En el presente trabajo se ha realizado un estudio de los epizoítos y endoparásitos de la tortuga boba (Caretta caretta) en el Mediterráneo occidental. En el apartado de epizoítos, se ha encontrado 39 taxones pertenecientes a los filos Cnidaria, Annelida, Crustacea, Mollusca y Ectoprocta. El hallazgo de algunas de estas especies suscita cierto interés por ser de nueva aparición en el Mediterráneo o por constituir nuevos registros como epizoítos de tortugas marinas en el Mediterráneo o a nivel mundial. Se halló un copépodo harpacticoide perteneciente a la familia Balaenophilidae que muestra rasgos morfométricas propios de una nueva especie, denominada aquí, por el momento, Balaenophilus sp. Asimismo, se ha redescrito el copépodo especialista de C. caretta Balaenophilus umigamecolus a partir de ejemplares procedentes de Japón, tras hallarse nuevos caracteres y corregirse algunos otros respecto a la descripción original. Además, se ha estudiado el hábitat y la alimentación de los copépodos del género Balaenophilus para averiguar la asociación existente con sus hospedadores: B. unisetus, especialista de cetáceos misticetos, y Balaenophilus sp., la especie encontrada por nosotros en el Mediterráneo occidental. El contenido digestivo y el estudio histopatológico de lesiones asociadas a Balaenophilus sp., sugiere que ambas especies se alimentan de tejido del hospedador, compuesto en su mayor parte por queratina. Su asociación exclusiva con ballenas y tortugas marinas podría deberse a su habilidad para explotar este recurso, escaso en el medio marino. Asimismo, se ha realizado por primera vez un estudio cuantificado de algunos determinantes de la diversidad de epizoítos y se ha intentado cuantificar el efecto de la metodología del muestreo sobre los resultados. El presente estudio muestra que la comunidad potencial de epizoítos de cualquier individuo de C. caretta en el Mediterráneo occidental está compuesta por un grupo de especialistas y un conjunto mas variable de generalistas de sustratos flotantes. A diferencia de otros estudios, el análisis sobre las interacciones bióticas de colonización muestra asociaciones globales positivas en especialistas y neutras en las especies no especialistas. No hemos hallado relaciones de exclusión entre especies. La presencia de algas del género Polysiphonia determina la presencia de un núcleo de 3 especialistas frecuentes, Caprella andreae, Hyale grimaldii y Hexapleomera robusta. También se ha confirmado la relación positiva entre la talla de las tortugas y el número de especies de epizoitos. Se han hallado 10 especies de helmintos, todos en el tracto digestivo: 8 trematodos digeneos (Enodiotrema megachondrus, Calycodes anthos, Hemiuroidea spp., Pachypsolus irroratus, Rhytidodes gelatinosus, Orchidasma amphiorchis, Plesiochorus cymbiformis, Pleurogonius trigonocephalus) y 2 nematodos (Kathlania leptura y Anisakis sp. tipo I). Todos ellos son especialistas de tortugas marinas excepto el digeneo Hemiuroidea spp. y el nematodo Anisakis sp. tipo I, considerados accidentales. El estudio de la diversidad de las comunidades helmínticas gastrointestinales de C. caretta revela que éstas constituyen un sistema aislado para el intercambio de parásitos con otros vertebrados marinos. En el Mediterráneo occidental la tortuga boba debe "sostener" su fauna de parásitos especialistas puesto que tampoco los intercambia con otras especies de tortugas marinas. De hecho, las infracomunidades están compuestas por especialistas con prevalencias muy bajas. Esto podría explicarse por el carácter ectotérmico de las tortugas, su gran vagilidad y su amplia dieta. El análisis comparativo de la composición y estructura de las comunidades helmínticas de dos grupos de tortugas de distinto origen (decomisadas y varadas) no reveló diferencias, a pesar de que su dieta sí mostraba diferencias significativas, al menos en dos grupos de presas de gran importancia numérica, los tunicados pelágicos y los teleósteos. Se sugiere que ello se debe a que los digeneos especialistas de las tortugas bobas utilizan gasterópodos y/o bivalvos como hospedadores intermediarios. / This study focussed on the epibionts and endoparasitic fauna in the Loggerhead turtle (Caretta carretta) in the Western Mediterranean.39 taxons belonging 5 epizoite phyla were found. Some of these findings are of special interest since these species have never recorded in the Mediterranean or as epizoites of marine turtles.A comparative morphometric study between a harpacticoid copepod from our samples and Balaenophilus umigamecolus from Japan revealed differences indicative for a new species. Also, an updated description of B. umigamecolus, first described in Japan, was made.Also, a study was carried out in order to find out the type of association between the species of genus Balaenophilus and their hosts, suggesting that these species feed on host tissue, formed mainly of keratin.At the same time, a quantitative study of some limiting factors of the epizoites diversity in C. caretta was carried out, attempting to quantify the effect of the sampling methodology on the results. Our study shows that the potential community of epizoites of individuals of C. caretta in the Western Mediterranean is composed by a group of specialists and a group of non specific fouling species. In contrast to other studies, positive associations were found between the biotic colonization interactions in specialists and neutral associations in the case of non specialist. We did not find exclusive interactions between species. Positive relation between turtle size and season, with number of species of epizoites, was detected. A total of 10 species of helminths were found, 8 digenean and 2 nematodes, all of them in the digestive tract. Except Hemiuroidea spp. and Anisakis sp., both accidental, all species are marine turtle specialists. The gastrointestinal helminth infracommunities of C. caretta are very depauperate, being formed by species that appear in low prevalence, despite their specialist status. The comparative analysis of composition and structure of helminth communities of turtles from two different origins of the Western Mediterranean did not reveal differences, although their diet did show significant differences. It is suggested that this pattern is possibly explained because sea turtle specialist digeneans use gastropods and/or bivalves as intermediate hosts.

Esta tesis describe la situación del control biológico del piojo rojo de California, Aonidiella aurantii (Maskell) (Hemiptera: Diaspididae), por parasitoides en la Comunidad ValencianaEl piojo rojo de California es una de las plagas más importantes de cítricos en España. Esta plaga, a pesar de todos los tratamientos químicos que se realizan para su control, se encuentra por encima del umbral económico de daños.En este trabajo se constata, tras un muestreo realizado a lo largo de un año, que Aphytis chrysomphali (Mercet) (Hymenoptera; Aphelinidae) es el parasitoide mayoritario de esta cochinilla en la Comunidad Valenciana, a pesar de todas las sueltas realizadas desde los años 70 de la especie Aphytis melinus DeBach, parasitoide más eficaz en otros países. Junto a estas dos especies se ha verificado el establecimiento de Aphytis lingnanensis Compere en Castellón, tras repetidas sueltas, así como se ha descrito la presencia de dos nuevas especies de parasitoides sobre A. aurantii: Aphytis hispanicus (Mercet), parasitoide habitual de Parlatoria pergandii (Comstock) (Hem.; Diaspidadae) pero no de A. aurantii en España; y una especie que podría tratarse de un nuevo taxón para la ciencia y que hasta el momento de su próxima descripción se ha denominado Aphytis sp. grupo lingnanensis. De esta especie destacan como características principales la pigmentación casi absoluta de la pupa (fundamentalmente cabeza y tórax), la exuvia también oscura y la crénula solapada en el adulto. Junto a este grupo de ectoparasitoides, también se ha realizado la introducción de dos nuevos endoparasitoides del piojo rojo de California en la península Ibérica, dentro de un programa de control biológico clásico: Comperiella bifasciata (Howard) (Hym.; Encyrtidae) y Encarsia perniciosi (Tower) (Hym.; Aphelindae). Sólo se ha establecido la segunda especie en Castellón, tras ser transferida su cría al insectario de Sanidad Vegetal de Almazora (Castellón) y en colaboración con la unidad de entomología del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. Durante el periodo de estudio también se ha localizado a Comperiella lemniscata Compere y Annecke (Hym.; Encyrtidae), nueva especie de endoparasitoide de Chrysomphalus dictyospermi (Morgan) (Hem.; Diaspididae) en España.Se ha verificado que A. chrysomphali en campo parasita fundamentalmente cochinillas macho, lo cual --y tal y como se demuestra en la tesis-- afecta negativamente al tamaño del parasitoide, a su longevidad y fecundidad. Sin embargo, en condiciones de laboratorio, esta especie prefiere un hospedador de mayor tamaño como la hembra joven, y por tanto la elección en campo de un hospedador de menor calidad obedece a cuestiones de tipo ecológico. Entre estas variables, podrían ser determinantes aspectos como la estructura de la población de la cochinilla en campo donde predominan estados inmaduros, hecho que a su vez podría ser responsable de la baja densidad de la población de A. melinus que requiere estados más avanzados para su correcto funcionamiento.Por otro lado, se ha observado que A. chrysomphali está infectada por la bacteria endosimbionte Wolbachia. En este trabajo se demuestra como esta bacteria en A. chrysomphali induce la partenogénesis telitoca, de tal modo que si se elimina la bacteria mediante tratamientos antibióticos se revierte el porcentaje de sexos hacia la producción de una descendencia formada exclusivamente por machos. Además, a medida que disminuye la densidad de la bacteria en los progenitores, su fecundidad, y la supervivencia de los estados inmaduros, se ve reducida. Por otro lado, los machos obtenidos presentan un comportamiento de cópula normal a diferencia de las hembras, infectadas o curadas, que no se muestran receptivas e impiden la cópula, concluyendo que la reproducción partenogenética telitoca exhibida por la hembra es de tipo irreversible.

The present study carried out a detailed assessment of the metazoan parasite fauna in Boops boops (Sparidae) along the Spanish coasts off the Western Mediterranean and North-East Atlantic, which provided taxonomically consistent dataset comprising three levels of parasite community organisation that allowed questions regarding the structure of parasite communities to be addressed.The diversity of the parasite fauna of B. boops appeared to be higher than previously thought, as evidenced by the description of one new species, Wardula bartolii Pérez-del-Olmo et al., 2006 and the recovery of 53 parasite species (25 new host records). The complete checklist of parasites of this host throughout its distributional range comprises 78 species and 365 host-parasite-area records. A group of nine species with a wide geographical distribution was identified as the core of the parasite fauna of B. boops. The regional parasite fauna of B. boops was richest in the North-East Atlantic. There was a clear separation of the North-East Atlantic and Mediterranean local faunas, with a 'transition' location occupying an intermediate position. Local parasite faunas were generally diverse. There was a high representation of parasites with complex life-cycles, transmitted via food ingestion, mostly trematodes. The phylogenetic influence on the parasite communities in B. boops is rather weak, since generalist parasites comprised a considerable part of communities. The species of the core parasite fauna of B. boops were already present in juvenile fish, whereas all species added to communities in larger fish were rare/accidental. The observed sequence of species appearance and persistence supported the hypothesis that species with wide geographical distributions appear in the fish population earlier than rare/stochastic species. Parasite communities were rich and abundant from an early age. Six species of the core parasite fauna of B. boops were identified as key parasites in developing communities since they persisted as common in all size cohorts and represented the majority of the individuals. A nested subset pattern was found which could not be completely attributed to either accumulation over time or segregation of the parasite species among different host cohorts. Nestedness was strongly related to the differential species abundance, suggesting that passive sampling could be the mechanism leading to this non-random structure.The data revealed that the geographical distance and the region affect the species composition and structure of parasite faunas and component communities in B. boops. The distance between localities/regions contributed significantly to the decay of the similarity estimated from parasite abundance at the infracommunity level. The structured spatial patterns were consistent in time but not across seasons. The spatial synchrony observed was solely due to the assemblage of the 'core' species, supporting the hypothesis that widespread species would be strongly associated with patterns of variation in environmental conditions. The interspecific abundance-distribution patterns were recognized as the most important for the distance-decay relationship of similarity in this system due to the strong correlations observed at all scales of analysis.The comparative analyses revealed a notable alteration of parasite abundance patterns and dramatic changes in community richness, abundance and structure of parasite communities in B. boops studied after the Prestige oil-spill. A directional trend in parasite community succession was detected. However, the differences were still large indicating that shifting pollution baselines probably affect community recovery.The elevated levels of monoxenous infections could indicate that changes in immune parameters of fish. The increase of heteroxenous may have reflected an enhancement of the populations of the mollusc and copepod hosts due to organic enrichment following the oil-spill. Focusing on higher taxonomic/functional levels and the use of multivariate statistical approach have proved to be very useful in studying the response of parasite communities to pollution. / En la presente tesis doctoral se realizó un estudio exhaustivo de los metazoos parásitos de la boga, Boops boops (Sparidae) en la costa Mediterránea y Atlántica española. La diversidad parásita fue mucho mayor de lo que previamente se pensaba, como se evidenció en la descripción de una nueva especie y la presencia de 53 especies (incluyendo 25 nuevos registros). Se encontró regularmente un grupo de nueve especies de amplia distribución, que fueron considerados el núcleo de la parasitofauna de B. boops. Las faunas parásitas locales resultaron ser diversas y caracterizadas por una gran representación de parásitos generalistas y con ciclos vitales complejos. La secuencia de aparición y persistencia observada en el desarrollo de las comunidades parásitas apoyó la hipótesis de que las especies con distribución geográfica amplia aparecen en las poblaciones de peces antes que las raras y estocásticas. Las comunidades parásitas de B. boops fueron ricas y abundantes desde una edad temprana. Se detectó una estructura anidada fuertemente relacionada con una abundancia diferencial de las especies, sugiriendo que el muestreo pasivo de parásitos del hospedador podría ser el mecanismo responsable de esta estructura no-aleatoria. Tanto la distancia geográfica como la región de origen afectaron la composición de especies y la estructura de las faunas parásitas y comunidades componentes. El patrón de estructura espacial fue consistente en el tiempo pero no entre estaciones. La relación abundancia-distribución interespecífica fue el aspecto más importante en el declive de la similitud con la distancia.El análisis comparativo de las muestras de localidades afectadas por el vertido del petrolero "Prestige reveló un cambio drástico en la riqueza, abundancia y estructura de las comunidades parásitas, así como una notable alteración de los patrones de abundancia. Se detectó una tendencia direccional en la sucesión de las comunidades parásitas tras el vertido. Sin embargo, las diferencias siguen siendo acusadas, lo que podría indicar un desplazamiento de los niveles base que estaría afectando la recuperación de las comunidades bentónicas y parásitas tras el vertido. Tanto el enfoque basado en niveles taxonómicos y funcionales superiores como la aproximación mediante análisis estadísticos multivariantes, resultaron ser muy efectivos para este tipo de estudios.

En el presente proyecto se estudió el efecto de dos drogas adictivas, el tolueno y la cocaína, sobre la neurogénesis hipocámpica. Los experimentos diseñados para ambas drogas, abordaron el estudio de la neurogénesis, a través de la medida de proliferación, supervivencia, diferenciación y migración. Además se analizó el efecto ultraestructural que ambas drogas causan sobre el giro dentado. De forma más exhaustiva, se estudió el efecto producido por una administración crónica del tolueno, durante el desarrollo del animal. Por último, se estudiaron los efectos de este tratamiento sobre la memoria y el aprendizaje. En los experimentos con cocaína, se estudió el efecto sobre la proliferación, supervivencia y maduración, tras una exposición a corto plazo (8 días) y largo plazo (24 días) a la cocaína. Para ello, se realizó un experimento de proliferación, en el que se determinó que tanto a los 8 días como a los 24 días de tratamiento, se producía una reducción de la tasa de proliferación celular. En el segundo experimento, se determinó que la exposición crónica a la cocaína no alteraba la supervivencia de las nuevas células generadas. En el tercer experimento, se observó que el tratamiento con cocaína no afectaba la amplitud de las arborizaciones dendríticas, ni modificaba el desarrollo neuronal. Mediante el uso del microscopio electrónico, se observó que no existían cambios en las diferentes características analizadas, relativas a la ultraestructura de los botones sinápticos de la proyección de las fibras musgosas del CA3 provenientes del giro dentado hipocámpico. Los experimentos con tolueno se realizaron bajo dos protocolos de administración diferentes. En el primero, los animales inhalaron tolueno durante 24 días, mientras que en el segundo se estudió el efecto de una exposición crónica al tolueno durante 72 días y los efectos en sus crías, que fueron expuestas al tolueno durante su gestación y en la etapa postnatal temprana mediante la leche materna. De estos experimentos con tolueno, se pudo concluir que el solvente induce estrés oxidativo en el cerebro del animal, que a su vez produce un aumento de la muerte celular, y como respuesta, se produce un aumento de la supervivencia celular, de la maduración, una activación de la microglía, y una astrogliosis reactiva. Además, el análisis de la ultraestructura del giro dentado de los animales expuestos al tolueno, mostró la desorganización de la capa granular, la modificación de la morfología de las células granulares, y variaciones en su tamaño. Aunque no se encontraron diferencias en los nichos neurogénicos entre animales control y los tratados con tolueno. Como complemento a los análisis hechos, se realizaron estudios de conducta, para el experimento de exposición al tolueno durante 72 días. Estos estudios mostraron que no se producía una hiperactivación en la actividad locomotora, tanto de las madres como de las crías expuestas al tolueno. Además, se realizaron pruebas de reconocimiento de lugar y de objetos, que mostraron resultados diferentes para las madres y las crías. Las ratas madres, expuestas al tolueno durante su etapa adulta,no mostraron diferencias estadísticamente significativas, por lo que se puede concluir que no vieron afectadas sus capacidades cognitivas ni de percepción. En cambio, en las crías expuestas al solvente durante su desarrollo, si que se vieron afectadas ambas capacidades. En conclusión, la cocaína y el tolueno, bajo estos modelos de exposición y dosificación empleados, tienen efectos evidentes sobre la neurogénesis en el hipocampo, aunque será necesario seguir investigando, para conocer con mayor detalle los efectos de ambas drogas sobre la neurogénesis y el hipocampo. / Recent observations indicate that drugs of abuse, including alcohol and opiates, impair adult neurogenesis in the hippocampus. The purpose of this work was studying the impact of cocaine and toluene treatment on cell proliferation, survival and maturation in rats. Furthermore the ultrastructural effects caused by these two drugs have also been analyzed in the dentate gyrus. And finally the behavioural study of the effect of a chronic administration of toluene. The studies with cocaine focused on the effect of treatments following shortterm (8-day) and long-term (24-day) exposure. With this drug one concluded that both short- and long-term cocaine exposures significantly reduced cell proliferation in the dentate gyrus (DG) of the hippocampus, but the survival, the maturation and the ultrastructural of the dentate gyrus was not affected by this drug. In register with this finding, cocaine chronic exposure did not increase the number of apoptotic cells, so this drug did not alter the cell death. Moreover, cocaine did not produce significant morphological alterations of the mossy fiber projection system to “stratum lucidum” in the CA3 area of the hippocampus. On the other hand, two experiments were carried out with toluene. In the first one the toluene was administered for 24 days and, in the second one, the drug was inhaled by adult rats for 72 days and by their pups during their development and postnatal early stage. In the study of toluene for 24 days an increase in the cell survival and in maturation was observed in treated rats. And in comparison with these in the experiment for 72 days a decrease on cell survival was observed in pups but not in the adult rats, and in concordance with these the cell differentiation was affected by toluene. In addition to this, the length of the dendritic arborization was increased in the brain of the animals treated with toluene, in both, pups and adult rats. With these experiments we can conclude that the toluene induces oxidative stress in the brain of the treated animals, and this stress produces an increase in the cell death and as result of this an activation of the cells of astroglia and microglia takes place. In addition, the ultrastructural analyses using an electron microscopy showed a disorganization of the granular layer of the dentate gyrus of the animals treated with toluene, and an alteration was observed in the morphology of the granular cells and variability in the shape of these cells. Basing on the results of the behaviour experiments, it can be concluded that the animals treated with toluene were showing hyperactivity, and their results in the objects and place recognition test were worse than the ones obtained by the control rats in pups, and no effect was observed in the adult rats. To sum up, cocaine and toluene, under these specific treatments, affect the neurogenesis of the hippocampus, but it would be necessary to r carry out further experiments with these drugs to know the effects on the hippocampal neurogenesis better.

La vitamina A, a partir de una serie de transformaciones metabólicas, se convierte en el ácido retinoico (RA), su metabolito activo más potente biológicamente. La vitamina A y sus derivados juegan un importante papel como reguladores fisiológicos de un gran número de procesos biológicos. Concretamente, el RA posee un papel relevante en el desarrollo embrionario temprano y en la generación de varios órganos y sistemas, como es el caso del Sistema Nervioso. El RA es capaz de inducir la parada proliferativa y la diferenciación in vitro de líneas celulares de muy diferente origen, incluyendo muchos tipos celulares tumorales como el neuroblastoma. Estudios previos realizados en la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y han mostrado que, además de las acciones clásicas sobre la transcripción de genes específicos, el receptor nuclear de RA (RAR), perteneciente a la superfamilia de los receptores nucleares de hormonas, media cambios rápidos en el estado de activación de rutas de señalización, como la ruta de PI3K/Akt y la vía de la MAP kinasa ERK. Este tipo de acciones rápidas independientes de transcripción, también llamadas no genómicas, constituyen el tema de interés principal de esta Tesis Doctoral, siendo nuestro objetivo general tratar de comprender cómo contribuyen este tipo de acciones en los procesos celulares y cómo se integran con las acciones genómicas transcripcionales para conseguir una única respuesta al RA. Un primer estudio de los intermediarios de estas rutas, mediante el empleo de fosfoanticuerpos específicos de residuo e inhibidores de las vías de señalización, demostró que la activación de PI3K/Akt y ERK por un tratamiento a tiempos cortos con RA se traduce en la fosforilación de sustratos corriente abajo (downstream), como mTOR y p70S6 en el caso de Akt, y MSK1 para ERK. Además, se estableció que ERK es activada independientemente de PI3K, aunque existe cierta relación entre ambas, pues la inhibición de PI3K con LY294002 modificaba el grado de inducción de ERK. Mediante un abordaje proteómico, se trató de identificar a aquellas proteínas nucleares que sufrían un cambio en su estado de fosforilación como consecuencia de las acciones atípicas del RA. Primeramente, se realizó una comparación de geles bidimensionales teñidos con Coomassie de fosfoproteínas nucleares de las células control y tratadas con RA. Este estudio fue ampliado con un ensayo LC-MS/MS cuantitativo empleando la metodología iTRAQ. Los resultados mostraron que el RA modifica el patrón de fosforilación de dos grandes grupos de proteínas: 1) aquellas que participan en transcripción y en la remodelación de la cromatina, y 2) las relacionadas con el procesamiento del mRNA, y dentro de ellas, sobre todo las implicadas en splicing. Además, estos resultados pudieron ser validados para algunas de estas proteínas mediante el empleo de otras metodologías. Los estudios funcionales mostraron que efectivamente el RA participa en la regulación del splicing alternativo, a través de la activación de la vía de PI3K/Akt. El mecanismo molecular podría implicar alteraciones en la unión al mRNA de algunos factores de splicing ricos en Ser y Arg (proteínas SFRS) y la promoción de la interacción entre las proteínas de splicing SF2 y U1- 70K. Por otro lado, el RA también desempeña un papel en la regulación del inicio de la traducción, que requiere de la inducción de la vía de PI3K/Akt/mTOR, responsable de fosforilar a 4E-BP1, y de la MAP kinasa ERK. Como conclusión, la activación de vías de señalización por las acciones no genómicas del RA en células de neuroblastoma puede regular el procesado del mRNA como parte de la respuesta orquestada por el receptor nuclear RAR. / Retinoic acid (RA), the biologically active form of vitamin A, is an important molecular signal for the early embryonic development and the differentiation of many cell types. RA induces the differentiation of neuroblastoma cells when added in vitro, and a therapeutic effect for RA has been demonstrated in a multicenter clinical assay with high-risk neuroblastoma patients. RA signaling is mediated by the retinoic acid receptor (RAR), belonging to the nuclear hormone receptor superfamily. In addition to its classical transcriptional actions, RAR also mediates rapid transcription-independent (nongenomic) actions, consisting in the activation of signal transduction pathways, as the phosphatidyl-inositol-3-kinase or the ERK MAPK-signaling pathways. RA-induced rapid transcription-independent actions play a role in different physiological contexts, being our main goal to elucidate how these rapid actions converge with the transcriptional actions and integrate together to achieve a physiological response to RA. First, several experiments using phospho-specific antibodies and signaling pathways inhibitors showed that activation of PI3K/Akt pathway downstream targets, like mammalian target of rapamycin (mTOR) and p70S6 kinases, was rapidly induced by RA treatment. On the other hand, mitogen- and stress-activated protein kinase 1 (MSK1) was shown to be an ERK target induced by RA addition. Secondly, we identified nuclear proteins whose phosphorylation state was rapidly modified by RA treatment in neuroblastoma cells, by comparing nuclear phosphoproteins from control and RA-treated cells using two proteomic approaches: 2DE-gels stained with Coomassie and quantitative LC-MS/MS assay based on the iTRAQ (isolated tags for relative and absolute quantification) methodology. Our results showed that RA addition led to changes in the phosphorylation patterns in two families of proteins: 1) those related to chromatin dynamics in relation to transcriptional activation, and 2) those related to mRNA processing and, in particular, mRNA splicing. Finally, functional assays showed that RA treatment in neuroblastoma cells led to the alteration of pre-mRNA alternative splicing and mRNA translation patterns, through a molecular mechanism involving SFRS (splicing factor, serine/arginine-rich) proteins. Therefore, we conclude that RA activation of signaling pathways converge at multiple levels with RAR-dependent transcriptional regulation to generate the cellular response to RA orchestrated by RAR receptor.

En la presente Tesis Doctoral se investiga, desde un punto de vista teórico, procesos de transferencia de carga y/o energía inducida por la luz en distintos sistemas biológicos. En concreto se estudian tres procesos paradigmáticos: la transferencia de carga en la fotosíntesis, la fotofísica y fotorreactividad de las bases nitrogenadas del DNA y el proceso de fotoisomerización del cromóforo de la Rodopsina, desencadenante de la visión. La metodología empleada para la realización de estos estudios es principalmente la CASPT2//CASSCF, una herramienta químico-cuántica especialmente adecuada para el tratamiento de los estados moleculares excitados, debido a su carácter multiconfiguracional. / This Doctoral Thesis investigates, from a theoretical point of view, charge and energy transfer processes in biological systems that are induced by light. In particular, three paradigmatic processes are studied: the charge transfer in photosynthesis, photophysics and photoreactivity of DNA nucleobases and the photoisomerization of the chromophore of Rhodopsin, which is the first step in the vision process. These studies has been carried out by using CASPT2//CASSCF methodology, a quantum chemistry tool very useful for the study of excited molecular states due to their multiconfigurational character.

Los primeros receptores de hormona de crecimiento (GHR) descritos en peces se agruparon en dos grupos, las secuencias descritas en peces salmónidos y las descritas en peces no salmónidos. Las de peces no salmónidos presentaron una gran conservación estructural con las secuencias de mamíferos, pero las secuencias de peces salmónidos muestraron un bajo nivel de identidad aminoacídica con ausencia de un par de cisteínas extracelulares y un diferente patrón de tirosinas intracelulares. Llegados a este punto, se planteó la hipótesis de la existencia de dos formas alternativas para el gen GHR en el genoma de los peces: la forma de los peces no salmónidos (GHR-I) y la de los peces salmónidos (GHR-II). A la luz de esta hipótesis se plantearon los siguientes objetivos: 1) Abordar la caracterización molecular y organización genómica de los receptores de la hormona del crecimiento en peces teleósteos, 2) analizar la divergencia evolutiva de los receptores de la hormona del crecimiento en los peces teleósteos, 3) analizar en dorada el patrón de regulación transcripcional de los receptores de la hormona del crecimiento y 4) definir en dorada el uso de los receptores de la hormona del crecimiento como biomarcadores de crecimiento y estrés por confinamiento y exposición a patógeno. Para analizar la divergencia evolutiva, se diseñaron cebadores degenerados en base a las secuencias de los GHR descritos previamente en los peces salmónidos. Utilizando estos cebadores en una estrategia de RT-PCR, se determinó la existencia del GHR-II en dorada, trucha y lubina. Las nuevas secuencias de GHR-II presentaron las mismas características estructurales que las secuencias de salmónidos y se agruparon con ellas al realizar un análisis filogenético. De esta manera se definió lo que sería en grupo de secuencias de GHR-II de peces mientras que el resto de secuencias de peces corresponderían al GHR-I. La caracterización molecular de ambos GHR en dorada mostró la misma organización genómica que el GHR de mamíferos, con la salvedad de la falta de un exón homólogo al 3 de mamíferos y la presencia de un intrón adicional en el exón 10 del GHR-I. Además se determinó que ambos receptores presentaron un único sitio de inicio de la transcripción en contraposición a la situación de mamíferos: un único receptor con diferentes inicios de la transcripción. Esta diferente organización sugirió que el gen del GHR se ajusta al modelo de evolución por subfuncionalización. Para analizar su regulación transcripcional, se midió la expresión de ambos GHR junto con la de IGF-I e IGF-II bajo diferentes modelos experimentales en dorada. Los modelos estudiados fueron ayuno, estación, edad, infección por patógeno (Enteromyxum leei) y estrés por confinamiento. De estas experiencias se dedujo que la mayor de expresión de ambos GHR se dio en hígado y que los cambios en la concentración de IGF-I circulante reflejaron su expresión a nivel hepático. La expresión del GHR-I estuvo altamente correlacionada con la expresión de IGF-I e IGF-II en las experiencias de estación, edad e infección por patógeno tanto a nivel hepático como extrahepático. Sin embargo, en el modelo de estrés por confinamiento, la disminución de la expresión hepática de la IGF-I e IGF-II reflejó los cambios en la expresión del GHR-II. Esto estuvo en consonancia con los sitios de unión de factores de transcripción presentes en su región flanqueante. El modelo propuesto mostró una regulación diferencial de los GHR de dorada, aunque no se pudo excluir un cierto solapamiento funcional con independencia de que fueran promiscuos o específicos de la GH. / The first fish growth hormone receptor (GHR) sequences were grouped in two major groups: salmonid fish and non-salmonid fish. Sequences of non-salmonid fish showed a high structural conservation with those of mammals. On the other hand, sequences of salmonid fish showed a low level of aminoacid identity with the lack of two extracellular cysteines and a different intracellular tyrosine pattern. At that moment, the existence of two alternative copies of the GHR gene in fish genomes, GHR-I (non-salmonid form) and GHR-II (salmonid form), was hypothesised. Following that hypothesis, we formulated the following objectives: 1) Address the molecular characterization and genomic organization of GHRs in teleost fish, 2) analyse their evolutional divergence, 3) analyse their transcriptional regulation in gilthead sea bream and 4) define their use in gilthead sea bream as biomarkers of growth and stress. The presence of GHR-II was demonstrated for the first time in gilthead sea bream, European sea bass and rainbow trout. In addition, the genomic organization of both GHR was elucidated in gilthead sea bream. Fish GHR showed the same genomic organization than human GHR except for the lack of the exon 3 and the presence of a short intron within GHR-I exon 10. Moreover, fish GHRs only contained a transcription start site whereas tetrapods’ GHR has several sites. The transcriptional regulation of gilthead sea bream GHR-I, GHR-II, IGF-I and IGF-II was assessed in basis to fasting, season, age, stress and parasite challenge (Enteromixum leei). In basis to our results, the expression of GHR-I was higher in hepatic tissue. Moreover, changes in circulating IGF-I levels reflected the IGF-I hepatic expression. GHR-I expression was highly correlated with IGF expression in season, age and parasite challenge at hepatic and extrahepatic level. However, changes in IGF expression under stress were correlated to hepatic GHR-II expression. This fact agreed with the transcription factor binding sites found in the 5’flanquing region of GHR-II. In summary, coexpression analyses suggest a key role of GHR-I in the tissue-specific regulation of IGFs in gilthead sea bream. Some functional redundancy of GHR-I and GHR-II cannot be excluded, emerging GHR-II as a stress and redox-sensitive gene.

Tits (Paridae) are one of the most and better passerines known owing to they are broadly distributed, breeding in different habitats from gardens to forests, and they make use of nest boxes for breeding. Hence, such species are ideal for comparative studies on a large geographical scale. Despite the great amount of information concerned to tits, we still do not really understand life-history strategies of birds living under most ecological conditions. The present thesis is focused on achieving a better understanding of how birds are adapted to their environment. In particular, to examine the existence and the consequences of food limitation in Mediterranean evergreen habitats, through an adequate knowledge of the constraints affecting both feeding behaviour and breeding success. To achieve the main objectives proposed, studies were conducted in three Mediterranean ecosystems: pine and Holm Oak Quercux iles forests, and an orange grove. This was carried out mainly over Great Tits Parus major, and in certain cases over Crested Tits Lophophanes cristatus and Coal Tits Periparus ater. The specific aims pursued in this thesis are as follows: / Los Carboneros son aves insectívoras que pertenecen a la Familia Paridae. Las especies que engloba dicha familia están muy estudiadas, conociéndose bastante sobre su biología. Esto se debe a que están ampliamente distribuidas, reproduciéndose en diferentes tipos de hábitat. Por lo tanto, dichas especies son ideales para estudios comparativos a gran escala geográfica. A pesar de la gran cantidad de información existente, todavía se desconoce las estrategias de vida de las aves bajo determinadas condiciones ecológicas. La presente tesis pretende alcanzar un mejor entendimiento de cómo las aves están adaptadas a su ambiente. En concreto, se examinó la existencia y las consecuencias de la limitación de alimento en ambientes Mediterráneos perennifolios, sobre el comportamiento trófico y el éxito reproductor. El estudio se llevó a cabo en tres ecosistemas Mediterráneos: bosque de pino y Carrasca Quercus ilex, y en un naranjal. Se utilizó principalmente como especie modelo, el Carbonero Común Parus major, y en menor medida, el Herrerillo Capuchino Lophophanes cristatus y el Carbonero Garrapinos Periparus ater. En la presente tesis, se ha demostrado que las aves hicieron uso de la temperatura ambiental en tal de ajustarse a las variaciones de la fenología del alimento, haciendo uso de las características de la vegetación para reducir la detección por parte de los depredadores. Las aves también se las arreglaron en relación a factores ambientales e intrínsecos cuando alimentaban a sus pollos, disminuyendo o aumentando su esfuerzo. Han compensado demandas conflictivas, por ejemplo, entre la coloración y la predación del nido. Hembras coloridas evitaron la predación del nido eligiendo lugares camuflados. Además, se ha demostrado cómo se las arreglaron los Herrerillos Capuchinos que se reprodujeron en un ambiente poco usual para la especie (carrascar), mediante la elección de cajas nido rodeadas de pino. Finalmente, las tres especies de aves utilizadas coexisten dentro de un mismo hábitat alimentándose de presas de distinto tamaño, reproduciéndose en lugares con características de la estructura de la vegetación diferente, o a través de distintos tiempos de reproducción. Dado que los datos fueron obtenidos mediante el uso de cajas nido, algunos de los resultados obtenidos podrían no ser relevantes o comparativos en aquellos casos en los que se estudie las aves nidificando en agujeros naturales debido a las diferencias, por ejemplo, en la presión por predación.

Trabajos clínicos y experimentales han demostrado que el etanol altera al sistema inmunitario. Aunque los mecanismos moleculares se desconocen, se ha demostrado que sus acciones sobre el sistema inmunitario son complejas y dependen de la dosis, el tiempo de exposición (agudo o crónico), tipo celular y presencia o ausencia de estímulos adicionales, como patógenos. Evidencias recientes indican el papel de los receptores tipo Toll (TLR) en la respuesta inmunitaria innata y, posiblemente, en la adquirida. De hecho, el tratamiento agudo de alcohol parece inhibir la respuesta inflamatoria y la liberacion de citocinas mediada por los receptores TLR en macrófagos. Por el contrario, el tratamiento crónico causa una activación de la vía NFκB, incrementando la expresión de citocinas, que a su vez, activan diferentes vías de señalizacion en hígado, hepatocitos y cerebro, que pueden conllevar a daño inflamatorio. Estos resultados sugieren que el etanol podría activar las vías de señalización asociadas a los receptores IL-1RI/TLR4. En el presente trabajo se han estudiado las posibles interaciones del etanol con los receptores TLR y se han evaluado los mecanismos por los que el etanol puede modular las respuestas de estos receptores, tomando como variables: diferentes dosis de etanol, tipos celulares y presencia o ausencia de ligandos. Para estos objetivos hemos utilizado las celulas RAW 264.7 (línea celular de macrófagos de ratón), macrófagos peritoneales y células microgliales en cultivo primario (principales células inmunes del sistema nervioso central). Los resultados obtenidos demuestran: 1) El etanol, a dosis moderadas, activa la respuesta innata inmunitaria tanto in vivo como in vitro, en macrófagos y en microglía, induciendo la cascada de señalización asociada al receptor TLR4 e incrementando la liberación de mediadores inflamatorios. En ratones deficientes en el TLR4-/- no se observa la inducción por el etanol de citocinas y mediadores inflatorios. 2) Los efectos del etanol sobre la activación de los macrófagos dependen de la dosis suministrada: concentraciones moderadas (50 mM), activan la respuesta de los TLR4 y su cascada de señalización, mientras que altas dosis (100 ó 200 mM) inhiben esta respuesta. 3) El etanol inhibe la respuesta de los TLR4 inducida por su ligando LPS. Refrente al mecanismo de la activacion del TLR4 por el etanol, demostramos que el etanol, a través de sus interacciones con los lípidos de membrana, induce un reclutamiento de este receptor y de las moléculas asociadas a su señalización hacia los microdominios de membrana “lipid rafts”. Sugerimos que a través de sus interaciones con estos microdominios podría interacionar con otros receptores de membrana, como el TLR2. Además, demostramos que tratamientos agudos de etanol modulan la inmunidad adaptativa produciendo un aumento de la expresión de moléculas que interviene en la presentación antigénica (MHC-I y MHC-II) y su reclutamiento hacia lipid rafts. Por el contrario, el consumo crónico de etanol inhibe la expresión de estas moléculas, lo que podría causar supresión de la respuesta a patógenos, tal y como se observa en pacientes alcohólicos. Globalmente, nuestros resultados no sólo proporcionan la primera evidencia del papel crítico de la respuesta del TLR4 en la activación inducida por el etanol en células fagocitarias, sino también una nueva comprensión de los mecanismos básicos que participan en el daño inducido por etanol a nivel sistémico y en procesos neuroinflamatorios. / Clinical and experimental research have shown that ethanol alters the immune system, although the molecular mechanisms are unknown. Recent evidence indicates the role of Toll-like receptors (TLRs) in immune responses. In fact, alcohol treatment modulate the inflammatory response and cytokine release in macrophages suggesting the role of TLR4 in the ethanol-induced damage. We have studied the interactions of ethanol with TLRs and evaluated the mechanisms by which ethanol can modulate the responses of this receptor in RAW 264.7 cells, and primary culture of peritoneal macrophages and microglial cells. Our results show: 1) Moderate doses of ethanol activates the innate immune response both in vivo and in vitro, in macrophages and microglia, inducing a signalling pathway associated with TLR4 and increasing the release of inflammatory mediators. The inflammatory response induced by ethanol is completely abrogated in microglia of TLR4 deficient mice 2) The effects of ethanol on the activation of macrophages depend on the dose administered: low/moderate concentrations (10-50 mM) activates the response of TLR4 and its signalling pathways, whereas high doses (100 or 200 mM) inhibit TLR4 response. 3) Ethanol interferes and inhibits the response induced by the TLR4 ligand, LPS. An important finding of this study is the involvement of lipid rafts in the activation mechanism of the TLR4 by ethanol. We demonstrated that ethanol, through its interaction with membrane lipids induces a recruitment into the lipid rafts of this receptor, as well as signalling molecules. We suggest that ethanol, through interactions with these microdomains, might modulate other membrane receptors such as TLR2. Furthermore, we demonstrate that acute ethanol treatment modulate adaptive immunity leading to increased expression of molecules involved in antigen presentation (MHC-I and MHC-II) and their recruitment into lipid rafts. By contrast, chronic ethanol consumption inhibits the expression of these molecules, which might lead to the suppression of the immune response to pathogens, as observed in alcoholic patients. Overall, our results not only provide the first evidence of the critical role of TLR4 response in ethanol-induced activation in phagocytic cells, but also a new understanding of the basic mechanisms involved in ethanol-induced damage and causes neuroinflammatory processes.

The study of desiccation tolerance of lichens, and of their phycobionts in particular, has been mainly focused on the antioxidant system that protects the cell against photo-oxidative stress produced during dehydration and rehydration. However, desiccation tolerance cannot be achieved in lichen phycobionts with antioxidant activity alone. The main objective of the thesis was to expand the knowledge of the poorly understood desiccation tolerant mechanisms. The first chapter presents an introduction to the subject of the thesis, based on the available background information, and explains the rationale of the thesis. The aim of the chapter 2 was to establish the optimal growing conditions for the isolated phycobiont Trebouxia erici Ahmadjian (SAG 32.85 = UTEX 911) and to determine how these working procedures could modify the results of further experiments. We concluded that cellulose-acetate discs for agar cultures should be inoculated with 14-day-old liquid cultures, and growth under irradiance of 30 mol m-2 s-1 PAR at 20 ºC. Experiments should be carried out with 21day-old algal discs. The experiments carried out in third chapter were designed on one hand, to determine the grade of desiccation tolerance of the isolated lichen phycobiont T. erici, and on the other hand, we studied the response of some protective mechanisms. The results showed that both long desiccations and rapid drying produced greater membrane damage and lower recovery of metabolic and photosynthetic activity than after brief desiccations and slow drying, respectively. Photosynthesis was never recovered totally neither after rapid nor slow drying. Classical mechanisms involved in the protection of the cell against oxidative stress were present in hydrated algae although were not enhanced during dehydration/rehydration. Likewise, in T. erici, dehydrins were also constitutively expressed. However, a slow drying time was required for activating the conformational change in the photosystem II which protect against photoinhibition in desiccation state. In the fourth chapter we decided to carry out proteomic and genetic expression analyses of the changes associated with desiccation and rehydration in the isolated phycobiont Trebouxia erici, in order to find out other proteins that may be involved on desiccation tolerance mechanisms of phycobionts. Proteomic analysis showed that desiccation caused up-regulation of around 19 proteins and down-regulation of 43 proteins. Among the proteins up-regulated during drying were found: a putative cation transport protein; a protein with an F-box domain; a cell division cycle 48 protein; -tubulin protein; a 90 kDa Heat shock protein. We observed that five Hsp90 and two -tubulin genes were activated during dehydration and mRNA was accumulated until the cell was completely dried. In the fifth chapter we investigated the role of the NO in the biochemical interaction between lichen symbionts and whether the NO may increase the endurance of lichenized phycobionts under desiccation. Rehydration of the lichen R. farinacea caused the release of NO together with a high production of ROS. The amount of NO detected decreased significantly with the addition of c-PTIO. In the isolated phycobionts, scavenging of the self produced NO caused a decrease in the recovery of photosynthetic activity after dehydration, probably due to the higher levels of photo-oxidative stress. The aim of the work presented in the sixth chapter was to determine the effect of cell ageing in desiccation resistance of T. erici. Phycobiont capacity to recover photosynthesis activity after desiccation was inversely related with cell ageing, suggesting that desiccation tolerance is age-dependent. The results presented in this thesis demonstrate that desiccation tolerance of T. erici is achieved by a complex system of constitutive and induced mechanisms. Moreover, some factors such as drying rate, desiccation duration, lichenization and ageing may alter the recovery capacity of T. erici after desiccation. / El estudio de la tolerancia a la desecación de los líquenes, y de sus fotobiontes en particular, ha sido principalmente enfocado hacia los sistemas antioxidantes que protegen a la célula frente al estrés fotoxidativo. Sin embargo, la tolerancia a la desecación no puede ser alcanzada solamente con sistemas antioxidantes. Por esta razón, el objetivo principal de esta tesis fue profundizar en el conocimiento de los mecanismos de tolerancia a la desecación en fotobiontes liquénicos. El fotobionte liquénico Trebouxia erici Ahmadjian mostró ser tolerante a la desecación incluso cuando es cultivado separado de su compañero micobionte. Sin embargo, la resistencia a la desecación dependió de la velocidad de deshidratación, del tiempo de desecación y del envejecimiento del cultivo. Tasas de deshidratación altas, largos periodos de desecación y cultivos viejos redujeron la capacidad de recuperación. Esto es debido a que la tolerancia a la desecación del fotobionte se consigue por un lado mediante mecanismos de protección celular que son constitutivamente expresados como, enzimas antioxidantes, xantofilas o proteínas LEA, junto con la activación Mientras que por otro, existen mecanismos que se activan durante la deshidratación, como son de la síntesis de proteínas implicadas en el transporte, la protección de membranas y proteínas, el citoesqueleto, el ciclo celular y el marcaje y la degradación de proteínas. Aunque los fotobiontes liquénicas tienen sus propios mecanismos para resistir la desecación, en la relación simbióntica la tolerancia a la desecación podría ser aumentada por otros mecanismos. Nuestros estudios con el liquen Ramalina farinacea Ach. y fotobiontes aislados mostraron que el gas bioactivo oxido de nitrógeno (NO) es liberado principalmente por el hongo durante la rehidratación del talo, el cual podría tener un papel importante en la maquinaria antioxidante del fotobionte durante las primeras fases de la rehidratación.