La terapia génica no viral avanza al ritmo que marca el desarrollo en sus vectores de transferencia génica. Vectores más eficientes, más sofisticados y con posibilidades nuevas, son el frente de avance y motor del campo. La presente tesis doctoral describe el desarrollo de dos nuevos vectores para terapia génica no viral, pertenecientes a ámbitos de aplicación muy diferenciados. El LPP (lipopoliplejo) es un vector de asociación liposomas/ADN/PEI cuya característica esencial es la capacidad para transportar en compartimentos independientes una gran carga de antígenos y genes u otras moléculas, que son transferidos conjuntamente a la misma célula, y cuyo ámbito de aplicación más apropiado sería la dispensación de antígenos en estrategias terapéuticas de inmunización. Adicionalmente, he desarrollado varios métodos nuevos que permiten una caracterización completa de los vectores de asociación liposomas/policatión/ADN, desarrollándose un protocolo que permite una caracterización completa de estos vectores previa a su uso en ensayos de inmunización. Por otro lado, se han diseñado vectores basados en tensoactivos dimerizables, dotados de una cabeza polar de dos aminoácidos que proporcionan las funciones químicas tiol y amino, y una cola hidrofóbica de diez carbonos de longitud; que son capaces de compactar monomolecularmente un plásmido de ADN, consiguiendo partículas de tamaño nanométrico que constituyen el primer paso fundamental en la construcción de un vector de terapia génica no viral con estructura y tamaño semejantes a las de los virus. Los vectores desarrollados se han sometido a diversos ensayos biológicos, en particular en modelos de inmunización antitumoral en ratón contra un antígeno lipídico de melanoma (el gangliósido de membrana GD3), y también con antígenos proteicos hidrosolubles de la membrana de células tumorales de melanoma, obteniéndose en ambos casos respuesta humoral. / This assay describes the development and characterization of new gene transfer vectors. The lipopolyplex (LPP) constitutes a new microtechnological device able to simultaneously deliver plasmids and other molecules, such as drugs, proteins or lipids, to a cell. It is have been developed based on the association of anionic liposomes and cationic DNA:PEI complexes, with a set of novel analytical techniques for the characterization of these complexes. Most effective noncellular genic vaccines against cancer tried at the present time are based on the simultaneous use of one or more antigen combined with DNA that codifies for cytokines or other inmunoestimulatory molecules. Frequently it is not had the genes that codify these antigens, so they are purified and incorporated like such in the vaccine. Nevertheless, these molecules are of diverse chemical nature, and sometimes the combination of antigens selected is chemically incompatible to each other, not being possible its association. We show a novel LPP particle for the vehiculization of antigens based on two different compartments, lipidic and hidrosoluble, associated to a third compartment for the nucleic acids transport. Additionally, we present the new chemical agents RCC10 and HCC10 for the compactation of a DNA plasmids cariying therapeuthics genes into a single and stable globular nanometric system.

El presente estudio paleolimnológico se centra en la evolución Holocena de la Albufera de Valencia, el mayor lago costero oligohalino de la Península Ibérica. Este lago costero ha sido el punto de mira de numerosos estudios durante el último siglo, sin embargo, se sabía muy poco sobre el origen y evolución del mismo. Se utilizaron los restos subfósiles de ostrácodos como los mejores bioindicadores ambientales. Se emprendió un estudio basado en la calibración de una especie de ostrácodo eurihalino clave, Cyprideis torosa. Los resultados mostraron que la combinación de los nodos de las valvas junto con los isótopos de oxígeno (δ18O), nos proporcionaba un modelo cuantitativo certero para reconstruir salinidades. Por otro lado, el Sr/Ca de las valvas de C. torosa estaba altamente correlacionado con el Sr/Ca del agua, permitiendo así la posibilidad de reconstruir el Sr/Ca de aguas pasadas. Además, se reafirmó que el δ13CDIC puede ser inferido a partir del δ13C del ostrácodo. Estos resultados, junto con las técnicas de análisis paleoecológicos se aplicaron en tres secuencias sedimentarias de la Albufera con distintas longitudes (850 cm, 240 cm y 63 cm). Los sondeos más largos aportaron información sobre las principales transgresiones marinas que se produjeron durante el Holoceno. Sin embargo, no se encontró ninguna asociación típicamente marina, sugiriendo así que el lago no estuvo totalmente abierto al mar durante este periodo. El estudio de los sondeos cortos mostro que la desalinización de la Albufera se produjo más tarde de lo postulado en estudios previos, probablemente en el último cuarto del siglo XIX. Las aguas no tratadas de la de las ciudades de alrededor incrementaron la carga de nutrientes en el lago provocando un proceso drástico de eutrofización durante la mitad y la parte final del siglo XX. La densa pradera de macrófitos que poblaba el lago desapareció hacia finales de los años 60. Así mismo, los vertidos incontrolados de las industrias de alrededor del lago y probablemente el incremento de las actividades cinegéticas en el lago, desde principios del siglo XIX, incrementaron la carga de metales pesados que todavía hoy permanecen en los sedimentos de la Albufera / We undertook a paleolimnological study on the Holocene evolution of the Albufera de Valencia, the largest coastal oligohaline lake in the Iberian Peninsula, enclosed in the Albufera Natural Park. The lake has been the focus of many studies during the last century; however, the origin and the evolution of the lake remained unknown. Subfossil ostracod remains preserved in lake sediments were considered as the most suitable bioindicators owing to the significant relationships between the species distribution and shell chemistry (trace elements and isotopes) of ostracods and water physical and chemical variables. The paleolimnology of coastal lakes is a complex and difficult task; hence, prior to this we undertook a study to calibrate the euryhaline ostracod target species Cyprideis torosa as a quantitative paleoenvironmental proxy. The results showed that the combination of both shell nodes and !18O provided an accurate quantitative model for salinity reconstruction. On the other hand, C. torosa shell Sr/Ca was highly correlated with water Sr/Ca, allowing the possibility to reconstruct past water Sr/Ca in a quantitative manner. Additionally, we support the previous findings that !13CDIC can be inferred from ostracod shell !13C. These results, together with classical paleoecological analyses and interpretations based on ostracod paleoassemblages and sediment characteristics were applied to study three sedimentary sequences from lake Albufera of various lengths (850 cm, 240 cm and 63 cm). The longest two cores provided information about the main transgressive phases occurred during the mid to late Holocene. However, a typical marine ostracod fauna was not recorded at a certain unit of the core, suggesting that the lake was not totally open to the sea during this period. The highest resolution of the shorter two cores, allowed to establish that the main desalinization of the Albufera took place later than thought before, probably in the last quarter of the XIXth century, when an important rice field expansion took place around the lake. The untreated sewage waters and the change of rice cultivation methods from surrounding towns increased the nutrient load onto the lake favoring a drastic eutrophication process during the mid to late XX century. The dense macrophyte cover disappeared from the lake by the end of 1960 resulting in marked sediment differences (disturbed and anoxic sediment layer). Furthermore, the uncontrolled spills from the nearby industries and probably also the increasing hunting activities since the beginning of the XIXth century increased the heavy metals load remaining in the sediment.

De entre los 7 Pisos en los que está subdividido el Sistema Devónico, el Emsiense, es quizás uno de los que más interés ha despertado en los últimos años, siendo la redefinición de su límite inferior y su posible subdivisión en 2 subpisos, algunos de los objetivos principales que se ha planteado la Subcomision de Estratigrafia del Devónico. Teniendo en cuenta estos problemas y las posibilidades que muestran los Pirineos Centrales Españoles para contribuir a su solución, se propuso la realización del presente trabajo. Se han descrito y muestreado 11 secciones, así como diversos muestreos aislados, pertenecientes a las Subfacies Sierra Negra, Baliera y Compte del Área de Facies Sur, con edades que abarcan desde el Praguiense más alto al Emsiense superior. Estas secciones han podido ser correlacionadas y ordenadas en base a su contenido en conodontos; 9 de ellas (Isábena 1, Baliera 6, Compte-I top, LGA, LGA-X, LGA-XI, Vi-IA, Vi-IB y Vi-IE) han resultado adecuadas para estudios bioestratigráficos. El estudio de los conodontos recuperados en las más de 300 muestras procesadas ha permitido determinar 41 taxones pertenecientes a 3 familias y 5 géneros: 19 taxones a la familia Polygnathidae (género Polygnathus); 3 a la familia Spathognathodontidae (géneros Criteriognathus, “Ozarkodina” y Pandorinellina?); y 19 taxones a la familia Icriodontidae (género Icriodus). De los 41 taxones descritos 8 son nuevos (Polygnathus carlsi n. sp., Polygnathus rosae n. sp., Polygnathus ramoni n. sp., Polygnathus luciae n. sp., Polygnathus aragonensis n. sp., Icriodus balieraensis n. sp., Icriodus riosi n. sp. e Icriodus susanae n. sp.) y 6 se tratan en nomenclatura abierta, citándose además, por primera vez en los materiales emsienses de los Pirineos a Polygnathus nothoperbonus, Polygnathus laticostatus, Polygnathus linguiformis bultyncki, Polygnathus pannonicus, Polygnathus gilberti y Polygnathus vigierei. Con esta base taxonómica y atendiendo a su distribución estratigráfica, se han podido identificar el límite inferior del Emsiense y las Zonas del Praguiense terminal y Emsiense: pireneae, kitabicus, excavatus Inferior y Media, nothoperbonus, laticostatus y serotinus, proponiéndose en este trabajo la subdivisión de la zona nothoperbonus en Inferior y Superior, utilizando al taxón Polygnathus mashkovae como indicador del comiendo de la Subzona nothoperbonus Superior. Además, esta información, nos ha permitido datar con precisión las formaciones geológicas del Emsiense aquí estudiadas, corroborando las dataciones previas de otros autores. Se han propuesto diferentes hipótesis filogenéticas de los taxones de polygnátidos estudiados, identificándose hasta 8 linajes diferentes, o partes de ellos: (1) Linaje Po. pireneae → Po. linguiformis bultyncki, (2) Linaje Po. pireneae → Po. tamarae, (3) Linaje Po. pireneae → Po. “postpostpannonicus”, (4) Linaje Po. pireneae → Po. aragonensis n. sp., (5) Linaje Po. pireneae → Po. carlsi n. sp., (6) Linaje Po. pireneae → Po. rosae n. sp., (7) Linaje Po. pireneae → Po. gilberti y (8) Linaje Po. pireneae → Po. cf. serotinus. De ellos, se han reconocido y descrito por primera vez los linajes 4, 5 y 6., que son exclusivos de los Pirineos. Esta gran diversidad de taxones en el Emsiense inferior corrobora de nuevo la hipótesis de una radiación evolutiva de este y otros géneros en las proximidades del límite Praguiense/Emsiense, y contrasta con el descenso en el número de especies en el Emsiense superior, cuyos registros en los Pirineos son mucho más escasos que los del Emsiense inferior. Por último, destacar que el presente estudio ha permitido aumentar el número de secciones relevantes en los Pirineos, ayudándonos con ello a mejorar el conocimiento general de las faunas de conodontos del Emsiense. Lo que nos ha permitido contribuir al establecimiento de una escala bioestragráfica local de gran utilidad para correlaciones de tipo regional y supraregional. / Of the seven stages in which the Devonian System is subdivided, the Emsian, is perhaps one of the most interesting ones, due to the need of redefinition of its lower boundary and its possible subdivision into two sub-stages. Given this scenario, and the opportunities shown by the Spanish Central Pyrenees to contribute to their solution, we proposed the present Doctoral Thesis. Eleven sections have been described and sampled for conodonts belonging to the Sierra Negra, Compte and Baliera Subfacies, with ages ranging from the upper Pragian to the upper Emsian (Lower Devonian). These sections have yielded important conodonts for biostratigraphic studies, which have allowed us to determinate 41 species, included in 5 genera and 3 families: 19 belonging to the Polygnathidae family (genus Polygnathus); 3 to the Spathognathodontidae family (genera Criteriognathus, "Ozarkodina" and Pandorinellina?) and 19 to the Icriodontidae family (genus Icriodus). Of the 41 species described, 8 are news and 6 are treated in open nomenclature, citing for the first time in the Emsian of Pyrenees the species: Polygnathus nothoperbonus, Polygnathus laticostatus, Polygnathus linguiformis bultyncki, Polygnathus pannonicus, Polygnathus gilberti and Polygnathus vigierei. In addition, we have proposed 8 phylogenetic linage for the different species of the genus Polygnathus. Based on the different species studied, we have identified the lower Emsian boundary, and the following conodont Zones: pireneae, kitabicus, Lower and Middle excavatus nothoperbonus, laticostatus and serotinus, proposing in this work the subdivision of the nothoperbonus Zone in the Lower and Upper nothoperbonus Subzones. In addition, this information has allowed us to date the different geological formations herein studied, corroborating previous studies. This great conodont diversity in the lower Emsian, supports previous hypothesis of an evolutionary radiation of the group around the Pragian/Emsian boundary, which contrasts with the decline in the number of species of the upper Emsian. Finally, we can conclude that this study has increased the number of relevant sections from the Pyrenees, helping us to improve the knowledge of the Emsian conodont faunas.

Los aislados de CTV están formados generalmente por una mezcla de variantes de secuencia, que se generan mediante procesos de mutación y recombinación. Su frecuencia en la población es el resultado de distintas presiones selectivas y de fenómenos de migración y deriva genética, generalmente asociados a los procesos de transmisión. El objetivo de esta tesis era analizar por separado el efecto de diversos factores de los procesos de transmisión sobre la estructura poblacional y la diversidad genética de distintos aislados del virus. Se analizó el efecto de la transmisión por pulgón. Ésta ocurrió con baja eficiencia y en general, las secuencias de los genes analizados en las plantas receptoras fueron idénticas a las de las plantas donantes y el aislado de colección. La transmisión por injerto y/o pulgón supone un cuello de botella que puede dar lugar a un efecto fundador. Se analizó el efecto de la transmisión por injerto entre plantas de una misma especie huésped y no se observaron cambios llamativos en la estructura y diversidad poblacional. También se estudió si la transmisión por injerto de dos aislados de CTV a diferentes especies y variedades comerciales propagadas sobre citrange Carrizo podía inducir cambios en la población. Aunque no observamos cambios significativos en la diversidad genética, la estructura poblacional se vio alterada en algunas plantas. Esta alteración fue debida a la aparición de nuevas variantes de secuencia cercanas filogenéticamente que llegaban a predominar en dichas poblaciones. Finalmente, se utilizó un aislado clonal de CTV para el estudio de la variación genética de novo en distintos huéspedes a lo largo del tiempo. Se efectuaron pases sucesivos por injerto de dicho aislado desde su huésped original a distintos huéspedes susceptibles, y a un huésped parcialmente resistente (naranjo amargo). Las poblaciones en los huéspedes susceptibles presentaron una elevada estabilidad, pero los pases sucesivos en el huésped naranjo amargo dieron lugar a cambios importantes en la población, debido a la aparición de variantes de secuencias muy divergentes anteriormente halladas en dos aislados naturales del virus. La detección de secuencias minoritarias cuya posición filogenética se sitúa entre los tres genotipos avala la idea de una evolución entre el genotipo original y los otros dos detectados para intentar adaptarse al huésped. El hallazgo de secuencias recombinantes entre los tres genotipos apoya la presencia de éstos en el huésped naranjo amargo. La inoculación de huéspedes susceptibles a partir de plantas de naranjo amargo puso de manifiesto la progresiva pérdida de infectividad de la población mantenida en esta especie, debido en parte a la baja acumulación de CTV en la misma. Además fue imposible detectar el virus en brotes de lima propagados sobre estas plantas, lo que sugiere que además del bajo título viral algún factor del huésped pudiese dificultar el paso de CTV desde naranjo amargo a lima. / CTV isolates are composed of a population of sequence variants, resulting from mutation and recombination events. The frequency of these variants in the population is the outcome of different selective pressures, and migration and genetic drift phenomena generally associated to transmission processes. Here we analyzed separately the effect of different factors of the transmission process on the diversity and population structure of CTV isolates. We studied the effect of aphid transmission by nucleotide sequence comparisons between the donor and receptor plants and the collection CTV isolate. Transmission efficiency was low, and no sequence variation was observed. Aphid and graft transmission are a bottleneck resulting in a founder effect. We analysed the effect of graft transmission to a host of the same species. No obvious changes were observed in the CTV population structure and diversity We also studied if graft-transmission to different varieties propagated on Carrizo citrange could alter the CTV population. Although significant diversity changes were not observed, the population structure was occasionally altered due to the appearance of new sequence variants genetically close that became predominant in these populations. Finally, we used a clonal CTV isolate to study genetic variation generated de novo in different hosts. This isolate was serially passed by graft-transmission in different susceptible hosts and in a partially resistant host (sour orange). While CTV population was stable in the susceptible hosts, passages through sour orange caused major changes due to the appearance of new diverged sequence variants previously found in two natural isolates). Detection of minor variants phylogenetically located between these three genotypes supports the idea of an evolutionary process between the original and two new genotypes to get adapted to sour orange. Recombination events involving the three genotypes supports the presence of more than one genotype in infected sour orange. Inoculation from sour orange to susceptible hosts showed progressive loss of infectivity, due in part to the low virus titer in this host. CTV could neither be detected in Mexican lime propagated on these sour orange plants, suggesting that some host factor might also block CTV movement from sour orange to lime.

La epilepsia lateral temporal de herencia autosómica dominante, es una forma de epilepsia parcial, con crisis secundariamente generalizadas, causada por mutaciones en LGI1. Este gen fue inicialmente descrito en 1998 en relación a la aparición de glioblastomas malignos y se ha visto que su expresión, se relaciona inversamente con el grado de malignidad de estos tumores. El análisis in silico de la secuencia primaria de LGI1, permitió identificar una familia génica compuesta por cuatro elementos, que compartían una misma organización en dominios proteicos: la familia LGI. La existencia de formas clínicas de epilepsia similares a aquellas debidas a mutaciones en LGI1 pero sin relación con este gen, permite establecer la hipótesis de que algún otro componente de la misma familia génica podría estar implicado en la aparición de la enfermedad. Además, la existencia de varios parálogos sugiere que se da un cierto grado de redundancia funcional, que podría ser explicado por una distinta distribución anatómica de los elementos de la familia LGI. En este trabajo se presentan los resultados del análisis de expresión de los ARNm de los componentes de la familia LGI en cerebro de ratón adulto. La distribución de transcritos de los genes de la familia LGI es regionalmente heterogénea, lo que hace pensar que desde su origen a partir de un gen ancestral común, sufrieron una subfuncionalización. Además, en este trabajo se trata de indagar, en la posible función o funciones de estos genes. / Autosomic dominant lateral temporal epilepsy (ADLTE) is a form of partial epilepsy with secondary generalized seizures, caused by mutations in LGI1. This gene was initially identified in 1998, as a tumour suppressor in multiform glioblastoma, affecting to the malignancy of these tumours. In silico analysis of the primary sequence of LGI1, revealed four paralogues of the gene, which shared a very similar domain structure and were named as LGI1, LGI2, LGI3 and LGI4. The existence of similar types of epilepsy with common features for that seen for ADLTE, suggests that some other members of this gene family could be involved in these pathologies. Moreover, the presence of four paralogues, makes the idea of a certain degree of functional redundancy, possible. This fact, could be explained by the complementary distribution of cells expressing the genes of this family in the brain. In this work, we show a detailed expression analysis of the mRNA of the members of the LGI family in adult mouse brain. The distribution of these genes is regionally heterogeneous, suggesting that since their origin as a common ancestral gene, a subfunctionalization might have occurred. In this work, we try to shed light on these possible functions.

Autosomic dominant lateral temporal epilepsy (ADLTE) is a form of partial epilepsy with secondary generalized seizures, caused by mutations in LGI1. This gene was initially identified in 1998, as a tumour suppressor in multiform glioblastoma, affecting to the malignancy of these tumours. In silico analysis of the primary sequence of LGI1, revealed four paralogues of the gene, which shared a very similar domain structure and were named as LGI1, LGI2, LGI3 and LGI4. The existence of similar types of epilepsy with common features for that seen for ADLTE, suggests that some other members of this gene family could be involved in these pathologies. Moreover, the presence of four paralogues, makes the idea of a certain degree of functional redundancy, possible. This fact, could be explained by the complementary distribution of cells expressing the genes of this family in the brain. In this work, we show a detailed expression analysis of the mRNA of the members of the LGI family in adult mouse brain. The distribution of these genes is regionally heterogeneous, suggesting that since their origin as a common ancestral gene, a subfunctionalization might have occurred. In this work, we try to shed light on these possible functions. / Negative cofactor 2 (NC2) has been described as an essential and evolutionarily conserved transcriptional repressor, although in vitro and in vivo experiments suggest that it can function as both a positive and a negative effector of transcription. NC2 operates by interacting with the core promoter and components of the basal transcription machinery, like the TBP. In this work, we have isolated mutants that suppress the growth defect caused by depletion of NC2. We have identified mutations affecting components of three different complexes involved in the control of basal transcription: the mediator, TFIIH, and RNA pol II itself. Mutations in RNA pol II include both overexpression of truncated forms of the two largest subunits (Rpb1p and Rpb2p) and reduced levels of these proteins. Suppression of NC2 depletion was also observed by reducing the amounts of the mediator essential components Nut2p and Med7p, as well as by deleting any of the nonessential mediator components, except Med2p, Med3p, and Gal11p subunits. Interestingly, the Med2p/Med3p/Gal11p triad forms a submodule within the mediator tail. Our results support the existence of different components within the basic transcription complexes that antagonistically interact with NC2 repressor and suggest that the correct balance between the activities of specific positive and negative components is essential for cell growth. In the second part of this work, we study a novel and highly conserved factor that physically interacts with most of the RNA pol II subunits, Iwr1p. Here we show that Iwr1p genetically interacts with components of the basal transcription machinery and plays a role in both basal and regulated transcription. We report that mutation of IWR1 gene is able to bypass the otherwise essential requirement for the transcriptional regulator NC2, which occurs with different components of the basal transcription machinery, including TFIIA and subunits of the mediator complex. Deletion of the IWR1 gene leads to an altered expression of specific genes, including phosphate-responsive genes and SUC2. Our results show that Iwr1p is a nucleocytoplasmic shuttling protein and suggest that Iwr1p acts early in the formation of the pre-initiation complex by mediating the interaction of certain activators with the basal transcription apparatus.

Desde la erradicación del paludismo en España, los estudios acerca de los mosquitos culícidos (Diptera: Culicidae) han disminuido drásticamente en nuestro país. Con el objetivo de actualizar los datos faunísticos de la familia en la Comunidad Valenciana, se llevaron a cabo intensivos muestreos larvarios en los años comprendidos entre 2005 y 2008. Durante estos cuatro años se consiguió recolectar 11.279 ejemplares pertenecientes a 29 especies de Culicidae, repartidos en 548 puntos de captura diferentes. El estudio de la salinidad de los biotopos larvarios indica que únicamente Ochlerotatus caspius (Pallas, 1771) y Ochlerotatus detritus (Haliday, 1833) pueden calificarse como especies eurihalinas, tipificándose al resto de especies como estenohalinas del componente dulceacuícola u oligosalobre. Se obtuvieron elevados porcentajes de asociación larvaria entre especies, como Culex territans Walker, 1856 y Culex impudicus Ficalbi, 1890 (61,9%), Oc. caspius y Oc. detritus (57,2%) o Culiseta longiareolata (Macquart, 1838) y Culex laticinctus Edwards, 1913 (48,7%), fruto de la existencia de similares requerimientos acerca de los hábitats donde desarrollar la fase preimaginal. Por el contrario, otras como Culex pipiens Linnaeus, 1758 demuestran ser especies poco restrictivas al cohabitar en porcentajes elevados con especies de requerimientos muy dispares. Las variables cuantitativas y cualitativas recopiladas para cada criadero larvario han permitido la obtención de modelos predictivos acerca de la presencia de especies como Cx. pipiens, Cx. territans, Cs. longiareolata y Oc. caspius, con porcentajes de precisión del 60%, 60%, 67% y 67,2%, respectivamente. Los resultados también evidencian que la biodiversidad de mosquitos sufre importantes variaciones con respecto a la influencia de patrones climáticos y antrópicos diferentes, de modo que la escasez de precipitaciones y la proximidad de asentamientos humanos son dos factores que afectan negativamente a la biodiversidad de mosquitos, deparando un filtro de selección que sólo unas pocas especies pueden superar. Se han detectado especies relacionadas con la transmisión de enfermedades al hombre. La bioecología de los vectores estudiados, coadyuvada por el nivel socioeconómico y sanitario de nuestro país, revela que los episodios de transmisión de paludismo son poco probables. La situación es diferente atendiendo a las arbovirosis, ya que existen vectores con elevados grados de domiciliación. Además, exceptuando a los virus de carácter antroponótico, la participación de animales vertebrados como hospedadores amplificadores suele enmascarar las posibilidades reales de iniciación de brotes epidémicos. En conclusión, los programas de control poblacional de mosquitos deben tener en cuenta los aspectos bioecológicos, biogeográficos y fenológicos de las especies implicadas. Datos éstos que se ven incrementados con la contribución de la presente tesis. / Intensive larval samplings of mosquitoes (Diptera: Culicidae) were carried out between 2005 and 2008 in several biotopes located in a varying climate region in Eastern Spain (Valencian Autonomous Region). The biodiversity was deeply analyzed and divided into alpha, beta and gamma components with the aim of comparing the mosquito biodiversity according to the different structure of the landscape due to the incidence of climatic and anthropic patterns. Likewise the synanthropic index of Nourteva was calculated for each species caught. A total of 11.279 mosquitoes belonging to 29 species were collected and identified. Mosquito biodiversity was higher in the wettest and non-anthropized areas. All this information was also used to group the different regions studied depending on its mosquito faunistic composition through cluster analysis. On the other hand, a classification of Spanish mosquitoes according to different life cycles was also developed. The bio-ecological parameters analyzed were the ovipositional sites, overwintering stages, preferred hosts, and number of generations per year of each species. Results showed the existence of 13 different functional groups. The Jaccard cluster and the principal components analysis (by means of between group analysis method) revealed 3 different mosquito groups: the tree hole species, the aedine species (except dendrolimnic ones) and the rest of the non-dendrolimnic culicid species. The importance of the different overwintering patterns in distinguishing these 3 classes is also discussed. Moreover the quantitative and qualitative variables analyzed for each larval breeding site have allowed the establishment of predictive models about species such as Culex pipiens Linnaeus, 1758, Culex territans Walker, 1856, Culiseta longiareolata (Macquart, 1838) and Ochlerotatus caspius (Pallas, 1771), with accuracy rates of 60%, 60%, 67% and 67.2% respectively. Finnally the re-emergence of antroponosis, like malaria, seems unlikely given the low values of the synanthropic index for the anophelines captured. However the situation is clearly different regarding to several arboviruses due to the presence of different vector species with high degrees of domiciliation.

La pérdida ósea acelerada puede desencadenar en osteoporosis, una enfermedad esquelética caracterizada por una menor resistencia ósea y riesgo aumentado de fractura. Es la enfermedad metabólica más prevalente entre la población femenina ya que afecta al 35% de las mujeres españolas mayores de 50 años, y por lo tanto es un problema de salud pública muy importante. El tipo de osteoporosis más frecuente es la osteoporosis posmenopáusica, una enfermedad multigénica que se inicia con la retirada de la protección estrogénica. No obstante, a pesar de que todas las mujeres aceleran su tasa de pérdida ósea con la menopausia, no todas desarrollarán osteoporosis en el futuro. La causa hay que buscarla en el pico de masa ósea alcanzado por cada mujer y que está determinado principalmente por factores genéticos. Históricamente, los factores genéticos se han buscado en genes que regulan el metabolismo óseo y en genes de diversas citoquinas. Recientemente, se ha descrito la relación que existe entre el sistema inmune con la pérdida ósea, debida a la deficiencia estrogénica, y con la regulación ósea basal. De hecho, se ha relacionado la participación de células T, células B, monocitos, incluso de células dendríticas, con la osteoporosis. En este trabajo de Tesis Doctoral se ha estudiado la asociación a masa ósea de genes importantes en el metabolismo óseo, como RUNX2, y otros genes relacionados con el sistema inmune, como OCIL, CD40 y CD40L, en una población de mujeres posmenopáusicas. Debido a que la principal causa de la osteoporosis es la deficiencia estrogénica, el tratamiento más utilizado para esta patología ha sido la terapia hormonal sustitutiva (THS) mediante la administración de estrógenos. Pese a los efectos beneficiosos de la THS en el hueso, se ha descrito diversos efectos adversos, como el aumento en el riesgo de cáncer de mama o alteraciones cardiovasculares, que han llevado a la búsqueda de alternativas terapéuticas a la THS. Entre las alternativas terapéuticas utilizadas actualmente, encontramos compuestos agonistas del receptor de estrógenos, como los moduladores selectivos del receptor de estrógenos (raloxifeno) y fitoestrógenos (genisteina), y también extractos vegetales (Cimicífuga racemosa). En el presente trabajo de Tesis Doctoral se ha estudiado, comparativamente, el efecto sobre la pérdida de hueso y microestructura ósea, mediante micro-TC, de la administración del estradiol, el raloxifeno y la genisteina en el ratón ovariectomizado como modelo animal de pérdida ósea. Asimismo, también se ha evaluado en una población pequeña de mujeres posmenopáusicas, el efecto sobre el metabolismo óseo de un extracto isopropanólico vegetal de Cimicífuga racemosa (Remifemin). / Osteoporosis is a disease characterized by the progressive loss of bone mineral density (BMD) that may compromise bone strength leading to an increased risk of fracture. Although osteoporosis affects an elevated percentage not only of women but also of men, the most frequent form of the disease is the postmenopausal osteoporosis associated with the estrogenic deficiency that occurs in the menopause. Genetic factors have been recognized as playing an important role in the pathogenesis of osteoporosis, although, as a multifactorial disease, it is influenced by other parameters such diet, physical activity, medication use and lifestyle. Twin and family studies have demonstrated a high heritability of BMD. Most of the genetic studies have been focused on genes than regulated the bone metabolism and on several citoquines. Recently, the immune system have been associated with the posmenopausal osteoporosis. In fact, the participation of T cells, B cells, monocytes and dendritic cells have been related with osteoporosis. In this doctoral thesis work we have analyzed the association with BMD of polymorphisms in bone metabolism genes, as RUNX2, and other genes related with the immune system, as OCIL, CD40 and CD40L. The hormone replacement (HRT), with the estrogen administration, has been the main treatment used in the postmenopausal osteoporosis to prevent bone loss. However, there were some studies that have demonstrated some adverse effects in the HRT as cancer and cardiovascular risk. Therefore, attention has been centered on other therapeutic possibilities with lesser side-effects. Among the alternative treatments we can list the estrogen receptor agonist, as the selective estrogen receptor modulators (raloxifene) and phytoestrogens (genistein), as well as vegetable extracts (Cimicífuca racemosa). In this work, we also have studied the effect of estradiol, raloxifene and genistein administration on bone loss and bone microarchitecture in an animal model of accelerated bone loss by using ovariectomized young female mice. Likewise, we studied the effect of an isopropanolic extract of Cimicífiga racemosa on the bone metabolism in a group of postmenopausal women.

Gene loss is the most important event in the process of genome reduction that appears associated with bacterial endosymbionts of insects. These small genomes were derived features evolved from ancestral prokaryotes with larger genome sizes, consequence of a massive process of genome reduction due to drastic changes in the ecological conditions and evolutionary pressures acting on these prokaryotic lineages during their ecological transition to host-dependent lifestyle. In the present thesis, the process of genome reduction is studied from different perspectives. In the first chapter, genome rearrangements have been studied in a set of 31 complete γ-proteobacterial genomes that includes five genomes of bacterial endosymbionts of insects. This is carried out by comparing the order of a subset of 244 single-copy orthologous genes presents in all the genomes and calculating the number of inversions and breakpoints between each genome pair. This reveals that inversions were the main rearrangement event in γ-proteobacteria evolution, with a progressive increase in the number of rearrangements with increased evolutionary distance. However, significant heterogeneity in different γ-proteobacterial lineages was also detected, with a significant acceleration in the rates of genome rearrangements in bacterial endosymbionts of insects at initial stages of the association. In the second chapter, the structure and functional capabilities of Sodalis glossinidius has been studied. S. glossinidius is the secondary endosymbiont of tsetse flies, and it´s at very initial stages of genome reduction process. It´s genome is experiencing a massive process of gene inactivation, with 972 pseudogenes (inactivated genes) that were described but not annotated in the original annotation of the genome. In this chapter, a complete functional re-annotation of this genome was carried out, that includes the characterization of 1501 pseudogenes though analysis of S. glossinidius intergenic regions. A massive presence of CDSs related with mobile genetic elements and surface proteins were detected, being also the functional classes most affected by pseudogenization. The reconstruction of the metabolic map of S. glossinidius revealed a functional profile very similar to that of free-living enterics, with inactivation of L-arginine biosynthesis pathway, whereas the comparison with Wigglesworthia glossinidia (tsetse primary endosymbiont) reveals possible cases of metabolic complementation between both tsetse endosymbionts at thiamine, coenzyme A and tetrahydrofolate biosynthesis level. Finally, in the third chapter of the thesis, the complete reductive evolution process associated with S. glossinidius was studied from a systems biology perspective through the reconstruction of their genome-scale metabolic networks at different stages of this process and the prediction of their internal reaction fluxes under different external conditions through Flux Balance Analysis. This revealed the decisive role of the pseudogenization of genes involved in L-arginine and glycogen biosynthesis and specially the pseudogenization of the key anaplerotic enzyme phosphoenolpyruvate carboxylase in the ecological transition to a host-dependent lifestyle experienced by S. glossinidius. A progressive decrease in network robustness to gene deletion events and to changes in particular reaction fluxes were detected. Finally, reductive evolution simulations over the functional network of S. glossinidius under different external conditions revealed a higher plasticity in minimal networks evolved in a nutrient-rich environment, and allow defining different sets of essential and disposable genes based on their presence or absence in minimal metabolic networks. These essential genes had more optimized patterns of codon usage and more restricted patterns of sequence evolution than disposable genes that could be lost without affecting the functionality of the network. However, lineage-specific estimates of dN and dS in S. glossinidius and Escherichia coli revealed that common features of ancient bacterial endosymbionts like acceleration in the rates of sequence evolution and the loss of adaptative codon usage were starting to affect S. glossinidius evolution. / En esta tesis doctoral, el proceso de reducción genómica característico de bacterias endosimbiontes de insectos ha sido estudiado utilizando diferentes aproximaciones computacionales basadas en la genómica comparada y la biología de sistemas. Por un lado, las dinámicas de reordenaciones genómicas han sido estudiadas en un subconjunto de 31 genomas completos de γ-proteobacterias que incluyen 5 genomas completos de endosimbiontes bacterianos de insectos, revelando una aceleración significativa de las tasas de reordenaciones en estos genomas en etapas iniciales del proceso de reducción. Posteriormente, el genoma de Sodalis glossinidius, el endosimbionte secundario de la mosca tsétsé, fue re-anotado con el objetivo de evaluar el impacto de los procesos de inactivación génica y proliferación de elementos genéticos móviles en etapas tempranas del proceso de reducción, asi como su impacto sobre las capacidades funcionales de la bacteria en el contexto ecológico de su coexistencia con el endosimbionte primario ancestral Wigglesworthia glossinidia. Finalmente, el proceso completo de reducción genómica en S. glossinidius ha sido estudiado a través de la reconstrucción de su red metabólica a diferentes etapas de este proceso y su análisis funcional mediante Análisis de Balance de Flujos, evaluando la robustez de las redes frente a sucesos de deleción asi como las dinámicas evolutivas de genes esenciales y no esenciales en base a su presencia en redes mínimas evolucionadas a partir de la red funcional. Este análisis permitió identificar sucesos de inactivación génica con efectos drásticos sobre las capacidades funcionales del sistema como los genes implicados en la biosíntesis de arginina y glicógeno, y especialmente la inactivación de la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa, asi como una disminución progresiva de la robustez de las redes frente a diferentes sucesos mutacionales asociada al proceso de pérdida génica. Finalmente, simulaciones de evolución reductiva sobre la red funcional bajo diferentes condiciones de entorno ha permitido definir conjuntos de genes esenciales y delecionables en base a su presencia o ausencia en las redes mínimas producto de las simulaciones, revelando una mayor conservación a nivel de secuencia y un uso de codones más optimizado en genes esenciales frente a genes cuya pérdida no afecta a la funcionalidad del sistema.

El coure (Cu) és un element essencial per tal de dur a terme les reaccions de transferència d’electrons en els organismes de metabolisme aerobi. Tanmateix, la citotoxicitat associada a l’excés de Cu, deguda a la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS), implica l’existència de mecanismes homeostàtics regulats de forma precisa. La majoria dels elements de la xarxa homeostàtica del Cu està conservada en els organismes eucariotes. Els transportadors de Cu d’alta afinitat CTR/COPT hi participen durant el procés d’adquisició del metall sota condicions de deficiència. En la present tesi s’escomet l’establiment dels rangs nutricionals de Cu i la identificació de marcadors moleculars associats en la planta model Arabidopsis thaliana. En base als resultats obtesos, se suggereix que els medis ½MS suplementats amb una concentració entre 0.5 i 1 M de CuSO4 comprenen el rang de suficiència de Cu. Per altra banda, l’excés de Cu s’associa als medis suplementats amb una concentració igual o superior a 5 M CuSO4, mentre que la deficiència de Cu s’estableix en els medis suplementats amb una concentració inferior a 0.5 M de CuSO4. El patró d’expressió dels mRNA regulats per Cu suggereix que COPT2 i FSD1 esdevenen marcadors moleculars per detectar el dèficit de Cu, mentre que l’expressió de CCS i CSD1 s’associa a rangs òptims. Atenent a aquests paràmetres, s’ha aportat noves evidències de què el medi ½ MS comercial, considerat un medi estàndard per créixer plantes, esdevé un medi deficient en Cu. En segon lloc, s’ha abordat la caracterització de les proteïnes COPT2, COPT6 i COPT5 d’Arabidopsis thaliana. Podem concloure que COPT2 i COPT6 constitueixen, junt amb COPT1, els transportadors de membrana plasmàtica. Ara bé, mentre que sota condicions de deficiència de Cu COPT1 i COPT2 s’expressen fonamentalment a l’arrel principal amb un patró no solapant, COPT6 és un gen d’expressió exclusiva a la part aèria, els nivells del qual no s’alteren per Cu. La importància del Cu en la planta es reflecteix en què tots tres transportadors de membrana plasmàtica s’expressen a l’embrió i als teixits reproductius, i s’evidencia pels fenotips dels mutants per pèrdua de funció. Tot i que els mutants de pèrdua d’expressió copt2 no exhibeixen alteracions en deficiència de Cu, els mutants COPT1 antisentit manifestaven una disminució en el contingut de Cu endogen i alteracions morfològiques en el gra de pol•len, mentre que la línia mutant copt6 produeix menys llavors que les línies silvestres en condicions de dèficit de Cu. COPT5, per la seua banda, esdevé un transportador intracel•lular probablement associat al compartiment prevacuolar (PVC) d’expressió àmplia en el cos de la planta, a excepció de les anteres i del gra de pol•len, preferentment a nivell de feixos vasculars i nervadures. La manca d’expressió de COPT5 en els mutants per pèrdua de funció causa una hipersensibilitat al dèficit sever de Cu que es tradueix en la inhibició del creixement de l’arrel principal, pèrdua de pes fresc i un estat avançat de clorosi. De la mateixa manera, el dèficit sever de Cu implica en els mutants copt5 una disminució dràstica en el flux de la cadena de transport d’electrons entre fotosistemes, probablement degut a alteracions en la distribució del Cu a la plastocianina. Tot plegat, COPT5 constitueix una via essencial per a la distribució del Cu en condicions de dèficit sever i perllongat de Cu. Les dades aportades en la present tesi doctoral contribueixen a millorar el coneixement de la resposta d’Arabidopsis thaliana al dèficit de Cu i bastiran el desenvolupament de futures estratègies biotecnològiques enfocades tant a la millora de l’adquisició del Cu com a la fitorremediació. / Copper (Cu) is an essential element that participates in electron transfer reactions in aerobic organisms. Nevertheless, Cu excess causes toxicity among others reasons due to reactive oxygen species generation. Eukaryotic cells display conserved homeostatic networks in which the CTR/COPT proteins are involved in high affinity Cu uptake under environmental deficient conditions. In this thesis, we have first studied the availability of Cu in the Arabidopsis thaliana growth medium ½MS. We show that the ½MS medium supplemented with 0.5-1 M CuSO4 represents the Cu sufficiency range, whereas Cu excess is achieved in media with more than 5 M CuSO4 and Cu deficiency results from growth in media with a concentration of CuSO4 bellow 0.5 M. Furthermore, gene expression studies at different Cu concentrations suggest that COPT2 and FSD1 are appropriate markers for Cu deficiency in Arabidopsis. We have also characterized the role played by COPT2, COPT6 and COPT5 in Arabidopsis. According to the expression studies performed with COPT::GFP fusion constructs, COPT2 and COPT6 are plasma membrane proteins. By using COPTp::GUS plants, we show that COPT2 is a Cu-regulated gene, mostly expressed in roots, whereas COPT6 is predominantly expressed in aerial tissues in a Cu-independent manner. Interestingly, our studies demonstrate that Arabidopsis COPT5 is a protein associated to the prevacuolar compartment and expressed through the whole plant, except in anthers and pollen grains. Moreover, copt5 knock-out lines are hypersensitive to Cu deficiency and exhibit an inhibition of the main root growth and a decrease in both fresh weight and chlorophyll when compared to the wild type. Furthermore, Cu deficiency causes the impairment of copt5 electron transport between photosystems, probably due to problems in Cu delivery to plastocyanin. Altogether, these data suggest that COPT5 functioning is crucial for Cu delivery under severe Cu deficiency conditions.