Los nauplios de Artemia son de uso obligado en acuicultura como alimento para la mayoría de larvas de peces y crustáceos. Su valor nutricional depende esencialmente del perfil de ácidos grasos de sus lípidos. En la actualidad existe gran cantidad de información acerca de la composición de ácidos grasos en quistes y nauplios de diferentes poblaciones de Artemia, sin embargo, se desconocen las causas determinantes de estos perfiles. Este trabajo se centra en el estudio de los factores condicionantes de la composición de ácidos grasos de quistes y biomasas de Artemia profundizando en las relaciones tróficas que se dan en sus hábitats naturales. Gran parte del trabajo se llevó a cabo utilizando como modelo Artemia procedente de Argentina. Las dos especies endémicas de Sudamérica son A. persimilis, hasta ahora hallada sólo en Argentina y Chile, y A. franciscana, existente en el resto del continente americano.El análisis de la composición de ácidos grasos de los quistes de Artemia procedentes de los biotopos argentinos (Capítulo 4) refleja una gran variabilidad mostrando perfiles de ácidos grasos tanto de tipo marino como de tipo dulceacuícola, independientemente del origen costero o continental de sus biotopos y de la composición iónica de las salmueras. Además, se describen por primera vez poblaciones de A. persimilis con elevados porcentajes de ácido eicosapentaenoico (20:5n-3, EPA). La caracterización de las poblaciones mediante marcadores moleculares (RFLPs) (Capítulo 5) confirma los resultados hallados mediante análisis citogenéticos y morfológicos, mostrando una gran divergencia entre las dos especies argentinas de Artemia. La composición bioquímica de Artemia parece estar muy poco marcada por herencia genética, y posiblemente sea complejo averiguar esta influencia. Una primera aproximación molecular, de carácter meramente aleatorio, no permitió la localización de haplotipos adscribibles al fenotipo marino/dulceacuícola de las poblaciones de A. persimilis, aunque no por ello se descarta el efecto genotípico como uno de los factores determinantes de la composición en ácidos grasos de Artemia.Los experimentos realizados en laboratorio revelan que los quistes obtenidos de las poblaciones de Artemia alimentadas con diferentes dietas microalgales, muestran patrones similares a los del alimento suministrado, aunque no de un modo estricto (Capítulo 6). Así, ciertos ácidos grasos, en su mayoría saturados, se presentan en los quistes en niveles independientes al de los hallados en el alimento. Además, se observan diferencias en el perfil de ácidos grasos entre poblaciones, hecho que sugiere un claro componente genotípico. Por otro lado, una dieta mixta con presencia de ácido linolénico (18:3n-3, LNA) y EPA aumenta el fitness de Artemia. A pesar de compartir un mismo haplotipo, las poblaciones mostraron diferencias notables en la fecundidad, lo que podría sugerir la existencia de diferencias genéticas intraespecíficas, no detectadas mediante los marcadores moleculares mitocondriales estudiados.La temperatura (Capítulo 7) tiene un efecto notable sobre el perfil de ácidos grasos de Artemia. Así, a temperaturas más bajas se produce un aumento en el porcentaje de los ácidos grasos insaturados. Este hecho queda demostrado tanto en quistes como en biomasas, donde además, el perfil de ácidos grasos es diferente entre especies (A. persimilis y A. franciscana) siendo esta diferencia más acusada en los primeros. Esta circunstancia vuelve a sugerir un posible efecto genotípico determinante del perfil de ácidos grasos en Artemia.Los estudios realizados en mesocosmos (Capítulo 8) mostraron la influencia conjunta de diversos parámetros físico-químicos y biológicos en la composición de ácidos grasos en diferentes estadios de desarrollo de Artemia. La comparación de la abundancia relativa de los ácidos grasos entre ambas especies (A. persimilis/A. franciscana) revela que las diferencias interespecíficas son mayores que la variabilidad intraespecífica. / The nauplii of the branchiopod crustacean Artemia spp. are widely used as live food in aquaculture. Their nutritional value depends essentially on their fatty acid profile, which can be very variable. Many studies have investigated the composition of fatty acids of cysts and nauplii from different Artemia populations. However, little is known about the factors influencing this composition. The present study focuses on the investigation of factors that determine the fatty acid composition of cysts and biomasses of Artemia.The work was carried out using Artemia populations from Argentina as a model. Two Artemia species are found in Argentinean biotopes, A. franciscana, and the endemic A. persimilis. Original cysts from all Artemia populations exhibited fatty acid profiles typical of either marine - or freshwater - type, irrespective of the inland or coastal origin of their biotope. For the first time, a significant amount of eicosapentaenoic acid (20:5n-3) was reported in A. persimilis cyst samples.Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of a fragment of the 16S rRNA mitochondrial gene was used to investigate the genetic diversity and population structure of the Artemia populations from Argentina. The results showed a pattern similar to those of previous cytogenetic and morphological analyses, with the two Argentinean species appearing as highly divergent. A lack of correlation between RFLP patterns and the fatty acid profiles was found.Te effect of diet on the fatty acid composition of Artemia cysts was evaluated. The results revealed a high phenotypic influence of diet. However, some fatty acids, mainly saturated, did not reflect this influence, suggesting specific metabolic pathways.With lowering temperature the amount of highly unsaturated fatty acids in cysts and biomasses of Artemia gradually increases. Significant differences were found between species and among populations in response to temperature changes. Mesocosm studies revealed the influence of diverse physicochemical and biological parameters in the fatty acid profile of different developmental stages of Artemia. Higher percentages of unsaturation in the fatty acids were found in A. persimilis as compared to A. franciscana, demonstrating that a species-specific genotypic effect in the lipid composition should not be discarded.

El treball que he desenvolupat s'ha centrat en l'estudi dels efectes fisiològics de dos metalls pesants, el Cd i el i Ni, en plantes d'arròs durant les etapes inicials del seu desenvolupament. Els objectius concrets d'aquesta tesi són:- Caracteritzar l'efecte del Cd i del Ni sobre les membranes cel·lulars.- Estudiar l'acció del Cd i del Ni sobre el metabolisme energètic. - Determinar les variacions dels nivells d'etilé per efecte dels metalls i la seua possible modulació per altres hormones.Els resultats obtinguts en les nostres investigacions poden resumir-se en:· Tant la permeabilitat de les membranes com la difència de potencial transmembrana (Em) es veuen afectades per Cd, que afecta la component activa d'Em de forma transitòria. Pel contrari el Ni no provoca alteracions d'Em en arrels, ni es detecten augments de la permeabilitat a curt termini, però si en tiges, a llarg termini.· Ambdós metalls afecten dràsticament l'activitat fotosintètica de les plantes i a nivell de planta sencera, no es detecten canvis en l'activitat respiratòria. · El Cd no altera la taxa respiratòria de tiges ni d'arrels, quan es mesuren separadament, excepte a concentracions elevades.· El Ni provoca una clara inhibició de la respiració en les arrels, mentre que augmenta lleugerament la de les tiges. Aquest efecte indica un canvi en la distribució de l'energia que resulta de la respiració entre creixement i manteniment dels teixits. · el Cd i el Ni indueixen una disminució de la síntesi d'etilé. El GA3, però no l'ABA, interacciona amb l'efecte inhibitori dels metalls, i augmenta la producció d'etilé fins a valors semblants als dels controls.· Tots els efectes detectats, i per als dos metalls estudiats, poden ser revertits, al menys parcialment, per l'eliminació dels metalls del medi on creixen les plantes. / Some physiological responses of rice plants to two heavy metals, Cd and Ni, have been studied during the first stages of their development, with the following specific objectives:- Characterization of Cd and Ni effects on plasma membrane functionality.- Study of the effects of these heavy metals on energetic metabolism, which supplies the energy needed for membrane transport.- Evaluation of the changes induced by Cd and Ni in the production of ethylene, the hormone most directly related to variations in membrane stability under stress conditions. The possible interactions of these metals with other hormones have also been studied. The results obtained in these investigations indicate that:- Cd induces rapid and drastic effects on membrane permeability and transmembrane potential difference (Em). However, the effect is transient, possibly due to the existence of inducible detoxifying mechanisms. - Contrastingly, Ni treatments do not affect membrane permeability at the short term, but causes strong losses of K+ at the long term, which may be related with the reduced water content measured in Ni-treated plants.- Both metals affect drastically the photosynthetic performance, which is reflected in a strong decrease in plant growth. - At the whole plant level, respiration is not altered by any of these metals. However, a differential effect of Ni on roots and shoots is observed, indicating a change in the distribution of the energy between growth and maintenance of the tissues.- Both metals induce a decrease in ethylene production, even at metal concentrations which do not alter plant growth. - GA3, but not ABA, interacts with the inhibitory effect of the metals, causing an increase in ethylene production up to values similar to those of controls. - All the effects observed may be reverted, at least partially, by elimination of the metals from the external medium.

El ozono troposférico es el contaminante atmosférico más fitotóxico conocido. El ozono provoca estrés oxidativo en las plantas y sus concentraciones actuales causan importantes disminuciones del rendimiento agrícola en cultivos sensibles. El objetivo general de esta tesis doctoral es el estudio de los efectos de una exposición crónica a ozono durante todo el período de cultivo en plantas de patata (Solanum tuberosum L. cv. Agria). La metodología de cultivo empleada han sido las cámaras de techo abierto (OTC), realizando tres tratamientos: aire filtrado de ozono (CF), aire con concentraciones ambientales de ozono (NF) y aire ambiental enriquecido con ozono (NF+). El primer objetivo ha sido el estudio del efecto del ozono sobre el rendimiento agrícola: se ha encontrado que el tratamiento NF provoca una disminución de un 9-24 %, y el tratamiento NF+ una disminución de un 25-73 %; además existe una alta correlación entre la disminución del rendimiento agrícola y los índices de exposición acumulada a ozono AOT40 y AOT00. En segundo lugar se ha aplicado difenilamina y citrulina a cultivos en campo para evaluar su acción protectora frente al ozono ambiental. Con ambos compuestos químicos, especialmente con la citrulina, se ha encontrado un aumento en el rendimiento agrícola de las patatas comerciales; el mecanismo de acción de ambos agentes parece estar basado en la disminución del estrés oxidativo. El tercer objetivo ha consistido en el estudio de la respuesta del antioxidante glutatión a la exposición crónica a ozono. Como resultado, la concentración de GSSG y, en mayor proporción, la de GSH, han aumentado, de manera que las plantas aumentan la capacidad amortiguadora del glutatión frente al estrés oxidativo; una de las causas del aumento de la concentración de GSH es una mayor síntesis regulada por la expresión de la enzima γ-GCS. El cuarto objetivo ha sido la cuantificación de radicales libres formados por la exposición a ozono mediante espectroscopía ESR en banda X y banda Q. Se ha detectado una señal perteneciente a uno o varios radicales libres permanentes. Además, se ha desarrollado un método de análisis de imagen para cuantificar el área de hoja con síntomas visibles inducidos por ozono. Las técnicas empleadas han permitido encontrar una estrecha relación entre la intensidad de la señal del(de los) radical(es) libre(s) y el porcentaje de superficie foliar con síntomas visibles por ozono. Por último, se ha realizado el estudio de las alteraciones histológicas producidas por la exposición crónica a ozono, así como la detección histoquímica de las especies reactivas del oxígeno radical superóxido y peróxido de hidrógeno. El ozono provoca una degeneración de la lámina media y de la pared celular, además de una pérdida de turgencia de la vacuola, dando como resultado una pérdida de contacto entre las células y finalmente el colapso celular; las células más afectadas han sido las del parénquima lagunar próximas a los estomas. Se ha encontrado un taponamiento del floema debido a la acumulación de calosa, y una acumulación de almidón en las células dañadas del parénquima, fenómenos que podrían ser la principal causa de la disminución del rendimiento agrícola. El radical superóxido se ha detectado principalmente en el parénquima lagunar, concretamente en la pared y/o membrana celular y en membranas intracelulares como el tonoplasto, membrana de los cloroplastos y grana. El peróxido de hidrógeno se ha detectado principalmente en la pared celular, y en los peroxisomas, que se revelan como una fuente importante de esta especie reactiva del oxígeno en condiciones de estrés por ozono; se ha encontrado peróxido de hidrógeno de manera abundante en las paredes del floema, y se discute una posible relación con la acumulación de calosa. / Tropospheric ozone is considered the most phytotoxic air pollutant. The general aim of this thesis is to study the effects of a chronic ozone exposure during the entire growing season on potato plants (Solanum tuberosum L. cv. Agria). Plants were grown in open-top chambers (OTC), and treatments consisted of charcoal-filtered air (CF), ambient air (NF) and ambient air enriched with ozone (NF+). The first aim was to study the effects of ozone on crop yield: the result was a 9-24 % decrease, and a 25-73 % decrease in NF and NF+ treatments, respectively. A strong correlation was found between yield decrease and accumulated ozone exposure indexes AOT40 and AOT00. Secondly, diphenylamine and citrulline were applied to crops in field conditions to test their protective role against ambient ozone. Both chemical compounds, specially citrulline, caused a yield increase in commercial tubers; these compounds seemed to alleviate oxidative stress. Furthermore, glutathione response to chronic ozone exposure was studied. There was an increase in GSSG and GSH concentrations. An enhanced γ-GCS enzyme expression was observed, being a cause for the increase in GSH concentration. Another aim was the quantification of free radicals generated by ozone exposure employing X- and Q-band ESR spectroscopy. A signal belonging to one or several permanent free radicals was detected. Also, an image analysis method was developed to quantify leaf area exhibiting visible ozone symptoms. A strong relationship between free radical(s) signal intensity and percentage of visible ozone-induced damage was found. Finally, research into ozone stress effects on foliar histology was conducted. Ozone caused cell wall degeneration and loss of vacuolar turgence, resulting in the loss of contact between cells and cell collapse. Phloem was blocked by callose, and starch accumulated in injured cells of parenchyma. Superoxide radical was mainly detected in the spongy parenchyma, specifically in the cell wall and/or plasmalemma, tonoplast, chloroplast membrane and grana. Hydrogen peroxide was principally observed in the cell wall, and in peroxisomes, which became an important source of this reactive oxygen species under ozone stress; hydrogen peroxide was abundant in phloem walls, and a possible relationship with callose accumulation is discussed.

La hemostasia es el conjunto de procesos que controlan la fluidez de la sangre yla integridad del sistema vascular a través de cuatro grandes mecanismos, lacoagulación y anticoagulación controlan la formación del coágulo, mientras que lafibrinolisis y la antifibrinolisis controlan la eliminación del coágulo. La coagulaciónsanguínea requiere mecanismos de regulación que eviten su propagación y extensión deun modo incontrolado. De hecho, la trombosis es la principal causa de mortalidad ymorbilidad en países desarrollados.El sistema de la proteína C constituye uno de los principales mecanismos deanticoagulación, puesto que presenta actividades anticoagulantes, antiinflamatorias,antiapoptóticas, neuroprotectoras y profibrinolíticas.Para la activación de la proteína C se requiere el preciso ensamblaje de, almenos, cuatro proteínas sobre la superficie de la célula endotelial la trombina, latrombomodulina, la proteína C y el receptor endotelial de la proteína C (EPCR). Laproteína C así activada (APC) se une a su cofactor la proteína S e inactiva a loscofactores V activado y VIII activado frenando, por tanto, la cascada de la coagulación.Por ello, como hipótesis planteamos que cualquier cambio que altere laexpresión o el preciso ensamblaje de las proteínas que forman el complejo de activaciónde la proteína C, podría dar lugar a una reducción de la generación de APC. Además,dada la función anticoagulante del sistema de la proteína C, una reducción de lageneración de APC daría lugar a un incremento del riesgo trombótico.Hemos desarrollado un ensayo para la cuantificación de los niveles circulantesde APC que es rápido, fácil de llevar a cabo y con un límite de detección losuficientemente bajo como para detectar niveles muy reducidos de APC circulanteposiblemente presentes en algunas patologías trombóticas. Mediante este ensayo hemosdeterminado que un nivel reducido de APC es un factor de riesgo prevalente eindependiente de tromboembolismo venoso, el cual parece estar genéticamentedeterminado.1La determinación de la proteína C activada nos ha permitido seleccionarpacientes con tromboembolismo venoso y con niveles de proteína C activadapersistentemente bajos. En estos pacientes, hemos llevado a cabo la búsqueda de nuevasmutaciones en los genes que codifican para las proteínas del complejo de activación dela proteína C, identificando un número considerable de alteraciones en estos cuatrogenes.Al secuenciar el gen de la trombomodulina identificamos el polimorfismoC1418T que produce un cambio de Alanina a Valina en el aminoácido 455. Estepolimorfismo está asociado con niveles elevados de APC y con un menor riesgotrombótico.Al secuenciar el gen del EPCR identificamos diversas mutaciones. Elpolimorfismo A4600G que produce un cambio de Serina a Glicina en el aminoácido219, determina los niveles plasmáticos de EPCR soluble. A su vez, identificamos elpolimorfismo G4678C en la región 3´ no traducida del EPCR, el cual está asociado conniveles elevados de APC y con una disminución del riesgo trombótico, como hemoscomprobado también ocurre en los individuos portadores de la mutación factor VLeiden, uno de los principales factores de riesgo trombótico.Al secuenciar el gen de la proteína C identificamos la mutación G1435A la cualproduce un cambio de Glutámico a Lisina en el aminoácido 16, un residuo esencial paraque la proteína C ejerza su función anticoagulante. Esta mutación es privativa de unafamilia en la que los individuos con historia de trombosis son portadores de la mutación.La presencia de esta mutación produce una deficiencia de proteína C tipo II. / The protein C anticoagulant pathway plays a crucial role in the control ofthrombus formation. Protein C circulates in plasma as an inactive zymogen that isconverted to the active enzyme, activated protein C (APC) on the surface of endothelialcells by the thrombin-thrombomodulin complex. Another receptor, the endothelialprotein C receptor (EPCR) binds protein C on the endothelial cell surface and furtherenhances the rate of protein C activation. APC is then released from the complex, bindsprotein S and inhibits thrombin formation by inactivating coagulation factors Va andVIIIa.The protein C pathway also plays a significant role in inflammatory processes,and displays anti-apoptotic and neuroprotective activities.Therefore, alterations in the expression or in the assembly of these four proteinscould lead to a reduction in APC levels and to an increase in the thrombotic risk.We have developed a sensitive, rapid and reproducible assay for thedetermination of circulating APC levels. Using this assay, we have observed thatreduced APC levels constitute an independent prevalent risk for venous thrombosis,which seems to be hereditary.We have identified several mutations in the proteins that form the protein Cactivation complex.The C1418T (Ala455Val) polymorphism in the thrombomodulin gene isassociated with increased APC levels and decreased risk of venous thromboembolism.The A4600G (Ser219Gly) polymorphism in the EPCR gene determines thelevels of soluble EPCR.And the G4678C polymorphism located in the 3´ untranslated region of EPCR isassociated with increased levels of circulating APC and decreased risk of venousthrombosis, as we also observed in carriers of the factor V Leiden mutation, the mostcommon genetic risk factor for familial venous thrombosis.

Las poliaminas constituyen un grupo de moléculas de bajo peso molecular implicadas en una gran cantidad de procesos esenciales para las plantas. En su síntesis participa la S- Adenosil-L-metionina decarboxilasa1 (SAMDC1) que hemos sobreexpresado de forma constitutiva en Arabidopsis en este trabajo. Se ha profundizado en el estudio de los efectos de la sobreexpresión constitutiva del gen SAMDC1 en plantas de Arabidopsis. Se han seleccionado tres líneas sobreexpresoras, S3´, S9´y S15, que presentaban unos niveles de mRNA del orden de 3 veces superiores a las plantas control no transformadas. El análisis de los efectos de la sobreexpresión de SAMDC1 revela una serie de cambios en la germinación y desarrollo de las plantas transgénicas, alteraciones en el tejido vascular de tallos y hojas, así como alteraciones en los niveles de expresión de una gran cantidad de genes. En las plantas sobreexpresoras se encuentran inducidos genes participantes en la síntesis de poliaminas, en la respuesta al estrés abiótico y en la respuesta al estrés biótico. Asímismo, las plantas transgénicas presentan un mayor contenido en ácido Abscísico. Por el contrario, estas plantas presentan una menor producción de etileno y de su precursor ACC. Estos cambios van acompañados de una tolerancia por parte de las plantas sobreexpresoras de SAMDC1 al estrés abiótico causado por la salinidad, el déficit hídrico y el ozono. De forma similar, las plantas transgénicas presentan una tolerancia al estrés biótico causado por la infección por bacterias y hongos. Un análisis en profundidad revela la implicación de la espermina, una de las tres poliaminas más importantes, en los cambios observados. Así, en este trabajo se ha comprobado que el crecimiento de plantas Col0 en presencia de espermina provoca un descenso en los niveles de etileno y ACC similar a la presente en las plantas transgénicas. Asimismo se ha observado que el crecimiento en presencia de altas concentraciones de ACC provoca en Col0 un aumento en los niveles de etileno, pero no ocurre lo mismo en las plantas transgénicas. Se ha comprobado también que el crecimiento de Col0 en presencia de espermina provoca también un aumento en los niveles de ABA. De igual forma la aplicación de espermina provoca una inducción de la expresión de los genes de síntesis de ácido jasmónico, de señalización de etileno y de respuesta al estrés abiótico y biótico similares a los presentes en las líneas transgénicas. El crecimiento de las plantas transgénicas en presencia de MGBG, inhibidor de la SAMDC, da lugar a unos niveles de etileno, ACC, ABA y de los genes estudiados similares a los presentes en plantas Col0 no tratadas. Esto establece una relación entre esta poliamina, los niveles de ABA y etileno y las respuestas al estrés abiótico y biótico. La responsabilidad de la Spm en los cambios observados en las plantas sobreexpresoras de SAMDC1 se reveló al compararlas con plantas sobreexpresoras de ADC2, que acumulan putrescina. Mientras que en las plantas sobreexpresoras de ADC2 no se observan cambios importantes en otros genes de la síntesis de PAs, la sobreexpresión de SAMDC1 provoca un aumento en los niveles de SPMS y SPDS1. Otra diferencia se encuentra en el efecto de la sobreexpresión de SAMDC1 o ADC2 sobre los niveles de expresión de enzimas relacionados con la síntesis de ABA y ácido jasmónico, defensa frente a estrés abiótico o biótico o señalización por etileno. Así como la sobreexpresión de SAMDC1 da lugar a un claro aumento en la expresión de muchos enzimas relacionados con estos procesos, la sobreexpresión de ADC2 no provoca tales efectos. En consecuencia las plantas sobreexpresoras de ADC2 no presentan una mayor resistencia al estrés salino que las plantas silvestres. / Polyamines are a group of low molecular weight molecules implicated in a lot of different and essential proceses in plants like the promotion of plant growth and development by activating the synthesis of nucleic acids. Polyamine metabolism has long been known to be altered in plants responding to abiotic environmental stress and to undergo profound changes in plants interacting with fungal and viral pathogens. The most important polyamines are spermidine, spermine and putrescine. These small compounds are positively charged at physiological pH and are known to bind to negatively charged molecules, e.g. nucleic acids, acidic phospholipids and various types of proteins. The biosynthesis of polyamines in Arabidopsis thanliana is a well-known process in which S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) contitutes an important metabolic control point. This enzyme catalizes de decarboxylation of S-adenosylmethionine which is also an intermediate product in the synthesis of ethylene. Changes in SAMdC expression have been observed as a response to environmental factors. In this work we have studied the effects of the constitutive overexpression of SAMDC1 under the control of the CAMV-35S promoter in Arabidopsis thaliana plants. Results show that the transgenic lines show a direct increase in levels of spermine. Furthermore, these SAMDC1 overexpressing plant show an induction in the expression levels of a series of genes related to response during salt or drought stress and pathogen infection. There are as well, changes in the expression levels of genes involved in Abcisic acid (ABA) and jasmonic acid biosynthesis. These changes result in a higher tolerance against abiotic and biotic stresses, increased production of ABA, lower levels of ethylene biosynthesis and a series of estructural differences with Col 0 wildtype plants. Further studies in this work have established a direct relationship between the higher levels of espermine and the changes observed in the transgenic plants.

La ruta de la Proteína quinasa C en Saccharomyces cerevisiae desempeña funciones esenciales en el control de la integridad celular y además se ha sugerido que participa en la coordinación entre el crecimiento y la división celular. En este trabajo se ha estudiado el mecanismo molecular de regulación de la expresión génica mediada por la ruta PKC, tomando como modelo en gen FKS1 que codifica para la subunidad catalítica de la glucano sintasa. Se ha caracterizado que la secuencia mínima responsable de la regulación mediada por la ruta PKC en el gen FKS1 corresponde con una secuencia de unión del factor Rlm1. Además se ha detectado unión in vivo de Rlm1 al promotor del gen FKS1 y que dicha capacidad de unión no está regulada por la ruta PKC. Por otro lado, se ha detectado que la MAP quinasa Slt2 de la ruta PKC se une al DNA en la zona cercana al ATG del gen FKS1. Se detectó que la RNA polimerasa II se une tanto a la zona del ATG como al final del gen FKS1 con independencia de la función de la ruta PKC. Por otro lado, se ha observado una modificación post-traduccional de la proteína Paf1 (miembro del complejo Paf1C) dependiente de Slt2, consistente con una posible fosforilación de Paf1 por Slt2. Se observó que aunque la ruta no regula la capacidad de unión in vivo al gen FKS1 de Paf1 en la zona del ATG si parece controlar el desplazamiento de Paf1 a lo largo del gen FKS1. En esta tesis se ha realizado un estudio de expresión global de un mutante pkc1-8 termosensible, dicho estudio ha permitido identificar 65 genes cuya expresión se modifica significativamente al inactivar la función Pkc1. En este mismo sentido se han identificado proteínas asociadas a Pkc1 y Slt2 mediante la utilización del método TAP de purificación de proteínas. A destacar las proteínas Rpc34, Ssk22 y Apd1 que se detectaron asociadas a Pkc1. Y las proteínas Mot1, Sec31 y Kap123 asociadas a Slt2. Los estudios realizados han descubierto una relación de la carioferina Kap123 con la ruta PKC. Kap123 podría participar en la ruta PKC importando al núcleo a alguna de las proteínas downstream de la ruta PKC. Se ha detectado también una relación génica entre la ruta PKC y la ciclina Cln2, en la que la deleción del gen CLN2 suprime los defectos de crecimiento de los mutantes de la ruta PKC, posiblemente debido al retraso en el proceso de gemación que supone la inactivación de la ciclina Cln2. / In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the PKC pathway main function is maintaining the cell integrity, moreover it has been said that partipates in coordination between division and cell growth. In this work, we have studied the molecular mecanism that controls gene expression by the PKC pathway using the FKS1 gene (glucan sintase gene) as a model. We have identified that the minimun sequence in FKS1 responsible of the regulation of transcription mediated by PKC pathway corresponds with a Rlm1 binding sequence. Rlm1 binds in vivo to the FKS1 promoter and this binding is not dependent on PKC pathway. In other hand, it has been detected that MAPK Slt2 is bind to the FKS1 promoter near to the ATG. We have also detected the RNA pol II subunit Rpb1 binds to the FKS1 promoter near to the ATG and in the end of the coding region independently of the PKC function. We have also observed a Slt2 dependent post translationally modification (consistent with a phosphorilation) of Paf1. Moreover, the PKC pathway seems to regulate the Paf1 movement right across the gene FKS1. A global expression study using DNA arrays in a pkc1 mutant allow us to identified 65 genes whose expression is modified by inactivating PKC function. In the same way, we have identified by TAP purification several proteins associated with Pkc1 and Slt2. It´s worth mentioning, Rpc34, Ssk22 and Apd1interacting with Pkc1. And Mot1, Sec31 and Kap123 interacting with Slt2. We have uncover a relationship between karyopherin Kap123 and the PKC pathway. We propose that Kap123 could participate in PKC pathway importing into the nucleus some of the proteins dowstream of Slt2. In other way, we have detect a genetic interaction between PKC pathway and cyclin Cln2, where deletion of CLN2 gene supress the growth defects associated to PKC pathway mutants, probably because of a delay in the budding process caused by inactivating Cln2.

El aroma es una de las propiedades organolépticas más valorada para determinar lacalidad de un vino. Se caracteriza porque está determinado por cientos de compuestosvolátiles de diversa naturaleza química que se encuentra a concentraciones muy bajas .En términos enológicos el perfil aromático de un vino se clasifica en tres categoríasdenominadas, aroma primario, secundario y terciario. El aroma primario se componede sustancias que proceden directamente de la variedad de uva utilizada y de loscompuestos que se generan en el transcurso de la manipulación y acondicionamientodel mosto. El aroma secundario, es el que se atribuye a los compuestos generadosdurante el proceso de fermentación por el metabolismo de las levaduras vínicas. Elaroma terciario, está constituido por sustancias que se sintetizan como consecuencia delas reacciones enzimáticas y/o físico-químicas en el proceso de envejecimiento delvino. Pese a esta clasificación, el aroma genérico de fondo, se atribuyemayoritariamente, a compuestos aromáticos volátiles sintetizados por la levaduravínica S. cerevisiae a lo largo de la fermentación alcohólica. Los metabolitos secundariosmás relevantes en el aroma genérico de fondo son los ésteres volátiles con fraganciasaromáticas y sus correspondientes precursores alcohólicos cuya producción dependedel balance de actividades alcohol acetiltransferasa y éster hidrolasa. Las alcoholacetiltransferasas, codificadas por los genes ATF1 y ATF2, catalizan la síntesis deésteres volátiles a partir de un alcohol superior y acetil-CoA. La esterasa, codificadapor el gen IAH1, hidroliza los ésteres de acetato rindiendo acetato y el alcoholconstituyente.Dada la importancia que el metabolismo de la levadura S. cerevisiae ejerce en laproducción de compuestos volátiles responsables del aroma de fermentación,fundamentalmente ésteres de acetato y alcoholes, en este trabajo se han desarrolladodistintos tipos de estrategias moleculares basadas en técnicas de ingeniería metabólica.Todas ellas encaminadas a incrementar el aroma secundario originado por la levaduravínica en forma de ésteres de acetato y alcoholes superiores.En primer lugar se realizó un estudio de la implicación de las distintas actividades desíntesis y de degradación que contribuyen en la producción de volátiles. Dicho estudiose centró en el análisis cuantitativo de la acumulación de ésteres y alcoholes endistintos tipos de cepas mutantes que carecen de los genes ATF1, ATF2 e IAH1. Losdatos obtenidos muestran que la enzima codificada por el gen ATF1 participa de formamayoritaria y por este orden en la síntesis de acetato de isoamilo, acetato de isobutilo,acetato de 2-feniletilo. Además, indican que la proteína Atf2 también interviene en elproceso de síntesis, aunque su participación es cuantitativamente menor. Finalmente seconcluye que la proteína Iah1 interviene en la degradación de estos mismoscompuestos.Posteriormente, las estrategias de ingeniería metabólica desarrolladas fueron lassiguientes:1.- Sobreproducción de ésteres de acetato por sobreexpresión del gen ATF1bajo el control del promotor del gen glicolítico TDH3. Con esta estrategiade consiguió incrementar, del orden de 50 veces, la concentración de ésteresvolátiles en condiciones de vinificación.2.- Sobreproducción de volátiles por deleción de la éster hidrolasa Iah1. Eneste caso se consiguió duplicar la acumulación de dichos compuestos.3.-Sobreexpresión del gen que codifica la a-cetoisocaproato descarboxilasaimplicada en la conversión del a-cetoisocaproato en alcohol isoamílico. Conesta estrategia no se consiguió incrementar la cantidad del precursoralcohólico y/o éster de acetato acumulado.En conclusión, la estrategia más adecuada para incrementar y/o mejorar el aromasecundario en el vino es obtener una levadura vínica industrial genéticamentemodificada que contenga una expresión fuerte y constitutiva del gen ATF1. / Flavour is a wine's most important distinguishing characteristic that stem from acomplex, completely non-linear system of interactions among many hundreds ofcompounds. Wine flavour is classified according to the sources of the differentcompounds contributing to it. This include varietal flavour, flavour compoundsoriginating from the grapes, fermentative flavour, produced by yeast during alcoholicfermentation and post-fermentative flavour, compounds that appear during the ageingprocess through enzymatic or physicochemical actions. It is well known that duringfermentation processes, yeast cells produce a broad range of aroma-active substances,which greatly affect the complex flavour of wine. While these secondary metabolitesare often formed only in trace amounts, their concentrations determine the flavourprofile of these beverages. In the main secondary metabolites synthesised for S.cerevisiae are the volatile esters. Their are the product of an enzyme-catalyzedcondensation reaction between acetyl-CoA and a higher alcohol. Several differentenzymes are involved in formation of esters, which are encoded by genes ATF1 andATF2. Furthermore, they can be hydrolyzed by esterase like IAH1 gene product.Therefore, a balance of these two enzyme activities controls accumulation of volatileesters.The aims of this study are to develop several molecular strategies to construct wineyeast strain that improve accumulation of acetate esters through genetic engineering.The strategies develops were:1.- Construct disruptant strain that were lose ATF1, ATF2 and IAH1 gene,to resolve implication of gene product in volatile production.2.-Ester overproduction by regulated over expression of ATF1 genecontrolled TDH3 promoter gene and disruption IAH1 gene3.- Alcohols over production by over expression of THI3 gene.In conclusion, this study has demonstrated that in the main strategy for improvefermentative flavour in wine is construct a genetically modified wine yeast which haveheave and constitutive over expression of ATF1 gene

En la cromatina de los organismos eucariotas el DNA se organiza alrededor de octámeros de histonas, dando lugar a la estructura nucleosomal. Las histonas sufren una serie de modificaciones postraduccionales entre las que se encuentra la acetilación de residuos de lisina, situados en los extremos N-terminales de estas proteínas. Esta modificación reversible, catalizada in vivo por las histona desacetilasas (HD) y las histona acetiltransferasas (HAT), ha sido implicada durante muchos años en la regulación de diversos procesos celulares de gran importancia. Recientemente, el papel de la acetilación de histonas en la regulación de la transcripción ha cobrado gran importancia con el descubrimiento de que proteínas con actividad HAT y HD son reguladores transcripcionales. En la levadura Saccharomyces cerevisiae se han identificado los genes que codifican para cuatro proteínas con actividad HAT, GCN5, HAT1, ESA1 y TAF130. Mediante métodos bioquímicos se había detectado previamente la existencia de al menos cuatro actividades histona acetiltransferasa diferentes, HAT A1, HAT A2, HAT A3 y HAT B. El análisis bioquímico de cepas de levadura mutantes en estos genes, y en otros genes que codifican proteínas relacionadas funcionalmente con estas HATs clonadas, realizado en este trabajo, ha permitido caracterizar estos enzimas previamente descritos en cuanto a su composición en proteínas, su localización subcelular y su especificidad de sustrato. Además el estudio bioquímico de cepas de levadura mutantes ha llevado a la identificación de una nueva actividad histona acetiltransferasa no descrita hasta el momento, el enzima denominado HAT A4. / In eukaryotes DNA is packaged with histones into chromatin. One of the most important posttranslational modifications of the N-terminal tails of histones is the reversible acetylation of lysine residues. Acetylation has been correlated with the regulation of many important cellular processes such us chromatin assembly, DNA replication and gene transcription. Histone acetylation is maintained in vivo by two different enzymatic activities, namely histone acetyltransferases (HAT) and histone deacetylases (HD). The relationship between chromatin acetylation and gene transcription has become very clear since several proteins known to be transcriptional regulators have been reported to posses HAT or HD activity.In the yeast Saccharomyces cerevisiae four proteins with HAT activity have been reported, the products of the genes HAT1, GCN5, ESA1 and TAF130.By biochemical methods it had been previously reported the presence in yeast of at least four HAT activities, HAT A1, HAT A2, HAT A3 and HAT B. In this work, the biochemical analyses of the HAT activity present in yeast strains bearing mutations on HAT genes, or genes coding for proteins related to HATs, have allowed the characterization of these enzymatic activities previously described in terms of protein composition, subcellular location and substrate specificity. The biochemical study of yeast mutants has also lead to the identification of a new yeast HAT activity, HAT A4 enzyme.

La propagación de una infección viral en plantas está mediada por unasproteínas codificadas por el propio virus denominadas proteínas de movimiento(MP). Estas proteínas unen el genoma viral de forma cooperativa y sinespecificidad de secuencia, formando unos complejos RNA-MP, que se asocian,en la mayoría de casos, al retículo endoplasmático (RE) para ser transportadosmuy posiblemente a través del citoesqueleto hacia los plasmodesmos, canalesmembranosos que interconectan las células en plantas. Una vez estos complejosalcanzan los plasmodesmos, el RNA viral es translocado a las célulasadyacentes a través de un mecanismo todavía desconocido.A pesar de la variabilidad entre las distintas familias virales en elnúmero y tamaño de este tipo de proteínas, se ha descrito que muchas de estasMPs interaccionan con las membranas celulares. Sin embargo, la naturaleza deesta interacción y los mecanismos que subyacen a este fenómeno no se hanexplorado todavía. Así pues, el objetivo central de la presente tesis se ha basadoen el estudio y caracterización de la asociación de estas proteínas con lamembrana del RE. El virus objeto de estudio ha sido el Virus del Moteado delClavel, que codifica dos MPs, p7, una proteína soluble capaz de unir el genomaviral y p9, que presenta dos regiones hidrofóbicas susceptibles de interaccionarcon las membranas celulares.En primer lugar, mediante experimentos de transcripción/traducción invitro se ha demostrado que p9 es una proteína integral de membrana quecontiene dos fragmentos transmembrana y adopta una orientación N-/Cterminalcitoplasmática.En segundo lugar, se ha caracterizado el mecanismo a través del cual p9alcanza las membranas celulares. Los resultados obtenidos demuestran que lainserción de p9 tiene lugar de forma co-traduccional y es dependiente de SRP,un complejo ribonucleoproteico que, en general, participa en eldireccionamiento de proteínas a la membrana del RE. Además, el virus explotala propia maquinaria celular responsable de la integración de las proteínas demembrana celulares. Así, el complejo Sec61 y la proteína TRAM participan en elproceso de inserción de p9. Entre los resultados obtenidos cabe destacar que (i)los segmentos transmembrana de este virus se integran en la membrana através de un mecanismo secuencial y ordenado desde Sec61a a TRAM; y (ii) laproteína TRAM media la integración de esta proteína viral desempeñando unaposible función de reclutamiento de segmentos transmembrana antes de queéstos particionen conjuntamente a la bicapa lipídica, una vez completada latraducción de la proteína.Finalmente, se ha realizado un estudio de los determinantes topológicosde la proteína que determinan su orientación en la membrana. Se ha exploradola contribución de toda una serie de parámetros, que se han establecido comodeterminantes en el caso de proteínas de membrana de procariotas o eucariotas.Entre estos factores se encuentran la presencia de residuos cargados en lasecuencia de la proteína, la hidrofobicidad de los fragmentos transmembrana, lalongitud de dominios extramembranosos y/o la presencia de residuosaromáticos en las regiones flanqueantes de los propios segmentostransmembrana. Los resultados demuestran que la proteína viral p9 presenta lainformación topológica distribuida a lo largo de la secuencia de aminoácidos dela proteína. Esta estrategia impediría que la posible aparición de una mutaciónno conservativa en el gen de la proteína, proceso muy habitual durante lareplicación de los genomas virales, alterara la orientación de la proteína en lamembrana y en definitiva, comprometiese su función biológica. / The cell-to-cell movement of plant virus is assisted by the viral so-called"movement proteins" (MP). Functions assigned to these proteins include nucleicacid binding, targeting to the endoplasmic reticulum (ER), and modification of the sizeexclusion limit of the plasmodesmata, a membranous channel that connectadjacent cells. Although the number and size of these proteins vary from viralfamilies it has been described that many of the viral MPs interact with the membranesbut the nature of this interaction is not well defined yet. Therefore, the main goal ofthis study is the characterization of MPs interaction to the ER membranes. TheCarnation Mottle Virus has been used as an experimental model. This virusencodes two MPs, a cytoplasmic soluble protein of 7 kDa, p7, which binds viralgenome, and a hydrophobic protein of 9 kDa, p9, with two putativetransmembrane segments.Firstly, it has been demonstrated that p9 is, in fact, an integral membraneprotein containing two transmembrane segments and facing both N- and Cterminusto the cytosol.Secondly, it has been dissected the cellular pathway followed by p9 toreach the host membranes. This viral protein is targeted to ER membrane by thesignal recognition particle, and the translocon components Sec61a and TRAMmediate p9 integration into the membrane. The unexpected results obtained inthese studies are the following: (i) viral TM fragments integrate into the lipidbilayer through a sequentially ordered contact to Sec61a and TRAM; and (ii)TRAM mediates viral protein integration by collecting TM domains, which areonly partitioned into the lipid bilayer after translation termination.Finally, it has been studied the topological determinants of p9 thatgovern the proper orientation of this viral membrane protein. It has beenanalysed contribution of different parameters such are distribution of positiveresidues along the protein sequence, hydrophobicity of transmembranesegments, length of extramembranous domains, and presence of aromaticresidues flanking transmembrane domains. The results demonstrate thattopological information of p9 is distributed along the amino acid sequence. Thisstrategy could avoid any alteration of native topology of p9 due to a randommutation in the protein gene, a common process during viral genomereplication.

El ciclo celular en mamíferos está regulado positivamente por holoenzimas formadas por una subunidad reguladora (denominada ciclina) y quinasas dependientes de ciclinas (CDK). Estos complejos ciclina/CDK se activan e inhiben secuencialmente en las diferentes fases del ciclo celular. Las proteínas inhibidoras de las CDKs, CKIs, constituyen una familia importante de supresores de cecimiento celular. La proteína p27Kip1 es una CKI de la familia CIP/KIP que actúa como inhibidor universal de CDKs. Sus niveles son elevados en células en reposo y disminuyen durante la entrada en el ciclo celular inducida por mitógenos. La fosforilación de p27Kip1 en treonina 187 (T187) es un mecanismo importante que regula los niveles de p27Kip1.. La proteína supresora de tumores p53, que puede ser activada en respuesta a determinados insultos celulares, también modula el número de células, regulando negativamente el ciclo celular e induciendo apoptosis. Diversos modelos animales de arteriosclerosis, denudación mecánica y arteriosclerosis por transplante han demostrado que p27Kip1 y p53 protegen frente al desarrollo de lesiones vasculares obstructivas, cuya formación depende en parte de una respuesta hiperproliferativa de células de la pared arterial, principalmente células musculares lisas vasculares (CMLVs) y macrógafos. El trabajo de esta Tesis Doctoral se ha centrado en la elucidación de mecanismos moleculares implicados en el control de la proliferación celular, con especial énfasis en CMLVs en cultivo y modelos animales de aterosclerosis y daño vascular mecánico. Se han perseguido los siguientes objetivos: 1) Estudiar el el mecanismo molecular por el que los agentes citostáticos PCA-4230 y STI571 inhiben la proliferación de CMLVs y células cancerosas (Trabajo 1 y Trabajo 2). 2) Estudiar la importancia de la fosforilación de p27Kip1 en la T187 en la progresión del ateroma inducido por dieta rica en grasa y colesterol en ratones deficientes en apolipoproteína E (ApoE-KO) (Trabajo 3) 3) Analizar el papel de la ganancia de función de p53 en la prevención del desarrollo de la placa de ateroma en un modelo de aterosclerosis experimental así como en la protección frente al desarrollo de la neoíntima tras daño mecánico en la arteria femoral de ratones apoE-KO (Trabajo 4). Los resultados de los trabajos 1 y 2 demuestran que la inhibición de E2F y la represión transcripcional de la ciclina A son parte del mecanismo molecular por el que PCA-4230 y STI571 inhiben la proliferación de CMLVs. Además, STI571 también inhibe la activación de las ERK1/2, mientras que la activación constitutiva de estas MAPKs en CMLVs de arteria femoral previene tanto el efecto citostático como su capacidad de inhibir la transcripción del promotor de la ciclina A del STI571. Los resultados del trabajo 3 en el modelo de arteriosclerosis experimental inducida por dieta muestran idéntico tamaño de ateroma, celularidad y tasas de proliferación y apoptosis cuando se comparan ratones apoE-KO con p27T187A-apoE-KO. Además nuestros resultados demuestran que la fosforilación de p27Kip1 en T187 no está implicada en el control de la expresión de p27 en la aorta. Estos resultados contrastan con los de estudios previos de otros investigadores que han implicado este evento de fosforilación con la regulación del ciclo celular y expresión de la proteína p27Kip1 en otros tipos celulares. Por tanto, la relevancia de la fosforilación de p27Kip1 en la T187 parece depender del tipo celular, tejidos y condiciones patofisiológicas, tanto in vitro como in vivo. Los resultados del manuscrito 4 mostraron que la ganancia de fucnión de p53 puede reducir la hiperplasia de la neoíntima tras daño mecánico, pero no tiene efecto sobre la aterosclerosis, por lo que pone de manifiesto importantes diferencias en el papel de p53 en diferentes modelos de daño vascular que pueden tener importantes implicaciones para futuras aplicaciones terapéuticas. / The mammalian cell cycle is positively regulated by holoenzymes constituted by a regulatory subunit (called cyclin) and a cyclin-dependent kinase (CDK). Cyclin/CDK complexes are sequentally activated and inhibited in different phases of the cell cycle. CDK inhibitory proteins (CKIs) constitute an important family of growth suppressors. The p27Kip1 protein is a CKI that belongs to the CIP/KIP family which acts as an universal CDK inhibitor. Its levels are elevated in quiescent cells and decreased during mitogen-dependent entry into the cell cycle. Phosphorylation of p27Kip1 at threonine 187 (T187) is an important mechanism by which p27Kip1 levels are regulated. The tumour suppressor protein p53, which can be activated in response to several cellular insults, also modulates cell number by negatively regulating the cell cycle and inducing apoptosis. Several animal models of atherosclerois, mechanical injury and transplant-atherosclerosis have demonstrated that p27Kip1 and p53 protect against vascular obstructive lesion development, which depends in part on a hiperproliferative response of arterial wall cells, mainly smooth muscle cells (SMCs) and macrophages. The work carried out in this Doctoral Thesis has been focused in the elucidaton of molecular mechanisms implicated in the control of cellular proliferation, with especial interest in cultured SMCs and murine models of atherosclerosis and mechanical injury of the vessel wall. The following specific objectives were pursued: 1) To study the molecular mechanism by which the cytostatic agents PCA-4230 and STI571 inhibit SMC and cancer cell proliferation (Paper 1 and Paper 2). 2) To investigate whether p27Kip1 phosphorylation on T187 regulates atheroma progression in apolipoptotein E-null mice (apoE-KO) fed a high-fat and cholesterol-rich diet (Paper 3) 3) To analyze in apoE-KO mice the consequences of hightening p53 function on the development of aortic atherosclerosis and neointimal lesions induced by mechanical injury of the femoral artery (Manuscript 4). Results from paper 1 and paper 2 demostrated that E2F inhibition and transcriptional repression of cyclin A contribute to PCA-4230- and STI571-dependent SMC growth arrest. STI571 also inhibited ERK1/2 activation, whereas forced activation of these MAPKs in femoral artery SMCs impaired STI571-dependent inhibition of both cyclin A promoter activity and SMC proliferation. Results from paper 3 in the experimental model of diet-induced atherosclerosis showed identical atheroma size, lesion cellularity, proliferation, and apoptotic rates when comparing apoE-KO and p27T187A-apoE-KO mice. Moreover, our findings demonstrate that phosphorylation of p27Kip1 on T187 was not implicated in the control of aortic p27 expression. These findings are in contrast with previous studies by other investigators that have implicated this phosphorylation event on cell cycle regulation and p27Kip1 protein expression in other cell types. Thus, the relevance of p27Kip1 phosphorylation on T187 level seems to depend on the cell type and tissues and on pathologic conditions both in vitro and in vivo. Results from manuscript 4 revealed that gain of p53 function can reduce neointimal hyperplasia after mechanical injury, but has no effect on atherosclerosis, thus highlighting profound differences in the role of p53 in different models of vascular injury that may have important implications for therapeutic purposes.