzido devem ser realizados para aferir se ocorrem aumentos de produtividades, os quais poderiam levar as reduções de áreas de cultivos e conseqüentemente redução de impactos ambientais. A criação de biofábricas por pequenos produtores ou assentados é totalmente possível, demandando políticas públicas e sensibilização de empresários do setor, através de incentivos fiscais e legislações específicas.

[ES] El empleo de organismos vivos como biofactorías ha ganado una atención significativa en la industria debido a la creciente demanda de sistemas de producción sostenibles y la escasez de recursos. Entre sus muchas aplicaciones, las biofactorías pueden ser diseñadas para producir feromonas de insectos, las cuales sirven como alternativa ecológica a los pesticidas para el control de plagas en la agricultura. Como prueba de concepto, en esta tesis doctoral se caracterizaron plantas de Nicotiana benthamiana modificadas genéticamente con una ruta multigénica para producir las feromonas de polillas (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) y (Z)-11-hexadecenil acetato (Z11-16OAc). Las plantas resultantes produjeron cantidades moderadas de ambas feromonas (111.4 µg g-1 FW y 11.8 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente), y tasas de emisión diarias de ~10 ng g-1 FW para cada feromona. La producción de feromonas afectó negativamente al desarrollo de las plantas, probablemente debido a la sustancial carga metabólica y posible toxicidad de estos productos. Una estrategia para superar estas limitaciones es diseñar un sistema de expresión condicional que permita a las plantas crecer con normalidad antes de inducir la producción de feromonas. Para ello desarrollamos un conjunto de promotores sintéticos personalizables, llamados GB_SynP, activables con dCasEV2.1, un activador transcripcional potente y programable desarrollado recientemente para la inducción de genes en plantas. Los promotores GB_SynP permitieron una regulación precisa de los transgenes, con unos niveles de transcripción robustos y modulables en el estado "encendido" (presencia de dCasEV2.1 y la correspondiente guía de ARN), y una expresión mínima en el estado "apagado". Para implementar el sistema de producción condicional de feromonas en plantas se generó una nueva ruta multigénica para la biosíntesis de feromonas de polilla bajo el control de los promotores GB_SynP. Paralelamente, el activador dCasEV2.1 se reguló transcripcionalmente mediante el módulo CUP2:GAL4 sensible a sulfato de cobre, un inductor químico ampliamente utilizado en la agricultura. La funcionalidad del sistema se probó mediante expresión transitoria en N. benthamiana, resultando en unos rendimientos en el estado "encendido" de 32.7 µg g-1 FW y 25 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente, y unos niveles insignificantes en ausencia de cobre. Sin embargo, la expresión en estable de esta ruta en N. benthamiana produjo unos niveles de expresión de los transgenes significativamente menores y una marcada disminución en la producción de feromonas. Esto supone que el sistema en su forma actual resulte inviable como biofactoría de feromonas en términos prácticos. La optimización de este sistema debe centrarse en mejorar la cascada de activación, en el uso de especies de plantas alternativas con mayor biomasa, y/o en incrementar las tasas de emisión en planta. Como alternativa a la producción de feromonas en plantas, la intercambiabilidad de piezas génicas entre plantas y hongos filamentosos puede aprovecharse para crear biofactorías fúngicas de feromonas. En este sentido, nuestro grupo adaptó previamente el sistema GoldenBraid a hongos filamentosos, llamado FungalBraid. En esta tesis ampliamos la colección de FungalBraid incorporando 27 piezas nuevas que incluyen diferentes marcadores de selección y promotores constitutivos e inducibles, los cuales se caracterizaron funcionalmente en Penicillium digitatum y P. chrysogenum. Además, se expresaron con éxito los promotores GB_SynP en P. digitatum, en combinación con el sistema de dCas9 activadora contenido en el vector pAMA18. Aunque los niveles de expresión de GB_SynP en hongos filamentosos fueron menores que los observados previamente en plantas, ésta y otras herramientas disponibles en la colección FungalBraid pueden utilizarse en el futuro para el desarrollo de biofactorías fúngicas que produzcan feromonas de insectos y otras biomoléculas de alto valor. / [CA] L'ús d'organismes vius com biofàbriques ha guanyat una atenció significativa a la indústria a causa de la creixent demanda de sistemes de producció sostenible i l'escassetat de recursos. Entre les seues moltes aplicacions, les biofàbriques poden ser dissenyades per a produir feromones d'insectes, les quals serveixen com a alternativa ecològica als pesticides per al control de plagues a l'agricultura. Com a prova d'aquest concepte, en aquesta tesi doctoral es van caracteritzar plantes de Nicotiana benthamiana modificades genèticament plantes de amb una ruta multigènica per a produir les feromones d'arnes (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) i (Z)-11-hexadecenil acetat (Z11-16OAc). Les plantes resultants van produir quantitats moderades de totes dues feromones (111.4 µg g-1 FW i 11.8 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament), i taxes d'emissió diàries d'aproximadament 10 ng g-1 FW per a cada feromona. La producció de feromones en aquestes plantes va afectar negativament el seu desenvolupament, probablement a causa de la substancial càrrega metabòlica i possible toxicitat d'aquests productes. Una estratègia per superar aquestes limitacions és dissenyar un sistema d'expressió condicional que permeta a les plantes créixer amb normalitat abans d'induir la producció de feromones. Per això hem desenvolupat un conjunt de promotors sintètics personalitzables, anomenats GB_SynP, activables amb dCasEV2.1, un activador transcripcional potent i programable desenvolupat recentment per a la inducció de gens en plantes. Els promotors GB_SynP van permetre una regulació precisa des transgens, amb uns nivells de transcripció robustos i modulables a l'estat "encès" (presència de dCasEV2.1 i la corresponent guia d'ARN), i una expressió mínima a l'estat "apagat". Per implementar el sistema de producció condicional de feromones en plantes es va generar una nova ruta multigènica per a la biosíntesi de feromones d'arna sota el control dels promotors GB_SynP. Paral·lelament, l'activador dCasEV2.1 es va regular transcripcionalment al mòdul CUP2:GAL4 sensible al sulfat de coure, un inductor químic àmpliament utilitzat en l'agricultura. La funcionalitat del sistema es va provar mitjançant expressió transitòria en N. benthamiana, resultant en uns rendiments a l'estat "encès" de 32.7 g-1 FW i 25 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament, i uns nivells insignificants en absència de coure. No obstant això, l'expressió estable d'aquesta ruta a N. benthamiana va produir uns nivells d'expressió dels transgens significativament menors i una marcada disminució en la producció de feromones. Això suposa que el sistema en la seua forma actual resulte inviable com a biofàbrica de feromones en termes pràctics. L'optimització d'aquest sistema ha de centrar-se en millorar la cascada d'activació, en l'ús d'espècies de plantes alternatives amb major biomassa, i/o en incrementar les taxes d'emissió a la planta. Com a alternativa a la producció de feromones en plantes, la intercanviabilitat de peces gèniques entre plantes i fongs filamentosos pot aprofitar-se per crear biofàbriques fúngiques de feromones. En aquest sentit, el nostre grup va adaptar prèviament el sistema GoldenBraid a fongs filamentosos, anomenat FungalBraid. En aquesta tesi, vam ampliar la col·lecció de FungalBraid incorporant 27 peces noves que inclouen diferents marcadors de selecció i promotors constitutius i induïbles, els quals es van caracteritzar funcionalment a Penicillium digitatum i P. chrysogenum. A més, es van expressar amb èxit els promotors GB_SynP en P. digitatum, en combinació amb el sistema de dCas9 activadora contingut en el vector pAMA18. Encara que els nivells d'expressió de GB_SynP en fongs filamentosos van ser menors que els observats prèviament en plantes, aquesta i altres eines disponibles a la col·lecció FungalBraid poden utilitzar-se en el futur per al desenvolupament de biofàbriques fúngiques que produeixin feromones d'insectes i altres biomolècules de gran valor. / [EN] The use of living organisms as biofactories have gained significant attention in the industry due to the increasing demand for sustainable production systems and the shortage of resources. Among their many applications, biofactories can be engineered to produce insect pheromones, which serve as eco-friendly alternatives to pesticides for pest management in agriculture. As a proof of concept, in this thesis we characterized Nicotiana benthamiana plants engineered with a multigene pathway to produce the moth pheromones (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) and (Z)-11-hexadecenyl acetate (Z11-16OAc). The resulting transgenic plants produced modest amounts of both pheromones (111.4 µg g-1 FW and 11.8 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc, respectively), and daily emission rates of ~10 ng g-1 FW for each pheromone. Pheromone production in these plants significantly affected their fitness, likely due to the substantial metabolic burden and possible toxicity of lipid-derived products. One strategy to address these developmental abnormalities consists of engineering conditional transgene expression systems, thus allowing plants to grow normally before inducing the production of pheromones. To achieve this goal, in this thesis we developed a set of customizable synthetic promoters called GB_SynP, which can be activated by dCasEV2.1, a strong programable transcriptional activator recently developed for plant gene regulation. These GB_SynP promoters enabled tight regulation of single and multiple transgenes, with robust and tunable transcription levels in the ON state (presence of dCasEV2.1 loaded with the corresponding gRNA), and minimal or undetectable expression in the OFF state. To implement a conditional expression system for pheromone production in plants, a newly engineered multigene pathway for the biosynthesis of moth pheromones was constructed under the control of GB_SynP promoters. In parallel, the dCasEV2.1 activator was transcriptionally regulated with the CUP2:GAL4 sensor for copper sulphate, an agronomically-compatible chemical trigger. The functionality of this system was tested transiently in N. benthamiana, resulting in estimated yields of 32.7 µg g-1 FW and 25 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc respectively in the ON state, and negligible levels in the absence of copper. However, stable transformation of the same copper-regulated pheromone pathway in N. benthamiana plants resulted in significantly lower transgene expression levels, which translated into a great reduction of pheromone yields. This makes the system in its current form a non-viable pheromone biofactory in practical terms. Further optimization should focus on the improvement of the activation cascade, the use of alternative plant hosts with more biomass, and/or the enhancement of emission rates in planta. As an alternative to pheromone production in plants, the interchangeability of DNA parts between plants and filamentous fungi could also be exploited to create fungal biofactories for pheromone production. In this regard, our research group previously adapted the GoldenBraid system for filamentous fungi, which we named FungalBraid. In this thesis, we expanded the FungalBraid collection by incorporating 27 new DNA parts, including different selection markers and several constitutive and inducible promoters, all of which were functionally characterized in Penicillium digitatum and P. chrysogenum. Furthermore, we successfully expressed the GB_SynP promoters developed for plants in P. digitatum, in combination with the non-integrative pAMA18-derived vector for the expression of a dCas9-based activator. Although further optimization of GB_SynP in filamentous fungi is required, as expression levels were lower than those previously observed in plants, this and the other tools available in the FungalBraid collection can be effectively employed in the future for the development of fungal biofactories that produce insect pheromones and other high value biomolecules. / Este trabajo ha sido financiado mediante la Ayuda para la Formación de Profesorado Universitario FPU18/02019 (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte), así como por el proyecto europeo SUSPHIRE (PCI2018-092893, Era- CoBiotech), y los proyectos de Plan Nacional I+D PID2019-108203RB-100 y PID2021-125858OB-100 (Ministerio de Ciencia e Innovación). / Moreno Giménez, E. (2023). Synthetic biology tools for production of insect pheromones in plants and filamentous fungi [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201180