Os fungos filamentosos acionam mecanismos eficientes para sobrevivência nas diferentes condições ambientais e modulam, por exemplo, a produção de proteínas. A abordagem proteômica tem sido utilizada com sucesso para investigar os mecanismos fisiológicos envolvidos nas adaptações metabólicas desses microrganismos, frente às mudanças de parâmetros físicos e químicos do meio extracelular. No presente trabalho foi avaliado o efeito das variações de pH, fontes de carbono e nitrogênio (aminoácidos e fontes complexas) sobre a produção de peptidases e sobre o proteoma intra- e extracelular do fungo Aspergillus niveus em bioprocessos submersos. As atividades proteolíticas foram avaliadas durante 96 h de cultivo e as melhores induções, entre os estudos comparativos, foram observadas em pH 6, xilose, cisteína e farinha de pena. O efeito dessas variações sobre o proteoma de A. niveus foi avaliado em 96 h de cultivo submerso e, para isso, foram realizados estudos proteômicos nos quais os conteúdos proteicos foram avaliados por eletroforese bidimensional (2-DE); e os spots proteicos selecionados foram identificados por espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF-MS/MS). As proteínas apresentadas no estudo demonstram que as variações de pH, fontes de carbono e nitrogênio influenciaram as proteínas intra- e extracelulares de A. niveus. Os perfis de proteínas mostram que os parâmetros avaliados foram capazes de influenciar a síntese ou degradação de polímeros biológicos e a resposta aos efeitos químicos e/ou disponibilidade de nutrientes do meio extracelular modularam proteínas envolvidas em diversas rotas metabólicas. Além disso, a suplementação com fontes de nitrogênio orgânicas promoveram a indução de enzimas com potencial biotecnológico para aplicação industrial, o que reforça a importância dos estudos proteômicos para a determinação do comportamento de fungos filamentosos frente às condições ambientais / The filamentous fungi activate efficient mechanisms to survive in different environment conditions and protein production modulation may be a tool of these survival adaptation. Proteomic approach has been used as methodology to investigate physiological processes related to these microorganism adaptation after chemical and physical changes in extracelullar medium. In this study, the influence of pH variation, carbon and nitrogen sources (amino acid and complex sources) was analyzed on protease production and in intra- and extracellular proteomics of filamentous fungus Aspergillus niveus during submerged bioprocess. The proteolytic activities were evaluated for 96 hours of incubation and as the best indutors among those studied, there were proteases in pH 6, xylose, cystein and feather meal conditions. The variation effects over A. niveus proteome 96 hours submerged bioprocess was analyzed, the protein contents was separated, evaluated and identified by bidimensional electrophoresys followed by mass spectometry (MALDI-TOF/TOFMS/ MS). The identified proteins showed that bioprocess condition variations could influence on intra- and extracelullar proteins of A. niveus. The protein profiles presented a modulation on synthesis and degradation of biological polymers, and on proteins from metabolic pathway in response to chemical effects and/or extracellular nutrient available. Moreover, the supplementaiton with nitrogen sources promoted the production of enzymes with biotechnological potential on industrial application, highlighting the importance of proteomics to determine the filamentous fungus behavior under environment changes.

Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyceae) é uma cianobactéria de grande potencial econômico para a produção de proteínas, principalmente. A utilização simultânea de duas fontes de nitrogênio no cultivo deste microrganismo pode aumentar a quantidade final de biomassa produzida e possibilitar resultados interessantes do ponto de vista de processo de produção. Esta pesquisa teve como principal objetivo verificar o efeito da adição de nitrato de potássio (KNO3) em cultivos de S. platensis realizados com cloreto de amônio (NH4Cl). Através da utilização de planejamento fatorial completo (22 mais configuração estrela), foram verificadas proporções de concentrações iniciais de KNO3 e totais de NH4Cl que variaram de 5,10 a 24,9 mmol · L-1. Foram realizados oito cultivos experimentais e seis cultivos de ponto central, com a utilização de processo descontínuo alimentado e vazões exponencialmente crescentes de adição do sal de amônio. As variáveis independentes (quantidade das fontes de nitrogênio) foram avaliadas simultaneamente através de metodologia de superfície de resposta (regressão multivariável) quanto a sua influência nas variáveis dependentes: concentração celular máxima (Xm), expressa em massa seca por litro de meio, produtividade em células (PX) e fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N). A otimização dos cultivos em relação à concentração celular resultou nos seguintes valores: KNO3 = 15,4 mmol · L-1 e NH4Cl = 14,1 mmol · L-1, com Xm esperado de 4450 mg · L-1. O maior valor de concentração celular obtido sob essas condições foi de 4327 mg · L-1, valor este equivalente ao obtido em cultivo de referência para KNO3 (KNO3 = 25,4 mmol · L-1; 4318 mg · L-1) e superior ao obtido em cultivo de referência para NH4Cl (NH4Cl = 21,5 mmol · L-1; 2125 mg · L-1). Concluiu-se que a adição de KNO3 em cultivos com NH4Cl contribuiu para que não houvesse deficiência de nitrogênio no decorrer dos cultivos, proporcionando maiores valores finais de biomassa, com maior conteúdo de clorofila, lipídios e proteínas. A utilização de NH4Cl permitiu a redução dos custos com o meio de cultura, tornando cultivos com associação de tais fontes de nitrogênio uma alternativa vantajosa para a produção desta cianobactéria. / Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyceae) is a cyanobacterium which has a great economic potential to protein production, particularly. The simultaneous use of two nitrogen sources can increase the final amount of produced biomass and provide interesting results from the production process point of view. This research had as main goal to evaluate the effect of potassium nitrate (KNO3) addition to S. platensis cultures performed with ammonium chloride (NH4Cl). Through the use of full factorial design (22 plus star configuration), proportions of initial KNO3 and total NH4Cl concentrations, which varied from 5.10 to 24.9 mmol · L-1, were validated. Eight experimental cultures and six central point cultures were carried out using fed-batch process and exponentially-increasing ammonium salt feeding rates. The independent variables (nitrogen sources amount) were simultaneously assessed by response surface methodology (multivariable regression) as to their influence on dependent variables: maximum cell concentration (Xm), expressed in dry mass per liter of medium, cell productivity (PX) and conversion yield of nitrogen to biomass (YX/N). The cultures optimization regarding cell concentration resulted in the following values: KNO3 = 15.4 mmol · L-1 and NH4Cl = 14.1 mmol · L-1, with an expected Xm of 4450 mg · L-1. The highest cell concentration value obtained under these conditions was 4327 mg · L-1, which is comparable to the cell concentration obtained in KNO3 reference culture (KNO3 = 25.4 mmol · L-1; 4318 mg · L-1) and superior to the one obtained in NH4Cl reference culture (NH4Cl = 21.5 mmol · L-1; 2125 mg · L-1). It was drawn that the addition of KNO3 to NH4Cl cultures contributed to avoid nitrogen deficiency during cultivation, providing higher final biomass values with higher chlorophyll, lipid and protein contents. The utilization of NH4Cl allowed the reduction of culture medium costs, turning cultures developed with such nitrogen sources association into an advantageous alternative to the production of this cyanobacterium.

Cette thèse s’attache à la maximisation de la consommation du dioxyde de carbone par les microalgues. En effet, suite aux différentes problématiques environnementales actuelles liées principalement aux émissions importantes de gaz à effet de serre et notamment le CO2, il a été démontré que les microalgues jouent un rôle très prometteur pour la bio-fixation du CO2. Dans cette optique, nous nous intéressons à la mise en place d’une loi de commande robuste permettant de garantir des conditions opératoires optimales pour une culture de la microalgue Chlorella vulgaris dans un photobioréacteur instrumenté. Cette thèse repose sur trois axes principaux. Le premier porte sur la modélisation de la croissance de l’espèce algale choisie à partir d’un modèle mathématique traduisant l’influence de la lumière et de la concentration en carbone inorganique total. En vue de la commande, le deuxième axe est consacré à l’estimation de la concentration cellulaire à partir des mesures disponibles en temps réel du dioxyde de carbone dissous. Trois types d’observateurs ont été étudiés et comparés : filtre de Kalman étendu, observateur asymptotique et observateur par intervalles. Le dernier axe concerne l’implantation d’une loi de commande prédictive non-linéaire couplée à une stratégie d’estimation pour la régulation de la concentration cellulaire autour d’une valeur maximisant la consommation du CO2. Les performances et la robustesse de cette commande ont été validées en simulation et expérimentalement sur un photobioréacteur instrumenté à l’échelle de laboratoire. Cette thèse est une étude préliminaire pour la mise en œuvre de la maximisation de la fixation du dioxyde de carbone par les microalgues. / This thesis deals with the optimization of carbon dioxide consumption by microalgae. Indeed, following several current environmental issues primarily related to large emissions of CO2, it is shown that microalgae represent a very promising solution for CO2 mitigation. From this perspective, we are interested in the optimization strategy of CO2 consumption through the development of a robust control law. The main aim is to ensure optimal operating conditions for a Chlorella vulgaris culture in an instrumented photobioreactor. The thesis is based on three major axes. The first one concerns growth modeling of the selected species based on a mathematical model reflecting the influence of light and total inorganic carbon concentration. For the control context, the second axis is related to biomass estimation from the real-time measurement of dissolved carbon dioxide. This step is necessary for the control part due to the lack of affordable real-time sensors for this kind of measurement. Three observers structures have been studied and compared: an extended Kalman filter, an asymptotic observer and an interval observer. The last axis deals with the implementation of a non-linear predictive control law coupled to the estimation strategy for the regulation of the cellular concentration around a value which maximizes the CO2 consumption. Performance and robustness of this control law have been validated in simulation and experimentally on a laboratory-scale instrumented photobioreactor. This thesis represents a preliminary study for the optimization of CO2 mitigation strategy by microalgae.

Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyceae) é uma cianobactéria de grande potencial econômico para a produção de proteínas, principalmente. A utilização simultânea de duas fontes de nitrogênio no cultivo deste microrganismo pode aumentar a quantidade final de biomassa produzida e possibilitar resultados interessantes do ponto de vista de processo de produção. Esta pesquisa teve como principal objetivo verificar o efeito da adição de nitrato de potássio (KNO3) em cultivos de S. platensis realizados com cloreto de amônio (NH4Cl). Através da utilização de planejamento fatorial completo (22 mais configuração estrela), foram verificadas proporções de concentrações iniciais de KNO3 e totais de NH4Cl que variaram de 5,10 a 24,9 mmol · L-1. Foram realizados oito cultivos experimentais e seis cultivos de ponto central, com a utilização de processo descontínuo alimentado e vazões exponencialmente crescentes de adição do sal de amônio. As variáveis independentes (quantidade das fontes de nitrogênio) foram avaliadas simultaneamente através de metodologia de superfície de resposta (regressão multivariável) quanto a sua influência nas variáveis dependentes: concentração celular máxima (Xm), expressa em massa seca por litro de meio, produtividade em células (PX) e fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N). A otimização dos cultivos em relação à concentração celular resultou nos seguintes valores: KNO3 = 15,4 mmol · L-1 e NH4Cl = 14,1 mmol · L-1, com Xm esperado de 4450 mg · L-1. O maior valor de concentração celular obtido sob essas condições foi de 4327 mg · L-1, valor este equivalente ao obtido em cultivo de referência para KNO3 (KNO3 = 25,4 mmol · L-1; 4318 mg · L-1) e superior ao obtido em cultivo de referência para NH4Cl (NH4Cl = 21,5 mmol · L-1; 2125 mg · L-1). Concluiu-se que a adição de KNO3 em cultivos com NH4Cl contribuiu para que não houvesse deficiência de nitrogênio no decorrer dos cultivos, proporcionando maiores valores finais de biomassa, com maior conteúdo de clorofila, lipídios e proteínas. A utilização de NH4Cl permitiu a redução dos custos com o meio de cultura, tornando cultivos com associação de tais fontes de nitrogênio uma alternativa vantajosa para a produção desta cianobactéria. / Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyceae) is a cyanobacterium which has a great economic potential to protein production, particularly. The simultaneous use of two nitrogen sources can increase the final amount of produced biomass and provide interesting results from the production process point of view. This research had as main goal to evaluate the effect of potassium nitrate (KNO3) addition to S. platensis cultures performed with ammonium chloride (NH4Cl). Through the use of full factorial design (22 plus star configuration), proportions of initial KNO3 and total NH4Cl concentrations, which varied from 5.10 to 24.9 mmol · L-1, were validated. Eight experimental cultures and six central point cultures were carried out using fed-batch process and exponentially-increasing ammonium salt feeding rates. The independent variables (nitrogen sources amount) were simultaneously assessed by response surface methodology (multivariable regression) as to their influence on dependent variables: maximum cell concentration (Xm), expressed in dry mass per liter of medium, cell productivity (PX) and conversion yield of nitrogen to biomass (YX/N). The cultures optimization regarding cell concentration resulted in the following values: KNO3 = 15.4 mmol · L-1 and NH4Cl = 14.1 mmol · L-1, with an expected Xm of 4450 mg · L-1. The highest cell concentration value obtained under these conditions was 4327 mg · L-1, which is comparable to the cell concentration obtained in KNO3 reference culture (KNO3 = 25.4 mmol · L-1; 4318 mg · L-1) and superior to the one obtained in NH4Cl reference culture (NH4Cl = 21.5 mmol · L-1; 2125 mg · L-1). It was drawn that the addition of KNO3 to NH4Cl cultures contributed to avoid nitrogen deficiency during cultivation, providing higher final biomass values with higher chlorophyll, lipid and protein contents. The utilization of NH4Cl allowed the reduction of culture medium costs, turning cultures developed with such nitrogen sources association into an advantageous alternative to the production of this cyanobacterium.

A microalga Spirulina platensis, que possui alto de teor de proteínas, vem sendo cultivada fotoautotroficamente para a produção de biomassa microbiana. Embora as fontes convencionais de nitrogênio utilizadas para a produção de Spirulina sejam os nitratos, há a possibilidade do emprego de fontes alternativas, como a uréia, utilizando o processo descontínuo alimentado, com diminuição do custo de produção. No entanto, o uso exclusivo de uréia, em função de sua hidrólise no meio de cultivo e conseqüente perda de amônia, pode levar as células a crescerem por determinados períodos sob carência da fonte de nitrogênio, uma vez que esta fonte não pode ser adicionada em grandes quantidades devido à toxicidade da amônia proveniente de sua hidrólise. Este trabalho teve como objetivo verificar se a adição de nitrato de potássio em cultivos realizados com uréia podem levar a processos com maior produtividade e/ou aumento na quantidade de biomassa produzida. Foram verificadas várias proporções entre as concentrações iniciais de nitrato de potássio e uréia, utilizando planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta. As variáveis dependentes foram concentração celular máxima (Xm), produtividade em células (Px) e fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N), bem como, os teores de clorofila, proteínas e lipídios na biomassa obtida. Os resultados obtidos permitiram concluir que a associação de nitrato de potássio e uréia aumentaram a concentração celular máxima. A condição ótima obtida pela análise de regressão multivariável para Xm foi 17,3 mM de KNO3 e 8,90 mM de uréia, nessas condições foram obtidos 6077 ±199 mg/L. / The cyanobacterium Spirulina platensis, that have high protein content, has been cultivated photoautrophically for microbial biomass production. However nitrates are the conventional nitrogen sources for Spirulina, there is the possibility of use alternative source, as urea by fed batch process, decreasing the costs of production. So, the exclusive use of urea, due to urea hydrolysis in culture medium and consequently loss of ammonia, can cause the cell to growing for specific moments without nitrogen source, because urea can not be added in huge quantity due to the ammonia toxicity provide by its hydrolysis. This work have as objectives verify if the potassium nitrate addition in the culture carried out with urea can lead a process with more productivity and/or increase in the biomass quantity. It was verified many proportion between initial concentration of potassium nitrate and urea, using experimental planning and surface response methodology. The dependent variables were maximum cell concentration (Xm), cell productivity (Px) and nitrogen-cell conversion factor (YX/N), as well as biomass contents of chlorophyll, protein and lipids. The results allowed us concluded that the association of KNO3 and urea was good and improved the maximum cell concentration. The optimal condition otained by statistic analysis for Xm was 17,3 mM of KNO3 and 8,90 mM of urea. In this condition the maximum cell concentration was 6077 ±199 mg L-1.

Uma abordagem promissora para a obtenção de coquetéis enzimáticos eficientes para a etapa de hidrólise na produção de etanol de 2ª geração é o enriquecimento em termos de atividades que lhes faltam, mas podem ser obtidas através de sistemas heterólogos. O trabalho teve como objetivo avaliar o sistema toxina -antitoxina (TA) para estabilização plasmidial em E. coli na produção de expansina e endoglucanase recombinantes. Os resultados indicaram que o sistema de expressão com estabilização TA é tão eficaz quanto o dependente de antibiótico para estabilização plasmidial. Além disso, mostrou-se mais eficiente pelo fato de não permitir a sobrevivência de células sem o plasmídeo. Estudos indicaram a quantidade mínima de 0,05mM de IPTG para expressão das proteínas nesta linhagem, cerca de 20 vezes menos que a concentração usualmente aplicada no momento da indução. Sendo assim, o sistema de estabilização plasmidial TA mostrou-se uma ótima ferramenta para o desenvolvimento de uma plataforma alternativa para a produção de proteínas recombinantes. / A promising approach to obtain efficient enzyme cocktails for the hydrolysis step in the production of 2nd generation ethanol is the enrichment in terms of activities that are lacking, but can be obtained by heterologous systems. The study aimed to evaluate the toxina-antitoxin (TA) system for plasmid stabilization in E. coli in the production of recombinant expansin and endoglucanase. The results indicated that the expression system with TA stabilization is as effective as the antibiotic dependent for plasmid stabilization. Moreover, it proved to be more efficient by not allo wing the survival of cells without the plasmid. Studies have indicated the minimum amount of 0.05 mM IPTG for expression of proteins in this strain, about 20 times less than the concentration usually applied for induction. Thus, the plasmid stabilization TA system proved to be a great tool for the development of an alternative platform for producing recombinant proteins.

The first aim of this study is the development of extracellular recombinant therapeutic protease streptokinase producing Bacillus sp., and the second aim is to determine fermentation characteristics for streptokinase production. In this context, the signal (pre-) DNA sequence of B.licheniformis (DSM1969) extracellular serine alkaline protease enzyme gene (subC: Acc. No. X03341) was ligated to 5&rsquo / end of the streptokinase gene (skc: Acc. No. S46536) by SOE (Gene Splicing by Overlap Extension) method through PCR. The resulting hybrid gene pre(subC)::skc was cloned into the pUC19 plasmid. Then, the hybrid gene was sub-cloned to pMK4 plasmid which is an E. coli-Bacillus shuttle vector with high copy number and high stability. Recombinant plasmid pMK4::pre(subC)::skc was finally transferred into B. subtilis (npr- apr-) and B. licheniformis 749/C (ATCC 25972) species. Streptokinase production capacities of these two recombinant Bacillus species were compared. The highest production was observed in recombinant B. lichenifomis 749/C (ATCC 25972) strain in a defined medium which was optimized in terms of carbon and nitrogen sources by a statistical approach, namely Response Surface Methodology (RSM). RSM evaluated the streptokinase concentration as the response and the medium components as the independent variables. The highest recombinant streptokinase concentration was found as 0.0237 kgm-3 at glucose and (NH4)2HPO4 concentrations of 4.530 and 4.838 kgm-3 respectively. The fermentation and oxygen transfer characteristics of the streptokinase production were investigated in a 3 dm3 pilot scale batch bioreactor (Braun CT2-2) equipped with temperature, pH, foam, air inlet and agitation rate controls having a working volume of VR=1.65 dm3 using the production medium optimized for the recombinant B. lichenifomis 749/C (ATCC 25972) strain. Streptokinase and &amp / #946 / -lactamase activities, cell, glucose and organic acid concentrations, dissolved oxygen, pH, oxygen uptake rate, overall liquid phase mass transfer coefficient for oxygen, maintenance coefficient for oxygen, specific cell growth rate and yield coefficients were determined through the bioprocess. The bioprocess of recombinant streptokinase production was performed at uncontrolled pH of these bioreactor operation conditions: air inlet rate of Q0/VR=0.5 vvm, and the agitation rate of N=400min-1. The resulting streptokinase volumetric activity reached its maximum as 1.16 PUml-1 (0.0026 g/l streptokinase) at t=20 h.

O ácido y-poliglutâmico (y-PGA) é um biopolímero solúvel em água, aniônico, atóxico, biodegradável e biocompatível, produzido por Bacillus e que possui aplicações nas áreas química, médica, ambiental e de alimentos. Este trabalho tem como objetivo estudar o processo de produção do y-PGA a partir do cultivo de uma nova linhagem de Bacillus isolada de ambiente amazônico, o Bacillus subtilis BL53. Este estudo inclui a seleção de culturas, a otimização de condições de cultivo e a prospecção de substratos de produção alternativos. A habilidade de produção de y-PGA por linhagens de Bacillus isoladas na região amazônica foi investigada. A linhagem BL53 foi a linhagem selecionada, sendo identificada como Bacillus subtilis, através da análise da seqüência do gene 16S DNAr e de suas características bioquímicas. A avaliação das condições de cultivo submerso foi conduzida em agitador orbital mediante delineamento composto central rotacional (DCCR) que apontou como ponto ótimo de produção de y-PGA, a temperatura de 37 oC, o pH inicial de 6,9 e a concentração de 1,22 mM de Zn2+ suplementada ao Caldo E. Nas condições otimizadas, a produção de y-PGA foi igual a 10,4 g/L, cerca de três vezes maior que a obtida em condições convencionais de cultivo em Caldo E, utilizando a mesma linhagem. A influência da disponibilidade de oxigênio sobre a produção de y-PGA por B. subtilis BL53 foi avaliada em biorreator agitado de 5 L, com o emprego das velocidades de agitação de 500, 750 e 1000 rpm, sendo mantida fixa a taxa de aeração de 2 vvm. A produção de y-PGA mostrou-se altamente dependente da transferência de oxigênio, sendo que o teor de oxigênio dissolvido decaiu rapidamente nas primeiras 15 horas de cultivo, como resultado da elevada demanda de oxigênio pelas bactérias. O aumento na velocidade de agitação no biorreator possibilitou uma maior transferência de oxigênio e induziu o aumento na taxa de consumo de oxigênio pelas bactérias, conduzindo a maior produção e maior produtividade de y-PGA. A intensificação da agitação também influenciou os parâmetros cinéticos de crescimento do Bacillus subtilis BL53, provocando um aumento na velocidade específica de crescimento na fase logarítmica (max) sem provocar a perda da viabilidade celular. Com a utilização da velocidade de agitação de 1000 rpm em biorreator, o tempo de cultivo pode ser reduzido para menos de 48 h, cerca de 50% do tempo necessário para operação a 500 rpm. A investigação de substratos alternativos para produção de y-PGA mostrou o glicerol residual de biodiesel e o resíduo fibroso de soja como substratos promissores, apontando para a possibilidade de investigação em trabalhos futuros. / The poly-gamma-glutamic acid (y-PGA) is a water-soluble biopolymer, anionic, non toxic, biodegradable and biocompatible, it is produced by Bacillus and it has applications in chemical, medical, environmental and food industries. This work aims to study the process of production of y-PGA through cultivation of a new strain of Bacillus isolated from the Amazonian environment, Bacillus subtilis BL53. This study includes the screening of strains, the optimization of culture conditions and the investigation of alternative substrates. The ability of y-PGA production by Bacillus strains isolated from Amazonian environment was investigated. The BL53 strain was selected and identified as Bacillus subtilis, through analysis of 16S rDNA gene sequence and its biochemical characteristics. Evaluation of culture conditions in submerged cultivation was conducted in shaker using central composite design (CCD), which showed the temperature of 37 oC, the initial pH 6.9 and concentration of 1.22 mM Zn2+ in Medium E as the optimal conditions to y-PGA production. Under optimized conditions, the production of y-PGA was 10.4 g/L, about threefold what was obtained using this strain under conventional cultivation in Medium E. The influence of oxygen availability on the production of y-PGA by B. subitlis BL53 was evaluated in a 5 l stirred bioreactor with the use of stirring rates of 500, 750 and 1000 rpm, using a fixed aeration rate of 2 vvm. Production of y-PGA was highly dependent on oxygen transfer, and the dissolved oxygen content decreased rapidly in the first 15 hours of culture as a result of high oxygen demand by bacteria. The increase in stirring rate in the bioreactor allowed a better oxygen transfer and induced a rise in the oxygen uptake rate by bacteria, leading to higher production and higher productivity of y-PGA. The intensification of the stirring also influenced the kinetics growth parameters of Bacillus subtilis BL53, producing an increase in specific growth rate in the logarithmic phase (max) without causing reduction of cell viability. Using the stirring rate of 1000 rpm in a bioreactor, the cultivation time can be reduced to less than 48 h, about 50% of the time required for operation at 500 rpm. The investigation of alternative substrates for the production of y-PGA showed crude glycerol from biodiesel and soybean industrial fibrous residue as promising ones, pointing to research possibilities in future work.

O ácido y-poliglutâmico (y-PGA) é um biopolímero solúvel em água, aniônico, atóxico, biodegradável e biocompatível, produzido por Bacillus e que possui aplicações nas áreas química, médica, ambiental e de alimentos. Este trabalho tem como objetivo estudar o processo de produção do y-PGA a partir do cultivo de uma nova linhagem de Bacillus isolada de ambiente amazônico, o Bacillus subtilis BL53. Este estudo inclui a seleção de culturas, a otimização de condições de cultivo e a prospecção de substratos de produção alternativos. A habilidade de produção de y-PGA por linhagens de Bacillus isoladas na região amazônica foi investigada. A linhagem BL53 foi a linhagem selecionada, sendo identificada como Bacillus subtilis, através da análise da seqüência do gene 16S DNAr e de suas características bioquímicas. A avaliação das condições de cultivo submerso foi conduzida em agitador orbital mediante delineamento composto central rotacional (DCCR) que apontou como ponto ótimo de produção de y-PGA, a temperatura de 37 oC, o pH inicial de 6,9 e a concentração de 1,22 mM de Zn2+ suplementada ao Caldo E. Nas condições otimizadas, a produção de y-PGA foi igual a 10,4 g/L, cerca de três vezes maior que a obtida em condições convencionais de cultivo em Caldo E, utilizando a mesma linhagem. A influência da disponibilidade de oxigênio sobre a produção de y-PGA por B. subtilis BL53 foi avaliada em biorreator agitado de 5 L, com o emprego das velocidades de agitação de 500, 750 e 1000 rpm, sendo mantida fixa a taxa de aeração de 2 vvm. A produção de y-PGA mostrou-se altamente dependente da transferência de oxigênio, sendo que o teor de oxigênio dissolvido decaiu rapidamente nas primeiras 15 horas de cultivo, como resultado da elevada demanda de oxigênio pelas bactérias. O aumento na velocidade de agitação no biorreator possibilitou uma maior transferência de oxigênio e induziu o aumento na taxa de consumo de oxigênio pelas bactérias, conduzindo a maior produção e maior produtividade de y-PGA. A intensificação da agitação também influenciou os parâmetros cinéticos de crescimento do Bacillus subtilis BL53, provocando um aumento na velocidade específica de crescimento na fase logarítmica (max) sem provocar a perda da viabilidade celular. Com a utilização da velocidade de agitação de 1000 rpm em biorreator, o tempo de cultivo pode ser reduzido para menos de 48 h, cerca de 50% do tempo necessário para operação a 500 rpm. A investigação de substratos alternativos para produção de y-PGA mostrou o glicerol residual de biodiesel e o resíduo fibroso de soja como substratos promissores, apontando para a possibilidade de investigação em trabalhos futuros. / The poly-gamma-glutamic acid (y-PGA) is a water-soluble biopolymer, anionic, non toxic, biodegradable and biocompatible, it is produced by Bacillus and it has applications in chemical, medical, environmental and food industries. This work aims to study the process of production of y-PGA through cultivation of a new strain of Bacillus isolated from the Amazonian environment, Bacillus subtilis BL53. This study includes the screening of strains, the optimization of culture conditions and the investigation of alternative substrates. The ability of y-PGA production by Bacillus strains isolated from Amazonian environment was investigated. The BL53 strain was selected and identified as Bacillus subtilis, through analysis of 16S rDNA gene sequence and its biochemical characteristics. Evaluation of culture conditions in submerged cultivation was conducted in shaker using central composite design (CCD), which showed the temperature of 37 oC, the initial pH 6.9 and concentration of 1.22 mM Zn2+ in Medium E as the optimal conditions to y-PGA production. Under optimized conditions, the production of y-PGA was 10.4 g/L, about threefold what was obtained using this strain under conventional cultivation in Medium E. The influence of oxygen availability on the production of y-PGA by B. subitlis BL53 was evaluated in a 5 l stirred bioreactor with the use of stirring rates of 500, 750 and 1000 rpm, using a fixed aeration rate of 2 vvm. Production of y-PGA was highly dependent on oxygen transfer, and the dissolved oxygen content decreased rapidly in the first 15 hours of culture as a result of high oxygen demand by bacteria. The increase in stirring rate in the bioreactor allowed a better oxygen transfer and induced a rise in the oxygen uptake rate by bacteria, leading to higher production and higher productivity of y-PGA. The intensification of the stirring also influenced the kinetics growth parameters of Bacillus subtilis BL53, producing an increase in specific growth rate in the logarithmic phase (max) without causing reduction of cell viability. Using the stirring rate of 1000 rpm in a bioreactor, the cultivation time can be reduced to less than 48 h, about 50% of the time required for operation at 500 rpm. The investigation of alternative substrates for the production of y-PGA showed crude glycerol from biodiesel and soybean industrial fibrous residue as promising ones, pointing to research possibilities in future work.

O ácido y-poliglutâmico (y-PGA) é um biopolímero solúvel em água, aniônico, atóxico, biodegradável e biocompatível, produzido por Bacillus e que possui aplicações nas áreas química, médica, ambiental e de alimentos. Este trabalho tem como objetivo estudar o processo de produção do y-PGA a partir do cultivo de uma nova linhagem de Bacillus isolada de ambiente amazônico, o Bacillus subtilis BL53. Este estudo inclui a seleção de culturas, a otimização de condições de cultivo e a prospecção de substratos de produção alternativos. A habilidade de produção de y-PGA por linhagens de Bacillus isoladas na região amazônica foi investigada. A linhagem BL53 foi a linhagem selecionada, sendo identificada como Bacillus subtilis, através da análise da seqüência do gene 16S DNAr e de suas características bioquímicas. A avaliação das condições de cultivo submerso foi conduzida em agitador orbital mediante delineamento composto central rotacional (DCCR) que apontou como ponto ótimo de produção de y-PGA, a temperatura de 37 oC, o pH inicial de 6,9 e a concentração de 1,22 mM de Zn2+ suplementada ao Caldo E. Nas condições otimizadas, a produção de y-PGA foi igual a 10,4 g/L, cerca de três vezes maior que a obtida em condições convencionais de cultivo em Caldo E, utilizando a mesma linhagem. A influência da disponibilidade de oxigênio sobre a produção de y-PGA por B. subtilis BL53 foi avaliada em biorreator agitado de 5 L, com o emprego das velocidades de agitação de 500, 750 e 1000 rpm, sendo mantida fixa a taxa de aeração de 2 vvm. A produção de y-PGA mostrou-se altamente dependente da transferência de oxigênio, sendo que o teor de oxigênio dissolvido decaiu rapidamente nas primeiras 15 horas de cultivo, como resultado da elevada demanda de oxigênio pelas bactérias. O aumento na velocidade de agitação no biorreator possibilitou uma maior transferência de oxigênio e induziu o aumento na taxa de consumo de oxigênio pelas bactérias, conduzindo a maior produção e maior produtividade de y-PGA. A intensificação da agitação também influenciou os parâmetros cinéticos de crescimento do Bacillus subtilis BL53, provocando um aumento na velocidade específica de crescimento na fase logarítmica (max) sem provocar a perda da viabilidade celular. Com a utilização da velocidade de agitação de 1000 rpm em biorreator, o tempo de cultivo pode ser reduzido para menos de 48 h, cerca de 50% do tempo necessário para operação a 500 rpm. A investigação de substratos alternativos para produção de y-PGA mostrou o glicerol residual de biodiesel e o resíduo fibroso de soja como substratos promissores, apontando para a possibilidade de investigação em trabalhos futuros. / The poly-gamma-glutamic acid (y-PGA) is a water-soluble biopolymer, anionic, non toxic, biodegradable and biocompatible, it is produced by Bacillus and it has applications in chemical, medical, environmental and food industries. This work aims to study the process of production of y-PGA through cultivation of a new strain of Bacillus isolated from the Amazonian environment, Bacillus subtilis BL53. This study includes the screening of strains, the optimization of culture conditions and the investigation of alternative substrates. The ability of y-PGA production by Bacillus strains isolated from Amazonian environment was investigated. The BL53 strain was selected and identified as Bacillus subtilis, through analysis of 16S rDNA gene sequence and its biochemical characteristics. Evaluation of culture conditions in submerged cultivation was conducted in shaker using central composite design (CCD), which showed the temperature of 37 oC, the initial pH 6.9 and concentration of 1.22 mM Zn2+ in Medium E as the optimal conditions to y-PGA production. Under optimized conditions, the production of y-PGA was 10.4 g/L, about threefold what was obtained using this strain under conventional cultivation in Medium E. The influence of oxygen availability on the production of y-PGA by B. subitlis BL53 was evaluated in a 5 l stirred bioreactor with the use of stirring rates of 500, 750 and 1000 rpm, using a fixed aeration rate of 2 vvm. Production of y-PGA was highly dependent on oxygen transfer, and the dissolved oxygen content decreased rapidly in the first 15 hours of culture as a result of high oxygen demand by bacteria. The increase in stirring rate in the bioreactor allowed a better oxygen transfer and induced a rise in the oxygen uptake rate by bacteria, leading to higher production and higher productivity of y-PGA. The intensification of the stirring also influenced the kinetics growth parameters of Bacillus subtilis BL53, producing an increase in specific growth rate in the logarithmic phase (max) without causing reduction of cell viability. Using the stirring rate of 1000 rpm in a bioreactor, the cultivation time can be reduced to less than 48 h, about 50% of the time required for operation at 500 rpm. The investigation of alternative substrates for the production of y-PGA showed crude glycerol from biodiesel and soybean industrial fibrous residue as promising ones, pointing to research possibilities in future work.