Doutoramento em Ciências Farmacêuticas / PhD in Pharmaceutical Sciences

Doutoramento em Bioquímica / PhD Degree - Biochemistry

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Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Bioquímica / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) es un protozoo parásito, agente causal de la enfermedad de Chagas, endémica en el continente americano. Presenta un ciclo de vida complejo, infectando tanto hospederos mamíferos como insectos triatominos (hematófagos) y presentando cuatro formas celulares: tripomastigotes sanguíneos, epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes metacíclicos. En humanos, la infección por T. cruzi en etapas avanzadas puede provocar serios trastornos cardíacos y digestivos, con un alto costo médico, y que pueden ser mortales de no ser tratados adecuadamente. Hasta el momento, no existe una cura definitiva para la infección crónica por T. cruzi. Este parásito sobrevive al efecto de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) generadas tanto por células del hospedero mamífero como por la digestión de la sangre en el insecto hematófago. Se ha propuesto que estas especies reactivas dañan el DNA del parásito y que éste sobrevive activando el mecanismo de reparación del DNA por escisión de bases (vía BER). Este es un proceso muy conservado, que presenta dos sub-vías: la vía corta, en la que se reemplaza un nucleótido, o la vía larga, donde se insertan dos o más nucleótidos. En esta vía de reparación del DNA participan distintas enzimas, como DNA glicosilasas, AP endonucleasas (APE), DNA polimerasas, flap endonucleasas (FEN1) y DNA ligasas. Hasta el momento, se ha demostrado que: 1) el DNA del parásito es dañado por ROS/RNS; 2) T. cruzi tiene la capacidad de reparar el daño producido por estas especies reactivas; 3) metoxiamina, un inhibidor de AP endonucleasas, aumenta la muerte celular provocada por ROS/RNS; 4) el parásito tiene dos DNA glicosilasas y dos AP endonucleasas activas. A la fecha de realización de esta Tesis no se había definido la presencia de flap endonucleasas así como de las diferentes vías (corta y/o larga) de reparación del DNA por escisión de bases en T. cruzi. Las enzimas flap endonucleasas (FEN1) se caracterizan por reconocer sustratos de DNA con estructuras específicas, que se generan en diversos procesos celulares, como la replicación del DNA o su reparación mediante la vía larga del mecanismo BER. Estudios en diversos eucariontes han demostrado su importancia en la reparación del daño oxidativo al DNA, así como en la mantención de la integridad genómica. En esta Tesis se investigó la presencia y actividad de una enzima flap endonucleasa de T. cruzi (TcFEN1), su expresión, su localización celular y su rol en la proliferación y en la sobrevida del parásito frente a condiciones de estrés oxidativo. Se demostró la presencia de actividad flap endonucleasa en distintas formas celulares de T. cruzi y se describieron algunas de sus propiedades. Paralelamente se encontró una secuencia correspondiente a una flap endonucleasa en el genoma publicado de T. cruzi, a partir de la cual se crearon plásmidos que permitieron la expresión en epimastigotes de T. cruzi de proteínas de fusión TcFEN1-GFP que también presentaron actividad flap endonucleasa y que se localizaron en el núcleo de epimastigotes del parásito, según estudios de microscopia de fluorescencia. Por otro lado, se observó un incremento en la proliferación de los epimastigotes que expresaban TcFEN1-GFP, así como una mayor sobrevida frente a la exposición sostenida a H2O2 respecto a lo observado en parásitos control. En base a los resultados obtenidos, TcFEN1 se presenta como protagonista en procesos claves para la infección por T. cruzi como son la proliferación y resistencia frente a daño oxidativo, por lo que desarrollar inhibidores específicos de TcFEN1 podría potenciar el efecto citotóxico del daño oxidativo al DNA generado por las células del hospedero, así como potenciar el tratamiento de la infección por T. cruzi por drogas convencionales, actualmente muy poco eficientes en el tratamiento de la enfermedad de Chagas crónica / Trypanosoma cruzi (T. cruzi) is a protozoan parasite, the etiological agent of Chagas´s disease, endemic in the American continent. It presents a complex life cycle, infecting both mammalian and triatomine insects and presenting four cellular forms: blood trypomastigote, epimastigote, amastigote and metacyclic trypomastigote. In humans, T. cruzi infection in advanced stages can cause serious cardiac and digestive disorders, with a high medical cost, and can be fatal if not treated properly. To date, there is no definitive cure for chronic T. cruzi infection. This parasite survives the effect of reactive oxygen and nitrogen species (ROS / RNS) generated by both mammalian host cells and by the digestion of blood in the hematophagous insect. It has been proposed that those reactive species damage the DNA of the parasite but it survives by activating the mechanism of DNA repair by base excision (BER pathway). This is a highly conserved process, which has two sub-pathways: the short one, where a single nucleotide is replaced, or the long one, where two or more nucleotides are inserted. Different enzymes, such as DNA glycosylases, AP endonucleases (APE), DNA polymerases, flap endonucleases (FEN1) and ligases are involved in that DNA repair pathway. To date, it has been shown that: 1) the DNA of the parasite is damaged by ROS / RNS; 2) T. cruzi repairs the damage produced by these reactive species; 3) methoxyamine, an inhibitor of AP endonucleases, increases ROS/RNS-induced parasite cell death and 4) T. cruzi presents two DNA glycosylases and two active AP endonucleases. At the date of this thesis, the presence of the different pathways (short and / or long) of DNA repair by base cleavage in T. cruzi had not been defined. Flap endonuclease enzymes (FEN1) are characterized by recognizing DNA substrates with specific structures, which are generated in various cellular processes, such as DNA replication or repair by the long path of the BER mechanism. Studies in various eukaryotes have demonstrated their importance in the repair of oxidative damage to DNA, as well as in the maintenance of genomic integrity. In this thesis the presence and activity of a T. cruzi flap endonuclease enzyme (TcFEN1), its expression, its cellular localization and its role in the proliferation and survival of the parasite against oxidative stress conditions were investigated. The presence of TcFEN1 was demonstrated in different cellular forms of T. cruzi and some of its properties were described. In parallel, a sequence corresponding to a flap endonuclease was found in the published T. cruzi genome, from which plasmids were created that allowed expression in T. cruzi epimastigotes of TcFEN1-GFP fusion proteins that also had flap endonuclease activity and were located in the epimastigotes nucleus, according to fluorescence microscopy. On the other hand, there was an increase in the proliferation of epimastigotes expressing TcFEN1-GFP, as well as a higher survival to H2O2 sustained exposure than observed in control parasites. Based on the results obtained, TcFEN1 is presented as a protagonist in key processes for infection by T. cruzi, such as proliferation and resistance to oxidative damage. Therefore, the development of specific inhibitors of TcFEN1 may enhance the cytotoxic effect of oxidative DNA damage generated by the host cells, as well as potentiate the treatment of T. cruzi infection by conventional drugs, currently very ineffective in the treatment of chronic Chagas´disease / Conicyt; Fondecyt

Tesis entregada a la Universidad de Chile como requisito parcial para optar al grado de Doctor en Ciencias con mención en Química

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