Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000412868-Texto+Completo-0.pdf: 709463 bytes, checksum: 24e54fc3c08be35252a751617c52ca4d (MD5) Previous issue date: 2009 / The epithelium-specific Ets factor, family member 3 (ESE-3), has been shown to play roles in determination of the early differentiated fate in stratified squamous epithelia, expression of a receptor for tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, and airway inflammation of respiratory disorders such as asthma and cystic fibrosis. The Ets domain proteins have been proposed to bind to purine-rich central core 5’-GGAA-3’ sequence with larger affinity than 5’-GGAT-3’. Here we describe surface plasmon resonance equilibrium and kinetics analyses of Ets domain ESE-3 binding to Drosophila E74 gene promoter sequence (a consensus Ets binding site) containing either 5’-GGAA-3’ or 5’-GGAT-3’core sequence. Competition assays are also described. The results showed that there is no large difference in equilibrium binding affinity between Ets domain ESE-3 and either 5’-GGAA-3’ or 5’-GGAT-3’. However, analysis of kinetic data indicates that larger association rate and lower dissociation rate constant values account for the slightly higher affinity of Ets domain ESE-3 for 5’-GGAA-3’-containing DNA sequence. The role of dynamics in protein-DNA recognition is discussed and a mechanism is proposed in which free Ets domain ESE-3 exists as two isomers in solution that undergoes a slow protein isomerization step, which is followed by a fast DNA binding process. Besides, data of spectrofluorimetric experiments give evidence to include a further step in the proposed mechanism. / Tem se mostrado que a proteína ESE-3 (Fator específico de epitélio, do inglês epithelium-specific Ets factor, family member 3) desempenha importantes papéis na determinação do destino inicial da diferenciação do epitélio escamoso estratificado, na indução da expressão do receptor para um ligante que induz à apoptose, relacionado com necrose tumoral, e em processos inflamatórios de doenças respiratórias, tais como a asma e a fibrose cística. Tem se proposto que proteínas com domínio Ets ligam-se com maior afinidade a seqüências com núcleo central rico em purinas 5’-GGAA-3’ do que em seqüências com núcleo central 5’-GGAT-3’. Neste trabalho, nós descrevemos análises cinéticas e em equilíbrio do domínio Ets de ESE-3 ligando-se ao sítio de ligação Ets presente na região promotora do gene E74 de Drosophila, contendo tanto as bases centrais 5’-GGAA-3’ quanto 5’-GGAT-3’, utilizando a técnica de ressonância plasmônica de superfície. Também descrevemos ensaios de competição. Os resultados mostraram que não há grande diferença na afinidade de ligação do domínio Ets de ESE-3 entre as seqüência contendo 5’-GGAA-3’ ou 5’-GGAT-3’. No entanto, as análises dos dados cinéticos indicam que há maior valor da constante de velocidade de associação e menor valor para a constante de velocidade de dissociação, que contam para uma afinidade levemente mais alta do domínio Ets de ESE-3 por seqüências de DNA contendo as bases centrais 5’-GGAA-3’.O papel da dinâmica do reconhecimento do DNA realizado pela proteína é discutido e é proposto o mecanismo no qual o domínio Ets de ESE-3 livre existe como dois isômeros em solução que sofrem um passo lento de isomerização, que é seguido por um rápido processo de ligação ao DNA. Além disso, os dados obtidos pelos experimentos de espectrofluorimetria dão uma evidência para a inclusão de mais um passo no mecanismo proposto.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401340-Texto+Completo-0.pdf: 549118 bytes, checksum: 0b891fb7ecb8b42c15bbd983f6da4c5e (MD5) Previous issue date: 2008 / Introduction: Current pollution and emission of toxic gases is leading to a gradual deterioration of the ozone layer that filters out a large portion of the ultraviolet (UV) emission. It has been shown that UV radiation significantly alters the structure of the skin, including nerve endings. Due to the increasing number of skin diseases as a result of UV exposure, it is necessary to evaluate the effectiveness of new skin care formulations with broad-spectrum sunscreens. Previous studies have not been able to quantify the damage induced by UV radiation on peripheral nerve endings. Objectives: To identify the nerve endings in the skin, quantify the effects of UV radiation on nerve endings and evaluate de neuroprotective effects of new skin care formulation to UV exposure Materials and methods: biopsies of skins were obtained from 35 healthy young adults, undergoing plastic surgery, and immediately treated (10 min) with three emulsions: Cream1, Cream2 (placebo) and commercially available sun protection factor (SPF) 15. Samples treated with the emulsions or control (untreated) were exposed to UVA and UVB for 60 min. Skin tissues were frozen and 15- m cryostate sections were produced. Peripheral nerve endings were identified by immunofluorescence using a monoclonal antibody anti-human CD56 (NCAM). The cell damage was identified from the automatic pixel selection (green - FITC) of captured images. Results: several cellular nervous structures were identified in the skin, including free nerve endings, innervations of the hair follicle and sebaceous glands. The UVA and UVB decreased significantly (40-60%) the density of nerve endings in the skin of control, samples treated with placebo or SPF 15 (all p < 0. 001). No morphological changes were observed in the free nerve endings exposed to UV radiation. Samples treated with Cream1 completely blocked the effects of UV radiation on nerve endings (p > 0. 05). Discussion: The quantification of cellular damage induced by UV radiation enables the identification of new skin care compounds with neuroprotective properties. The underlying mechanisms of UV-induced cellular damage as well as the neuroprotective actions should be further investigated in future studies. / Introdução: Atualmente, devido à poluição e emissão de gases tóxicos, há uma degradação gradual da camada de ozônio que filtra uma grande parcela das emissões UV. A radiação UV altera significativamente as estruturas da pele, incluindo as terminações nervosas. Em decorrência do crescente aumento de doenças de pele relacionadas à exposição UV, faz-se necessária a avaliação da efetividade de novos princípios ativos com finalidade de proteção contra as radiações. Estudos anteriores não foram capazes de quantificar o dano induzido pela radiação UV nas terminações nervosas. Objetivos: identificar as terminações nervosas na pele humana, quantificar os efeitos das radiações UV sobre as terminações nervosas e verificar o efeito de princípios ativos neuroprotetores à exposição UV. Materiais e Métodos: biópsias de pele, de 35 adultos saudáveis, sob cirurgia plástica, foram obtidas e imediatamente tratadas com três emulsões: Creme1, Creme2 (placebo) e FPS 15. As amostras tratadas com as emulsões ou controle (sem creme) foram submetidos à exposição UVA e UVB por 60 min. Secções de 15 m foram produzidas no criostato a partir de tecidos congelados e as estruturas nervosas foram identificadas por imunofluorescência utilizando um anticorpo monoclonal anti-CD56 (NCAM) humano. O dano nas terminações foi identificado a partir da seleção automática de pixels (verde – FITC) das imagens capturadas. Resultados: foram identificadas várias estruturas nervosas na pele, incluindo terminações livres, inervações do folículo piloso e glândulas sebáceas. As radiações UVA e UVB reduziram, significativamente (40-60%), a densidade das terminações nervosas na pele nas amostras controle, tratadas com placebo ou FPS 15 (p<0. 001). Não foram observadas diferenças morfológicas das terminações nervosas expostas a radiação UV. As amostras tratadas com o Creme1 bloquearam completamente os efeitos da radiação UV sobre as terminações nervosas (p > 0. 05). Discussão: A quantificação dos danos celulares induzidos pela radiação UV possibilita a identificação de compostos ativos com propriedades neuroprotetoras. Os mecanismos de dano celular bem como as atividades neuroprotetoras merecem ser identificadas nos próximos estudos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000400977-Texto+Completo-0.pdf: 4539357 bytes, checksum: a454d83262e33e9f70ab585e6cbbdd44 (MD5) Previous issue date: 2008 / The reemergence of tuberculosis is a current public health problem. The World Health Organization (WHO) reported in 2006 that 2 billion people, or one-third of the world’s total population, are infected with the bacilli Mycobacterium tuberculosis (MTB), and in 2007 reported that 1. 6 million people died from TB in 2005. Multidrug-resistant TB (MDR-TB) and extensively drug-resistant TB (XDR-TB) are forms of TB that does not respond to the standard drug treatment. Isoniazid (INH, isonicotinic acid hydrazide) is one of oldest synthetic antitubercular drugs. The mechanism of action of INH is complex, as mutations in at least five different genes (katG, inhA, ahpC, kasA, and ndh) have been found to correlate with INH resistance. Pentacyano(isoniazid)ferrate II (PIF) is a rational drug design effort to find alternative drugs capable of inhibiting InhA. It was found that PIF inhibit both wild type and isoniazid-resistant I21V mutants of InhA and this inactivation does not require activation by KatG. In this work we report the results of two molecular dynamics simulations of PIF-InhA interaction considering all atoms of this complex in aqueous solution. The results demonstrated that PIF strongly interacts with InhA and these interactions cause macromolecular instabilities due to substrate binding site perturbation. These instabilities are reflected in the long time necessary for trajectory convergence. Besides this, we observed that the residues Gly14, Ile15, Ile16, Ser20, Gly40, Phe41, Ile47, Ser94 and Thr196 of InhA are responsible for the PIF-InhA association. So, we conclude that PIF competes directly for the NADH binding site and indirectly with the substrate binding site. / A re-emergência da tuberculose é um problema de saúde pública mundial. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que, em 2006, cerca de 2 bilhões de pessoas, ou um terço da população mundial, foram infectadas com o bacilo Mycobacterium tuberculosis (MTB), e em 2007 relata que 1,6 milhões de pessoas morreram de tuberculose (TB) no ano de 2005. O surgimento das formas de TB resistente a múltiplas drogas (MDR-TB) e extensivamente resistente a drogas (XDR-TB), as quais não respondem ao tratamento convencional, colaboram para este crescimento. A Isoniazida (INH, hidrazida do ácido isonicotínico) é uma das drogas sintéticas mais antigas, e seu mecanismo de ação é complexo. Mutações em pelo menos cinco genes diferentes (katG, inhA, ahpC, kasA, e ndh) foram correlacionadas com a resistência a INH. O complexo inorgânico Isoniazida-pentacianoferrato (IPF) é o resultado do desenho racional de drogas na tentativa de achar uma alternativa capaz de inibir a InhA. O IPF é capaz de inibir os tipos selvagem e o mutante I21V da InhA, resistente à INH, e esta inativação não requer ativação por KatG. Neste trabalho, realizamos duas simulações por dinâmica molecular do complexo IPF-InhA, utilizando todos os átomos em solução aquosa, com o objetivo de investigar os eventos moleculares relacionados ao modo de interação droga-alvo e suas afinidades. Observamos que o IPF interage fortemente com a InhA e estas interações causam instabilidades na macromolécula devido a perturbação no sítio de ligação do substrato. Estas instabilidades se refletem no longo tempo necessário para a convergência da trajetória. Observamos também que os resíduos Gly14, Ile15, Ile16, Ser20, Gly40, Phe41, Ile47, Ser94 e Thr196 são os responsáveis por intermediar a associação IPF-InhA. Concluímos então que o IPF compete diretamente com o NADH pelo seu sítio de ligação e indiretamente com o substrato através da desestabilização do seu sítio de ligação.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422143-Texto+Completo-0.pdf: 659009 bytes, checksum: 4a462f7c36025ba4acbf746909b37608 (MD5) Previous issue date: 2009 / The purpose of this study was to evaluate the anti-inflammatory, immunomodulatory and cytotoxic effect of the compound derivative of 4-tioxopirimidinas denominated RDV 8. In order to investigate RDV 8 anti-inflammatory effect, the model used was pleurisy induced by carrageenan in rats, where the parameters of the acute phase of inflammation were evaluated. In the in vitro model, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs from humans ) culture was used to investigate both the cytotoxic action and the immunomodulatory effect of RDV 8. In the in vivo model, 30 female Wistar rats were used divided in control and experimental groups. Half hour (30min) after the intraperitoneal injection of RDV 8, 3. 0 mg/Kg, carrageenan (0. 2mL, 1%) was injected in the pleural cavity to cause inflammation. After 4 hours the pleural liquid was aspirated and the volume of exudate, total and differential leukocytes were counted and protein concentration and nitric oxide (NO) were measured. In the cell culture model of mononuclear cells, we used blood samples from 6 healthy individuals, between 17 and 40 years olds. These cells were distributed in 11 groups, 5 for cytotoxic assessment and 6 for immunomodulatory research. After 96 hours (4 days) the cells were counted and their supernatants were withdrawn, in order to assess concentrations of interleukin (IL) 1 and 6 and the monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1 or CCL2). In the pleurisy model, RDV 8 significantly reduced (P<0. 05) all variables except the number of polymorphonuclear cell (PMNs). The cytotoxic tests presented no significant change in the concentrations used, but there was a significant immunosuppressant effect (P<0. 05) in immunomodulatory tests. There was a decrease in MCP-1 and a increase in IL-6 in the RDV 8 concentration of 0. 1μg/ml. These results indicate a high immunomodulatory and anti-inflammatory action of RDV 8 without any cytotoxic action on the concentrations used in these experiments. / A proposta deste estudo foi avaliar o efeito antiinflamatório, imunomodulador e citotóxico do composto derivado de 4-tioxopirimidinas denominado RDV 8. Para investigar o efeito antiinflamatório usou-se o modelo de pleurisia induzida por carragenina em ratos, onde foram avaliados os parâmetros da fase aguda da inflamação. No modelo in vitro foi utilizado o método de cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humano, tanto para investigar a ação citotóxica quanto o efeito imunomodulador do RDV 8. No modelo in vivo foram utilizadas 30 ratas Wistar divididas em grupos controle e experimental. Meia hora (30min) após a injeção intraperitonial de RDV 8 (3,0 mg/kg) a carragenina (0. 2mL) foi injetada na cavidade pleural para causar inflamação. Após 4 horas o volume de exudato, leucócitos totais e contagem diferencial, concentração de proteínas e óxido nítrico (NO) foram mensurados no liquido pleural aspirado. No modelo de cultura de células foram utilizadas células mononucleares de 6 indivíduos saudáveis, na faixa entre 17 e 40 anos. Estas células foram distribuídas em 11 grupos, 5 para avaliação citotóxica e 6 para investigação imunomoduladora. Após 96 horas (4 dias) as células foram contadas e retirados seus sobrenadantes, a fim de avaliar as concentrações de interleucinas-1 (IL-1) e (IL-6) e a proteína-1 quimioatraente de monócitos (MCP-1 ou CCL2). Na pleurisia o RDV 8 reduziu significativamente (P<0,05) todas as variáveis inflamatórias exceto o numero de células polimorfonucleares (PMNs). Em nenhum dos testes de citotoxicidade ocorreu morte celularsignificativa nas concentrações utilizadas, mas nos testes de imunossupressão houve uma significante (P<0,05) imunossupressão (antilinfoproliferação), diminuição de MCP-1 e aumento da IL-6 na concentração de 0,1μg/mL. Esses resultados indicam uma ação antiinflamatória e imunomoduladora do RDV 8, não apresentando ação citotóxica nas concentrações utilizadas nos experimentos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439240-Texto+Completo-0.pdf: 319940 bytes, checksum: 78e312c8115e9e5356969e795047faba (MD5) Previous issue date: 2012 / Although Parkinson’s Disease (PD) is predominantly a movement disorder, the presence of cognitive problems related to frontal function, even in the earliest stages has been observed. These problems include attentional, executive and memory deficits. A study using an experimental paradigm developed to investigate the effects of different encoding instructions on contextual memory showed that, unlike healthy controls, PD patients could not reverse their contextual memory deficits and take any advantage of encoding instructions. However, it is unclear whether they have a memory deficit or executive dysfunction would be accountable for results. Attentional and executive deficits observed in PD patients have important implications for daily activities, mainly when patient perform concomitant cognitive and motor activities that are attention demanding. Catechol- O-methyltransferase (COMT) is an enzyme that degrades cortical dopamine. Some studies have examined the relationship between the COMT val158met polymorphism and executive function in PD patients and have found low enzyme activity, associated to met/met polymorphism- implying higher prefrontal dopamine levels- is related to worse performance. However, a recent study did not demonstrate a direct effect of COMT genotype on the executive performance. The present study aimed to characterize different cognitive parameters of patients with PD and to assess their relationship with the COMT polymorphism. In this study participated 18 patients with early disease stage PD and 18 healthy adults matched for age, gender and education. Patients were selected from a data bank of patients genotyped for COMT polymorphism. All participants completed the Wisconsin Card Sorting Test (WCST), the Stroop Color and Word Test, and dual tasking paradigm. In addition, patients completed a contextual memory paradigm. No effect of COMT val158met genotype on frontal function in patients with PD (executive function and contextual memory) was observed. A decrease in cognitive task performance under dual-tasking was observed in PD patients, by contrast to healthy controls. Relative dual-task cognitive cost was significantly greater for PD patients compared to controls in the arithmetic-walking condition. In conclusion, difficulties in performing a cognitive task while walking can be influenced by the executive/attentional load of the task. / Embora a Doença de Parkinson (DP) seja predominantemente um distúrbio do movimento, a presença de alterações cognitivas relacionadas à função frontal tem sido observada mesmo nos estágios iniciais da doença. Estas alterações incluem déficits atencionais, executivos e de memória. Um estudo usando um paradigma experimental desenvolvido para investigar os efeitos de diferentes instruções codificadoras na memória contextual mostrou que, ao contrário dos idosos, pacientes com DP não são capazes de reverter seus déficits de memória e não tiram nenhuma vantagem das instruções codificadoras. Entretanto, ainda não está claro se estes pacientes têm um déficit de memória ou se as disfunções executivas seriam as responsáveis pelos resultados observados. Déficits atencionais e executivos observados em pacientes com DP têm implicações importantes nas atividades diárias, principalmente quando o paciente desempenha atividades concomitantes cognitivas e motoras que requerem atenção. A catecol- O-metiltransferase (COMT) é uma enzima que degrada a dopamina cortical. Alguns estudos têm examinado a relação entre o polimorfismo val158met da COMT e função executiva em pacientes com DP e têm observado que a atividade reduzida da enzima, relacionada ao polimorfismo, que implica em maiores níveis de dopamina no córtex pré-frontal, está associada a uma pior performance. Entretanto, um estudo recente não demonstrou um efeito direto do genótipo da COMT no desempenho executivo. O presente estudo teve por objetivo caracterizar diferentes parâmetros cognitivos de pacientes com DP e verificar sua relação com o polimorfismo da COMT. Neste estudo participaram 18 pacientes em estágios iniciais da DP e 18 adultos saudáveis, pareados por idade, gênero e nível educacional. Os pacientes foram selecionados de um banco de pacientes genotipados para o polimorfismo da COMT. Todos os participantes completaram o Teste de Classificação de Cartas de Wisconsin, o Teste de Stroop e o paradigma para avaliação da realização de tarefas simultâneas. Adicionalmente, os pacientes com DP completaram o paradigma de memória contextual. Não foi observado efeito do polimorfismo val158met da COMT sobre a função frontal (função executiva e memória contextual) dos pacientes com DP. Os pacientes apresentaram um declínio cognitivo na realização das atividades simultâneas, ao contrário dos controles. O custo cognitivo associado à realização da tarefa aritmética juntamente à caminhada foi significativamente maior para os pacientes com DP, em relação aos controles. Em conclusão, as dificuldades em realizar uma atividade cognitiva e motora simultaneamente podem ser influenciadas pela carga executiva/atencional da atividade.

Em todo o mundo, menos de 5% dos doentes com tuberculose (TB), sejam casos novos ou previamente tratados, tem a avaliação dos isolados quanto ao perfil de sensibilidade aos antibioticos. No Rio Grande do Sul, estado localizado no sul do Brasil, cerca de 4700 casos novos de TB são registrados a cada ano, com uma taxa de cura de 68,9%, e uma taxa de abandono de 7,5%. A identificação rápida da resistência às drogas, em isolados clínicos de M. tuberculosis é importante para o estabelecimento de uma quimioterapia eficaz bem como para evitar a propagação de cepas resistentes. Os objetivos deste estudo foram caracterizar os pacientes de TB com maior risco de possuir TB-­‐MDR, analisando o perfil de resistência às drogas dos isolados e o perfil epidemiológico desses pacientes. Além disso utilizou-­‐se as amostras clínicas para avaliar o teste comercial (GenoType® MTBDRplus) e para desenvolver e padronizar um novo teste (Detect-­‐TBMR) para detectar as mutações mais frequentes associadas a resistência à INH e RIF. Uma proporção significativamente maior (75% versus 20%, p = 0,009) de pacientes do gênero masculino foi encontrada entre os casos resistentes às drogas do que entre os casos suscetíveis. 43,8% dos pacientes demoraram mais de 30 dias para procurar assistência médica e no grupo TB MDR, 25% dos casos não tinha sido submetido a qualquer tratamento prévio anti-­‐TB. Em nossas amostras, encontramos uma proporção de 48,3% de TB-­‐ MDR. A família T foi a família de spoligotipo mais frequente. Comparado com o método da proporções, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foram 82% e 94% para a resistência à RIF, 60% e 94% para resistência à INH. Comparado com sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio MTBDRplus foi 92% e 97% para a resistência à RIF e 100% e 100% para a resistência à INH, respectivamente. Para detectar resistência à RIF e INH, o ensaio Detect-­‐TBMDR mostrou sensibilidade e especificidade de 79,3% e 77,0% e 100% e 65%, respectivamente, em comparação com o método da proporções. Comparado com o sequenciamento, a sensibilidade e especificidade do ensaio Detect-­‐TBMDR foi de 81,2% e 94,7% e 100% e 96,2%, para detectar e resistência à RIF e INH, respectivamente. Ainda existem discordâncias entre o método das proporções e a abordagem molecular, particularmente em relação a resistência à INH. Contudo, estes métodos são muito importantes para o manejo mais rápido e correto dos pacientes, auxiliando na escolha do melhor esquema terapêutico. / In most parts of the world, less than 5% of new and previously treated tuberculosis (TB) patients are tested for multidrug resistance (MDR) TB. In Rio Grande do Sul state, the southern most Brazilian state; approximately 4700 new cases of TB are recorded each year, with a cure rate of 68.9%, and a noncompliance rate of 7.5%. Rapid identification of drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis is important to facilitate rapid and adequate chemotherapy of TB, and to prevent the spread of resistant strains. The aim of this study was to characterize TB patients at higher risk of having MDR-TB, to analyze the drug resistance and epidemiological profile of these patients. Use the clinical samples to assess the commercial test (GenoType® MTBDRplus) and develop and standardize a new test (Detect-MDRTB) for detecting the most frequent mutations associated with resistance to INH and RIF. A significantly higher proportion (75% versus 20%, p = 0.009) of males were found among drug-resistant cases than drug susceptible cases. 43.8% of patients took longer than 30 days to seek medical care and in the MDR group 25% of the cases did not undergo any previous anti-TB treatment. In our samples we found a proportion of 48.3% of MDR-TB. The T family was the most frequent spoligotype family. Compared with the proportion method, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 82% and 94% for RIF-resistance, 60% and 94% for INH resistance. Compared with sequencing, the sensitivity and specificity of the MTBDRplus assay were 92% and 97% for RIF-resistance, 100% and 100% for INHresistance. To detect RIF and INH-resistance, the Detect-TBMDR assay showed a sensitivity and specificity of 79.3% and 77.0%, and 100% and 65%, respectively, compared to proportion method. When compared with sequencing, Detect-TBMDR assay, to detect RIF and INH-resistance, showed a sensitivity and specificity of 81.2% and 94.7% and to 100% and 96.2%, respectively. Discordances still exist between the proportion method and molecular approach, particularly regarding INH-resistance. However, these methods are very important for the management faster and correct patient, helping to choose the best treatment regimen.

O tratamento com antimicrobianos é a principal estratégia de controle da tuberculose (TB). Entretanto, o aumento do número de casos de TB com cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente aos antimicrobianos cria um cenário que dificulta a cura do paciente e o controle da doença. Embora várias mutações em loci específicos tenham sido identificadas como base de resistência, outros mecanismos, como o sistema de efluxo, podem contribuir para a resistência e o estabelecimento dessas mutações. O objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição do mecanismo de efluxo em isolados clínicos de M. tuberculosis resistentes aos principais antimicrobianos do esquema básico (isoniazida, INH; e rifampicina, RIF) e de multirresistência (ofloxacina, OFX; e amicacina, AMK). Três clássicos inibidores de bombas de efluxo - EPI - (verapamil, VP; tioridazina, TZ; e clorpromazina, CPZ) foram selecionados para detectar o efluxo. Primeiramente, foram analisadas três cepas MDR, duas pré-XDR e a cepa sensível de referência H37Rv. Foi utilizada a metodologia de checkerboard combinada com o tetrazolium microplate-based assay para analisar a interação entre os EPIs com os fármacos. Foi observado que os EPIs diminuem efetivamente a resistência aos antibióticos utilizados, com reduções de 4 a 64 vezes. Para avaliar a atividade do efluxo em tempo real foi utilizado o método fluorimétrico com o brometo de etídio (BrEt), em presença dos EPIs. Foi demonstrado que todas as cepas apresentaram efluxo intrínseco, porém a acumulação e o efluxo do BrEt foi mais evidente na cepa pre-XDR com resistência adicional a AMK. A quantificação transcricional do RNAm dos genes de bombas de efluxo (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) e do regulador transcricional whib7, quando as cepas foram expostas às concentrações subinibitórias dos antibióticos, foi analisada por RT-qPCR. Houve um aumento do nível transcricional de todos os genes em uma cepa MDR e na cepa Pre-XDR com resistência adicional a OFX, quando expostas a pelo menos um dos fármacos envolvidos na resistência. / Treatment with antimicrobials is the main TB control strategy. However, the increase in the number of TB cases with Mycobacterium tuberculosis strains resistant to antimicrobial creates a scenario that hinders patient's healing and disease control. Although several genetic mutations in specific loci involved in drug resistance have been identified as base of resistance, other mechanisms such as efflux system may contribute to resistance and to the establishment of these mutations. The main goal of this study was to assess the overall contribution of efflux mechanism in M. tuberculosis clinical isolates resistant to the main first line drugs (isoniazid, INH; and rifampicin, RIF) and second line (ofloxacin, OFX; and amikacin, AMK). Three classical inhibitors of efflux pumps -EPI- (verapamil, VP; thioridazine, TZ; and chlorpromazine, CPZ) were selected to detect the efflux. Firstly, we analyzed three MDR strains, two Pre-XDR and an H37Rv reference susceptible strain. We used the checkerboard method combined with the tetrazolium microplate-based assay to analyze the interaction between EPIs and drugs. It was observed that EPIs effectively reduce the MIC of antibiotics, with four-fold to 64-fold reduction. Efflux activity was evaluated in real-time by fluorimetric method with ethidium bromide (EtBr), in the presence of EPIs. All strains showed intrinsic efflux, however the accumulation and efflux of EtBr was evident most in the pre-XDR strain with additional resistance to AMK. The quantification of mRNA transcriptional level of efflux pump genes (mmpl7, mmr, Rv1258, p55, efpA, Rv2459) and the transcriptional regulator, whib7, when strains were exposed to antibiotics subinibitory concentrations was examined by RT-qPCR. There was an increase in the transcriptional level of all genes in a MDR strain and pre-XDR strain with additional OFX resistance, when exposed to at least one of the drugs involved in resistance, INH, RIF or OFX. However, there was no correlation between the reduction of antibiotic resistance levels with the EPI and the expression of genes encoding the pumps. Finally, in order to demonstrate the time to detection (TTD) of the bacterial growth in the antimicrobial environment in presence and absence of EPI, were applied BACTECTM MGITTM system 960 and Epicenter V5.53A equipped with software TB eXiST. Were used the MDR strains, a pre-XDR strain with additional resistance to AMK, and a monorresistant to OFX strain. In general, strains have showed a slower grew in the presence of VP, TZ and/or CPZ when combined with INH or RIF. This suggests that efflux is essential for the strain to grow faster in the presence of certain antibiotics. In addition, the efflux can act synergistically with the presence of mutations in order to reduce the biological cost of the bacteria and promoting growth at high drug concentrations. In conclusion, the described results demonstrated that the efflux system plays an important role in resistance to antibiotics used in the treatment of TB, and that the use of efflux inhibitors may potentiate the antimicrobial activity.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Instituto de Física, Instituto de Química, Faculdade Unb Planaltina, Programa de Pós-Graduação em Ensino de Ciências, Mestrado Profissional em Ensino de Ciências, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-10-05T12:10:29Z No. of bitstreams: 1 2012_KarllaVieiraDoCarmo.pdf: 2069839 bytes, checksum: cf7b94fbe35ebdb837efd2c3491cf57c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-05T12:32:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_KarllaVieiraDoCarmo.pdf: 2069839 bytes, checksum: cf7b94fbe35ebdb837efd2c3491cf57c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-05T12:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_KarllaVieiraDoCarmo.pdf: 2069839 bytes, checksum: cf7b94fbe35ebdb837efd2c3491cf57c (MD5) / Uma das limitações nos currículos de ciências está em priorizar o processo de ensino pautado nos seus produtos ao invés de valorizar o entendimento dos processos que norteiam o fazer científico. Considerar as habilidades e procedimentos da investigação científica na prática pedagógica não é uma proposta nova, mas continua sendo negligenciada. Por compreender que essa abordagem é necessária no desenvolvimento de um pensamento reflexivo, esta pesquisa teve como objetivo obter as percepções de um grupo de licenciandos em Ciências Biológicas (n=6) acerca de três habilidades e procedimentos da investigação científica (observação, registro e inferência) a partir de uma sequência didática. Durante a sequência utilizou-se algumas atividades em Biologia Celular em Molecular. Optou-se pela abordagem qualitativa para a análise dos dados e, por meio dos resultados constatou-se que os alunos refletiram sobre tais habilidades e procedimentos, mostrando crescente refinamento em suas percepções. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / One of the limitations science education curricula face relates to a kind of a methodology that stresses the teaching of scientific products instead of the skills and processes that originated them. The teaching of those skills and processes is not a new educational endeavor, however, it is still neglected. To be successful in such approach there is a need to the develop students’ reflexive thought. The aim of this study was to investigate the perceptions of a group of pre-service biology teachers (n=6) about the scientific processes of observation, observation record, and inference developed during a teaching unit. Some cell and molecular activities were part of the unit. The data was analyzed using qualitative methods. The findings show that the students were not only able to reflect about the three processes and skills, but demonstrated greater improvement in their perceptions.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-12-13T13:01:52Z No. of bitstreams: 1 2012_FelipeAlmeidaLessa.pdf: 5150375 bytes, checksum: 4edd5817b50694327530a7458871646a (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-12-20T12:24:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_FelipeAlmeidaLessa.pdf: 5150375 bytes, checksum: 4edd5817b50694327530a7458871646a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-20T12:24:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_FelipeAlmeidaLessa.pdf: 5150375 bytes, checksum: 4edd5817b50694327530a7458871646a (MD5) / RNAs não-codificadores (ncRNA) são macromoléculas biológicas que, apesar de não codificarem proteínas, realizam funções regulatórias importante nas células. A ferramenta Infernal é principal referência em buscas de ncRNAs por homologia, e o banco de dados Rfam um dos mais importantes repositórios de ncRNAs. Neste trabalho, mostramos que há clusters de famílias de ncRNAs estruturalmente bem similares no Rfam, adaptamos a ferramenta Infernal com novas distribuições a priori específicas a certos grupos de famílias de ncRNAs baseados nesses clusters e mostramos que essas prioris específicas a certos grupos podem tornar o Infernal mais sensível e específico. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Non-coding RNA (ncRNA) molecules do not code for proteins, but instead play an important regulatory role in cells. Infernal is the main tool for homology searches for ncRNAs, and Rfam is one of the main ncRNA databases. On this work, we show that there are clusters of structurally very similar ncRNA families on Rfam, adapt Infernal with new priors constructed especially for certain groups of ncRNA families (based on these clusters) and show that these group-specific priors may improve Infernal’s specificity and sensitivity.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2009-10-19T16:55:50Z No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-03T18:32:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-03T18:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) Previous issue date: 2008 / Baculovírus são vírus de inseto com grande potencial de uso em programas de controle biológico principalmente devido ao seu apelo ecológico, uma vez que são altamente específicos ao inseto alvo e não apresentam toxicidade ao homem e ao meio ambiente. Sua produção tem sido feita basicamente pela sua multiplicação no inseto hospedeiro. Porém, a produção de baculovírus em cultivos celulares oferece vantagens em relação à multiplicação in vivo por ser um sistema controlável, estéril, com alta pureza do produto e por dispor de centenas de linhagens de células de inseto estabelecidas. No entanto, sucessivas passagens do vírus em cultura de células podem resultar em alterações genéticas levando à perda de virulência. A alteração mais comum refere-se à formação de mutantes FP (Few Polyhedra) devido a mutações no gene 25k fp. O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) vem sendo utilizado com sucesso como agente de controle da lagarta da soja (A. gemmatalis). Entretanto, sua produção tem sido feita in vivo e pouco se conhece sobre sua produção em cultivos celulares. Nesse trabalho, os efeitos causados pela passagem do vírus AgMNPV em células BTI-Tn-5B1-4 foram estudados. A porcentagem de células contendo muitos poliedros manteve-se alta e constante até a quinta passagem. A partir desse ponto houve uma redução significante na quantidade de células com muitos poliedros com concomitante aumento na quantidade de células com poucos poliedros. Em paralelo, houve um dramático aumento no título viral pela produção de vírus extracelulares (budded virus). Todos esses parâmetros associados à análise ultraestrutural caracterizam a geração de mutantes FP durante a passagem serial do vírus em cultura de células. Adicionalmente, os perfis de restrição do DNA viral obtido em diferentes passagens mostraram similaridade revelando a ausência de grandes modificações genéticas, como deleções e inserções no genoma do vírus. A indicação da presença de alterações menores como mutações pontuais no locus do gene 25k fp foi comprovada pela determinação da sequência nucleotídica deste gene nos mutantes selecionados (sobrenadante da sétima passagem). Mutações pontuais foram detectadas em três clones (FP1, FP3, FP4) na região do gene 25k fp, incluindo sua região promotora, sendo que apenas um clone (FP5) não apresentou qualquer alteração nesse gene. Com base na cinética de síntese de proteínas utilizado marcação radioativa, uma redução na síntese da poliedrina (principal componente protéico dos corpos de oclusão) foi também observada em todos os clones do tipo FP em comparação com o vírus padrão. Além disso, a análise ultraestutrural dos clones FP revelou características típicas de formação de mutantes FP como células com poucos ou nenhum poliedro, produção de poliedros amorfos com baixo número de virions e formação de estroma virogênico com intensa produção de nucleocapsídeos. Finalmente, variantes Many Polyhedra (MP), apresentando um maior número de poliedros por célula e um título de budded virus similar ao vírus parental, foram selecionados como parte de uma estratégia para produção do vírus em escala maior em cultivos celulares (biorreatores). _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculovirus are insect viruses with great application potential for biological control programs due mainly to their ecological appeal, once they are highly specific to the host insect and do not present toxicity to man and to the environment. Their production has been made basically by their multiplication in host insects. Nevertheless, baculovirus production in cell cultures offers advantages over the in vivo multiplication for being a controllable, sterile, high pureness product yield process besides the fact of hundreds of cell lines being already established. However, successive passages of the virus in cell culture result in genetic alterations leading to loss of virulence. The most common alteration is the FP (Few Polyhedra) mutants formation due to mutations in the 25k fp gene. Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) baculovirus is being used successfully as control agent of the soybean caterpillar (A. gemmatalis). However, its production has been made in vivo and little is known on its production in cell cultures. In this work, the effects caused by the passage of the AgMNPV in BTI-Tn-5B1-4 cells was studied. The percentage of cells containing many polyhedra remained high and constant until the fifth passage. From this point on there was a significant reduction in the amount of cells with many polyhedra with concomitant increase in the amount of cells with few polyhedra. In parallel, there was a dramatic increase in the viral titer by production of extracellular virus (budded virus). All these parameters associated to the ultra structural analysis characterize the FP mutants generation during serial passage of the virus on cell culture. Additionally, there was similarity in the viral DNA restriction endonuclease digestion profile of different passages reveling no significant genetic modifications, such as deletions and insertions. The indication that small alterations, such as point mutations, present in the 25k fp gene locus was confirmed by this gene nucleic sequence determination in the selected mutants (seventh passage of supernatant). Point mutations in the 25k fp gene region were detected in three clones (FP1, FP3 and FP4), including its promoter region, and only one clone (FP5) did not present any alteration in this gene. Based on the protein synthesis kinetics using radioactive labeling, a reduction in the polhyedrin synthesis (the main component of the occlusion bodies) in all FP clones was also observed in comparison to the standard virus. Moreover, the ultra structural analysis of the FP clones disclosed typical characteristics of FP mutants formation such as cells with few or no polyhedra, amorphous polyhedra production with low virions number and virogenic stroma formation with intense nucleocapsid production. Finally, Many Polyhedra (MP) variants, presenting a larger number of polyhedra per cell and a similar to the parental virus budded virus titer, were selected as part of a strategy for a larger viral scale up production in cell culture (bioreactors).