Made available in DSpace on 2013-10-11T13:35:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451454-Texto+Completo-0.pdf: 6697842 bytes, checksum: 890c954db41088b36538c3133a7c2606 (MD5) Previous issue date: 2013 / Epilepsy, characterized by the occurrence of spontaneous and recurrent seizures, is one of the main chronic neurological diseases, affecting around 1% of the world's population. Adenosine is an endogenous modulator of neuronal excitability and has anticonvulsant properties. Thus, the modulation of adenosinergic signalling pathway may presents important effects on epilepsy. In this study we characterize different aspects of the adenosinergic signaling in a model of seizures induced by pentylenetetrazole (PTZ) in zebrafish. In this study we also analyzed the effect of different modulators of adenosinergic signaling on controlling the development of seizures. Our results showed that the activation of type A1 adenosine receptors has an important role in controlling seizures in zebrafish. Furthermore, we observed that ecto-5´-nucleotidase and ADA enzymes, in addition to nucleoside transporters, are directly involved in controlling extracellular adenosine levels and, consequently, in controlling the development of seizures in this teleost. In addition, we clarified the occurrence of controversial data related to the mTOR signaling pathway in oxidative stress. Previous studies have suggested the activation of this pathway in oxidative stress based on the misinterpretation of the phosphorylation of RSK and MSK proteins through the antibody anti-phospho-Thr389-S6K, in addition to protein S6 phosphorylation, regulated by the MAPK signaling pathway in this case. Therefore, these findings might contribute for a better understanding about the signaling pathways involved in the mechanisms of seizure control and represents na alternative for the development of antiepileptic drugs, increasing the therapeutic options in epilepsia. Our results may also contribute to future studies on the characterization and modulation of TOR signaling pathway in zebrafish. / A epilepsia, caracterizada pela ocorrência de crises convulsivas espontâneas e recorrentes, é umas das principais doenças neurológicas crônicas, afetando em torno de 1% da população mundial. A adenosina é um modulador endógeno da excitabilidade neuronal e apresenta propriedades anticonvulsivantes. Sendo assim, a modulação da via de sinalização adenosinérgica pode apresentar um efeito importante na epilepsia. Neste estudo, nós caracterizamos diferentes aspectos da sinalização adenosinérgica em modelo de crise convulsiva induzida por pentilenotetrazol (PTZ) em peixe-zebra. Nossos resultados demonstram um aumento nas atividades da adenosina desaminase (ADA), responsável pela desaminação de adenosina em inosina, logo após uma crise convulsiva. Além disso, foi observado que os fármacos antiepilépticos gabapentina, fenitoína e ácido valpróico preveniram o efeito estimulatório promovido pelo PTZ sobre as atividades da adenosina desaminase. Neste estudo, também analisamos o efeito de diferentes moduladores da sinalização adenosinérgica no controle do desenvolvimento de convulsões induzidas por PTZ. Nossos resultados demonstraram que a ativação de receptores de adenosina do tipo A1 tem importante participação no controle de crises convulsivas em peixe-zebra. Além disso, observamos que as enzimas ecto-5´-nucleotidase e ADA, além dos transportadores de nucleosídeos estão diretamente envolvidos no controle dos níveis extracelulares de adenosina e, consequentemente, no controle do desenvolvimento de crises convulsivas neste teleósteo. Além disso, esclarecemos a ocorrência de dados controversos relacionados à via de sinalização mTOR em estresse oxidativo. Estudos sugeriram a ativação desta via em estresse oxidativo baseados na interpretação equivocada da fosforilação das proteínas RSK e MSK pelo anticorpo anti-fosfo-Thr389-S6K, além da fosforilação da proteína S6, regulada neste caso pela via de sinalização MAPK. Este estudo pode contribuir para um maior entendimento das vias de sinalização envolvidas nos mecanismos de controle de crises convulsivas e representar uma alternativa para o desenvolvimento de fármacos antiepilépticos, aumentando as opções terapêuticas em epilepsia. Nossos resultados também podem contribuir para futuros estudos referentes à caracterização e modulação da via de sinalização TOR em peixe-zebra.

Made available in DSpace on 2013-10-11T13:35:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451400-Texto+Completo-0.pdf: 16861193 bytes, checksum: 8e59e1dc262f6d66b6ff62e7eca281b9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Human tuberculosis (TB) is a major global health threat. The disease’s increasing prevalence, coupled with the emergence of drug-resistant strains and the devastating effects of co-infection with human immunodeficiency virus (HIV) indicate an urgent need for the development of new and more efficient drugs to combat the disease's causative agent, Mycobacterium tuberculosis. Global health authorities have also begun to recognize the need for drugs that can kill the mycobacteria in its different physiological states including but not limited to latent TB infection. A more comprehensive understanding of the bacilli's nucleotide metabolic pathways, in particular purine and pyrimidine salvage pathways, could aid in the development of new therapeutic strategies to reduce the incidence of TB worldwide. Nucleoside hydrolase catalyzes the irreversible hydrolysis of N-glycosidic bond of ribonucleosides, forming α-D-ribose and the corresponding base. This work describes the amplification, cloning, expression and purification of the iunH-encoding purine nucleoside hydrolase from M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Results from steadystate kinetic experiments indicate that MtIAGU-NH has broad substrate specificity, accepting inosine, adenosine, guanosine, and uridine as substrates. Kinetics analysis utilizing fluorescence spectroscopy of ribose binding to MtIAGU-NH suggests that prior to ligand association there are two pre-existing forms of the enzyme. We determined the intracellular concentrations of inosine, uridine, hypoxanthine, and uracil as well as the reaction’s thermodynamic parameters. Thermodynamic activation parameters (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) for the MtIAGU-NH-catalyzed chemical reaction, along with results from mass spectrometry, isothermal titration calorimetry (ITC), pH-rate profile experiments, multiple sequence alignment, and molecular docking experiments are also presented. Knockout experiments of the iunH gene indicate that this gene is not essential for the growth of M. tuberculosis H37Rv underutilized experimental conditions. The data presented here contribute to our understanding of MtIAGU-NH, providing a solid basis for the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to reduce the global incidence of TB. / A tuberculose humana (TB) é considerada uma ameaça à saúde global. O aumento na prevalência da doença, a emergência de cepas resistentes e a coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas mais eficientes para o combate do agente causativo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Além disso, há a necessidade de novas drogas contra a micobactéria nos seus diferentes estados fisiológicos, incluindo a TB latente. Um maior entendimento sobre as vias metabólicas de nucleotídeos do bacilo da TB, em particular as vias de salvamento de purinas e pirimidinas, levariam ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para controlar a incidência global de TB. A hidrolase de nucleosídeos catalisa a hidrólise irreversível da ligação N-glicosídica de ribonucleosídeos, dando origem à α-D-ribose e sua base livre correspondente. Este trabalho descreve a amplificação e clonagem do gene iunH, e a expressão e purificação da enzima recombinante hidrolase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Os resultados de cinética no estado estacionário mostram que a MtIAGU-NH possui uma ampla especificidade pelos substratos, utilizando inosina, adenosina, guanosina e uridina como substratos. As medidas cinéticas da ligação da ribose à MtIAGU-NH por espectroscopia fluorimétrica sugerem a existência de duas formas da enzima em equilíbrio, relacionadas à associação ao ligante. As concentrações intracelulares de inosina, uridina, hipoxantina e uracil foram determinadas e os parâmetros termodinâmicos, estimados. Os parâmetros termodinâmicos de ativação (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) para a reação química catalisada pela MtIAGU-NH, além dos resultados de espectrometria de massa, calorimetria de titulação isotérmica, experimento de perfil de pH, alinhamento de múltiplas sequências e experimentos de docagem molecular também são apresentados neste trabalho. O nocaute do gene iunH mostrou que este não é essencial para o crescimento do bacilo M. tuberculosis H37Rv nas condições experimentais empregadas. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para um melhor entendimento sobre a enzima MtIAGU-NH, fornecendo bases sólidas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas para diminuir a incidência global da TB.

Made available in DSpace on 2014-07-18T02:01:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459291-Texto+Completo-0.pdf: 2043101 bytes, checksum: 4e24ba48e0e78b22fe2b62461eb9b386 (MD5) Previous issue date: 2014 / Genotyping of polymorphic short tandem repeats (STRs) loci is widely used in forensic DNA analysis. STR loci eventually present tri-allelic pattern as a genotyping irregularity and, in that situation, the doubt about the tri-allele locus calculation can reduce the analysis strength. Alleles at the TPOX STR locus have 6– 14 different numbers of a four-nucleotide (AATG) repeat motif arranged in tandem. Although tri-allelic genotypes are generally rare, the TPOX tri-allelic pattern has a higher frequency, varying widely among populations. Despite this, there are few accurate reports to disclose the nature of the TPOX third allele. In this work we performed two studies: In the first one we present data obtained from 45 individuals belonging to the same pedigree, in which there were cases of tri-allelic TPOX genotypes. The subjects were apparently healthy with a normal biological development. We noticed six tri-allelic cases in this family, and all of them were women. Karyotype analysis showed no occurrence of partial 2p trisomy. All the tri-allelic cases had the genotype 8–10–11, probably due to three copies of the TPOX STR sequence in all cells (Type 2 tri-allelic pattern). Based on previous data we assumed an allele 10 as the TPOX third allele. The pedigree analyses show evidence that the TPOX extra allele was an allele 10, it is placed far from the main TPOX locus, and that there is a potential linkage of the TPOX extra-allele-10 with one marker on Xq. This was the first study that included a large pedigree analysis in order to understand the nature TPOX tri-allelic pattern. In the second study, we investigate whether there is a single third-extra allele in the TPOX tri-allelic pattern, what it is, and where it is. We looked for TPOX tri-allelic subjects in 75,113 Brazilian families. Considering only the parental generation (mother+father) we had 150,226 unrelated subjects evaluated. From this total, we found 88 unrelated subjects with tri-allelic pattern in the TPOX locus (0. 06%; 88/150,226). Seventeen percent of these subjects (15/88) presented heterozygosis with peak imbalance, which we describe as a derived category to Clayton’s Type 2 tri-allelic pattern (a higher peak of double dose homozygote plus a regular sized peak). In this paper we presented detailed data from 66 trios (mother+father+child; with true biological relationships) where the tri-allelic pattern was observed in the mother or in the father. In 39 of these families (39/66; 59%) the third-extra TPOX allele was transmitted either from the mother or from the father to the child. Our evidence indicated an allele 10 as the thirdextra TPOX allele, and it is on the X chromosome. The present data, which support the previous hypothesis, improve the knowledge about tri-allelic pattern of TPOX CODIS' locus allowing the use of TPOX profile in forensic analyses even when with tri-allelic pattern. This evaluation is now available for different forensic applications. / A genotipagem de short tanden repeats ( STRs ) é amplamente utilizada na análise de DNA forense, contudo eventuais ocorrências de trialelias podem reduzir o poder da análise. Alelos do lócus de STR TPOX tem de 6-14 números diferentes do motivo de repetição em tandem de quatro nucleotídeos (AATG). Apesar dos genótipos tri-alélicos sejam geralmente raro, o padrão tri-alélico do TPOX tem uma alta freqüência, variando amplamente entre as populações. Apesar disso, há poucos relatos precisos para divulgar a natureza do terceiro alelo do TPOX. Neste trabalho nós realizamos dois estudos: No primeiro, apresentamos os dados obtidos a partir de 45 indivíduos pertencentes à mesma linhagem, em que houve casos de genótipos tri-alélicos do TPOX. Os indivíduos foram aparentemente saudável, com um desenvolvimento biológico normal. Percebemos seis casos tri-alélicos nesta família, e todos eles foram em mulheres. A análise do cariótipo mostrou nenhuma ocorrência de trissomia parcial 2p. Todos os casos trialélicos tinham o genótipo 8-10-11, provavelmente devido a três cópias da seqüência do STR TPOX em todas as células (Padrão tri-alélico tipo 2). Com base nos dados anteriores, assumimos o alelo 10 como sendo o terceiro alelo do TPOX. As análises do pedigree mostraram evidências de que o alelo extra do TPOX foi o alelo 10, é localizado distante do lócus principal do TPOX, e que existe um potencial de ligação entre o alelo- extra-10 do TPOX com um marcador em Xq. Este foi o primeiro estudo que incluiu uma grande análise do pedigree, a fim de compreender a natureza do padrão tri-alélico do TPOX. No segundo estudo, investigamos se há um único terceiro extra-alelo no padrão tri-alélico do TPOX, o que é ele, e onde está. Nós pesquisamos por indivíduos tri-alélicos no lócus TPOX em 75. 113 famílias brasileiras. Considerando apenas a geração parental (mãe + pai) tivemos 150. 226 indivíduos não relacionados avaliados. Desse total, encontramos 88 indivíduos não relacionados com o padrão tri-alélico no lócus TPOX (0,06%, 88/150, 226). Dezessete por cento destes indivíduos (15/88) apresentaram heterozigoses com desbalanço de picos, que descrevemos como uma categoria derivada do padrão tri-alélico de Clayton Tipo 2 (um pico mais alto de homozigoto dose dupla, mais um pico de tamanho regular). Neste trabalho, apresentamos dados detalhados de 66 trios (mãe + pai + filho; com verdadeiras relações biológicas) onde o padrão tri-alélico foi observado na mãe ou no pai. Em 39 destas famílias (39/66; 59%) o terceiro alelo-extra do TPOX foi transmitido tanto a partir da mãe ou do pai para a criança. Nossas evidências indicaram o alelo 10 como sendo o terceiro alelo-extra do TPOX, e ele está no cromossoma X. Os dados apresentados, os quais suportam as hipóteses anteriores, melhoram o entedimento sobre o padrão tri-alélico do lócus TPOX do CODIS permitindo o uso do perfil TPOX em análises forense, mesmo quando com o padrão tri-alélico. Essa avaliação está agora disponível para diferentes aplicações forenses.

Made available in DSpace on 2014-07-19T02:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459408-Texto+Completo-0.pdf: 1270061 bytes, checksum: a4594eb8c40c25e57008dc9d40066c93 (MD5) Previous issue date: 2014 / We evaluated haplotype and allele frequencies, as well as statistical forensic parameters, for 23 Y-chromosome short tandem repeats (STRs) loci of the PowerPlex®Y23 system (DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, DYS448, DYS456, DYS458, DYS635, Y-GATA-H4, DYS481, DYS533, DYS549, DYS570, DYS576, DYS643) in a sample of 150 apparently healthy males, resident in south Brazil. A total of 150 different haplotypes were identified. The highest gene diversity was observed for the single locus marker DYS570 (GD = 0. 7888) and for a two-locus system DYS385 (GD = 0. 9009). We also examined 150 father-son pairs by the same system, and observed a total of 13 mutations were identified in the 3,450 father-son allelic transfers, with an overall mutation rate across the 23 loci of 3. 768 x 10-3 (95% CI = 3. 542 x 10-3 to 3. 944 x 10-3). In all cases there was only one locus mutated with gain/loss of repeats in the son (5 one-repeat gains, and 7 one-repeat and 1 two-repeat losses); we observed no instances of mutations involving a non-integral number of repeats. / Foram avaliadas as frequências alélicas e haplotípicas, bem como os parâmetros estatísticos forenses, para 23 lócus Short Tandem Repeat (STRs) de cromossomo Y presentes no kit comercial PowerPlex®Y23 system (DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, DYS448, DYS456, DYS458, DYS635, Y-GATA-H4, DYS481, DYS533, DYS549, DYS570, DYS576, DYS643) em uma amostra de 150 homens saudáveis, residentes no sul do Brasil. Um total de 150 haplótipos diferentes foram identificados. A maior diversidade genética foi observada para o marcador de lócus único DYS570 (GD = 0,7888) e para o lócus duplo DYS385 (GD = 0,9009). Também foram analisados 150 de pares de pai-filho pelo mesmo sistema, e um total de 13 mutações foram observadas em 3. 450 transferências alélicas entre pais-filhos, com uma taxa geral de mutação nos 23 lócus de 3. 768 x 10-3 (95% CI = 3. 542 x 10-3 - 3. 944 x 10-3). Em todos os casos foi encontrado apenas um lócus mutado com ganho ou perda de repetições no filho (5 ganhos de repetição única, 7 perdas de repetição única e 1 perda de dupla-repetição). Não foi observado nenhum caso de mutação envolvendo um número não integral de mutações.

Made available in DSpace on 2014-07-19T02:02:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459527-Texto+Completo-0.pdf: 855354 bytes, checksum: 2ebbe767e99c1ddc288d33fdf6ff1ebe (MD5) Previous issue date: 2013 / Salmonella enterica is an important pathogen that causes gastroenteritis, and is transmitted to human through the consumption of contaminated food, especially from animal origin. The use of antimicrobials for therapeutic purposes in veterinary medicine and as growth promoters in animals used for food production has been considered one of the causes of emergence and spread of multi-drug resistant (MDR) S. enterica, representing a major risk to public health. Thus, the aim of this study was to determine antimicrobial resistance profiles as well as to characterize the main determinants involved on phenotypes of resistance in S. enterica isolates from poultry by-product meal and from other samples derived of poultry production chain, especially from environment of broiler houses. A total of 203 S. enterica isolates was analyzed, being 106 from poultry by-product meal and 97 isolated mainly from drag swabs. Higher percentages of resistance were detected in S. enterica isolated from drag swab when compared with isolates from poultry by-product meal. The highest percentages of resistance were found to sulfonamides followed by tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, nalidixic acid, streptomycin and spectinomycin. The majority of isolates was sensitive to ciprofloxacin and enrofloxacin. MDR phenotypes were detected in 37 (18. 2%) isolates and the profile penta-resistant (ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, tetracycline and sulphamethoxazole) was detected in S. Heidelberg, S. Cerro and two S. Senftenberg. Class 1 integrons was found in 26 isolates (12. 7 %), and did not detect the presence of class 2 integron. A S. Senftenberg isolated from environment was found to harbor two class 1 integrons: one integron with a typical 3’CS, and the other with an atypical 3′CS linked to the qacH–sul3. The sul1, sul2 and sul3 genes were detected in 18. 7%, 32. 5% and 31. 2% S. enterica phenotypically resistant to sulfonamide, respectively. blaCMY, blaCTX-M and blaTEM genes were detected in 23. 8%, 9. 5% and 85. 7% of isolates resistant to β -lactams, respectively. Resistance determinants tetA, tetB and tetC were observed in 70%, 10% and 10% of isolates resistant to tetracycline, respectively. aadA and aadB genes were detected in 26. 1% and 32. 1% of isolates resistant to aminoglycosides, as well as the presence of strA and strB genes in 44. 4% and 34. 9% of S. enterica isolates phenotypically resistant to streptomycin. The presence of a heterogeneous profile of antimicrobial determinants and mobile genetic elements in the isolates analyzed indicates the potential risk that these bacteria represent to human health. / A Salmonella enterica é um importante patógeno causador de gastrenterite transmitido para humanos através do consumo de alimentos contaminados, principalmente os de origem animal. O uso de antimicrobianos para fins terapêuticos na medicina veterinária e como promotores de crescimento em animais destinados à produção de alimentos tem sido apontado como uma das causas do surgimento e disseminação de S. enterica multi-resistentes (MDR), constituindo um grande risco para a saúde publica. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi determinar o perfil de resistência a antimicrobianos, bem como caracterizar os principais determinantes envolvidos nos fenótipos de resistência em isolados de S. enterica provenientes de farinhas de aves e de outras amostras oriundas da cadeia produtiva do frango, especialmente do ambiente de criação. Um total de 203 isolados de S. enterica foi analisado, sendo 106 oriundos de farinhas de aves e 97 provenientes, principalmente, de suabes de arrasto. Percentuais mais elevados de resistência foram detectados em S. enterica isoladas de suabe de arrasto, quando comparadas com isolados de farinhas de aves. Os maiores percentuais de resistência foram encontrados para sulfonamida, seguida por tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, ácido nalidíxico, estreptomicina e espectinomicina.A maioria dos isolados foi sensível à ciprofloxacina e à enrofloxacina. Fenótipos de MDR foram observados em 37 (18,2%) isolados, sendo que o perfil penta-resistente (ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfametoxazol e tetraciclina) foi detectado em S. Heidelberg, S. Cerro e em duas S. Senftenberg. Integrons de classe 1 foram detectados em 26 isolados (12,7%), e não foi observada a presença de integron de classe 2. Uma S. Senftenberg isolada a partir do ambiente apresentou dois integrons de classe 1: um com um 3’CS típico e outro com 3′CS atípico ligado a qacH–sul3. Os genes sul1, sul2 e sul3 foram detectados, respectivamente, em 18,7%, 32,5% e 31,2% dos isolados de S. enterica fenotipicamente resistentes à sulfonamida. Os genes blaCMY, blaCTX-M e blaTEM foram detectados 23,8%, 9,5% e 85,7% dos isolados resistentes aos β-lactâmicos, respectivamente. Os determinantes de resistência tetA, tetB e tetC foram observados em 70%, 10% e 10% dos isolados resistentes à tetraciclina, respectivamente. Os genes aadA e aadB foram encontrados em 26,1% e 32,1 % dos isolados resistentes aos aminoglicosídeos, assim como a presença dos genes strA e strB foi detectada em 44,4% e 34,9% dos isolados de S. enterica fenotipicamente resistentes à estreptomicina. A presença de um perfil heterogêneo de determinantes de resistência e de elementos genéticos móveis nos isolados analisados indica o potencial risco que estas bactérias representam para a saúde humana.

Made available in DSpace on 2014-08-12T02:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000460176-Texto+Completo-0.pdf: 769931 bytes, checksum: 51ce02520c2340026c784bc9ef36d15d (MD5) Previous issue date: 2014 / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent primary tumor of the liver, and is currently one of the major neoplastic diseases, representing 85% of primary liver tumors and is the third leading cause of cancer-related death. The development of the majority of hepatocellular carcinomas related to the presence of a disease resulting from cirrhosis, such as hepatitis B and C. Its incidence has increased in recent years due to the number of patients with infections caused by hepatitis C. The aim of this study was investigate the in vitro effect of fructose-1,6-bisphosphate (FBP) on the growth of HepG2 cells, used as a model to hepatocellular carcinoma. The results showed that the FBP decreases cell proliferation in a dose-dependent manner, not being caused by cell cycle arrest or apoptosis verified by flow cytometry. It was observed that at 72 h of treatment FBP decreased levels of IL-8, which is closely related to the tumor progression and the generation of reactive oxygen species. Moreover, FBP decreased oxidative stress by increasing the levels of catalase and decrease TBARS, this effect is possibly caused by the result of low IL- 8. These findings demonstrated that the FBP may be a potential anticancer agent for the treatment of HCC. / O hepatocarcinoma (HCC) é o tumor primário de fígado mais frequente, sendo atualmente uma das principais doenças neoplásicas, representando 85% dos tumores hepáticos primários e sendo a terceira maior causa de morte relacionada ao câncer. O desenvolvimento da maioria dos hepatocarcinomas relaciona-se com a presença de alguma doença decorrente do quadro de cirrose, como hepatite B e C. Sua incidência tem aumentado nos últimos anos devido ao número de pacientes com infecções por hepatite C. O objetivo deste estudo foi investigar, in vitro, o efeito da frutose-1,6-bisfosfato (FBP) sobre o crescimento das células HepG2, modelo utilizado como carcinoma hepatocelular. Os resultados demonstraram que a FBP diminui a proliferação celular em uma relação dose-dependente, não sendo essa proliferação ocasionada por parada no ciclo celular ou apoptose verificado pelos testes de citometria. Observou-se que em 72 h de tratamento a FBP diminuiu os níveis de Interleucina 8 (IL-8), sendo esta interleucina relacionada com a progressão tumoral e a geração de espécies reativas de oxigênio. Além disso, a FBP diminuiu o estresse oxidativo, aumentando os níveis de catalase e diminuindoa produção das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico(TBARS), sendo esse efeito antioxidante possivelmente ocasionado por conseqüênte diminuição de IL-8. Estes resultados demonstraram que a FBP pode ser um agente antineoplásico em potencial para o tratamento de hepatocarcinoma.

Made available in DSpace on 2014-08-30T02:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000460859-Texto+Completo-0.pdf: 2353123 bytes, checksum: dd594f361c31a6e6ca5c19cd19a8c488 (MD5) Previous issue date: 2014 / The Mycobacterium tuberculosis NADH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase (MtInhA) catalyzes hydride transfer to long-chain enoyl thioester substrates. MtInhA is a member of the mycobacterial type II dissociated fatty acid biosynthesis system, and is the bona fide target for isoniazid, the most prescribed drug for tuberculosis treatment. Here, a series of piperazine derivatives was synthesized and screened as MtInhA inhibitors, which resulted in the identification of compounds with IC50 values in the submicromolar range. A structure-activity relationship (SAR) evaluation indicated the importance of the chemical environment surrounding the carbonyl group for inhibition. In addition, the structure of one selected compound was supported by crystallographic studies, and experimental geometrical values were compared with semi-empirical quantum chemical calculations. Furthermore, the mode of inhibition and inhibitory dissociation constants were determined for the nine most active compounds. These findings suggest that these compounds interact with MtInhA at the enoyl thioester (2-trans-dodecenoyl-CoA) substrate binding site. Finally, two 9H-fluoren-9-yl-piperazine-containing compounds exhibited moderate antimycobacterial activity against the M. tuberculosis H37Rv strain. / A enzima 2-trans-enoil-ACP redutase de Mycobacterium tuberculosis (MtInhA) catalisa a etapa enzimática final no ciclo de alongamento da via de biossíntese de ácidos graxos, convertendo 2-trans-enoil-ACP à acil-ACP em um mecanismo dependente de NADH. Essa enzima vem sendo descrita como alvo validado para a descoberta de fármacos. Nesse trabalho uma série de piperazinas foi sintetizada e avaliada quanto ao potencial inibitório da atividade enzimática da MtInhA, resultando em compostos com valores de IC50 na faixa de inibição de nanomolar. Avaliações de relação estrutura-atividade (SAR) indicam a importância do ambiente químico adjacente à carbonila para a inibição. Além disso, a estrutura de um composto foi confirmada por estudos cristalográficos e os valores geométricos experimentais foram comparados com valores obtidos através de cálculos semi-empíricos de obitais moleculares. Experimentos para determinação do modo de inibição e obtenção dos valores das constantes de dissociação foram realizados para os nove compostos mais ativos. Os resultados sugerem que esses compostos interagem com MtInhA no sítio de ligação dos substratos acil-graxos. Finalmente, dois compostos, contendo na sua estrutura 9H-fluoren-9-il-piperazina exibiram moderada atividade antimicrobiana contra a cepa Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

Made available in DSpace on 2015-04-30T14:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000467370-Texto+Completo-0.pdf: 6072599 bytes, checksum: 169f7ff123882c0b088732b04ad1956d (MD5) Previous issue date: 2014 / Schistososmiasis is a chronic endemic infection caused by parasites of the genus Schistosoma, and it occurs in 74 countries in Africa, South America and Asia. The three main agents of this infection in humans are: Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum, that cause the hepatic-intestinal disease, and Schistosoma haematobium, responsible for the genitourinary infection. Despite the effective treatment like praziquantel, schistososmiasis remains as the second most prevalent parasitic disease in the world. Diagnosis of the intestinal schistososmiasis is achieved through the direct visualization of the eggs in fecal samples. The current method recommended by the World Health Organization in epidemiological studies is the Kato-Katz method. Despite it being simple and cheap, in areas of low endemicity this technique loose sensibility, leading to the occurrence of false-negative cases and underestimation of the prevalence in the studied area. Helmintex™ is a coproparasitological method highly sensitive that allows the isolation of Schistosoma eggs from 30 grams of feces, based in the interaction between the eggs and paramagnetic microspheres in a magnetic field. However, this method demands time and specialized equipment, being of difficult manipulation in work field. The mechanism that promotes the interaction between the paramagnetic spheres with the Schistosoma eggs is not known. Considering the necessity of sensitive diagnostic tools of easy applicability in epidemiological studies in low endemicity areas, this work has the purpose to study the surface physical-chemical characteristics of S. mansoni and S. japonicum eggs, in order to enhance the efficiency of the Helmintex™ method. S. mansoni and S. japonicum eggs were isolated from livers of experimentally infected mice. The eggs were submitted to morphological and structural analysis using Scanning and Transmission Electron Microscopy and elemental analysis using Energy Disperssion Spectroscopy. The magnetic susceptibility was determined using SQUID (Superconducting Quantum Interference Device) and the concentration of the chemical elements was determined through Atomic Emission Spectroscopy. Experiments to elucidate the interaction properties of the eggs of the eggs and the microspheres were conducted incubating the eggs from both species with different paramagnetic microspheres. The results show that the egg surface of both species is recovered by a dense layer of microspines, being those shorter and less spaced in S. mansoni. The eggs spontaneously bind the particles, with a greater preference for magnetic material. S. japonicum eggs have a higher affinity for paramagnetic microspheres than S. mansoni eggs. The presence of streptavidin in the surface of the microspheres enhances the affinity of both species for non-magnetic material, however it decreases the affinity for paramagnetic microspheres. Despite the presence of iron in the eggshell of S. mansoni and S. japonicum, the origin of the interaction does not seem to be magnetic, but, based in the difference of electrostatic charges present in the surface of the eggs and the microspheres. The continuity of this study is important to determine the physical-chemical characteristics of eggs from human feces, and it can lead to the upgrading and optimization of the Helmintex™ method. Studies using Atomic Force Microscopy are in progress. / A esquistossomose é uma infecção crônica endêmica causada por parasitos do gênero Schistosoma, e ocorre em países 74 países na África, América do Sul e Ásia. Os três principais agentes desta infecção em humanos são: Schistosoma mansoni e Schistosoma japonicum, causadores da doença hepato-intestinal, e Schistosoma haematobium, responsável pela infecção genitourinária. Apesar de haver tratamento efetivo como o praziquantel, a esquistossomose permanece como a segunda infecção parasitária mais prevalente no mundo. O diagnóstico da esquistossomose intestinal é feito através da direta visualização dos ovos em amostras fecais. O método atualmente recomendado pela Organização Mundial de Saúde em estudos epidemiológicos é o método de Kato-Katz. Apesar de simples e barato, em áreas de baixa endemicidade esta técnica perde sensibilidade, levando à ocorrência de casos falso-negativos e subestimação da prevalência da área estudada. O Helmintex® é um método coproparasitológico altamente sensível que permite o isolamento de ovos de Schistosoma à partir de 30 gramas de fezes, baseado na interação entre os ovos e esferas paramagnéticas em um campo magnético. Entretanto, este método demanda tempo e equipamentos especializados, sendo de difícil manipulação em estudos de campo.O mecanismo que promove a interação das esferas paramagnéticas com os ovos de Schistosoma não é conhecido. Tendo em vista a necessidade de ferramentas diagnósticas sensíveis e de fácil aplicabilidade em estudos epidemiológicos em áreas de baixa transmissão, este trabalho tem por objetivo estudar características físico-químicas da superfície dos ovos de S. mansoni e S. japonicum, afim de aprimorar a eficiência do método Helmintex®. Ovos de S. mansoni e S. japonicum foram isolados de fígados de camundongos experimentalmente infectados. Os ovos foram submetidos à analise morfológica e estrutural utilizando Microscopia Eletrônica de Varredura e Transmissão e análise elementar utilizando Espectroscopia por Dispersão de Energia. A susceptibilidade magnética foi determinada utilizando-se o SQUID (Superconducting Quantum Interference Device) e a concentração dos elementos químicos foi determinada através de Espectroscopia por Emissão Atômica. Experimentos para elucidar as propriedades de interação dos ovos e das microesferas foram conduzidos incubando ovos de ambas as espécies com diferentes microesferas paramagnéticas. Os resultados mostram que a superfície do ovo de ambas as espécies é recoberta por uma camada densa de microespinhos, sendo estes mais curtos e menos espaçados em S. mansoni. Os ovos espontaneamente ligam-se às partículas, com maior preferência por material magnético. Os ovos de S. japonicum possuem maior afinidade pelas microsesferas paramagnéticas do que os ovos de S. mansoni. A presença de estreptavidina na superfície das microesferas aumenta a afinidade de ambas as espécies por microesferas não-magnéticas, porém diminui a afinidade por microesferas paramagnéticas. Apesar da presença de ferro na casca do ovo tanto de S. mansoni quanto de S. japonicum, a origem da interação não parece ser magnética, e sim, baseada na diferença de cargas eletrostáticas presentes na superfície dos ovos e das microesferas. A continuidade deste estudo é importante para determinar as características físico-químicas de ovos provenientes de fezes humanas, e pode levar ao aprimoramento e otimização do método Helmintex®. Estudos utilizando-se Microscopia de Força Atômica encontram-se em andamento.

Made available in DSpace on 2015-04-30T14:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000467140-Texto+Completo-0.pdf: 2666780 bytes, checksum: 69d9316002f8596f9f09b6c05ceb6081 (MD5) Previous issue date: 2015 / Tuberculosis (TB) is the leading cause of bacterial infectious disease mortality. The etiological agent, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is responsible for 1. 5 million deaths and 9 million people infected in 2013. The World Health Organization (WHO) estimates that one-third of the world´s population is infected with latent form of Mtb. Thus, there is a continuous need to find promising molecular targets for the development of anti-TB agents. The shikimate pathway produces an important precursor of aromatic compounds in bacteria, fungi, plants and apicomplexan parasites, chorismate. The pathway comprises seven enzymes, which convert erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate into chorismate, the precursor for the synthesis of aromatic amino acids, folic acid, ubiquinone, and many other aromatic compounds. This pathway is essential for growth of Mtb. The aroD gene, that codes for 3-dehydroquinate dehydratase (DHQase), catalyzes the reversible reaction of 3-dehydroquinate into 3-dehydroshikimate and the aroE gene, that codes for the NADP(H) dependent shikimate-5-dehydrogenase (SD), catalyzes the reduction of 3-dehydroshikimate into shikimate. The aim of the present study was to identify new dug-like molecules as inhibitors for MtbDHQase and MtbSD using structure-based modeling and virtual screening. The availability of the crystal structure bound with an inhibitor of MtbDHQase was explored using pharmacophore models based on interaction energy and docking to yield diverse leads. For MtbSD, due the absence of crystal structure and reported inhibitors, the tridimensional structure was achieved by molecular modelling. Structure-based pharmacophore and virtual screening of the in house database containing 3000 unique molecules retrieved twelve hit compounds with good docking score and interaction pattern for MtbDHQase. For MtbSD, the commercially available database Asinex, with 500,000 molecules, were used and seventeen compounds were selected based in its docking score, interaction pattern with amino acids in the active site, number of hydrogen bonds and GOLD score. MtbDHQase inhibitors were tested and, after inhibition assay, series of chemical modifications were made in the lead compound. The top two derivate presented IC50 values of 17. 1 and 31. 5 μM as well as MIC values of 25 and 6. 25 μg/mL and cytotoxicity below 15% at 100 μM respectively. The MtbSD compounds selected as possible inhibitors will be tested for inhibition, MIC value and cytotoxicity. / A Tuberculose (TB) é a principal causa de mortalidade devido a infecções bacterianas. Seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi responsável por 1,5 milhões de mortes e por 9 milhões de pessoas infectadas em 2013. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que um terço da população mundial está infectada com a forma latente do Mtb. Assim, há uma contínua necessidade de buscar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-TB. A via do chiquimato produz um importante precursor de compostos aromáticos em bactérias, fungos, plantas e parasitas do filo Apicomplexa, o corismato. A via é composta por sete enzimas, as quais convertem eritrose-4-fosfato e fosfenolpiruvato em corismato, o precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos, ácido fólico, ubiquinonas e muitos outros compostos aromáticos. Esta via é essencial para o crescimento do Mtb.O gene aroD, que codifica a enzima 3-desidroquinato desidratase (DHQase), catalisa a reação reversível do 3-desidroquinato em 3-desidrochiquimato e o gene aroE, que codifica a enzima dependente de NADP(H) chiquimato-5-desidrogenase (SD), catalisa a redução do 3-desidrochiquimato em chiquimato. O objetivo do presente estudo foi identificar novas moléculas como inibidores para a MtbDHQase e MtbSD utilizando modelagem baseada em estrutura e triagem virtual. A disponibilidade da estrutura cristalográfica ligada a um inibidor da MtbDHQase foi explorada utilizando modelos farmacóforos baseados na energia de interação e docagem para gerar diversos protótipos. Para a MtbSD, devido à ausência de estrutura cristalográfica e de inibidores, foi realizado através de modelagem molecular, um modelo da estrutura. A abordagem do farmacofórico baseado na estrutura, juntamente com a triagem virtual da base de dados in house contendo 3000 estruturas inéditas geraram compostos escolhidos com bom valor de docagem e padrão de interação com aminoácidos do sítio ativo. Para a MtbSD, foi utilizada a base de dados Asinex, que contém 500000 moléculas. Dezessete compostos foram encontrados baseados nos seus valores de docagem, no padrão de interação com os aminoácidos do sítio ativo, no número de interações de hidrogênio e no valor de GOLD. Os inibidores da MtbDHQase foram testados e, após os ensaios de inibição, foram realizadas diversas derivações químicas no composto protótipo. Os dois melhores compostos derivados apresentaram um valor de IC50 de 17,1 e 31,5 μM, um valor de MIC de 25 e 6,25 μg/mL e citotoxicidade abaixo de 15% a 100μM, respectivamente. Os compostos selecionados como possíveis inibidores para a MtbSD serão futuramente testados quanto a sua inibição, valor de CIM e citotoxicidade.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431140-Texto+Completo-0.pdf: 1654374 bytes, checksum: 1465b8ac4be5cfbe78bdaa126071ddf5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Guanosine monophosphate (GMP) reductase catalyzes the reductive deamination of GMP to inosine monophosphate (IMP). GMP reductase plays an important role in the conversion of nucleoside and nucleotide derivatives of guanine to adenine nucleotides. In addition, as a member of the purine salvage pathway, it also participates in the reutilization of free intracellular bases. Here we present cloning, expression and purification of Escherichia coli guaC-encoded GMP reductase to determine its kinetic mechanism, as well as chemical and thermodynamic features of this reaction. Initial velocity studies and isothermal titration calorimetry demonstrated that GMP reductase follows an ordered bi-bi kinetic mechanism, in which GMP binds first to the enzyme followed by NADPH binding, and NADP+ dissociates first followed by IMP release. The isothermal titration calorimetry also showed that GMP and IMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles showed groups with apparent pK values of 6. 6 and 9. 6 involved in catalysis, and pK values of 7. 1 and 8. 6 important to GMP binding, and a pK value of 6. 4 important for NADPH binding. Primary deuterium kinetic isotope effects demonstrated that hydride transfer contributes to the rate-limiting step, whereas solvent kinetic isotope effects arise from a single protonic site that plays a modest role in catalysis. Multiple isotope effects suggest that protonation and hydride transfer steps take place in the same transition state, lending support to a concerted mechanism. Pre-steady-state kinetic data suggest that product release does not contribute to the rate-limiting step of the reaction catalyzed by E. coli GMP reductase. / A enzima guanosina monofosfato (GMP) redutase catalisa a deaminação redutiva do GMP à inosina monofosfato (IMP). GMP redutase possui um papel importante na conversão dos nucleosídeos e nucleotídeos derivados de guanina a nucleotídeos de adenina. Além desse fato, como parte da via de salvamento de purinas, também participa da reutilização de bases livres intracelulares. Nesse trabalho, mostramos a clonagem, a expressão e a purificação da GMP redutase codificada pelo gene guaC de Escherichia coli a fim de determinar seu mecanismo cinético; bem como as características químicas e termodinâmicas da reação catalisada. Estudos de velocidade inicial e titulação de calorimetria isotérmica demonstraram que a GMP redutase possui um mecanismo cinético bi-bi ordenado, no qual o GMP liga primeiro à enzima, seguido pela ligação do NADPH; o NADP+ se dissocia primeiro, seguido pela liberação do IMP. A titulação calorimétrica também mostrou que a ligação do GMP e IMP são processos termodinamicamente favoráveis. Perfis de pH demonstraram grupos com valores de pK aparentes de 6,6 e 9,6 envolvidos na catálise, valores de pK de 7,1 e 8,6 importantes para ligação do GMP e um valor de pK de 6,4 importante para ligação do NADPH. Efeito isotópico primário demonstrou que a transferência do hidreto contribui para a etapa limitante da reação, enquanto que os efeitos isotópicos do solvente provêm de um único local de protonação que possui um papel modesto na catálise. Efeito isotópico múltiplo sugere que as etapas de protonação e transferência do hidreto ocorrem no mesmo estado de transição, fornecendo evidência de um mecanismo concerted. Os dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação do produto não contribui para a etapa limitante da reação catalisada pela GMP redutase de E. coli. Em conjunto, os resultados mostram que a reação catalisada pela GMP redutase segue um mecanismo sequencial e ordenado, onde a transferência do hidreto e do próton ocorrem no mesmo estado de transição. Os resultados aqui apresentados foram os primeiros a evidenciar o mecanismo cinético da GMP redutase, bem como, os resíduos fundamentais para catálise e/ou ligação, além de fornecer informações sobre o estado de transição da reação.