La tesis titulada “Plastic and paper platforms for nanoparticle based immunosensors” presentada como compendio de publicaciones, muestra avances significativos en el campo de los biosensores ópticos y electroquímicos. En la introducción (Capítulo 1) se presenta la importancia que tienen tanto los sensores inmunológicos basados en nanopartículas como los biosensores basados en plataformas de papel y nanomateriales para aplicaciones en diagnóstico. Ambas plataformas destacan por la versatilidad y facilidad de uso, bajo coste y tamaño reducido, lo que hace que sean unos dispositivos excelentes para aplicaciones en países en vías de desarrollo así como para el diagnóstico en casa por el propio paciente o en el consultorio médico. En el Capítulo 2 los objetivos de la tesis están presentados. En la primera parte del Capítulo 3, se explica cómo el tamaño de las nanopartículas de oro afecta a sus propiedades electroquímicas y, por consiguiente, a su detección. Se ha demostrado que para nanopartículas inferiores a 20 nm de diámetro, los efectos Brownianos disminuyen la velocidad de deposición de las nanopartículas en solución, lo que debe ser tenido muy en cuenta para aplicaciones en las que las nanopartículas de oro actúen como marcadores en biosensores. En la segunda parte, se trata sobre el desarrollo de un novedoso método de funcionalización de nanopartículas de oro con anticuerpos. Este método está basado en la interacción entre las cargas positivas que tienen los anticuerpos a pH inferior al de su punto isoeléctrico y las cargas negativas de la superficie de las nanopartículas de oro. Con este método es posible controlar la orientación de los anticuerpos y esto implica poder detectar una menor cantidad de analito (en este caso se uso la inmunoglobulina humana G como proteína modelo). Comparando este método con otro en donde no se controla la orientación, se ha obtenido un límite de detección un orden de magnitud mejor y se ha podido detectar la proteína modelo en una muestra real. En cuanto a la aportación en el campo de los biosensores ópticos, se ha desarrollado un sensor inmunológico basado en inmunoensayos de flujo lateral (LFIA) en papel, aplicado para la detección de inmunoglobulina G humana como se recoge en el Capítulo 4. Esta tecnología destaca por su aplicabilidad y bajo coste (similares a los populares test de embarazo). En esta tesis se han desarrollado dos modificaciones de la tecnología que, sin implicar pérdida en su simplicidad de uso y bajo coste, han aumentado los límites de detección en un orden de magnitud. Una de las modificaciones consiste en unos cambios de la geometría de las tiras que permiten la pre-concentración del complejo analito-marcador en la zona de detección. Esto implica que se puede detectar menor concentración de analito. La otra estrategia consiste en el desarrollo de un doble marcador, donde las nanopartículas de oro están acopladas a un enzima. De esta manera en el LFIA se puede obtener como señal el color rojo de las nanopartículas de oro, como se usa comúnmente, o es posible añadir el substrato del enzima para que catalice una reacción que genere un producto coloreado, que se suma al color rojo de las nanopartículas de oro, aumentando la intensidad del color y mejorando los límites de detección de analito. Ambas modificaciones permiten el uso de este tipo de sensores en una mayor variedad de campos, donde un límite de detección más bajo es necesario. Finalmente, en el Capítulo 5, se presenta también la integración de un transductor electroquímico en soporte de papel. Esta novedosa plataforma, presentada en la tesis como instrumento para la detección de nanopartículas, permite una fácil integración en sistemas ópticos como los LFIAs añadiendo la posibilidad de una cuantificación más precisa. / The thesis entitled “Plastic and paper platforms for nanoparticle based immunosensors” is presented as a compendium of publications and shows important improvements in the field of biosensors. In the Introduction (Chapter 1) the importance of immunosensors based on nanoparticles and on paper platforms is discussed. The resulting systems are versatile, easy-to-use, cheap and of small size, making them excellent devices for their use in third world countries as well as for home-diagnostics. The objectives of the thesis are presented in Chapter 2. Chapter 3 is divided into two main parts; in the first one it is explained that the size of gold nanoparticles (AuNPs) affects their electrochemical properties, and so their detection. It is shown that for AuNPs with a diameter smaller than 20 nm, the Brownian effects make the deposition of AuNPs in solution slower. This must be carefully considered for those biosensors in which the AuNPs are used as labels. In the second a new method to functionalize AuNPs with an oriented antibody is explained. The method is based on the interaction between the positive charges of the antibody, when the pH of the solution is lower than the isoelectric point, and the negative charges of the AuNP surface. In this way it is possible to control the antibody orientation so more antigen molecules can be captured. In this work the human immunoglobulin G (HIgG) was used as model protein. Comparing this method with one that does not control the orientation, an improvement of one order of magnitude in the limit of detection was achieved. Furthermore, the HIgG was detected in real human serum. Regarding the optical biosensors, the development of a lateral flow immunoassay (LFIA) that was used for the detection of HIgG is explained in Chapter 4. This technology stands out for its applicability in several fields and low cost (consider pregnancy tests strips). In this thesis two modifications of the technology are presented improving the limit of detection up to one order of magnitude, without losing the simplicity in the use and the low cost of the analysis. The first modification changes the geometry of the strip allowing the pre-concentration of the antigen-label conjugates on the test zone. In this way less concentrations of analyte are detectable. The second strategy uses as label an AuNPs-enzyme conjugate. In this way it is possible to consider as signal the red color of the AuNPs (as commonly used in the LFIA) or, adding the substrate of the enzyme, the color produced by the catalyzed reaction. The colored product adds intensity to the red of the AuNPs improving the limit of detection of the LFIA. The proposed modifications expand the applicability of this platform to fields, where better limits of detection are required. Finally, in Chapter 5, the integration of a screen printed electrode onto a paper platform is presented. This new platform, used for the detection of nanoparticles, allows an easy integration in paper-based optical sensors, such as LFIA, adding the possibility to a more precise quantification.

La presente tesis describe el desarrollo de nuevos métodos de sensado basados en nuevas propiedades de nanomateriales aplicados en la detección de proteínas y ADN. El trabajo ha sido basado en dos plataformas de sensado: primero, electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs). Estos electrodos fueron aplicados en un ensayo de detección por impedancia eléctrica de nanopartículas de oro (AuNPs). Del mismo modo, SPCE fueron adaptados mediante films de polythionina y nanopartículas de Iridio (IrOxNPs) para la detección de secuencias de ADN. La segunda plataforma utilizada fue basada en papel y tiene el formato de un inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, del inglés lateral flow immunoassays). Esta plataforma se adaptó para la detección de una proteína específica Parathyroid like hormone (PTHLH) utilizando AuNPs como marcas, con el fin de obtener una nueva estrategia más simple, sin marcaje de isótopos radioactivos, menos costosa y más rápida. En el Capítulo 1 se da una visión general de las aplicaciones llevabas a cabo y mejoras aportadas por parte de nanomateriales en el campo de los biosensores, y las posibles aplicaciones en la detección de biomarcadores. En el Capítulo 2 se presentan los objetivos de la tesis. El uso de SPCE como plataforma para la detección de AuNPs mediante medidas de impedancia se presenta en el Capítulo 3 consiguiendo una mejor detección en comparación con métodos similares publicados para la detección de AuNPs. La técnica desarrollada es aplicada satisfactoriamente en la detección de AuNPs de diferente tamaño, y en un magnetoinmunoensayo utilizando AuNPs como marca para la detección de una proteína modelo. En el Capítulo 4, se presenta el trabajo relacionado con el desarrollo de nuevos sensores para la detección de DNA. El sistema está basado en la modificación de SPCEs mediante películas de un polímero y nanopartículas de óxido de iridio (IrOxNPs) sobre las cuales se inmovilizan secuencias de captura de DNA. La detección del ADN objetivo se consigue mediante medidas de impedancia eléctrica, basadas en el efecto de bloqueo del ADN hibridado para la difusión de un indicador redox a la superficie del electrodo. El biosensor resultante, que opera en modo libre de marcas, fue utilizado para la detección de secuencias de ADN específicas para el parásito de Leishmania. En el Capítulo 5 se presentan conclusiones generales y perspectivas futuras. En el Anexo A, se presenta el trabajo relacionado con las plataformas de papel para la detección de una proteína específica, PTHLH. El sistema de detección presentado es del tipo LFIA. La técnica desarrollada supone una alternativa menos costosa, más rápida y menos peligrosa a las técnicas disponibles actualmente. El límite de detección (LOD) conseguido está en el rango de ng mL-1 en muestras reales (medio de cultivo celular y lisado celulares). Además, se comprobó la compatibilidad del método desarrollado con suero humano utilizando suero humano con PTHLH añadido. En el Anexo B, se presenta el trabajo llevado a cabo en una estancia de investigación. En esta sección se presenta la fabricación de sensores electroquímicos de ADN (E-DNA) y basados en aptameros (E-Ab), y la aplicación de dicha tecnología en sensores serigrafiados de oro y en SPCE modificados con AuNPs. El Anexo C representa la investigación llevada a cabo como continuación de otra hecha anteriormente en nuestro grupo. Las condiciones y materiales encontrados previamente se aplicaron en la fabricación de una plataforma de nanocanales para la detección de una proteína secretada por células cultivadas directamente sobre la plataforma de sensado. / This thesis describes the study and development of new biosensing approaches based on novel properties of nanomaterials for the detection of proteins and DNA. The work has been performed in basis of two sensing platforms: first platform, the carbon screen-printed electrodes (SPCEs), were used in a more sensitive detection of gold nanoparticles (AuNPs) through electric impedance measurements. Furthemore, the same platform (SPCE) was adapted through polythinione films and iridium oxide nanoparticles (IrOxNPs) for the detection of specific DNA sequences in a label free assay. The second platform, paper-based platforms in format of Flow Immunoassay (LFIA), using gold nanoparticles as labels is adapted for the detection of a specific protein, Parathyroid like Hormone (PTHLH), with the aim to find a new strategy for simpler, non-hazardous, cheaper and faster detection of the protein. In Chapter 1 a general overview of the application of nanomaterials for the improvement of biosensors and its application in the field of diagnostics and biomarkers detection is presented. In Chapter 2 the objectives of the thesis are presented. Use of SPCE as platform for detection of gold nanoparticles (AuNPs) through electric impedance measurements is presented in Chapter 3. The developed technique is successfully applied in the detection of AuNPs of different sizes, and in a magnetoimmnuoassay for the detection of a model protein using AuNPs as electrochemical labels. In Chapter 4, a novel biosensor for the detection of DNA is presented. The system is based in SPCE modified with polymer films and Iridium Oxide nanoparticles, where capturing DNA sequences have been immobilized. Detection of target DNA sequences is performed through electric impedance measurements, based in the blocking effect of the DNA against the diffusion of a redox indicator to the surface of the electrode. A label free immunoassay for detection of specific sequences of Leishmania parasite’s DNA is shown. In Chapter 5 general conclusions and future perspectives of the presented work are discussed. In Annex A the work related to the paper-based platform for protein detection is presented. In this annex, detection of a specific protein (parathyroid like hormone, PTHLH) through LFIA strips is described. The developed LFIA strips represent a cheaper, faster and non-hazardous alternative to current available systems for PTHLH detection. Limits of detection (LOD) in the range of ng mL-1 for PTHLH in real samples (cell culture media, cell lysates) are reported. Furthermore, the developed system is challenged using human serum spiked with PTHLH, proving the potential of the system to detect PTHLH In human serum. In Annex B the work carried out in a research stay is presented. In this section fabrication of electrochemical DNA (E-DNA), and electrochemical aptamer (E-Ab) biosensors is described. The aim of the work was focused on adapting the E-DNA and E-Ab technology to SPCE, using AuNPs as connecting platform between the thiol modified DNA and the SPCE. Annex C represents a research done as a continuation of a previous one done in the group related mostly to the study of compatible materials with interest to be used as cells growth platforms with interest in sensing. As continuation of this work, in Annex C the conditions and materials previously selected to grow cells are applied in a nanochannel platform for the detection of a protein secreted by the cells grown directly on the sensing platform.

El actual sistema sanitario está llegando a un tope en sus prestaciones. Los recursos disponibles tienden a ser insuficientes para conseguir que la asistencia sanitaria sea como en la actualidad: universal y gratuita. Las nuevas tecnologías y su uso en ocasiones no justificado, la aparición de nuevos fármacos y la tendencia a investigar con los fondos destinados a la asistencia hacen que, a medio plazo, sea previsible el fallo del sistema. Los políticos, que se han apercibido del cambio, han empezado a especular sobre los modelos sanitarios, y su presión se transmite a los gestores de los centros sanitarios que se ven obligados a mejorar sus cuentas de explotación. Realizan experiencias de externalización, algunos se limitan a los servicios centrales no asistenciales (lavandería, cocina, almacén, etc.) pero otros externalizan sus laboratorios cediéndolos a entidades privadas que los gestionan por paquetes a precios cerrados. La economía de escala juega un importante papel en el sector y no es infrecuente que para realizar determinadas técnicas las muestras de sangre puedan llegar a viajar varias horas hasta llegar a sus unidades de procesamiento. Esta realidad: externalización y concentración se va introduciendo paulatinamente en el sector. En el documento encontrarán el desarrollo de una experiencia de casi 10 años de gestión de un laboratorio de análisis clínicos en el marco de una institución que se adapta al futuro, con profesionales comprometidos en el cambio. Las conclusiones mas relevantes de la tesis son: 1. Los criterios de gestión económica de los servicios hospitalarios, hoy por hoy, no los marcan los profesionales. Son diversas las causas que impiden que los responsables de los servicios asuman sus responsabilidades de gestión económica, entre ellas se han de destacar: – La escasa delegación de las partidas económicas que realizan las direcciones. – La escasa preparación de los profesionales en los campos de la gestión. – El nulo refuerzo positivo que se recibe de las direcciones por los “buenos resultados de gestión” (dirección por objetivos). – El valor nulo o meramente simbólico de los presupuestos anuales. 2. Los servicios de hematología y microbiología, en general, consideran que con el buen hacer técnico tienen suficiente. Es necesario adaptarse a las necesidades de los tiempos y no sólo disponer de buenos productos, sino que es necesario gestionar bien los recursos para obtener los productos más competitivos. A diferencia de los hematólogos, microbiólogos e inmunólogos, los bioquímicos (médicos, farmacéuticos, analistas) se han incorporado a los nuevos avances y lideran, con amplia ventaja, el cambio en el laboratorio. 3. Algunos directivos creen, sin demasiado criterio, que las externalizaciones de los servicios de laboratorios pueden conseguir equilibrar sus partidas económicas y consideran que es mejor un gasto fijo presupuestado que el riesgo que representa un laboratorio propio. El coste económico del laboratorio está intrínsecamente ligado al valor añadido que representa para el global de la empresa. Una buena definición de objetivos y un correcto seguimiento de éstos supondrá una mejor gestión global del hospital. 4. El concepto de “Reinos de Taifas” que tienen algunos directores o jefes de servicios centrales, supondrá, sin lugar a dudas, la pérdida de la capacidad competitiva y a la inadecuación con el medio. Esta pérdida de capacidad competitiva es la que puede hacer pensar en criterios de externalización y/o absorción a los gestores de los centros. 5. Los laboratorios y otros servicios centrales se han considerado clásicamente como centros de coste o centros de consumo. En el momento en que la implicación de los profesionales en el concepto de empresa sea total podremos empezar a hablar de centros de beneficio. 6. La tendencia de la actual medicina es la apuesta por la tecnificación, abandonando el concepto más clásico de la historia clínica y la exploración física para dar más valor al “anticuerpo monoclonal“ más sofisticado. La función de los profesionales del laboratorio no es hacer muchas determinaciones, al mejor precio, sino hacer aquellas determinaciones adecuadas para el paciente y que permitan obtener un valor añadido. La bibliografía muestra el exceso de uso de los laboratorios y, probablemente, desde éstos tendríamos que hacer sesiones/campañas de información a los clínicos sobre el coste de la ineficacia. 7. La economía de escala tiene un límite en ocasiones se supera, pero a un coste cada vez más elevado. 8. La cartera de productos de cada centro viene modulada por la demanda que generan sus clínicos y por los intereses de los facultativos de los laboratorios. Las alianzas estratégicas con los propios competidores en el sector pueden permitir ampliar las carteras de productos y mejorar economías de escala. 9. Todo laboratorio debe tener sus productos estrella, que deben ser diferenciados en el sector y que justifican en parte su razón de ser, estos productos estrella son la moneda de intercambio en las alianzas estratégicas. 10. El valor del líder del equipo no sólo debe responder a criterios de capacidad técnica y buen hacer científico, que se suponen, sino que la principal capacidad del nuevo líder de los servicios es el conocimiento del personal que tiene a su cargo y la habilidad para hacer confluir los intereses de los profesionales, los de la empresa y los suyos propios en una única dirección. Si el líder no es capaz de esto, su trabajo tiene un horizonte limitado. / The current healthcare system is reaching a peak in performance. Available resources tend to be insufficient to make the health care as it is today: universal and free. New technologies and its use is sometimes not justified, the emergence of new drugs and the tendency to investigate funding for assistance can make in the medium term, a predictable system failure. Politicians have been warned of the change and have begun to speculate on health models, and pressure is transmitted to the managers of health facilities who have been forced to improve their operating accounts. Outsourcing experiences, have been made some of which are limited to the central non-care (laundry, kitchen, storage, etc.) However other loaning outsource are sent to private laboratories that are managed by closed-priced packages. Scale economies play an important role in the sector and it is not uncommon for certain techniques of blood samples to travel several hours to their processing units. This reality: outsourcing and concentration is being introduced gradually in the sector. In the document you will find the development experience of nearly 10 years of managing a clinical laboratory in an institution adapting to future professionals involved in the change. The most relevant conclusions of the thesis are: 1. The criteria of economic management of hospital services, today are not marked by the profesionals. Several causes prevent that heads of departments assume their responsibilities relating to economic management. Amongst them to be highlighted is: – The lack of delegation of financial items that perform directions. – The lock of preparation of the professionals in the fields of management. – The completely negative reinforcement received from the management for "Successful management" (management by objectives). – The null or merely symbolic value of the annual budget. 2. The hematology and microbiology services in general, considerer that with a good technical know how is sufficient . It is necessary to adapt to the needs of the times and not only to have good products, but it is necessary to manage the resources well, to obtain for more competitive products. Unlike hematologists, microbiologists and immunologists, biochemists (doctors, pharmacists, analysts) have been incorporated into new developments and lead, with extensive advantage, the change in the laboratory. 3. Some managers believe, without much criteria, that the outsourcing of the laboratory services may be able to balance their economic accounts and feel it is best a fixed expense budget rather than the risk posed by one’s own laboratory. The economic cost of the laboratory is intrinsically linked to the added value generated for the company's global. A good definition of goals and a correct monitoring of these will result in a better overall management of the hospital. 4. The concept of "Taifa Kingdoms" which some directors or managers of headquarters, have will without doubt, result in the loss of competitive capacity and inadequacies with the environment. This loss of competitive capacity is such you can think of outsourcing criteria and / or absorption of the managers of the centers. 5. Laboratories and other central services have been considered classically as cost centers or centers of consumption. When involvement of professionals in the business concept becomes total we can start talking total about profit centers. 6. The current trend in medicine is a commitment to expanding technology, abandoning the traditional concept of history and physical examination to give more value to the more sophisticated "monoclonal antibody". The role of laboratory professionals is not to make many determinations, the best price, but to make those determinations suitable for the patient and which would give an added value. The literature shows excessive use of laboratories and, probably, from these they should do sessions / information campaigns to clinicians on the cost of inefficiency. 7. The economy scale sometimes has a limit and is exceeded, but at an increasingly high cost. 8. The product portfolio of each center is modulated by demand generated by their clinical and interests of physicians in the laboratories. Strategic alliances with one's competitors in thesector can afford to expand product portfolios and improve scale economies . 9. Each laboratory should have its star products, which must be differentiated in the industry and partly to justify its raison d'etre, these star products are the currency of exchange in strategic alliances. 10. The value of the team leader must not only meet criteria of technical and scientific excellence, which are assumed, but the main capacity of the new leader is the knowledge services staff that is responsible and the ability to pull together the interests ofprofessionals, the company and its own in a single direction. If the leader is not capable of this, his work has a limited horizon.

La asociación entre un parásito y un hospedador ofrece una excelente oportunidad para el estudio de tazas de especiación y evolución. La base para dichos estudios sólo puede ser enfocada mediante el análisis de filogenético de la asociación parásito-hospedador. Los elementos transponibles son secuencias cortas de ADN que se comportan como parásitos intragenómicos. Ellos son transmitidos verticalmente a través de las generaciones, aunque la transferencia horizontal ha sido propuesta como un paso esencial en su dinámica evolutiva a largo plazo. Galileo es un miembro de la Superfamilia P de transposones de ADN. Galileo fue inicialmente descubierto en Drosophila buzzatii, en donde es responsable de la generación de tres inversiones cromosómicas y subsecuentemente reportado en especies cercanas y en seis genomas secuenciados de Drosophila. En este estudio se ha ejecutado una búsqueda exhaustiva del transposon Galileo en 234 muestras de 133 especies de los géneros Drosophila, Scaptodrosophila, Scaptomyza and Zaprionus con muestras provenientes de ocho regiones zoo-geográficas. Para detectar Galileo se realizaron búsquedas bioinformáticas y experimentales mediante PCR + clonación de la región más conservada de la transposasa. Galileo fue detectado en 152 muestras de 51 especies de Drosophila de los subgéneros Sophophora, Drosophila y Siphlodora. Simultáneamente, la filogenia de 174 especies de Drosophilidae (que incluye todas las especies en las que se realizó la búsqueda de Galileo) se construyó con secuencias parciales de cuatro genes: SinA, ND2, COI y COII. Los resultados son consistentes con una antigua coevolución de Galileo en el género Drosophila. Galileo ha sido encontrado en especies de los subgéneros Sophophora, Drosophila and Siphlodora, que divergieron hace ca. 40-57 millones de años. Un hecho interesante es que Galileo fue detectado en varias poblaciones del subgénero Sophophora de Asia, en donde se piensa ha tenido su origen el ancestro de dicho subgénero. En comparaciones de ambas filogenias, de las especies y Galileo se han encontrado: 1) ocurrencia discontinua (distribución parcheada) entre 31 grupos de especies, 2) incongruencias entre las topologías de los árboles filogenéticos de las especies hospedadoras y Galileo, 3) en el último caso, la divergencia las secuencias de Galileo fue más pequeña entre los genes de las especies hospedadoras, y 4) una señal biogeográfica en la filogenia de Galileo. Los resultados encontrados en este estudio sugieren que el transposon Galileo estuvo presente en el ancestro común más reciente del subgénero Sophophora. La invasión de Galileo en el subgénero Drosophila y Siphlodora puede ser datada en ca. 40-56 Ma, cuando estos clados se separaron. Dentro de su hospedador, Galileo ha sido mayoritariamente transmitido verticalmente con pérdidas estocásticas y propagaciones horizontales antiguas. / Host-parasite assemblages offer exciting possibilities for the comparative study of rates of speciation and evolution. The basis for such studies can only be approached from a phylogenetic analysis of host-parasite association. Transposable elements are short DNA sequences that behave as intragenomic parasites. They are vertically transmitted through many generations, although horizontal transfer has been proposed as an essential step in their long-term evolutionary dynamics. Galileo is a member of the P superfamily of DNA transposons. It was initially discovered in Drosophila buzzatii, where it is responsible for the generation of three chromosomal inversions, and subsequently reported in closely related species and in six Drosophila genomes sequenced. Here in a thorough search of the Galileo transposon has been carried out in 234 samples of 133 species from the genera Drosophila, Scaptodrosophila, Scaptomyza and Zaprionus. The samples come from eight zoo-geographical regions. In order to detect Galileo, in silico BLAST searches and experimental searches by PCR + cloning of the most conserved region of the TPase were performed. Galileo was unequivocally detected in 152 samples of 51 Drosophila species from the subgenera Sophophora, Drosophila and Siphlodora. Simultaneously, the phylogeny of 174 Drosophilid species (including all taxa in which Galileo was searched) was inferred from partial coding sequences of four genes: SinA, ND2, COI and COII. The results are consistent with an ancient coevolution of Galileo in the genus Drosophila. Galileo has been found in species of the subgenera Sophophora, Drosophila and Siphlodora, that diverged ca. 40-57 million years ago. An interesting fact is that Galileo was detected in several populations of the subgenus Sophophora from Asia, where it is thought the ancestor of Sophophora has its origin. In comparisons of both, the Drosophila species and Galileo transposon phylogenies, it was found: 1) discontinuous occurrence of Galileo across 31 species groups (patchy distribution), 2) incongruence between host and TE tree topologies, 3) in the latter case, divergence between Galileo sequences was smaller than between genes of the host species, and 4) a bio-geographical signal in the Galileo phylogeny. These results found herein suggest that the Galileo transposon was present in the most recent common ancestor of the Sophophora subgenus. The invasion of Galileo in the subgenera Drosophila and Siphlodora could be dated at ca. 40-56 Mya, when this clades split. Inside its host, Galileo has been mostly vertically transmitted with stochastic losses and occasional ancient horizontal spreads.

El trabajo recoge los principales aspectos de la producción recombinante de una lipasa del hongo Rhizopus oryzae (ROL) expresada en la levadura Pichia pastoris. El sistema de expresión empleado está basado en la utilización del promotor de la alcohol oxidasa (PAOX1) de la levadura y, por lo tanto es dependiente de la utilización de metanol como substrato inductor. El trabajo recoge una serie de estudios de producción en bioreactor, operando en fed-batch, en los que la productividad del sistema se incrementa hasta en un factor de 11, mediante el estudio de la estrategia de adición del metanol a lo largo de la etapa de producción. Asimismo, estos cultivos se han realizado utilizando un medio de composición sintética, mucho mas económico que el complejo. La optimización de la producción también se ha abordado mediante la construcción de cepas multicopia para el gen ROL, estudiando igualmente, el efecto de la expresión recombinante de la lipasa sobre la cepa hospedadota.Por otro lado, se han construido vectores de expresión basados en la utilización de promotores independientes de la utilización del metanol. Se han obtenido cepas de P. pastoris que expresan la ROL de forma constitutiva y mediante inducción por fuente de nitrógeno.El trabajo recoge en último lugar un protocolo para la recuperación de la ROL recombinante desde el caldo de cultivo hasta la obtención de un extracto liofilizado de lipasa ROL. La purificación de la lipasa se ha llevado a acabo a través de la combinación de los pasos de cromatografía, de intercambio catiónico e interacción hidrofóbica. El grado de pureza obtenido es el adecuado para la utilización de la enzima como biocatalizador en reacciones de química fina y para la obtención de anticuerpos contra la misma. / This work summarises the main aspects of the recombinant production of a lipase of the fungi Rhizopus oryzae (ROL) expressed in the yeast Pichia pastoris. The expression system used is based on the utilization of the alcohol oxidase promoter (PAOX1) of the yeast and therefore is dependent on methanol as the inductor substrate. The productivity of this system has been increased by a factor of 11 by studying the methanol feeding strategy during fed-batch fermentations in bioreactors. Moreover, a synthetic cultivation media has been used for these experiments, which is much more inexpensive than the regular complex ones. Furthermore, ROL multicopy strains have been also developed in order to optimise the final lipase production of the system.In addition, the study of the ROL production has been carried out based on the development of different expression vectors independent of the use of methanol as an inductor of the expression. In this context, we have developed new recombinant P. pastoris strains for the constitutive and nitrogen-dependent expression of ROL.Finally, a down-stream process for the recovery of the lipolitic enzyme has been defined through all stages: from the broth media to the final lyophilised product. The ROL purification has been achieved through two single-chromatography steps, which are cationic exchange and hydrophobic interaction. The final product has a purity which is appropriate for its use in fine chemical reactions and the development of antibodies against it.

Esta disertación, propone estrategias para sistemas urbanos sustentables introduciendo aspectos de eco-innovación en edificios con especial énfasis en reducir la energía y las emisiones de Gases de Efecto Invernadero (GEI). El estudio se desarrolla en dos contextos economicos, social y climáticamente diferentes. Por una parte la mejora ambiental y energética de la vivienda social en México a través de estrategias de eco rehabilitación en el interior y exterior de la misma: eco-tecnologías (equipos eficientes), sombreado y aislamiento (sombra sobre el techo, volados en muros, louvers en ventanas y techo verde) y producción de alimentos (tomates). Se calcularon os requerimientos de energía para enfriamiento de la vivienda social así como la demanda de energía acumulada y emisiones de CO2 asociadas con los materiales usados en las estrategias de sombreamiento. En la producción de alimentos el sistema fue expandido para determinar los impactos respecto a la logística de alimentos (distribución, empaque y pérdidas de producto). Por otra parte, la implementación de invernaderos de producción intensiva de alimentos en las cubiertas de edificios de Ciudades Mediterráneas de Europa, estudiando la barreras y oportunidades ambientales, sociales, económicas y tecnológicas de su implantación. El método de trabajó consistió en grupos multidisciplinarios de discusión a través de seminarios con expertos en diferentes áreas. El potencial de sinergia entre el edificio y el invernadero en términos de flujos de calor fue identificado focalizando únicamente en los requerimientos de energía para calefacción en invierno en un edificio de servicios en Barcelona, España. Para desarrollar esta investigación fue necesario integrar herramientas multidisciplinares y programas de: simulación energética (DesignBuilder, Ecotect), análisis de flujos (CFD), análisis de ciclo de vida (SimaPro) y herramientas sociales como seminarios y grupos focales. Según los resultados, para la vivienda social, las eco-tecnologías pueden proveer una reducción annual del 31% del consumo de energía (35.7 kWh/m2/año). Con la estrategia de sombreado del techo se obtuvo un ahorro de 126 kWh/m2/año. La producción de tomates en las áreas de la vivienda social de Mérida (México) puede aportar ahorros de 662 gCO2eq por kg de tomates producidos. En orden descendiente, los principales contribuyentes de estos ahorros son: requerimientos de transporte (57.7%), pérdida de producto (37.2%) y empaque (5.1%). Respecto al sistema invernadero-edificio, el grupo de expertos coincidió en definir la interconexión entre ambos como una de las oportunidades del sistema al hacer sinergia con los flujos de agua, energía y CO2, así como la reducción del transporte de los alimentos. La metodología aplicada a este estudio resultó positiva debido a la participación interdisciplinaria de expertos lo cual facilitó una visión global de la implementación del proyecto. De acuerdo al análisis energético, un total de 87 kWh/día de calor fue removido del invernadero con la finalidad de disminuir su temperatura. Este dato indica una estimación del potencial del calor que puede ser transferido al edificio en un día típico de invierno. Basado en los resultados generados en esta investigación, futuras líneas de investigación pueden ser desarrolladas con la finalidad de determinar otros beneficios energéticos y ambientales del sistema. Las estrategias presentadas en esta disertación tienen el objetivo de facilitar el desarrollo sustentable en sistemas urbanos através de la investigaciones para mejorar la vivienda social en países en vías de desarrollo e implementar la agricultura urbana en ciudades compactas. / This dissertation proposes strategies for sustainable urban systems, introducing eco-innovation in buildings and paying particular attention to energy and GHG emissions. The study was developed in two diferent social, economical and climatic contexts. Firstly, environmental and energy improvement of social housing in a warm-humid climate in Merida (Mexico) is investigated, through eco-rehabilitation strategies such as ecotechnologies (efficient equipment), shading and insulation (Above roof shade, overhangs on walls, louvers in windows and green roof) and food production (tomato). Energy requirements for cooling in social housing, cumulative energetic demand and CO2 emissions associated with the materials used in shading and insulative strategies were calculated. In food production, the expanded system is considered, in order to determine impacts related to food logistics (distribution, packaging, retail). Secondly, Rooftop Eco-Greenhouse (RTEG) is presented as an eco-innovative system that incorporates agriculture into the rooftops of buildings in Mediterranean European cities. A list of environmental, economical, technological and social barriers, as well as opportunities for the implementation of the RTEG system, were obtained. The work method consisted of discussion seminars involving an interdisciplinary group of experts from different areas. In addition, the potential for synergies between buildings and RTEG systems in terms of heat flows was identified, focusing only on heating requirements in winter, in an office building in Barcelona (Spain). To develop this research, multidisciplinary tools and software programs such as energy simulation (DesignBuilder, Ecotect), flow analysis (CFD), life cycle analysis (SimaPro) were used. Social tools, such as seminars and focus groups, were also utilised. According to the results for social housing, eco-technologies could potentially provide reduce annual energy consumption by 31% (35.7kWh/m2/year). The ‘Above roof shade’ strategy can provide a saving of 126kWh/m2/year. Production of tomatoes in social housing areas in Merida (Mexico) could provide a savings of 662 gCO2eq per kg of tomatoes produced. In descending order, the main contributors to these savings are transport requirements (57.7%), retail phase (37.2%) and re-usable packaging (5.1%). In respect to RTEG, we would highlight the interconnection of the building and the greenhouse as an opportunity for RTEG, making use of water, energy and CO2 flows between both, as well as reducing food transportation requirements. The participation of experts helped to produce a global vision for the implementation of the project. According to energy analysis, a total of 87 kWh/day of heat was removed from the greenhouse, in order to reduce its temperature. This data indicates the potential amount of heat that could be transferred to the building in a study day. Based on the results generated by this research, further lines of research can be investigated, in order to determine other energy and environmental benefits of the RTEG system. All strategies presented in this dissertation aim to facilitate the sustainable development of urban systems, through researching eco-innovation in the field of improvement of social housing in Developing Countries and urban agriculture in compact cities.

La història evolutiva dels insectes és llarga i complexa. Inferir les relacions evolutives dels insectes, amb la seva fascinant diversitat, és encara avui un gran repte, fins i tot amb les recents aportacions teòriques i tecnològiques. Aquesta tesi tracta de resoldre un seguit d’exigents qüestions relacionades amb l’evolució dels insectes, tot mitjançant mètodes d’inferència filogenètica. Donat l’ample ventall de divergències en que la reconstrucció d’arbres filogenètics es pot dur a terme, s’adrecen sis casos d’estudi a diferents nivells taxonòmics, cobrint un ampli espectre de divergències filogenètiques. A nivells taxonòmics profunds, s’estudia l’aplicabilitat d’utilitzar genomes mitocondrials complets com a marcadors filogenètics per a resoldre relacions entre ordres d’insectes. Es demostra que certs biaixos sistemàtics es poden eliminar substancialment si s’utilitza una metodologia adient, per així finalment obtenir filogènies en acord amb les hipòtesis més acceptades que es deriven de dades morfològiques i nuclears. A divergències intermitges, es realitza una revisió taxonòmica del grup de les papallones blaves Polyommatus mitjançant la reconstrucció d’una filogènia sòlida. Mitjançant l’establiment d’un marc temporal flexible que pugui incorporar incertesa filogenètica així com les actuals delineacions taxonòmiques, es defineixen un seguit de criteris pràctics per tal de consolidar la sistemàtica dels gèneres d’aquest grup de papallones d’enorme complexitat. Quant a divergències recents entre taxons estretament relacionats, s’exploren questions sobre límits entre espècies. En primer lloc, s’avalua el model GMYC per a delimitació d’espècies basant-se en arbres d’un sol locus, tot fent servir una exhaustiva matriu de dades de lepidòpters amb informació taxonòmica creïble. Els resultats mostren que aquest mètode per estudiar massivament la biodiversitat és capaç d’identificar entre un 80% i un 90% d’espècies correctament, i que és força estable sota una gran diversitat de circumstàncies com ara una elevada presència de llinatges únics, un ampli nivell taxonòmic o amb la presència de buits en una cobertura de mostratge intraespecífic. Seguidament, s’estudia l’estatus d’una possible nova espècie de formiga del gènere Lasius provinent de les cotes altes de l’illa de Mallorca. L’evidència morfològica, molecular i ecològica explorada confirma l’estatus d’espècie i així es descriu la primera formiga endèmica de les Illes Balears. Donada l’isolament altitudinal, l’extremadament baixa diversitat intraespecífica, rang de distribució i densitat de nius que es documenten, fan que la predicció mitjançant models climàtics per a condicions futures suggereixi una alta probabilitat d’extinció a curt termini per a Lasius balearicus sp. nov. Finalment, s’adrecen qüestions sobre límits entre espècies dins de dos llinatges relacionats de les papallones Polyommatina, les quals presenten fascinants diferències en el nombre cromosòmic, així com radiacions ràpides d’espècies, dos fenòmens molt probablement relacionats. Dins d’Agrodiaetus, s’avalua una tendència a la divisió de taxa en múltiples espècies tot contrastant dades genètiques i cromosòmiques per a espècies europees amb distribucions extremadament puntuals. Així, es realitza una reorganització taxonòmica i una avaluació sobre les necessitats de conservació. Dins de Lysandra, un gènere en què la morfologia és poc útil, s’obtenen relacions filogenètiques incertes donada una segregació incompleta de llinatges així com per freqüents casos d’hibridació. La inestabilitat cromosòmica s’hauria originat com a mínim en tres ocasions i en alguns casos s’observa fins i tot dins una mateixa espècie. Basant-se en l’evidència filogenètica i noves dades de cariotips, es proposa una reorganització que reconeix deu espècies dins del gènere. / Insects have had a complex and long evolutionary history. Mapping the evolutionary relationships of insects, with their stunning diversity, remains a challenge, even in light of new theory and technology. This thesis aims to face a variety of challenging questions on systematics and evolution of the insects, methodologically conducted by phylogenetic inference. Given the enormous range of divergences at which tree reconstruction can be done, six study cases are addressed at different taxonomic levels, covering a wide spectrum of phylogenetic divergence. At deep taxon levels, the feasibility of using complete mitochondrial genomes as phylogenetic markers to resolve inter-ordinal relationships of insects is studied. It is shown that systematic biases can be substantially avoided by using the proper methodology, to finally reconcile mitochondrial phylogenies with the most generally accepted hypotheses bases on morphological and nuclear data. At intermediate divergences, a taxonomic revision of the Polyommatus butterflies is performed, based on constructing a reliable phylogenetic framework. Establishing a flexible temporal threshold to accommodate phylogenetic uncertainty and current taxonomic delineations, helps to set practical criteria to consolidate the generic systematics of such a complex group of butterflies. At recent divergences among closely related taxa, limits among species are explored. First, the GMYC model for species delimitation based on single-locus trees is evaluated for a comprehensive dataset of butterfly fauna with credible taxonomic information. It is found that this method for assessing large-scale biodiversity surveys successfully identify a range between 80% and 90% of species, being remarkably stable under a wide array of circumstances including high singleton presence, taxon level and presence of gaps in intraspecific sampling coverage. Next, a potential new species of ant of the genus Lasius from Mallorca island high elevations is studied. All morphological, molecular and ecological evidence gathered confirm a specific status for the new taxon and thus the first endemic ant from the Balearic Islands is described. Given the altitudinal isolation, the extremely low intraspecific diversity, total range and nest densities documented, an assessment using climatic models for future conditions suggest a high probability of short-term extinction for Lasius balearicus sp. nov. Finally, species limits are assessed within two related lineages of Polyommatina butterflies displaying intriguing differences on chromosome numbers and fast species radiations, two phenomena most likely related. Within Agrodiaetus, taxonomic oversplitting is evaluated by contrasting chromosomal and genetic evidence for species with dot-like distributions in Europe. A taxonomic reorganization and evaluation of conservation efforts are conducted. Within Lysandra, a genus with difficult morphological diagnosability, uncertain phylogenetic relationships are found due to mixed incomplete lineage sorting and frequent hybridization. Chromosomal instability might have originated at least on three occasions, and variability in this character can be found even within the same species. Based on phylogenetic evidence and new karyotypic data, it is proposed a rearrangement recognizing ten species within the genus.

Il superavvolgimento del DNA nelle cellule, regolato dalle DNA Topoisomerasi, influenza molti processi biologici, quali la trascrizione, la replicazione, la ricombinazione ed il rimodellamento della cromatina. La DNA Topoisomerasi IB eucariotica, (Top1), è un enzima efficiente nella rimozione dei superavvolgimenti del DNA in vitro e la sua principale funzione cellulare è la rimozione dei superavvolgimenti positivi e negativi generati durante la trascrizione e la replicazione. Risultati recenti hanno fornito evidenze sperimentali del coinvolgimento di Top1 in meccanismi multipli di regolazione dell’espressione genica eucariotica, in particolare nella fase di inizio e maturazione dei trascritti. Tuttavia, le funzioni di Top1 non sono ancora state stabilite a livello globale. Pertanto, nella presente tesi di dottorato abbiamo risposto a questa domanda con l’analisi dei profili di trascrizione genica globale e con studi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule di S. cerevisiae. Circa il 9% dei geni sono influenzati da Top1, e l’analisi dei profili di espressione mostra che Top1 wt aumenta l’utilizzo del glucosio e dei pathway per la produzione di energia, con specifica diminuzione della trascrizione dei geni telomerici e subtelomerici. Abbiamo inoltre dimostrato che Top1 wt, ma non il suo mutante inattivo, aumenta la velocità di crescita cellulare nelle cellule di lievito studiate. Le analisi di ChIP mostrano che, in confronto all’assenza dell’enzima, Top1 wt diminuisce l’acetilazione dell’istone H4, compresa quella specifica della lisina 16, nel telomero destro del cromosoma XIV mentre la mutazione che inattiva l’enzima aumenta in maniera marcata l’acetilazione dell’istone H4 e la di-metilazione della lisina 4 dell’istone H3. Top1 wt incrementa anche il reclutamento di Sir3 nelle regioni di confine della cromatina silenziata dello stesso telomero. Studi di immunoprecipitazione indicano che l’enzima interagisce direttamente con la struttura della cromatina telomerica poichè entrambe le proteine, quella wt e quella inattiva, sono localizzate sulle ripetizioni telomeriche dei cromosomi di lievito. Questi risultati dimostrano che Top1, una proteina non essenziale in lievito, ottimizza i livelli globali dei trascritti per una crescita più efficiente di cellule in fase esponenziale. Indagando il meccanismo che è alla base della specifica repressione dei geni telomerici, abbiamo dimostrato che Top1 favorisce delle modifiche posttraduzionali degli istoni che indicano una struttura della cromatina repressa nelle regioni telomeriche.

Helicobacter pylori, un patogeno umano in grado di colonizzare la nicchia gastrica, è associato a patologie del tratto gastrointestinale di varia gravità. Per sopravvivere nell’ambiente ostile dello stomaco dell’ospite, e mettere in atto un’infezione persistente, il batterio si serve di una serie di fattori di virulenza che includono anche le proteine Heat Shock (chaperone). I principali geni codificanti le proteine chaperone in H. pylori sono organizzati in tre operoni trascritti dall’RNA polimerasi contenente il fattore sigma vegetativo σ80. La trascrizione di due dei tre operoni è regolata negativamente da due regolatori trascrizionali, HspR e HrcA, mentre il terzo operone è represso solo da HspR. Fino ad ora, studi molecolari per la comprensione del ruolo di ciascuna proteina nel controllo trascrizionale dei geni heat shock sono stati ostacolati dalla citotossicità ed insolubilità di HrcA quando espressa in sistemi eterologhi. In questo lavoro, è stata analizzata la sequenza amminoacidica di HrcA ed è stata confermata sperimentalmente la predizione bioinformatica della sua associazione con la membrana interna. La citotossicità e l’insolubilità di HrcA in E. coli sono state alleviate inducendone l’espressione a 42°C. Saggi in vitro con le proteine ricombinanti purificate, HspR e HrcA, hanno consentito di definire i siti di legame dei due repressori sui promotori degli operoni heat shock. Ulteriori saggi in vitro hanno suggerito che l’affinità di HrcA per gli operatori è aumentata dalla chaperonina GroESL. Questi dati contribuiscono parzialmente alla comprensione del meccanismo di repressione della trascrizione espletato da HrcA e HspR e permettono di ipotizzare il coinvolgimento di altri regolatori trascrizionali. L’analisi di RNA estratti dal ceppo selvatico e dai mutanti hrcA, hspR e hrcA/hspR di H.pylori su DNAmacroarrays non ha evidenziato il coinvolgimento di altri regolatori trascrizionali, ma ha permesso l’identificazione di un gruppo di geni indotti da HrcA e/ HspR. Questi geni sono coinvolti nella biosintesi e regolazione dell’apparato flagellare, suggerendo un’interconnessione tra la risposta heat shock e la motilità e chemiotassi del batterio.

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