Syfte: Syftet med denna studie var att studera huruvida algen Ascophyllum Nodosum (AN) utövar någon effekt på proteasaktivitet i oralt plack, samt om effekten finns i algen från början eller om man måste inta den oralt för att få en systemisk effekt.En förhöjd proteasaktivitet har förknippats med gingivit och parodontit. Vi förväntar oss en minskad proteasaktivitet hos försökspersonerna, och därmed en minskad risk för gingivit och parodontit, efter intag av AN under en månads tid. Material och metod: Ett in vitro med en pilotstudie, och ett in vivo försök utfördes. I in vitro försöket användes pulveriserat och upplöst Ascophyllum Nodosum. I in vitro studien deltog 5 personer i åldersgruppen 20 till 30 år. Plackprover på försökspersonerna togs före och efter intag av algen i 4 veckor. Under båda försökstillfällena fick försökspersonerna inte ha borstat tänderna på 12h innan försöket. Resultat: Vid kombinering av pilotstudien och in vitro studien ses ingen signifikant skillnad gällande Ascophyllum Nodosums proteasaktivitet i pulveriserad form. Våra resultat erhållna från in vivo studien visar att det har skett en ökad proteasaktivitet i placket hos försökspersonerna efter en månads intag av Ascophyllum Nodosum. Konklusion: Denna studie visar på en tendens till en ökad proteasaktivitet orsakad av Ascophyllum nodosum. Studien har inte undersökt vilka proteaser som påverkats. På grund av komplexiteten i den orala miljön och de många olika typerna av proteaser, behöver fler studier utföras för att studera de exakta effekterna på den orala miljön. / Aims: The purpose of this study was to investigate if the alga Ascophyllum Nodosum (AN) exerts any effect on protease activity in plaque, if such an effect is present in the algae from the beginning or if it has to be taken orally to exert a systemic effect.Increased protease activity has been associated with gingivitis and periodontitis. We expected a reduced protease activity, and thus a potentially reduced risk for gingivitis and periodontitis, after ingestion of AN for a month.Materials and methods: One in vitro trial with a pilot study, and one in vivo trial was carried out. In the in vitro trial pulverized and dissolved AN was used to make a solution, tested for protease activity.In the in vitro study 5 subjects, aged 20 to 30 years, participated. Plaque samples were taken before and after ingestion of the algae for 4 weeks. Subjects were instructed not to brush their teeth 12 h before sampling.Results: When combining the results from the pilot and in vitro studies, no AN protease activity could be detected. Our in vivo results showed an increased protease activity in the plaque after a month of AN intake.Conclusion: This study indicates a tendency to an increased protease activity caused by Ascophyllum Nodosum. However, the study did not examine which protease was affected. Because of the complexity in the oral environment and the many different types of protease, more studies need to be executed to study the exact effects of AN on the oral environment.

Fungal infections are one of the leading causes of death in humans, causing infections that range from mild superficial infections to severe, and life-threatening invasive infections that affect the bloodstream and vital organs. Invasive fungal infections have a high mortality rate, leading to approximately 1.5 million deaths annually. The most common pathogens responsible for these infections are Candida, Cryptococcus, and Aspergillus. Currently, treatment options for invasive fungal infections are limited to three main classes of antifungal drugs: azoles, polyenes, and echinocandins. The emergence of new fungal species, such as Candida auris, which displays high resistance and mortality rates (30-60%), has further complicated treatment efforts. Thus, there is a critical need for new therapeutic strategies to combat these life-threatening pathogens. C. auris isolates have demonstrated significant resistance, especially to azoles (fluconazole) and polyenes (amphotericin B, AmB). To address this, we screened approximately 2,600 FDA-approved drugs and clinical compounds to identify agents capable of inhibiting C. auris growth and enhancing or restoring the antifungal activity of existing antifungals. This screening revealed that HIV protease inhibitors, such as lopinavir, atazanavir, saquinavir and ritonavir, significantly enhanced the antifungal activity of azoles (fluconazole, voriconazole, itraconazole, and posaconazole) and polyene (AmB). Mechanistic studies showed that the HIV protease inhibitors inhibited the fungal efflux pump, and interfered with glucose utilization, leading to reduced ATP levels in C. auris. Moreover, HIV protease inhibitors, in combination with AmB, were able to inhibit the virulence factors of Candida species. Furthermore, HIV protease inhibitors, in combination with itraconazole or posaconazole, resulted in a significant reduction of the C. auris burden in mice kidneys. Two additional drugs, darapladib and rilapladib, phospholipase A2 inhibitors, were identified as potent inhibitors of C. auris. Darapladib and rilapladib demonstrated superior killing kinetics compared to itraconazole. Interestingly, C. auris did not develop any detectable resistance to both drugs at sub-inhibitory concentration over 16-passages. Mechanistic studies revealed that darapladib increased the plasma membrane permeability and caused DNA leakage, likely due to a direct interaction with ergosterol, as suggested by competition assays with exogenous ergosterol. We further validated the broad-spectrum, fungicidal, and potent activity of darapladib in combination with AmB, showing significant synergy against multidrug-resistant fungal pathogens, including C. auris, Aspergillus fumigatus and mucormycosis-associated species. Additionally, darapladib demonstrated a superior safety profile compared to AmB, exhibiting lower affinity for cholesterol, and no toxicity in combination with AmB to kidney cells. Finally, rilapladib (at 2× MIC) inhibited the C. auris burden by 1.5 Log10, whereas darapladib (at 2× MIC) achieved complete eradication of the C. auris burden in an in vivo C. elegans model. / Doctor of Philosophy / Fungi are a group of living organisms that are neither plants nor animals. While Some fungi are beneficial, others can cause serious diseases in humans. Candida auris is a human fungal pathogen that causes serious infections with mortality rate up to 60%. It has become a growing threat to global public health. This pathogen is particularly concerning due to its high virulence, resistance to multiple antifungal drugs, and ability to rapidly spread, often leading to hospital outbreaks. In our current research, we have identified several compounds that either inhibit the growth of C. auris and/or enhance the efficacy of existing antifungals, such as azoles and amphotericin B. We have identified HIV protease inhibitors (lopinavir, atazanavir, saquinavir, and ritonavir) that were able to enhance the antifungal activities of both azoles (fluconazole, itraconazole, voriconazole, and posaconazole) and polyene (amphotericin B) against multidrug-resistant C. auris. The combination of HIV protease inhibitors with amphotericin B inhibited the virulence factors of Candida species, including biofilm and hyphae formation. Two drugs darapladib and rilapladib were found to not only inhibit the growth of C. auris alone but also enhance the antifungal activity of amphotericin B against all medically important fungal pathogens tested. Additionally, we have explored the mechanisms by which these compounds act on the pathogen. Finally, we have confirmed the effectiveness of these drugs in live models, including mice and worms.

A inibição do quorum sensing (QS) altera a comunicação bacteriana, reduzindo a expressão de fatores de virulência e a formação de biofilmes, o que pode conferir menor pressão seletiva em comparação aos antibióticos tradicionais. As frutas e hortaliças constituem uma fonte rica em compostos com propriedades potenciais de inibição do QS. Entretanto, há pouca referência sobre o potencial de pimentas do gênero Capsicum e de seus compostos isolados como inibidores do QS. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de extratos orgânicos obtidos das variedades de pimenta-malagueta e pimentão vermelho sobre o sistema QS dependente do sinalizador AI-1 (acil homoserina lactona - AHL) em bactérias Gram-negativas. Os extratos foram obtidos por extração em fase sólida e separados em uma fração metanólica e outra amônica; sendo os compostos característicos identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e pela curva de crescimento de Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 e Pseudomonas aeruginosa PAO1. O efeito anti-QS dos extratos foi avaliado pelos testes de difusão em ágar e quantificação da produção de violaceína em meio líquido por C. violaceum e sobre a formação de biofilme, avaliado pelo ensaio de cristal violeta e microscopia confocal, em S. liquefaciens e P. aeruginosa nas temperaturas 30 ºC e 37 ºC. Os resultados obtidos pela CLAE indicaram que o extrato metanólico de pimenta-malagueta (EMPM) continha capsaicinoides como a capsaicina e dihidrocapsaicina, luteolina e outros compostos não identificados; já o extrato amônico desta não continha os compostos capsaicinoides. Ambos os extratos de pimentão vermelho continham luteolina e compostos não identificados, mas não apresentaram capsaicinoides. Como o EMPM era representativo dos demais extratos, por conter tanto capsaicinóides quanto luteolina, o foco deste trabalho foi avaliar os efeitos do EMPM sobre fenótipos microbianos nas concentrações 5; 2,5; 1,25 e 0,625 mg/ml, além de utilizar a capsaicina como controle comparativo em concentrações equivalentes às do extrato (25, 50 e 100 µg/ml). Os resultados da atividade antimicrobiana mostraram inibição parcial do crescimento das bactérias nas concentrações sub-MIC (MIC >5 mg/ml) de 5 e 2,5 mg/ml de EMPM. A capsaicina também inibiu parcialmente o crescimento das bactérias a 100 µg/ml, com exceção de S. liquefaciens a 37 ºC, cujo crescimento foi induzido em 50 e 25 µg/ml. A produção de violaceína foi reduzida pelo EMPM a 1,25 e 0,625 mg/ml, sem afetar o crescimento de C. violaceum. Ensaios com C. violaceum CV026, estirpe biosensora capaz de produzir o pigmento na presença de AI-1 exógeno, sugerem que o possível mecanismo de atuação do extrato sobre o sistema QS em C. violaceum 12472 é sobre a síntese do sinalizador, já que não foi observada inibição da produção de violaceína em CV026 pelo extrato. Contrariamente, a capsaicina incrementou a produção do pigmento na estirpe 12472, mas ensaios com a estirpe CV026 indicaram que a capsaicina não atua como sinalizador do QS, uma vez que esta não induziu a produção de violaceína nesta estirpe. Já a formação de biofilme foi incrementada na presença do EMPM, sendo consideravelmente maior em P. aeruginosa a 30 ºC. Igualmente, observou-se indução da formação de biofilme por capsaicina em S. liquefaciens (37 ºC) e P. aeruginosa (30 ºC). Porém, a capsaicina não teve efeito sobre a formação de biofilme de S. liquefaciens quando cultivada a 30 ºC, nem P. aeruginosa a 37 ºC. Os resultados revelam que a produção de violaceína em C. violaceum ATCC 12472 é inibida pelo EMPM, mas não pela capsaicina. Já, o EMPM e a capsaicina, de forma geral, não inibem a formação de biofilme de S. liquefaciens MG1 nem P. aeruginosa PAO1. Outros estudos são necessários para elucidar os mecanismos pelos quais o EMPM e a capsaicina agem sobre os fenótipos avaliados neste trabalho. / Quorum sensing inhibition alters bacterial communication by reducing virulence factors expression and biofilm formation, exerting less selective pressure compared to antibiotics. Fruits and vegetables are rich sources of compounds with potential QS-inhibition properties. However, there are few references about the potential of peppers belonging to the genus Capsicum and its isolated compounds as QS inhibitors. This study aimed to assess the effect of organic extracts obtained from Capsicum varieties, pimenta-malagueta (red chili) and pimentão vermelho (red bell pepper), on the AI-1 dependent QS system. The extracts were obtained by solid phase extraction and split into a methanolic and an ammonic fraction. Characteristic compounds were identified and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The antimicrobial activity of the extracts was assessed by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) and the growth curve of Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. The anti-QS effect of the extracts was evaluated by the agar diffusion assay and the quantification of violacein production was assessed in liquid medium by C. violaceum, as well as in the biofilm formation test determined by the crystal violet assay and confocal microscopy with S. liquefaciens and P. aeruginosa at 30 ºC and 37 ºC. HPLC results showed that the methanolic extract of pimenta-malagueta (EMPM) contained capsaicinoids such as capsaicin and dihidrocapsaicin, luteolin and other unidentified compounds in lower concentrations; while its ammonic extract did not have capsaicinoids. Both pimentão vermelho extracts contained luteolin and other unidentified compounds in low concentrations, but they did not contain capsaicinoids. As EMPM was representative among the extracts because it contained capsaicinoids and luteolin, the focus of this work was to assess the effect of EMPM over microbial phenotypes at concentrations of 5, 2.5, 1.25 and 0.625 mg/ml, using capsaicin as a comparative control at equivalent concentrations to those in EMPM (25, 50 and 100 µg/ml). Antimicrobial activity assays showed a partial inhibition growth of bacteria at sub-MIC concentrations (MIC >5 mg/ml) of EMPM at 5 and 2.5 mg/ml. Similarly, capsaicin partially inhibited bacterial growth at 100 µg/ml, except for S. liquefaciens at 37 ºC in which growth was induced at 50 and 25 µg/ml. Violacein production was reduced by EMPM at 1,25 and 0,625 mg/ml without affecting C. violaceum growth. Assays with C. violaceum CV026, a biosensor strain that produces violacein in the presence of exogenous AI-1, suggest that EMPM reduced violacein production in C. violaceum 12472 by interfering with the AI-1 synthesis. In contrast, capsaicin incremented violacein synthesis in strain 12472, but experiments with strain CV026 revealed that capsaicin does not function as an analog of AI-1. Biofilm formation was increased in EMPM presence, being remarkably superior in P. aeruginosa cultivated at 30 ºC, as opposed to cultivation at 37 ºC. Similarly, capsaicin induced biofilm formation in S. liquefaciens (37 ºC) and P. aeruginosa (30 ºC). However, capsaicin did not affect biofilm formation on S. liquefaciens cultured at 30 ºC, neither on P. aeruginosa at 37 ºC. These results show that violacein production in C. violaceum ATCC 12472 is inhibited by EMPM, but not by capsaicin. In general, EMPM and capsaicin did not inhibit biofilm formation in S. liquefaciens MG1 neither in P. aeruginosa PAO1. More studies are necessary to elucidate the mechanisms by which EMPM and capsaicin affect the studied phenotypes in this work.

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-01Bitstream added on 2014-06-13T19:43:46Z : No. of bitstreams: 1 storti_a_dr_arafcf.pdf: 1083866 bytes, checksum: 46bd528115c854e2d63db0b4111bbd28 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Os cateteres venosos centrais são muito usados nas Unidades de Terapia Intensiva (UTIs). O seu uso está freqüentemente associado a complicações incluindo infecções fatais. Durante o período de janeiro de 2004 a janeiro de 2005, foram analisadas 118 pontas de cateteres e 42 amostras de sangue provenientes de 100 pacientes hospitalizados em Unidade de Terapia Intensiva de um hospital da região Noroeste do estado de São Paulo. O objetivo deste estudo foi analisar, por meio de cultura e microscopia eletrônica de varredura, a colonização do cateter intravenoso central de vialon Intracath de lúmem único. Para detectar a produção de slime dos microrganismos isolados foi usado o método de Christensen et al., (1985) e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de acordo com o (NCCLS-M2-A7-2000). Das 118 pontas de cateteres estudadas pelo método semi-quantitativo, 34 (28,8%) estavam colonizadas (d15 UFC/placa) em que foram isolados 55 microrganismos. Desses, 32 (58,2%) foram classificados como Gram-positivos com freqüência maior para 15 (27,3%) Staphylococcus aureus, seis (10,9%) Staphylococcus epidermidis; 19 (34,5%) classificados como Gram-negativos com freqüência maior para seis (10,9%) Acinetobacter baumannii, três (5,4%) Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes respectivamente e ainda quatro (7,3%) classificadas como leveduras sendo duas (3,6%) Candida albicans e duas (3,6%) Candida parapsilosis.... / The aim of the present study was to evaluate the hepatotoxicity, pharmacokinetic parameters and biotransformation of isoniazid when rats were treated with isoniazid (INH); rifampicin (RMP); and INH + RMP. Daily doses of the tuberculostatic drugs were administrated intragastrically to the animals (Wistar rats) for one period of 21 days as follow: sterile water (group I, control); INH (100mg/Kg) (group II), RMP (100mg/Kg) (group III); INH (100mg/Kg) + RMP (100mg/Kg) (group IV). The serum levels of the biomarkers aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were determined before the administration of the drugs (basal) and after the 21 days treatments. On day 21, blood samples were obtained before and 15þ; 30þ; 45þ; 60þ; 1,5; 3h; 6h; 12h and 24 hours after the dose. (five animals for each point). The blood samples were deproteinized with 10% trichloroacetic acid, derivatized by 1% cinnamaldehyde and analyzed by liquid chromatograph. For the determination of the acetylated metabolites acetylisoniazid (AcINH) and acetylhydrazine (AcHz) a previous hydrolysis with 6 M hydrochloride acid was performed. The results are presented as mean and SEM. ...(Complete abstract, click electronic address below).

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / <i>Enterococcus faecium</i> tem se destacado no cenário das infecções hospitalares, particularmente, amostras portadoras de características de multirresistência. Apesar de serem responsabilizados como agentes etiológicos em diferentes quadros clínicos, fatores associados a patogênese das infecções ainda não estão esclarecidos. Entretanto, sabe-se que a capacidade de formação de biofilmes pode ser responsabilizada como um dos atributos capazes de promover o papel patogênico desses microrganismos. Assim sendo, este estudo se propôs a investigar a capacidade de formação de biofilmes por duas amostras de <i>E. faecium</i>: SS-1274 (derivada da amostra tipo da espécie) e CL-6729 (multirresistente e pertencente a um complexo clonal globalmente disperso). As amostras foram caracterizadas fenotipica e genotipicamente para confirmação da identificação, determinação da susceptibilidade a 17 antimicrobianos, caracterização da concentração mínima inibitória para ampicilina, gentamicina e vancomicina, determinação do genótipo vanA e detecção de genes associados a expressão dos genes asa1, cylA, esp, gelE e hyl. A análise quantitativa da formação por 24h e 72h dos biofilmes foi realizada por metodologia do cristal violeta, em placas de microtitulação de poliestireno. Foram construídas curvas de formação pela avaliação da DO570nm das preparações coradas por cristal violeta em períodos de tempo de 2h a 74h. A influência de subCMIs de ampicilina, gentamicina e vancomicina na formação de biofilmes de <i>E. faecium</i> foi também caracterizada em ensaios de quantificação da biomassa. A presença de DNA e proteínas foi avaliada em ensaios de destacamento e por fluorimetria. A arquitetura, distribuição espacial e reação aos fluorocromos Syto9 e SYPRO Ruby Protein foram evidenciadas por microscopia confocal de varredura a laser. Análises proteômicas através da avaliação por SDS-PAGE e por ESI-Q-TOF também foram empregadas para avaliação de biofilmes versus crescimento planctônico. Nossos resultados demonstraram que a amostra CL-6729 apresentou uma maior biomassa nos tempos analisados. Apesar da menor quantidade de biomassa da amostra SS-1274, o perfil da curva de formação foi semelhante a CL-6729. As análises da matriz por ensaios quantitativos e microscopia confocal revelaram que proteína parece ser um importante constituinte para ambas as amostras, entretanto biofilmes formados na presença de da CMI e durante 24h, parecem sofrer alterações na constituição. Os resultados relativos às espectrometrias de massa sugerem que células de biofilmes de <i>E. faecium</i> podem também estar metabolicamente ativas, devido a identificação de um considerável número de proteínas relacionadas ao metabolismo e divisão celular, similarmente às células planctônicas. No entanto, investigações complementares são necessárias para quantificar as diferenças relacionadas a sua expressão. Foi observado que ambas as amostras independente das variações fenotípicas e genotípicas são capazes de formar biofilmes maduros exibindo constituição e arquitetura similares. Entretanto, nossos resultados sugeriram que cada amostra responde as diferentes situações de acordo com seus determinantes de virulência e resistência. / <i>Enterococcus faecium</i> has emerged as an important pathogen related to the scenario of the hospitalar infections, particularly strains bearing characteristics of multidrug resistance. Despite being identified as the etiological agents in various infections, their virulence traits remain unclear. However, it is known that the ability to form biofilms may be implicated as one of the attributes capable of promoting the pathogenic role of these microorganisms. Therefore, this study aimed to investigate the ability of biofilm formation by two strains of <i>E. faecium</i>: SS-1274 (derived from the type strain) and CL-6729 (belonging to a clonal complex globally dispersed). Quantitative analysis of biofilm formation were carried out by using the semiquantitative crystal violet assay after 24h and 72 h of incubation in poliestirene microtiter plates. Growth curves were obtained for biomass quantification by crystal violet assay after a range of incubation period from 2h to 74 h. The influence of subinhibitory concentrations (subMICs) of ampicillin, gentamicin and vancomycin in the biofilm formation of <i>E. faecium</i> is further characterized in assays for quantification of biomass. The presence of DNA and protein in extracellular polymeric substance (EPS) was evaluated by detachment assays and by fluorimetry. The architecture, spatial distribution and reaction against the fluorochromes Syto9 (DNA stain) and Sypro Ruby Protein (protein stain) were observed by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Proteomic analysis was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) and by ESI-Q-TOF mass spectrometry. Our results showed that the multidrug resistance strain (CL-6729) formed greater biomass than the reference strain (SS-1274) at the different periods. The growth curve analyses suggest different stages during the process of maturation of these structures. Despite the lower amount of biomass of SS-1274, the profile of the growth curve, during the period measured, was similar to CL-6729. The analysis of extracellular polymeric substance by confocal microscopy and quantitative assays revealed that protein appears to be an important constituent for the biofilms constituition of both strains. However biofilms formed in the presence of antimicrobials, especially those formed in the presence of of CMI and during 24h seem to suffer changes in the constitution. The results for mass spectrometry suggest that biofilm cells of <i>Enterococcus faecium</i> can also be metabolically active because the identification of a considerable number of proteins related to the metabolism and cell division, similarly to planktonic cells. However, further investigations are needed to quantify the differences related to its expression.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / <i>Enterococcus faecium</i> tem se destacado no cenário das infecções hospitalares, particularmente, amostras portadoras de características de multirresistência. Apesar de serem responsabilizados como agentes etiológicos em diferentes quadros clínicos, fatores associados a patogênese das infecções ainda não estão esclarecidos. Entretanto, sabe-se que a capacidade de formação de biofilmes pode ser responsabilizada como um dos atributos capazes de promover o papel patogênico desses microrganismos. Assim sendo, este estudo se propôs a investigar a capacidade de formação de biofilmes por duas amostras de <i>E. faecium</i>: SS-1274 (derivada da amostra tipo da espécie) e CL-6729 (multirresistente e pertencente a um complexo clonal globalmente disperso). As amostras foram caracterizadas fenotipica e genotipicamente para confirmação da identificação, determinação da susceptibilidade a 17 antimicrobianos, caracterização da concentração mínima inibitória para ampicilina, gentamicina e vancomicina, determinação do genótipo vanA e detecção de genes associados a expressão dos genes asa1, cylA, esp, gelE e hyl. A análise quantitativa da formação por 24h e 72h dos biofilmes foi realizada por metodologia do cristal violeta, em placas de microtitulação de poliestireno. Foram construídas curvas de formação pela avaliação da DO570nm das preparações coradas por cristal violeta em períodos de tempo de 2h a 74h. A influência de subCMIs de ampicilina, gentamicina e vancomicina na formação de biofilmes de <i>E. faecium</i> foi também caracterizada em ensaios de quantificação da biomassa. A presença de DNA e proteínas foi avaliada em ensaios de destacamento e por fluorimetria. A arquitetura, distribuição espacial e reação aos fluorocromos Syto9 e SYPRO Ruby Protein foram evidenciadas por microscopia confocal de varredura a laser. Análises proteômicas através da avaliação por SDS-PAGE e por ESI-Q-TOF também foram empregadas para avaliação de biofilmes versus crescimento planctônico. Nossos resultados demonstraram que a amostra CL-6729 apresentou uma maior biomassa nos tempos analisados. Apesar da menor quantidade de biomassa da amostra SS-1274, o perfil da curva de formação foi semelhante a CL-6729. As análises da matriz por ensaios quantitativos e microscopia confocal revelaram que proteína parece ser um importante constituinte para ambas as amostras, entretanto biofilmes formados na presença de da CMI e durante 24h, parecem sofrer alterações na constituição. Os resultados relativos às espectrometrias de massa sugerem que células de biofilmes de <i>E. faecium</i> podem também estar metabolicamente ativas, devido a identificação de um considerável número de proteínas relacionadas ao metabolismo e divisão celular, similarmente às células planctônicas. No entanto, investigações complementares são necessárias para quantificar as diferenças relacionadas a sua expressão. Foi observado que ambas as amostras independente das variações fenotípicas e genotípicas são capazes de formar biofilmes maduros exibindo constituição e arquitetura similares. Entretanto, nossos resultados sugeriram que cada amostra responde as diferentes situações de acordo com seus determinantes de virulência e resistência. / <i>Enterococcus faecium</i> has emerged as an important pathogen related to the scenario of the hospitalar infections, particularly strains bearing characteristics of multidrug resistance. Despite being identified as the etiological agents in various infections, their virulence traits remain unclear. However, it is known that the ability to form biofilms may be implicated as one of the attributes capable of promoting the pathogenic role of these microorganisms. Therefore, this study aimed to investigate the ability of biofilm formation by two strains of <i>E. faecium</i>: SS-1274 (derived from the type strain) and CL-6729 (belonging to a clonal complex globally dispersed). Quantitative analysis of biofilm formation were carried out by using the semiquantitative crystal violet assay after 24h and 72 h of incubation in poliestirene microtiter plates. Growth curves were obtained for biomass quantification by crystal violet assay after a range of incubation period from 2h to 74 h. The influence of subinhibitory concentrations (subMICs) of ampicillin, gentamicin and vancomycin in the biofilm formation of <i>E. faecium</i> is further characterized in assays for quantification of biomass. The presence of DNA and protein in extracellular polymeric substance (EPS) was evaluated by detachment assays and by fluorimetry. The architecture, spatial distribution and reaction against the fluorochromes Syto9 (DNA stain) and Sypro Ruby Protein (protein stain) were observed by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Proteomic analysis was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) and by ESI-Q-TOF mass spectrometry. Our results showed that the multidrug resistance strain (CL-6729) formed greater biomass than the reference strain (SS-1274) at the different periods. The growth curve analyses suggest different stages during the process of maturation of these structures. Despite the lower amount of biomass of SS-1274, the profile of the growth curve, during the period measured, was similar to CL-6729. The analysis of extracellular polymeric substance by confocal microscopy and quantitative assays revealed that protein appears to be an important constituent for the biofilms constituition of both strains. However biofilms formed in the presence of antimicrobials, especially those formed in the presence of of CMI and during 24h seem to suffer changes in the constitution. The results for mass spectrometry suggest that biofilm cells of <i>Enterococcus faecium</i> can also be metabolically active because the identification of a considerable number of proteins related to the metabolism and cell division, similarly to planktonic cells. However, further investigations are needed to quantify the differences related to its expression.

A inibição do quorum sensing (QS) altera a comunicação bacteriana, reduzindo a expressão de fatores de virulência e a formação de biofilmes, o que pode conferir menor pressão seletiva em comparação aos antibióticos tradicionais. As frutas e hortaliças constituem uma fonte rica em compostos com propriedades potenciais de inibição do QS. Entretanto, há pouca referência sobre o potencial de pimentas do gênero Capsicum e de seus compostos isolados como inibidores do QS. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de extratos orgânicos obtidos das variedades de pimenta-malagueta e pimentão vermelho sobre o sistema QS dependente do sinalizador AI-1 (acil homoserina lactona - AHL) em bactérias Gram-negativas. Os extratos foram obtidos por extração em fase sólida e separados em uma fração metanólica e outra amônica; sendo os compostos característicos identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e pela curva de crescimento de Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 e Pseudomonas aeruginosa PAO1. O efeito anti-QS dos extratos foi avaliado pelos testes de difusão em ágar e quantificação da produção de violaceína em meio líquido por C. violaceum e sobre a formação de biofilme, avaliado pelo ensaio de cristal violeta e microscopia confocal, em S. liquefaciens e P. aeruginosa nas temperaturas 30 ºC e 37 ºC. Os resultados obtidos pela CLAE indicaram que o extrato metanólico de pimenta-malagueta (EMPM) continha capsaicinoides como a capsaicina e dihidrocapsaicina, luteolina e outros compostos não identificados; já o extrato amônico desta não continha os compostos capsaicinoides. Ambos os extratos de pimentão vermelho continham luteolina e compostos não identificados, mas não apresentaram capsaicinoides. Como o EMPM era representativo dos demais extratos, por conter tanto capsaicinóides quanto luteolina, o foco deste trabalho foi avaliar os efeitos do EMPM sobre fenótipos microbianos nas concentrações 5; 2,5; 1,25 e 0,625 mg/ml, além de utilizar a capsaicina como controle comparativo em concentrações equivalentes às do extrato (25, 50 e 100 &#181;g/ml). Os resultados da atividade antimicrobiana mostraram inibição parcial do crescimento das bactérias nas concentrações sub-MIC (MIC >5 mg/ml) de 5 e 2,5 mg/ml de EMPM. A capsaicina também inibiu parcialmente o crescimento das bactérias a 100 &#181;g/ml, com exceção de S. liquefaciens a 37 ºC, cujo crescimento foi induzido em 50 e 25 &#181;g/ml. A produção de violaceína foi reduzida pelo EMPM a 1,25 e 0,625 mg/ml, sem afetar o crescimento de C. violaceum. Ensaios com C. violaceum CV026, estirpe biosensora capaz de produzir o pigmento na presença de AI-1 exógeno, sugerem que o possível mecanismo de atuação do extrato sobre o sistema QS em C. violaceum 12472 é sobre a síntese do sinalizador, já que não foi observada inibição da produção de violaceína em CV026 pelo extrato. Contrariamente, a capsaicina incrementou a produção do pigmento na estirpe 12472, mas ensaios com a estirpe CV026 indicaram que a capsaicina não atua como sinalizador do QS, uma vez que esta não induziu a produção de violaceína nesta estirpe. Já a formação de biofilme foi incrementada na presença do EMPM, sendo consideravelmente maior em P. aeruginosa a 30 ºC. Igualmente, observou-se indução da formação de biofilme por capsaicina em S. liquefaciens (37 ºC) e P. aeruginosa (30 ºC). Porém, a capsaicina não teve efeito sobre a formação de biofilme de S. liquefaciens quando cultivada a 30 ºC, nem P. aeruginosa a 37 ºC. Os resultados revelam que a produção de violaceína em C. violaceum ATCC 12472 é inibida pelo EMPM, mas não pela capsaicina. Já, o EMPM e a capsaicina, de forma geral, não inibem a formação de biofilme de S. liquefaciens MG1 nem P. aeruginosa PAO1. Outros estudos são necessários para elucidar os mecanismos pelos quais o EMPM e a capsaicina agem sobre os fenótipos avaliados neste trabalho. / Quorum sensing inhibition alters bacterial communication by reducing virulence factors expression and biofilm formation, exerting less selective pressure compared to antibiotics. Fruits and vegetables are rich sources of compounds with potential QS-inhibition properties. However, there are few references about the potential of peppers belonging to the genus Capsicum and its isolated compounds as QS inhibitors. This study aimed to assess the effect of organic extracts obtained from Capsicum varieties, pimenta-malagueta (red chili) and pimentão vermelho (red bell pepper), on the AI-1 dependent QS system. The extracts were obtained by solid phase extraction and split into a methanolic and an ammonic fraction. Characteristic compounds were identified and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The antimicrobial activity of the extracts was assessed by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) and the growth curve of Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. The anti-QS effect of the extracts was evaluated by the agar diffusion assay and the quantification of violacein production was assessed in liquid medium by C. violaceum, as well as in the biofilm formation test determined by the crystal violet assay and confocal microscopy with S. liquefaciens and P. aeruginosa at 30 ºC and 37 ºC. HPLC results showed that the methanolic extract of pimenta-malagueta (EMPM) contained capsaicinoids such as capsaicin and dihidrocapsaicin, luteolin and other unidentified compounds in lower concentrations; while its ammonic extract did not have capsaicinoids. Both pimentão vermelho extracts contained luteolin and other unidentified compounds in low concentrations, but they did not contain capsaicinoids. As EMPM was representative among the extracts because it contained capsaicinoids and luteolin, the focus of this work was to assess the effect of EMPM over microbial phenotypes at concentrations of 5, 2.5, 1.25 and 0.625 mg/ml, using capsaicin as a comparative control at equivalent concentrations to those in EMPM (25, 50 and 100 &#181;g/ml). Antimicrobial activity assays showed a partial inhibition growth of bacteria at sub-MIC concentrations (MIC >5 mg/ml) of EMPM at 5 and 2.5 mg/ml. Similarly, capsaicin partially inhibited bacterial growth at 100 &#181;g/ml, except for S. liquefaciens at 37 ºC in which growth was induced at 50 and 25 &#181;g/ml. Violacein production was reduced by EMPM at 1,25 and 0,625 mg/ml without affecting C. violaceum growth. Assays with C. violaceum CV026, a biosensor strain that produces violacein in the presence of exogenous AI-1, suggest that EMPM reduced violacein production in C. violaceum 12472 by interfering with the AI-1 synthesis. In contrast, capsaicin incremented violacein synthesis in strain 12472, but experiments with strain CV026 revealed that capsaicin does not function as an analog of AI-1. Biofilm formation was increased in EMPM presence, being remarkably superior in P. aeruginosa cultivated at 30 ºC, as opposed to cultivation at 37 ºC. Similarly, capsaicin induced biofilm formation in S. liquefaciens (37 ºC) and P. aeruginosa (30 ºC). However, capsaicin did not affect biofilm formation on S. liquefaciens cultured at 30 ºC, neither on P. aeruginosa at 37 ºC. These results show that violacein production in C. violaceum ATCC 12472 is inhibited by EMPM, but not by capsaicin. In general, EMPM and capsaicin did not inhibit biofilm formation in S. liquefaciens MG1 neither in P. aeruginosa PAO1. More studies are necessary to elucidate the mechanisms by which EMPM and capsaicin affect the studied phenotypes in this work.

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Ligninolytic fungi are well known for their ability to degrade a wide range of xenobiotics contaminating the environment, including synthetic industrial dyes. In this work Pleurotus ostreatus was used for decolorization of a synthetic textile dye Remazol Brilliant Blue R (RBBR). To set up a model fungal "fixed-bed" bioreactor the fungus was immobilized on a polyurethane foam and artificially contaminated with a model bacterium Rhodococcus erythropolis. The development of bacterial contamination can be expected during a real application of fungal bio filters in wastewater treatment. The main aim of the work was to study interspecies interactions in the model bioreactors during the dye decolorization. Ligninolytic enzyme activities were followed in the bioreactor cultures as markers of fungal biodegradation ability. In contrast to the controls, no bacterial growth was observed in the P. ostreatus bioreactor culture liquid. The results showed that fungal laccase, pH of the culture liquid, and glucose consumption by the fungus had no effect on the bacterial growth. However, 4*105 - 1,3*106 CFU/ml of R. erythropolis was detected to be associated with the fungal solid support. The presence of these bacteria had no effect on the decolorization performance of the bioreactors. Dye decolorization efficiency...