Understanding the early life stages of fishes and the processes influencing their survival has been at the heart of the fisheries oceanography since the beginning of the 20th century. By focusing on spatial and temporal patterns in the ichthyoplankton (those early stages whose horizontal location is largely determined by currents), it is possible to gain some understanding of interrelationships among environmental conditions, fish spawning phase and dispersal/survival dynamics of the planktonic stages of fish. The different physical and/or biological processes controlling Larval Fish Assemblages (LFAs) variability (abundances, composition and distribution) act at very different space and time scales. Sampling the sea at the appropriate frequency and at adequate time and space scales is required to evaluate those mechanisms. These studies are insufficiently developed in the Balearic Archipelago, a hotspot for biodiversity located in an extremely dynamic area of the Mediterranean. With this premise in mind, the main objective of the thesis was to deepen in the knowledge of LFA dynamics in the Balearic Sea (NW Mediterranean) at different spatio-temporal scales. Four different approaches were addressed. At a sub-seasonal temporal scale, the influence of coastal environmental conditions during the shift from winter-spring to summer on fish larvae assemblages in a temperate area was evaluated. Larval fish assemblages were sampled fortnightly at three stations located in coastal waters off southern Mallorca from March to August 2007, covering the main spawning period for the resident coastal fish in this region. The larval fish assemblage showed clear seasonality with higher specific abundance but lower diversity in the spring, probably linked to a spatial (at the vertical scale) shift in the energy flow, which may trigger the summer spawning of many bottom-dwelling species. At the submesoscale domain, the factors that may regulate the previously suggested high levels of larval self-recruitment were explored in Cabrera National Park (CNP), an insular Marine Protected Area (MPA) located off southern Mallorca. Our study attributes the regulation of larval arrival to the MPA to a combination of retention by topographically generated circulation patterns around the island and shelf break frontal dynamics. Also at scales smaller than the mesoscale, we examined fish larval distribution drivers in Palma Bay, a large (~20 Km) wind-driven microtidal bay in the southern coast of Mallorca. Distributions and abundances of fish larvae in the Bay were analyzed and interpreted in the context of the observed circulation patterns, adult habitat distribution and spawning traits. Acoustic Doppler Current Profiler (ADCP) observations showed the presence of retentive flow patterns in the middle of the Bay enhancing local larval accumulation and self-recruitment. A multivariate approach based on Redundancy Analysis (RDA) revealed differences between the larval fish assemblages in the Bay, constituted by small pelagic and benthopelagic families (Gobiidae, Chromis chromis and Serranus hepatus) and offshore larvae, mostly from meso and large pelagic fish. These larval fish assemblages were structured according to depth variations and zooplankton abundance, and remained relatively unmixed because of the circulation patterns in the mouth of the Bay that uncouple its dynamics from alongshelf circulation. At mesoscale level, we investigated the effect of two hydrographic scenarios, representing well-known contrasting examples of the early summer mesoscale dynamics in the archipelago, on the summer larval fish assemblages during two cruises in 2004 and 2005. While depth was the most important variable in explaining the assemblage structure and diversity observed under both scenarios, indicators of mesoscale activity (dynamic height, geostrophic velocity) contributed significantly to understanding the dynamics of the larval fish community. The larval assemblage dynamics are discussed in terms of species-specific and extrinsic factors, including future consequences of potential changes in these environmental scenarios. The main results of this thesis are put together in context in a general discussion section and shortcomings and future directions are explored. / Desde principios del siglo veinte, el estudio de los estadios tempranos de los peces y de los procesos que influyen en su supervivencia forma parte de la oceanografía pesquera. La investigación de los patrones temporales y espaciales del ictiopláncton hace posible entender las relaciones entre las condiciones del ambiente, la fase reproductiva de los adultos y la dinámica de supervivencia y retención de los estadios planctónicos de los peces. Los diferentes procesos físicos y/o biológicos que controlan la variabilidad (abundancia, composición y distribución) en las comunidades de larvas de peces (a partir de aquí LFA, del inglés Larval Fish Assemblage) actúan a escalas espaciales y temporales muy diferentes. Se hace necesario por tanto muestrear en el mar con la frecuencia apropiada y a la escala espacio-temporal adecuada para evaluar esos mecanismos. Este tipo de estudios son escasos en el archipiélago Balear, punto de interés de la biodiversidad y situado en un área del Mediterráneo extremadamente dinámica. Teniendo todo lo anterior en cuenta, el principal objetivo de la tesis fue profundizar en el conocimiento de la dinámica de las LFA en el Mar Balear, a diferentes escalas espacio-temporales. Se realizaron cuatro aproximaciones diferentes. A escala temporal, se evaluó la influencia de las condiciones ambientales costeras durante la transición primavera temprana-verano sobre las LFAs. Se realizaron muestreos quincenales entre marzo y agosto (cubriendo el pico de puesta de la mayoría de las especies de la zona) en tres estaciones de la zona costera del sur de Mallorca. Las LFAs reflejaron claramente la estacionalidad de la zona con una alta abundancia de especies pero bajas densidades de larvas en primavera, probablemente relacionada con la transición espacial (en el plano vertical) del flujo de energía que seguramente desencadena la puesta estival de muchas de las especies cercanas al fondo. A una escala menor que mesoescala, se estudiaron los factores que regulan los altos niveles de auto reclutamiento previamente sugeridos para el Parque Nacional de Cabrera. Nuestro estudio atribuye la regulación de la llegada de larvas al área a una combinación de retención por los patrones de circulación generados por la topografía alrededor de Mallorca y la dinámica asociada a un frente de plataforma. También a escala inferior a la mesoescala, examinamos los agentes responsables de la distribución de LFAs en la bahía de Palma en la costa sur de Mallorca. Se analizaron e interpretaron la abundancia y distribución horizontal de las larvas de peces en la bahía en el contexto de los patrones de circulación observados, el hábitat de los adultos y las estrategias de puesta. Mediante observaciones de un perfilador de corrientes mediante Doppler, se describió la presencia de patrones retentivos de circulación en el medio de la bahía que favorecen la acumulación de larvas locales y el auto reclutamiento. Una aproximación multivariante basada en el análisis de redundancia (RDA) reveló diferencias entre la comunidad de la bahía formada por familias bentopelágicas y de pequeños pelágicos y una LFA de especies más lejanas a la costa, principalmente mesopelágicos y grandes pelágicos. Esas comunidades estaban estructuradas según variaciones en profundidad de abundancia de zooplancton y permanecían relativamente separadas debido a que los patrones de circulación a la entrada de la bahía separan su dinámica interna de la circulación en la plataforma. A nivel de mesoescala investigamos mediante dos campañas en años consecutivos el efecto que ejercen dos escenarios hidrográficos (que representan ejemplos de escenarios muy contrastados entre sí característicos de la dinámica de mesosescala en verano en el archipiélago) sobre las LFAs estivales en la zona. Bajo ambos escenarios, la profundidad resultó ser la variable que mejor explicaba la estructura de la comunidad y su diversidad. Aun así, los indicadores de actividad mesoescalar (altura dinámica, velocidad geostrófica) contribuyeron de manera significativa a entender la dinámica de las LFAs. Los principales resultados de esta tesis se tratan como conjunto en una discusión general final donde también se comentan las limitaciones y se exploran las posibilidades de futuro. / Des de principis del segle vint, l’estudi dels estadis primerencs dels peixos i dels processos que influeixen en la seva supervivència forma part de l’oceanografia pesquera. La recerca dels patrons temporals i espacials del ictioplàncton fa possible entendre les relacions entre les condicions de l’ambient, la fase reproductiva dels adults i la dinàmica de supervivència i retenció dels estadis planctònics dels peixos. Els diferents processos físics i biològics que controlen la variabilitat (abundància, composició i distribució) en les comunitats de larves de peixos (d’aquí endavant LFA, de l’anglès larval Fish Assemblage) actuen a escales espacials i temporals molt diferents. Es fa necessari per tant mostrejar la mar amb la freqüència adient i a la escala espaitemporal adequada per avaluar aquests mecanismes. Aquest tipus d’estudi son escassos a les Illes Balears, punt d’interès de la biodiversitat i situades a un àrea de la Mediterrània extremadament dinàmica. Amb tot lo anterior en ment, l’objectiu principal d’aquesta tesi va ser augmentar el coneixement de la dinàmica de les LFA a la Mar Balear, a diferents escales espai-temporals. Es varen realitzar quatre aproximacions diferents. A l’escala temporal, es va avaluar la influencia de les condicions ambientals costaneres durant la transició primavera-estiu sobre les LFAs. Es varen realitzar mostreigs quinzenals de març a agost (pic de posta de la majoria de les especies de la zona) a tres estacions costaneres del sud de Mallorca. Les LFAs varen reflectir clarament la estacionalitat de la zona amb una alta abundància d’espècies però amb baixes densitats de larves a la primavera amb molta probabilitat relacionada amb la transició espacial (dins del pla vertical) del flux d’energia que segurament desencadena la posta estival de moltes especies properes al fons. A una escala menor que la mesoescala, es varen estudiar els factors que regulen els alts nivells de auto reclutament prèviament suggerits per el Parc Nacional de Cabrera. El nostre estudi atribueix la regulació de l’arribada de larves al àrea a una combinació de retenció pels patrons de circulació generats per la topografia al voltant de Mallorca i la dinàmica associada a un front de plataforma. També a escala inferior a mesoescala, vàrem examinar els agents responsables de la distribució del LFA a la badia de Palma a la costa sud de Mallorca. Es varen analitzar i interpretar la abundància i distribució horitzontal de les larves de peixos a la badia en el context dels patrons de circulació observats, l’habitat dels adults i les estratègies de posta. Mitjançant observacions amb un perfilador de corrents Doppler es va descriure la presencia de patrons retentius de circulació al mig de la badia que afavoreixen la acumulació de larves locals i el auto reclutament. Una aproximació multivariant basada en l’anàlisi de redundàncies (RDA) va revelar diferencies entre la comunitat de la badia formada per famílies bentopelàgiques i de petits pelàgics i una LFA d’espècies mes allunyades de costa, principalment mesopelàgics i grans pelàgics. Aquestes comunitats estaven estructurades segons variacions en profunditat de abundància de zooplàncton i romanien relativament separades degut a que els patrons de circulació a l’entrada de la badia separen la seva dinàmica interna de la circulació a la plataforma. A nivell de mesoescala vàrem investigar mitjançant dues campanyes a anys consecutius l’efecte que exerceixen dos escenaris hidrogràfics (que representen exemples d’escenaris molt contrastats l’un de l’altre característics de la dinàmica de mesoscale a l’estiu a l’arxipèlag) sobre les LFAs estiuenques a la zona. Sota ambdós escenaris, la fondària va resultar ésser la variable que millor explicava l’estructura de la comunitat i la seva diversitat. Tot i això, els indicadors d’activitat mesoscalar (alçada dinàmica i velocitat geostrofica) varen contribuir se manera significativa a entendre la dinàmica de les LFAs. Els principals resultat d’aquesta tesi es tracten com a conjunt a una discussió general final on també es comenten les limitacions i s’exploren les possibilitats de futur.

Serogroup B Neisseria meningitidis (MenB) is the cause of the invasive meningococcal disease (IMD). Bexsero is the first genome-derived vaccine against MenB. Neisserial adhesin A (NadA) is one of the three protein antigens included in Bexsero. The main aim of this work was to obtain detailed insights into the structure of vaccine NadA variant 3 (NadAv3) and into the molecular mechanisms governing its transcriptional regulation by NadR (Neisseria adhesin A Regulator). A deep understanding of nadA expression is important for understanding the contribution of NadA to vaccine-induced protection against meningococcal disease. NadA expression is regulated by the ligand-responsive transcriptional repressor NadR. The functional, biochemical and high-resolution structural characterization of NadR is presented in the first part of the thesis (Part One). These studies provide detailed insights into how small molecule ligands, such as hydroxyphenylacetate derivatives, found in relevant host niches, modulate the structure and activity of NadR, by ‘conformational selection’ of inactive forms. In the second part of the thesis (Part Two), strategies involving both protein engineering and crystal manipulation to increase the likelihood of solving the crystal structure of NadAv3 are described. The first approach was the rational design of new constructs of NadAv3, based on the recently solved crystal structure of a close sequence variant (NadAv5). Then, a comprehensive set of biochemical, biophysical and structural techniques were applied to investigate all the generated NadAv3 constructs. The well-characterized trimeric NadAv3 constructs represented a set of high quality reagents which were validated as probes for functional studies and as a platform for continued attempts for protein crystallization. Mutagenesis studies and screenings to identify a new crystal form of NadAv3 were performed to improve crystal quality; structure determination is ongoing. The atomic resolution structure of NadAv3 will help to understand its biological role as both an adhesin and a vaccine antigen.

Considering the crucial involvement of matrix metalloproteinases’ (MMPs) misregulated activity in the pathogenesis of several degenerative diseases, this class of enzymes has been considered a highly active set of targets for the design of new therapeutic agents. However, the scant success of synthetic MMP inhibitors, largely due to the disappointing results obtained in both clinical and preclinical studies, makes medicinal plants a valuable source of new active compounds able to modulate MMPs activity. In this work, a consistent number of plants, selected on the base of an ethnobotanical research, were tested as inhibitors of collagenase, the founding member of the MMPs family. 1H-NMR-based metabolomic analysis combined with multivariate data treatment (PLS and OPLS) was used to correlate the biological activity to the phytochemical profiles, suggesting tannins as an important class of collagenase inhibitors. Thus, a tannin-removal procedure was developed, which allowed to prove this hypothesis and to identify another class of active metabolites, the glucuronide-conjugated flavonoids (especially quercetin-3-O-β-glucoronide), whose the plant Alchemilla vulgaris was found to be a good source. In another stage of the project, different varieties of tea were investigated as collagenase inhibitors, finding black tea samples particularly potent. Then, an OPLS model was developed with the aim of correlating the biological activity to the UV-Vis spectra of teas, showing that a high activity was related to absorption values in the range 350-440 nm. A subsequent fractionation of the most active tea sample was carried out, and this approach allowed to corroborate the results obtained by the metabolomic analysis. Considering that the absorbance measurement of an extract represents a cheap and simple procedure, the proposed method can be suitable, for instance, to select the best tea variety to be developed as an anti-wrinkles cosmetic or food supplement.

Neisseria meningitidis is a strictly human pathogen and is a major cause of septicemia and meningitis worldwide. Factor H binding protein (fHbp) is a surface-exposed lipoprotein that binds human factor H (hfH) allowing the bacterium to evade the host innate immunity response. Of note, fHbp is a key antigen in two vaccines against N. meningitidis serogroup B. Although the fHbp gene is present in most circulating meningococcal strains, its level of expression varies among isolates and may influence strain susceptibility to anti-fHbp antisera. The aim of the study was to understand the sequence determinants that control fHbp expression in globally circulating strains. We analyzed the upstream fHbp intergenic region (fIR) of a panel of 105 invasive strains and we identified nine fIR sequence types which represent 77% of the isolates. By mass spectrometry we obtained an absolute quantification of fHbp in the same panel of strains and found a correlation between the fIR type and fHbp amounts. By the generation of a series of isogenic recombinant strains, where fHbp expression was under the control of each of the nine fIR types, we were able to confirm that the fIR sequence determines a specific level of expression and investigate the major determinants involved. The quantity of fHbp on the surface of the bacteria correlated directly with the susceptibility to killing mediated by anti-fHbp antibodies in immune sera. The influence of fHbp to mediate the evasion from generic complement-mediated killing presumably through binding of hfH was assessed and survival in human non-immune serum was less correlated with protein amounts measured from an in vitro growth culture. Overall, we demonstrated that the expression level of this antigen can be inferred by the DNA sequence of the fHbp intergenic region. Therefore, our findings can contribute to understand and predict vaccine coverage mediated by fHbp.

In this research the phenomenon of monoclonal antibodies (mAbs) cooperative bactericidal activity and the structure of the N.meningitidis antigen NadA var.3 are investigated using Transmission Electron Microscopy (TEM). The mAbs cooperativity is a mechanism that occurs when mAbs that individually show low or no bactericidal activity become bactericidal when coupled together. Revealing the structural bases of cooperative bactericidal activity is fundamental for a thorough understanding of antibody-based mechanisms of protection. Meningococcal factor H binding protein (fHbp), surface-exposed lipoprotein presents in the vaccine against serogroup B Neisseria meningitidis, Bexsero®. A comparison of the structure of the murine cooperative complex with the human cooperative one has been performed revealing a higher level of flexibility and instability of the first complex. Moreover we have been able to prove a simultaneous binding of factor H (fH) to the immune cooperative complex. The 3D structures of the cooperative complexes demonstrated that the angle formed between fHbp-antibodies is orientated only depending on the epitope location on the antigen. Non-cooperative human complexes show a structural dissimilarities compared with the cooperative couples mainly for the absence of the complex formation due to the partial epitopes overlapping, as proved by Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX_MS). The NadA var. 3, the variant included in Bexsero® vaccine, structure was determined by the Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM) technique combined with Single Particle (SP) reconstruction method. The 3D reconstruction of NadA var.3, generated from Cryo-TEM data, shows an elongated and thin stalk decorated by a globular compact head characterized by a three-fold symmetry. Moreover the 3D EM map shows three evident points of interruption in the density of the stalk region presumably correlated with the three interruptions present in the coiled-coil periodicity of NadA var.3 the sequence. This result indicates a possible alternative mechanism of the antigen flexibility.

Tesi realitzada a l'Institut de Bioenginyeria de Catalunya (IBEC) / The heart can be considered the most important organ of our body, as it supplies nutrients to all the cells. When affected from injuries or diseases, the heart function is hampered, as the damaged area is substituted by a fibrotic scar instead of functional tissue. Understanding the mechanisms leading to heart failure and finding a cure for cardiac diseases represents a major challenge of modern medicine, since they are the leading cause of death and disability in Western world. Being the heart a vital organ it is difficult to have access to its cells, especially in humans. In order to model it or find therapeutic strategies many approaches and cell sources have been studied. For example cardiac stem cells, skeletal myoblasts, bone marrow-derived cells and peripheral blood mononuclear cells have been tested in pre-clinical and clinical trials, without significant tissue regeneration. Human pluripotent stem cells (hPSC) are thought to be the most promising cell type in the field, thanks to their unlimited capacity of self-renewal and retention of differentiation potency. Induced pluripotent stem cells (iPSC) are pluripotent cells derived through reprogramming from adult cells, easily accessible from patients, like keratinocytes. iPSC can be differentiated to cardiac cells, through stage-specific protocols that reproduce embryonic development, offering a very useful platform for modelling diseases of patients with heart failure, for testing new drugs, and for cellular therapy in the future. However, properly mimicking cardiac tissue is very complex, since not only the correct cardiac cell type has to be reproduced, but also its overall cellular composition, architecture and biophysical functions. In order to study these aspects, we applied biotechnological strategies such as the use of transgenic cell lines for obtaining pure and scalable differentiated cells to be cultured in a 3D scaffold with a perfusion bioreactor. Although it is well known that iPSC can give rise to cardiomyocytes in vitro, not every cell line can be efficiently differentiated. Thus, a cell line-specific differentiation protocol has to be identified and optimized. We finally identified a fast and efficient stage-specific differentiation protocol suitable for the iPSC lines used in this work, derived from human keratinocytes. With this protocol, we can reproducibly obtain close to 50% cardiomyocytes after 15 days of differentiation. One important feature of currently available differentiation protocols is that the target cell type is obtained among a heterogeneous cell population. To track the cardiac population of interest we generated transgenic cell lines where the reporter protein GFP follows the expression of different genes specific for stages of differentiation, such as T (Brachyury) for mesoderm; NKX2.5 for cardiac progenitors; and MHC for cardiomyocytes. Moreover, cardiomyocytes obtained from hPSC using currently available differentiation protocols are typically immature, mostly resembling embryonic or fetal cardiomyocytes, arguably because of the lack of mechanical and electrical stimuli that only a 3D environment can provide. In order to create a piece of tissue in 3D we used a collagen and elastin-based scaffold, to mimic the structural proteins of endogenous extracellular matrix. We also built a perfusion bioreactor to culture the construct. After initial validation with primary cultures of rat neonatal cardiomyocytes, we tested iPSC-derived cardiac cells at different stages of differentiation. While early mesoderm or cardiac progenitors could not survive in our system, iPSC differentiated to cardiomyocytes, could be retained and maintained alive within the scaffold for at least 4 days. In conclusion, in this work we combined biotechnological tools in order to obtain a test platform for studying the mechanisms underlying cardiac differentiation, maturation, as well as providing valuable in vitro systems for disease modelling, drug screening of patient-specific heart muscle cells and cell therapy. / El corazón es el órgano más importante del cuerpo: impulsando la sangre, aporta oxigeno y nutrientes a cada célula del organismo. En caso de fallo cardiaco la función del corazón no puede recuperarse, ya que los cardiomiocitos son reemplazados por una cicatriz fibrosa no funcional. Las enfermedades cardiacas representan la mayor causa de muerte y enfermedad en el mundo occidental y entender los mecanismos de las patologías cardiacas, así como encontrar curas para ellas, es un desafío de primaria importancia para la medicina moderna. Siendo el corazón un órgano vital y difícilmente accesible, resulta imprescindible encontrar una fuente celular alternativa. Las células madre humanas con pluripotencia inducida (iPSC – induced pluripotent stem cells) parecen óptimas, porque se derivan de simples biopsias de piel de pacientes y se pueden diferenciar a cualquier tipo celular, cardiomiocitos incluidos. Aún así, diferenciar el tejido cardiaco es muy complejo: no solamente se debe de reproducir el tipo celular, sino también su composición celular, su arquitectura y sus funciones biofísicas. Para estudiar estos aspectos, por un lado obtuvimos tres líneas celulares de iPSC reporteras de genes específicos de diferentes estadios de diferenciación cardiaca (T para mesodermo, NKX2.5 para progenitores cardiacos y alpha-MHC para cardiomiocitos), y por otro desarrollamos un biorreactor adecuado para el cultivo de células cardiacas en 3D. Utilizamos las líneas transgénicas como herramienta para seleccionar células en diferentes estadios de diferenciación y las co-cultivamos con fibroblastos en un andamio compuesto de colágeno y elastina (imitando la matriz extracelular cardiaca y la composición celular del corazón). En conjunto, este estudio revela que las iPSC pueden ser retenidas y cultivadas en nuestro sistema 3D. Mientras células de mesodermo temprano y progenitores cardiacos no completaron la diferenciación cardiaca, los cardiomiocitos derivados de iPSC con cultivo convencional y cultivados en el biorreactor pudieron ser mantenidos viables en el mismo al menos 4 días. La aproximación experimental aquí presentada representa una base para desarrollar plataformas de estudio in vitro paciente-especificas para modelar enfermedades cardiacas humanas y estudios de fármacos, así como ofrecer una herramienta de estudio de los mecanismos de la diferenciación y maduración cardiacas.

L’ús cada cop més extensiu de plataformes “òmiques” per a l’estudi de llevats ha generat grans quantitats d’informació relativa a la fisiologia cel·lular sota diferents condicions de cultiu, la qual pot ser utilitzada per al desenvolupament de noves estratègies d’enginyeria genètica. S’ha observat que els nivells d’expressió d’un fragment d’anticòs humà produït en el llevat metilotròfic Pichia pastoris augmenten significativament quan aquest és cultivat en nivells de baixa disponibilitat d’oxigen. Anàlisis transcriptòmics mostren que hi ha una regulació important dels gens involucrats en el metabolisme de lípids i la resposta al mal plegament de proteïnes (UPR), destacant la l’augment de transcrits provinents de gens involucrats en les rutes de biosíntesi de l’ergosterol i esfingolípids. A més, s’ha observat que la presència en el medi de cultiu de fluconazol, un agent antifúngic que inhibeix específicament l’activitat de la esterol C14α-demetilasa (Erg11p) en la ruta de biosíntesi de l’ergosterol, resulta en una disminució dels nivells d’ergosterol en les membranes cel·lulars, millorant els nivells de proteïna recombinant secretada al medi de cultiu. Finalment, el factor de transcripció Hac1, amb un paper important en la regulació de la UPR, també es troba involucrat en la regulació de la síntesi de lípids. En el present estudi, la soca de referència, P. pastoris que produeix el fragment d’anticòs 2F5 de manera recombinant, s’ha modificat genèticament per tal de canviar la seva composició lipídica. S’ha generat una bateria de soques que presenten alguns gens de la ruta de biosíntesi d’esfingolípids delecionats (DES1, SUR2), o bé sobreexpressats (DES1). Al mateix temps, s’ha alterat la ruta de síntesi de l’ergosterol de la soca de referència mitjançant la sobreexpressió del gen ERG11 o tractant les cèl·lules amb fluconazol. Finalment, també es va sobreexpressar HAC1. Les cèl·lules es van cultivar en cultius en continu sota condicions d’oxigen normals (normoxia), i baixos (hipòxia), i les soques van ser caracteritzades en quant a nivells de Fab produïts, la seva distribució intra/extracel·lular, morfologia a partir d’estudis de microscòpia electrònica (TEM), i el seu contingut lipídic, quantificant els nivells d’àcids grassos, fosfolípids, esterols, lípids neutres i esfingolípids. Amb tota aquesta informació es pretén comprendre com les cèl·lules s’adapten a canvis genètics i ambientals a través de canvis en el seu contingut lipídic. Els resultats obtinguts s’han combinat amb informació transcriptòmica prèviament publicada, demostrant que existeix una important remodelació del metabolisme lipídic quan les cèl·lules es troben en condicions d’hipòxia. / The increasing availability of omics databases provides an important knowledge base for the design of novel yeast engineering strategies, since they offer systems-level information on the physiology of the cells under diverse growth conditions and genetic backgrounds. In a previous study, a beneficial effect of low oxygen availability on the expression of a human Fab fragment in Pichia pastoris has been identified. Transcriptomic analyses pointed out important regulation of the Unfolded Protein Response (UPR) and lipid metabolism, with a significant transcriptional up-regulation of ergosterol and sphingolipid biosynthetic pathways. Furthermore, cells cultured in the presence of fluconazole, an antifungal agent that inhibits sterol C14α-demethylase (Erg11p) activity in the ergosterol biosynthetic pathway, showed a reduced amount of ergosterol in the plasma membrane, resulting in increased protein secretion levels. Moreover, it is known that the transcription factor Hac1, which plays a key role by regulating the UPR, regulates lipid biosynthesis In the present study, a reference strain of P. pastoris secreting the 2F5 Fab antibody fragment as a model recombinant protein was genetically modified in order to change its lipid composition. A set of strains harbouring either deleted (DES1, SUR2) or overexpressed (DES1) genes of the sphingolipid pathway were generated. In addition, a Fab producing strain overexpressing HAC1 or ERG11 were constructed and, as an alternative to the ergosterol pathway knockout, the reference strain was treated with fluconazole. The series of strains were cultivated in chemostat cultures under normoxic and hypoxic conditions. Strains were characterised in terms of Fab- productivity, intra/extracellular product distribution, cell morphology by transmission electron microscopy (TEM) and lipid content in terms of phospholipids, fatty acids, sterols, non-polar lipids and sphingolipids, in order to fully understand how cells adapt to genetic and environmental changes involving lipid changes. The obtained results were combined with previously published transcriptional data, allowing us to demonstrate an important remodelling of the lipid metabolism under limited oxygen availability.

En animales de laboratorio, la exposición previa a estímulos estresantes de naturaleza emocional suele inducir una reducción de algunas respuestas de estrés cuando los animales son re-expuestos al mismo estímulo, mientras que generalmente da lugar a respuestas normales o acentuadas (sensibilización cruzada) frente a un estímulo estresante diferente (heterotípico). En las últimas décadas ha habido un creciente interés por los procesos de sensibilización ya que se postula que están en gran medida implicados en la aparición de un número considerable de alteraciones fisiológicas y psicopatologías, incluyendo desordenes gastrointestinales, dolor crónico, trastorno por estrés post-traumático (PTSD), psicosis o adicción, entre otras. La presente tesis se ha centrado en el estudio de las características de los estímulos estresantes que contribuyen a la inducción y la expresión de la sensibilización cruzada inducida por una única exposición al estrés, así como la exploración de posibles mecanismos implicados en el proceso. Para ello, hemos utilizado ratas macho adultas como sujetos experimentales y se ha valorado la actividad del eje hipotalámico-hipofisario-adrenal (HPA) y aspectos conductuales relacionados con actividad/exploración y ansiedad. Nuestros resultados muestran que una sola exposición a un estímulo estresante de elevada intensidad (inmovilización en planchas, IMO) induce una sensibilización de la respuesta del eje HPA a ambientes nuevos y un incremento en la ansiedad, evaluada mediante el laberinto elevado en cruz (EPM), que son observables durante la semana posterior a la IMO pero no a los diez días. No obstante, la sobreimposición de una sesión breve de choques eléctricos (FS) justo antes del EPM incrementa notablemente la ansiedad en los animales previamente expuestos a una IMO diez días antes, sin afectar a los animales sin experiencia previa con la IMO. Estos datos indican que una sola IMO causa un estado de sensibilización endocrina y conductual a nuevas situaciones de estrés, siendo el efecto más duradero a nivel conductual. Ni la inhibición de la síntesis de glucocorticoides, ni la administración de antagonistas de los receptores de glucocorticoides o del receptor CRHR1 antes de la IMO afectaron a los efectos de la IMO sobre la conducta o a la sensibilización del eje HPA en respuesta a un ambiente nuevo al día siguiente, sugiriendo que ni los glucocorticoides ni los CRHR1 juegan un papel relevante. La comparación de la exposición a la IMO con la exposición a otros estímulos que difieren en intensidad (choques eléctricos y natación forzada), pone de manifiesto que la sensibilización del eje HPA en respuesta a un ambiente nuevo es directamente proporcional a la intensidad del estímulo inductor. Aunque una breve exposición a la IMO es suficiente para inducir sensibilización cruzada del eje HPA, el grado de sensibilización es mayor y más duradero cuanto más prolongada es la exposición a la IMO. Finalmente, demostramos que la sensibilización cruzada del eje HPA tras una exposición previa a la IMO es más evidente cuando el estímulo estresante heterotípico es de menos intensidad, aunque es mucho más crítica la duración de la exposición al estímulo heterotípico, de tal manera que ésta es máxima con 5 min de exposición para desaparecer tras una exposición de 30 min. En conjunto, los datos experimentales presentados en esta tesis, apoyados por el artículo de revisión, permiten delimitar las características de la sensibilización cruzada del eje HPA inducida por la exposición aguda a distintas situaciones de estrés y su relación con la sensibilización conductual. La importancia de la intensidad y duración de los estímulos estresantes tanto respecto a la inducción como a la expresión de la sensibilización aportan luz sobre muchas de las discrepancias que aparecen en la literatura. / In laboratory animals, prior exposure to emotional stressors usually induces a reduction of some stress responses when animals are re-exposed to the same stimulus, while exposure to a different stressor (heterotypic) generally results in normal or enhanced responses (cross-sensitization). In the last decades, a growing interest for the processes of sensitization has been generated because it is postulated they are heavily involved in the development of a large number of physiological alterations and psychopathologies, including gastrointestinal disorders, chronic pain, post-traumatic stress disorder (PTSD), psychosis and addiction, among others. This thesis has focused on the study of the characteristics of the stressors that contribute to the induction and expression of cross-sensitization induced by a single prior exposure to stress, as well as on the exploration of mechanisms likely to be involved in this process. To this end, we have used adult male rats as experimental subjects, and the activity of hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA) and some behavioral aspects related to activity/exploration and anxiety have been assessed. Our results show that a single exposure to a severe stressor (immobilization on boards, IMO) induces cross-sensitization of the HPA response to novel environments and increased anxiety, as assessed by the elevated plus maze (EPM). These effects are noted during the week following IMO but not ten days after. However, a brief exposure to foot-shocks just before the EPM markedly enhances anxiety in rats previously exposed to IMO, without altering behavior in animals having no previous experience with IMO. These data indicate that a single IMO causes a state of endocrine and behavioral sensitization to new stressors, being the latter longer-lasting. Neither glucocorticoid synthesis inhibition nor administrations of antagonists for glucocorticoid or CRHR1 receptors before IMO were able to alter behavioral consequences of IMO or HPA cross-sensitization after exposure to the open field (OF) the day after. These data suggest that neither glucocorticoids nor CRHR1 play an important role in these cross-sensitization processes. Comparing IMO with other stressors that differ in intensity (foot-shock or forced swim), indicates cross-sensitization after response to the OF is directly proportional to the intensity of the triggering (inductive) stressor. Although brief exposure to IMO is enough to induce HPA cross-sensitization, the degree of cross-sensitization is greater and longer-lasting after more prolonged exposure to IMO. Finally, we demonstrate that HPA cross-sensitization after a previous exposure to IMO is more evident when the heterotypic stressor is of low intensity. Nevertheless, the length of exposure to the heterotypic stressor is much more critical, so that HPA cross-sensitization is highest with 5 min exposure and disappears after 30 min exposure. Overall, the experimental data presented in this thesis, supported by the review article, allows defining the characteristics of HPA cross-sensitization induced by an acute exposure to different emotional stressors and its relationship with the behavioral sensitization. The relevance of the intensity of stressors and length of exposure regarding both the induction and the expression of cross-sensitization can explain many of the discrepancies observed in the literature.

La enterectomía es un procedimiento quirúrgico que consiste en suturar dos segmentos intestinales, la mayor complicación que aparece es la pérdida por las suturas y las dehiscencias y que están asociadas a una alta morbilidad y mortalidad. En pequeños animales las complicaciones en las anastomosis del intestino delgado tienen una incidencia 7-16%, y cerca 74-80% de estos pacientes mueren. Se han realizado diversos procedimientos para asegurar la impermeabilidad de la anastomoses: Omentoplastia, parches de serosa, endotubos, anillos ajustables internos y entre otros. También se han buscado nuevas innovadoras alternativas quirúrgicas, que incluyeron el uso de sustancias adhesivas, fibrinas elaboradas por moléculas (fibrinógeno y trombina). Desde hace varios años, los estudios relacionados con la regeneración se han dirigido a investigar cuál es el efecto de los factores de crecimiento sobre los tejidos. Gran parte de los estudios se han realizado in vitro, utilizando factores recombinantes, es decir, factores de crecimiento elaborados en el laboratorio. Pero la desventaja de estas sustancias incluye el alto coste económico para su obtención. Y poco se sabe de sus efectos secundarios.Actualmente, el estudio del proceso de la cicatrización se centra en la aceleración de este proceso a nivel celular con el uso de plasma rico en plaquetas (PRP). En el presente estudio se han incluido 35 cerdos de raza Large White, sexo indiferente con un peso medio de 55±5 Kg. En cada animal, se realizaron 2 enterectomías, en una de ellas se le aplicó PRP en el lugar de la incisión, mientras que en la otra no, sirviéndonos como control. Para el examen histológico se realizaron 5 grupos de 3 animales cada uno. Los cerdos se eutanasiaron a las 24h, 48h, 72h, 96h y 7 días, respectivamente, tras la cirugía. Para la evaluación de la resistencia de la anastomosis, se emplearon 2 grupos de 10 animales cada uno. El grupo A se eutanasió a los 3 días tras la cirugía, mientras que el grupo B se eutanasió a los 7 días. A nivel histológico en todas las muestras de las 24h y 48h, tanto en las muestras control como PRP, mostraron una creciente inflamación que finalmente, a las 72h y 96h fue substituida por un tejido de granulación inmaduro. La presencia de tejido de granulación fue más abundante en las muestras PRP. En la determinación de la fuerza de rotura no se obtuvieron diferencias significativas en la resistencia de la anastomosis entre el grupo control y el PRP, para ninguno de los 2 días (3 y 7 días). Sin embargo, aunque los resultados no sean significativos, las mayores fuerzas de rotura obtenidas corresponden a las anastomosis con PRP.Para la determinación de la activación plaquetar evaluamos los valores del componente plaquetar medio (MPC) en la sangre y PRP obtenidos durante el recuento (ADVIA 120). Los valores del MPC obtenidos en la sangre (21,3±1,58 g/dL) y en el PRP (20,3±1,39 g/dL), no mostraron diferencias significativas. Este hecho sugiere que el protocolo de preparación de PRP no produce una activación significativa de las plaquetas. Para la determinación de factores de crecimiento usamos el test (ELISA). Los niveles del TGF- &#946;1 han sido determinados en distintas fracciones que se obtenien durante la preparación del PRP: en el PRP (24312 pg/mL) y PRP gel, activado con cloruro cálcico (15504 pg/mL) y en el plasma pobre en plaquetas (PPP) - obtenido después de la segunda centrifugación (3715 pg/mL). En resumen con el protocolo de obtención de PRP utilizado en este estudio se obtuvo una elevada concentración e integridad plaquetar demostrado en los valores del MPC y los niveles de TGF-&#946;1. Palabras clave: anastomosis intestinal, cerdo, plaquetas, plasma rico en plaquetas, factores de crecimiento. / The principle of performing an intestinal anastomosis consists of apposing the proximal and distal edges of the segments and suturing. Compromised healing may lead to dehiscence and leakage, which is attended by high morbidity and mortality. In small animals the reported incidence of small intestinal dehiscence rates 7-16%, with 74 -80% of those patients dying. Attempts to enhance anastomotic healing have included the use of various surgical techniques and materials: quality of suture threads, use of staples; mechanical protection (endoluminal latex prosthesis, biofragmental ring) and local application of fibrin bioadhesive, fibrin and collagen patches, omental flaps with the most promising results.One of the most significant advances in the field of modern molecular biology and biochemistry in the last three decades are certainly growth factors and cytokines. Growth factors are biologically active polypeptides influencing growth, differentiation and metabolism of target cells through specific receptors. In the last several years a number of authors investigated the use of various recombinant growth factors (local or systemic) in order to enhance some of the phases of wound healing process.The disadvantage of these recombinant growth factors is that they are expensive and concerns exist about their safety in human administration. Alternatively, platelet-rich plasma (PRP), which is a volume of autogenous plasma that has a platelet concentration above baseline, is a proven source of growth factors. Recently, attention has been focused on cellular acceleration of the wound healing process by the use of platelet-rich plasma (PRP). This study determined the effects of PRP application on intestinal healing. Autologous PRP was obtained in 35 Large White breed pigs, males and females, weighting 55±5 Kg, which were submitted to two intestinal anastomosis procedures. Activated PRP was applied in one of the anastomosis sites, while the other site served as control. After 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 7 days, histology was performed, and after 72 h and 7 days breaking strength was also measured. After 24-48 h of PRP and control anastomosis, increasing inflammation was observed, followed by immature granulation tissue at 72-96 h. In PRP samples, the granulation tissue was more abundant. Although breaking strength in PRP samples was higher than in control samples, differences were not statistically significant. Although differences were subtle, PRP application on intestinal anastomosis seemed to slightly improve the anastomotic resistance due to an increase of inflammatory infiltrates and fibrosis.In this study we also determinate the platelet activation using a mean platelet component (MPC), we monitored MPC values on citrated whole blood and on PRP in all (47) animals used in this study obtained on (ADVIA 120) (a decrease in the MPC value occurs when platelets are activated and degranulated in vitro). The MPC values were not statistically significantly different (p<0.05) on citrated whole blood (21,3±1,58 g/dL) when compared to PRP (20,3±1,39 g/dL) values. In our opinion, this finding might be the result of the non significant platelets activation during PRP preparation process.We analyzed the amount of TGF-&#946;1 by enzyme-linked immunosorbent sandwich assay (ELISA) on PRP (obtained after double spin centrifugation), PPP (supernatant after second centrifugation) and PRP gel (obtained by mixing fresh PRP and calcium chloride). In our study, concentrations of TGF-&#946;1 on PRP fractions were different. The concentration of TGF-&#946;1 on PRP (24312 pg/mL) was significantly increased compared to PPP (3715 pg/mL). This supposes that the protocol for PRP obtention using a double spin centrifugation procedure employed in this study results in a high platelet concentrate and maintains a high quality biological product as measured by MPC values and TGF-&#946;1 levels.Keywords: intestinal anastomosis, pig, platelets, platelet-rich plasma, growth factors.

Estudios previos de nuestro grupo demostraron que la hipertensión portal causa una importante inhibición de RNA mensajeros y proteínas implicadas en neurotransmisión adrenérgica, acompañada de una marcada atrofia simpática de los nervios que rodean la vasculatura mesentérica. Esta atrofia simpática local podría estar contribuyendo a la vasodilatación arterial esplácnica de la hipertensión portal. La hipótesis que se estableció a partir de los resultados obtenidos asumía que durante la hipertensión portal, los cambios de presión detectados en la vasculatura esplácnica podrían promover una señal a través de la vía sensitiva aferente hasta los núcleos de regulación cardiovascular del tronco cerebral, donde se desencadenaría una respuesta eferente responsable de provocar la atrofia simpática. Los resultados de la primera parte del trabajo confirman esta hipótesis y apoyan el papel de la atrofia simpática en la vasodilatación arterial esplácnica de la hipertensión portal, demostrando que mediante el bloqueo de la señal aferente con la neurotoxina capsaicina, de ratas con ligadura de la vena porta (PVL), se consigue evitar la atrofia simpática y las alteraciones hemodinámicas simultáneamente. Además, en ratas PVL, en el ganglio mesentérico superior (SMG) que contiene los somas de las neuronas adrenérgicas que inervan el mesenterio, se demostró un aumento en la expresión de neuromoduladores tales como el factor de crecimiento neuronal NGF y su precusor proNGF y la molécula quimiorepelente Semaforina 3A (Sema3A). Sema3A se localizó en el espacio interneuronal, alrededor de las neuronas adrenérgicas colocalizando con fibras positivas a VAChT. Este aumento en la expresión de moduladores neuronales también se evitó en ratas PVL tratadas con capsaicina. En la segunda parte del trabajo, con el objetivo de confirmar la vía neuronal en la hipertensión portal, se estudiaron dos estructuras intermediarias: el ganglio nodoso donde se confirmó un aumento de la señal aferente sensitiva, vía el nervio vago en animales con hipertensión portal y las neuronas simpáticas colinérgicas preganglionares del núcleo intermediolateral de la médula espinal donde se observó presencia de Sema3A, sugiriendo el origen del aumento de la expresión de Sema3A del SMG en las neuronas colinérgicas preganglionares. Por otro lado, se profundizó en el estudio de alteraciones en la expresión de neuromoduladores implicados en las vías de crecimiento/regresión axonal y supervivencia/muerte neuronal en el SMG de ratas PVL. La expresión de la forma activa del receptor de NGF, la tirosina quinasa A (TrkA), que conduce a la activación de las vías de supervivencia y crecimiento neuronal, se reveló disminuida en ratas PVL comparando con sham. Sin embargo, las vías de apoptosis y de retracción axonal se encontraron estimuladas en ratas PVL, exhibiendo una sobreexpresión significativa de Sema3A y de su receptor Neuropilina1, junto con un aumento en la expresión del receptor de proNGF, el receptor de neurotrofinas p75, la caspasa7 activa, la poli(ADP-ribosa) polimerasa inactiva y Rho kinasa. Finalmente, se probó la administración de un agonista de TrkA, la amida gambógica, en ratas PVL con el fin de estimular la vía de crecimiento y proliferación en detrimento de la vía apoptótica. Los resultados mostraron una mejora de las alteraciones hemodinámicas y de la atrofia simpática, a través de la activación de las vías de supervivencia y la inhibición de la cascada apoptótica y regresión axonal mediada por Rho kinasa. En conclusión, estos resultados indican que la alteración adrenérgica y la atrofia simpática en la vasculatura mesentérica durante la hipertensión portal tiene su origen en alteraciones de la neuromodulación que conducen a regresión simpática post-ganglionar y a apoptosis que contribuyen a la vasodilatación esplácnica. / We have previously demonstrated that portal hypertension causes an important inhibition of messenger RNA and proteins implicated in adrenergic neurotransmission and a marked atrophy in the sympathetic nerves surrounding mesenteric vasculature. This sympathetic atrophy could be contributing to the splanchnic vasodilation of portal hypertension. Our hypothesis assumed that during portal hypertension, pressure changes detected in the splanchnic vascular área could promote a signal through the visceral afferent sensitive pathway to the cardiovascular regulatory nuclei of the brainstem, triggering from there an efferent response resulting in sympathetic atrophy. The present results confirm this hypothesis and support the role for sympathetic atrophy in splanchnic arterial vasodilation of portal hypertension, showing that by blocking the sensitive afferent signal with capsaicin, the splanchnic sympathetic atrophy can be prevented in those animals where, simultaneously, the hemodynamic alterations were normalized. Indeed, in the superior mesenteric ganglia (SMG) of PVL, which contains the somas of adrenergic neurons that innervate the mesenteric vasculature, an increase in neuronal modulators such as nerve growth factor (NGF), its precursor proNGF and the chimiorepelent Semaphorine 3A (Sema3A) molecule was demonstrated. Sema3A localized in the interneuronal space surrounding adrenergic neurons and colocalizing with VAChT positive fibers. This increment in neuronal modulators was also avoided in capsaicin treated PVL. In the second part of the study, the neural pathway of portal hypertension was confirmed through the analysis of two intermediate structures. An increase in neuronal afferent activity was demonstrated in the vagal nodose ganglia of PVL rats and presence of Sema3A in the cholinergic sympathetic preganglionic neurons of the intermediolateral nucleus of the spinal cord suggested that it was the origin of the increased expression of Sema3A in the SMG. We also investigated alterations on neuromodulators and signaling pathways that, in the SMG of PVL rats, lead to axonal regression or apoptosis. We found that the active form of tyrosine kinase receptor A (TrkA), leading to proliferation and survival signaling was decreased in PVL compared to sham rats. In contrast, the apoptotic and axonal retraction pathways were stimulated in PVL, demonstrated by a significant overexpression in Sema3A and its receptor Neuropilin1, together with an increase in the neurotrophic receptor p75, the active caspase7 and the inactive poly(ADP-ribose) polymerase kinase expression. Finally, we tested the administration of a TrkA agonist, gambogic amide, in PVL rats. Our results showed an amelioration of hemodynamic alterations and sympathetic atrophy, through the activation of survival pathways and the inhibition of the apoptotic cascade and axonal regression mediated by Rho kinase. In conclusion, these results suggest that the adrenergic alterations and sympathetic atrophy observed in mesenteric vessels during portal hypertension is caused by alterations on neuromodulation leading to postganglionic sympathetic regression and apoptosis contributing to splanchnic vasodilation.