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Estudio de la bibliografía especializada y realización de ensayos preliminares que permitan la proposición de un mecanismo de reacción sometido a análisis cinético, que aporte expresiones útiles para un diseño experimental , aplicable para comprobar la validez del mecanismo de reacción planteado, así como para la caracterización cinética de los sistemas enzimáticos investigados, superando a otros métodos descritos en la bibliografía. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación enzimática por peroxidasas, de los colorantes Índigo Carmín (IC) y Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR), mediante un método espectrofotométrico. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de IC, por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de RBBR por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la determinación de fenoles con aplicaciones biotecnológicas, mediante un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Biodegradación de IC con peroxidasas La reacción se realizó en tubos de plástico con una concentración de enzimas HRP y SBP que varió entre 2.5-30 nM , la concentración de contaminante entre 10-120 M y la de peróxido de hidrógeno también entre 10 y 120 M , todo ello a pH óptimo de 10 mM de tampón citrato de pH 5.0 y 4.0 para HRP y SBP respectivamente, a 25 ºC.Se analizaron las reacciones en el espectrofotómetro y en el HPL, determinando los parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), la velocidad en estado estacionario VSS y la constante de biodegradación (). Biodegradación de IC con sistemas lacasa/peroxidasa-mediador Se comparó el estudio a 25 ºC de SBP con el de TvL para la degradación de IC entre con los mediadores MSG, ASG, SGA y SGO con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del colorante. Biodegradación de RBBR con sistemas lacasa-mediador Se optimizaron las condiciones de reacción para la degradación de RBBR con sistemas EML a temperatura ambiente, eligiendo el sistema mediador más eficaz para dicha reacción. Bioanálisis enzimático de fenoles Se diseña y optimiza un método de análisis enzimático espectrofotométrico para el análisis de distintos tipos de fenoles industriales (fármacos, contaminantes y fitoquímicos). La reacción se realiza en presencia de AA como reductor acoplado y biomolécula detectora, catalizada por HRP. Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente y optimizado la biodegradación enzimática de IC y RBBR por H2O2, catalizada por las peroxidasas HRP y SBP, mediante un método espectrofotométrico • Se ha conseguido la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática del IC, por varios sistemas enzima-mediador (EMS). En concreto, las enzimas SBP con H2O2 y TvL con O2, en presencia del premediador natural SGO, y de los mediadores naturales, MSG, ASG y SGA. • Se ha estudiado la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática de RBBR por TvL con O2, ante el premediador natural SGO y los mediadores naturales MSG, ASG y SGA. • Se ha desarrollado un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático, útil para la determinación de concentraciones nanomolares, de diferentes contaminantes, fármacos y fitoquímicos fenólicos de interés biotecnológico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. / Kinetic characterization and optimization of a spectrophotometric method, for the enzymatic biodegradation by peroxidases, of the dyes Indigo Carmine (IC) and Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR). • Kinetic characterization and optimization of the IC biodegradation, by enzyme-mediator systems in the presence of natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the RBBR biodegradation, by enzyme-mediator systems with natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the determination of bioactive phenols, by using a spectrophotometric and ultrasensitive method of enzymatic bioanalysis. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Biodegradation of the dyes IC and RBBR by POD. This chapter describes a new ecofriendly alternative for removal Remazol Brilliant Blue (RBBR) and Indigo Carmine by soybean (SBP) and horseradish (HRP) peroxidases. Thus, studies for optimization of reaction conditions (pH, concentration of enzymes/substrates/hydrogen peroxide) have been proposed. Biodegradation of IC by enzyme-mediator systems. A reaction mechanism is proposed beside the pH results. This mechanism involves enzymatic and nonenzymatic reactions, in which a premediator (PM), mediator (M) and the mediator radical (MR) are considered. Vss values were determined from enzymes, mediator and IC effects. Thus, the assay conditions for biodegradation of IC, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Vss values were determined from enzyme, mediator and RBBR effects. The experimental data obtained confirmed the reliability of the reaction mechanism proposed. Thus, the assay conditions for biodegradation of RBBR, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Biodegradation of RBBR by laccase-mediator systems. Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR) biodegradation was carried out by laccase from Trametes villosa (TvL) using the natural mediators ASG, MSG, SGA and SGO Enzymatic bioanalysis of phenols. A number of analytical methods with different sensitivity, complexity, quickness and cost have been proposed The aim of this chapter is the possible determination of phenols of biotechnological interest, in nanomolar concentrations, by using an enzymatic and spectrophotometric method of bioanalysis, easy, quick and with low cost. Conclusions • It has characterized kinetically and optimized the enzymatic biodegradation of IC and RBBR by H2O2, catalyzed by the peroxidases HRP and SBP, with a spectrophotometric method. • It has reached the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of IC, by several systems enzyme-mediator (EMS). In particular, the enzyme SBP with H2O2 and TvL with O2, in presence of the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has been studied the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of RBBR by TvL and O2, with the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has carried out a spectrophotometric and ultrasensible method of enzymatic biodegradation, useful for the determination of nanomolar concentrations of different phenolic contaminants, drugs and phytochemicals of biotechnological interest. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.

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Memoria para la obtención de Título de Bioquímico / En esta Memoria de Título se purificó L-Ficolina humana. A nivel nacional, no hay esfuerzos reportados en este sentido. Esta purificación se realiza en el contexto de los intereses de una de las líneas centrales de investigación del Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile), relacionada con el rol del Sistema del Complemento humano en la infectividad de Trypanosoma cruzi, agente protozoario de la enfermedad de Chagas. Aunque con un rendimiento moderado, se logró la purificación de L-Ficolina recombinante, a través de cromatografía. Se sienta así la estandarización del protocolo en las condiciones locales, el que deberá ser escalado para cubrir las necesidades de futuros experimentos de infectividad parasitaria, a realizarse ya fuera del contexto de esta Memoria / In this dissertation, we describe the purification of human Complement L-Ficolin. At the national level, there are no reported efforts in this regard. This purification was performed within the context of the interests of one of the central lines of research in our laboratory, related to the role of the Complement System in Trypanosome cruzi (the agent of Chagas disease) infectivity. Although with a modest yield, chromatographic purification of L-Ficolin was achieved. Thus, we established the experimental basic conditions for the purification of this rather elusive molecule. Outside the context of this dissertation, this procedure, adequately scaled, may meet the needs of future experiments on parasite infectivity, mediated by this molecule / Conicyt; Fondecyt

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El Metapneumovirus humano (hMPV) es el segundo agente viral causante de bronquiolitis en niños de todo el mundo. Es el origen etiológico de variados cuadros clínicos del tracto respiratorio y afecto principalmente a niños y ancianos. La infección induce una respuesta Th2 por parte del sistema inmune del hospedero produciéndose una inflamación patológica de las vías respiratorias. Luego de la resolución de la enfermedad no hay inducción de memoria inmunológica, por lo que la enfermedad causada por la infección con hMPV puede recurrir en el mismo paciente. Por esta razón una vacuna contra hMPV que induzca una respuesta inmune protectora que perdure en el tiempo es un objetivo importante para la salud pública mundial. Hasta la fecha no hay una vacuna efectiva disponible contra este virus. Este estudio evalúa la inducción de respuesta inmune protectora contra hMPV mediante vacunación con la nucleoproteína N del virus más el adyuvante ABISCO-100. Los datos muestran que los ratones vacunados desarrollan una respuesta inmune protectora frente a una infección posterior con el virus. En estos ratones vacunados y luego desafiados con el virus se midió una disminución del transcrito del gen de la nucleoproteína N de hMPV en pulmones y una reversión en la pérdida de peso comparado con los ratones infectados que no fueron vacunados. Además en pulmón se observó una reducción en la infiltración de granulocitos y células dendríticas inflamatorias (CD11b-/CD11c+) en el grupo vacunado y desafiado con el virus. Por otro lado, al estimular con proteína N del virus a esplenocitos provenientes del grupo vacunado se midió un aumento en la secreción de IFN-γ, IL-10 e IL-17A. También se observó un aumento en la concentración de anticuerpos isotipo IgG tipo IgG2A en sangre en el grupo vacunado y desafiado. Por último se determinó que la vacuna no tiene por si misma efecto en la producción de anticuerpos neutralizantes. Los resultados obtenidos en esta investigación sugieren que los ratones vacunados desarrollaron una respuesta inmunitaria protectora mediada por células T con un perfil combinado Th1/Th17 que los protegió contra la infección con hMPV y su patología asociada y que la proteína N podría ser un buen antígeno para el desarrollo de una vacuna / Worldwide, human Metapneumovirus (hMPV) is the second cause of acute respiratory tract infection in children such as bronchiolitis and pneumonia. It is the etiological origin of several clinical manifestations of the respiratory tract and mainly affects children and the elderly. The hMPV infection has been associated with an unbalanced Th2 pathological response causing inflammation and obstruction in the respiratory tract. Because a poor immunological memory induction is developed, the airway infections with hMPV and disease associated are recurrent. In consequence, an hMPV vaccine that generates protective immune response is necessary. To date there is no effective vaccine available against this virus. This study shows that vaccinated mice with N-hMPV-ABISCO developed a protective immune response against hMPV infection. Compared to non-vaccinated mice, we measured a reduction in the transcripts of the N gene of hMPV in lungs and a reduction in weight loss in vaccinated mice. Besides, in these mice there is a decrease of granulocyte infiltration and of dendritic cell infiltration of conventional migratory DCs (CD11b-/CD11c+) in lungs. Moreover, we isolated splenocytes from vaccinated and non-vaccinated mice and stimulated these cells with recombinant N protein of hMPV. The induced cytokines was measured in the supernatant tissue culture medium. We observed an increase of IFN-γ, IL-10 and IL-17A in splenocytes obtained from vaccinated mice. Total and IgG subclasses was measured in serum and higher levels of IgG and IgG2a were detected in the serum of vaccinated and challenged mice compared to naïve mice. The results obtained in this investigation suggest that the vaccinated mice developed a protective T cell-mediated immune response with a combined Th1 / Th17 profile that protected them against infection with hMPV and its associated pathology and that N protein could be a good candidate for a vaccine

Memoria para optar al Título de Bioquímica / Las histonas son proteínas pequeñas con una alta carga positiva, capaces de interactuar con el ADN y ayudar en su compactación. Antes de poder ejercer esta función estas proteínas son sintetizadas en el citoplasma celular, en donde adquieren su correcto plegamiento y modificaciones post-traduccionales características por el paso secuencial a través de una serie de complejos proteicos. Pero no todas las proteínas recientemente sintetizadas adoptan su estructura nativa, y hasta un 30% de ellas son marcadas co-traduccionalmente para ser degradadas por el sistema ubiquitina-proteosoma. El objetivo de este trabajo fue dilucidar la función que cumple este mecanismo proteolítico enfrentado a una población de histonas H3 citosólicas mal plegadas. Para esto se trabajó con dos análogos aminoacídicos, AZC y Can, inductores del mal plegamiento, además de MG132, un inhibidor del proteosoma. Mediante técnicas de fraccionamiento subcelular se obtuvo el extracto citosólico y se demostró la acumulación de la histona H3 cuando se inhibe la subunidad 20S del proteosoma en paralelo a la inducción del mal plegamiento. Con estos resultados se concluyó que, al utilizar análogos de aminoácidos que inducen mal plegamiento proteico, las histonas recientemente sintetizadas se degradan por la vía ubiquitina-proteosoma. Trabajos a futuro debiesen enfocarse en investigar la potencial participación de otros mecanismos de degradación para esta proteína / Histones are small highly positive charged proteins, capable of interact with the DNA to assist in its compaction. Before being able to exert this function, these proteins are synthesized in the cellular cytoplasm and then sequentially associate with different protein complexes to acquire their correct conformation and to establish their characteristic post-translational modifications. But not all newly synthesized proteins succeed in acquiring their native structure, indeed, up to 30% of them are marked to be degraded by the ubiquitin-proteasome system. We focus our study on understand the participation of this proteolytic mechanism when faced to a population of cytosolic misfolded histone H3. To this end we worked with two amino acid analogues, AZC and Can, whose presence increases the amount of aberrant proteins, in addition to MG132, a proteasome inhibitor. By using subcellular fractionation techniques, the cytosolic extract was isolated and we demonstrated that the proteasomal 20S subunit inhibition, together with the induction of the misfold, leaded to a significant accumulation of the histone H3. With this, we established the participation of the ubiquitin-proteasome system in the degradation of the newly synthesized histone H3 in conditions of induced misfolding. Future work should investigate the potential participation of other degradation mechanisms for this protein / FONDECYT 1160480; Proyecto Basal PFB-16

Coenzimas piridínicos desempenham papel fundamental relacionado à suas propriedades de óxido-redução. Assim, participam da cadeia respiratória, onde se situam, devido ao valor do potencial de óxido-redução do par, logo no início, sendo os primeiros intermediários entre certos substratos e oxigênio. Constituem-se também no primeiro local de síntese de ATP; muito importante, presumivelmente em conexão com a função respiratória, é de fato de os coenzimas piridínicos intervirem nos sistemas de algumas transhidrogenases. / Not available

Barreiras reativas permeáveis orgâncias (BRPOs) contendo substratos orgânicos, tais como resíduos agrícolas, podem ser empregadas na remediação in-situ de áreas contaminadas por drenagem ácida de minas, ou de áreas industriais contaminadas por solventes clorados, entre outros. O desempenho da remediação nestas BRPO depende da atividade de bactérias redutoras de sulfato, por sua vez condicionada pela composição e degradabilidade dos materiais orgânicos/celulósicos providos na BRPO. Com base em dados da literatura, são apresentados valores COT, COD, N, ligninha/N, C/N para diferentes resíduos já utilizados como fontes de carbono ou de nutrientes em ensaios em batelada de redução bacteriana de sulfato. A disponibilidade de nutrientes ou de carbono orgânico durável, verificada nos diferentes resíduos analisados, evidencia aspecto de complementariedade e demonstra a importância de trabalhar com misturas em BRPOs. Neste trabalho, foram escolhidos para estudo resíduos agrícolas de grande disponibilidade no Brasil como o bagaço de cana-de-açúcar (o qual foi caracterizado quimicamente) e a cama de aviário. Os ensaios de batelada foram realizados em reatores anaeróbios desenvolvidos a partir de garrafas PET adaptadas com lacre anaeróbio. Este trabalho também apresenta uma metodologia desenvolvida para remoção de compostos orgânicos das amostras coletadas nos reatores e destinadas à análise em cromatógrafo de íons. Os resultados de potencial de oxidação-redução menor que -200 mV, pH (5-7) e variação da concentração de sulfato, indicaram a eficiência do procedimento experimental e da mistura dos substratos bagaço de cana, testado como fonte de carbono durável, e cama de aviário, testada como fonte de nutrientes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-31Bitstream added on 2014-06-13T20:40:50Z : No. of bitstreams: 1 ouchi_ry_dr_sjrp.pdf: 1860080 bytes, checksum: 6ea294f1febce43f75eaaecd7bef2497 (MD5) / A cada ano, milhares de novos compostos químicos entram no mercado, e um volume enorme de resíduos é gerado pela atividade humana, existindo uma grande preocupação com relação aos seus efeitos a curto e longo prazo sobre a saúde e o ambiente. Um grande número dessas substâncias químicas é potencialmente perigoso e pode acarretar efeitos biológicos deletérios, sendo que mudanças a nível molecular são usualmente as primeiras respostas detectáveis da perturbação ambiental. Para avaliar os efeitos em sistemas biológicos, são utilizados bioindicadores, organismos sensíveis a agentes tóxicos. O presente trabalho teve por objetivo analisar os efeitos do Brometo de Etídio (BE), substância potencialmente mutagênica, na mosca da fruta (Drosophila melanogaster), realizando-se sempre comparações com o controle positivo, etilmetanosulfonato (EMS). Escolhemos o brometo de etídio por se tratar de uma substância usada frequentemente em métodos de biologia molecular, sendo tida como mutagênica, apesar de não constar como carcinogênico nas listagens da Agência Internacional para Pesquisa de Câncer (IARC). A pesquisa foi feita ao longo de 25 gerações, e em seis gerações (1ª, 5ª, 10ª, 15ª, 20ª, 25ª gerações) foram analisados: (1) os efeitos sobre padrões morfológicos, (2) a produtividade diária ao longo de 15 dias. Além disso, foram analisadas também: (3) alterações bioquímicas em enzimas do sistema oxidativo, acarretadas pela exposição a diferentes concentrações de brometo de etídio e EMS, (4) alterações gênicas: em nível de transposição do elemento transponível Bari-1 e na expressão dos genes que codificam as proteínas catalase, hsp 70 (heat shock protein), superóxido dismutase... / Each year thousands of new chemicals enter the market, and an enormous volume of waste is generated by human activity. Accordingly, there is a great concern regarding their short and long term health and environmental effects. A large number of these chemicals is potentially dangerous and can cause harmful biological effects, and changes at the molecular level are usually the first detectable responses of environmental disturbance. To evaluate the effects on biological systems, are used bioindicators, organisms sensitive to toxic agents. This study aimed to analyze the effects of Ethidium Bromide (EB), a potentially mutagenic substance, in the fruit fly (Drosophila melanogaster), comparing with a positive control, ethylmethanesulfonate (EMS). We chose ethidium bromide because it is a chemical frequently used in molecular biology techniques, and considered as a mutagenic although it is not included in the lists of the International Agency for Research on Cancer (IARC). The survey was conducted over 25 generations, and in six generations (1st, 5th, 10th, 15th, 20th, 25th generations) were analyzed: (1) the effects on morphological patterns, (2) the daily productivity over 15 days. In addition, we also analyzed: (3) biochemical changes in enzymes of the oxidative system brought about by exposure to different concentrations of ethidium bromide and EMS, (4) genetic alterations: level of transposition of the transposable element Bari-1 and expression genes that encode proteins catalase, hsp 70 (heat shock protein), superoxide dismutase 1 and esterase-6 and (5) longevity. Concerning daily productivity, five replicates were done, involving negative and positive controls (not exposed to any mutagen and with EMS, respectively), and three groups exposed to 1, 5 and 30 µM of EB. The results show that there were... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-28Bitstream added on 2014-06-13T20:21:36Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_hb_dr_araiq_parcial.pdf: 153628 bytes, checksum: 3d4ba64426023c8a7714053c2f4e83d3 (MD5) / As β-D-frutofuranosidases, também conhecidas como invertases, são hidrolases que catalisam a hidrólise da sacarose em uma mistura equimolar de β-D-glicose e β-D-frutose que recebe o nome de açúcar invertido. Estas enzimas podem ser encontradas em diversos organismos, como vegetais, animais, bactérias, leveduras e em fungos filamentosos, sendo que os últimos merecem destaque pela alta produção enzimática e estabilidade. O objetivo deste trabalho foi estudar a β-D-frutofuranosidase produzida por Fusarium graminearum em Fermentação Submersa (FSbm) e Fermentação em Substrato Sólido (FSS) purificando-a e caracterizando-a bioquimicamente, além de submeter esta enzima a secagem em Spray dryer e imobilização em suportes de baixo custo. O fungo F. graminearum foi selecionado como bom produtor da enzima, com maiores níveis de produção encontrados quando cultivado em substrato sólido com farelo de trigo umidificado com água de torneira (1:1; m/v) por 9 dias (150 U/g substrato). A β-D-frutofuranosidase extracelular obtida foi purificada 8,41 vezes com recuperação de 14%, obtendo-se em PAGE 7% uma única banda protéica, e em SDS-PAGE 12%, 2 bandas proteicas (94 kDa e 70 kDa) supondo-se um heterodímero, uma vez que a enzima nativa, estimada pela coluna de filtração Sephacryl S200, apresentou 159 kDa. A temperatura ótima de atividade ficou na faixa de 55-60ºC e o pH ótimo 4,5. Foi totalmente estável em temperaturas entre 30oC e 50oC por 1 hora, e com atividade residual acima de 80% entre pH 3,0 e 8,0 por 30 minutos. A β-D-frutofuranosidase extracelular foi ativada pelos íons Mn2+ e K+. A enzima foi capaz de hidrolisar sacarose e rafinose, mas não a inulina, com maior afinidade para a rafinose, com Km de 21,16 mM e Vmax maior quando utilizada a sacarose como substrato... / The β-D-fructofuranosidases, also known as invertase, are hydrolases which catalyze the hydrolysis of sucrose in an equimolar mixture of β-D-glucose and β-D-fructose that is called invert sugar. These enzymes can be found in many organisms, such as plants, animals, bacteria, yeasts and filamentous fungi, and the latter must be highlighted for high enzyme production and stability. The objective of this work was to study the β-D-fructofuranosidase produced by Fusarium graminearum in Submerged Fermentation (SbmF) and Solid Substrate Fermentation (SSF) purifying and characterizing them biochemically, and submit this enzyme to drying using Spray dryer and immobilization on low cost supports. The F. graminearum was selected as a good enzyme producing strain, with higher production levels found when the fungus was grown on wheat bran as solid substrate moistened with tap water (1:1, w/v) for 9 days (150 U/g substrate). The extracellular β-D-fructofuranosidase obtained was purified 8.41-fold with recovery of 14%. A single protein band was obtained in 7% PAGE, and two protein bands (94 kDa and 70 kDa) in 12% SDS-PAGE indicating a heterodimeric structure, since the native enzyme, estimated by gel filtration using Sephacryl S200 column presented 159 kDa. The optimum temperature for activity was 55-60°C and optimum pH 4.5. It was completely stable at temperatures between 30oC and 50oC for 1 hour, and residual activity above 80% between pH 3.0 and 8.0 for 30 minutes was observed. This β-D-fructofuranosidase was activated by Mn2+ and K+. The enzyme was able to hydrolize sucrose and raffinose, but not inulin, with a higher affinity for raffinose, with a Km of 21.16 mM and Vmax was higher when sucrose was used as substrate (1639.34 U/mg protein). The crude extract containing the extracellular enzyme was... (Complete abstract click electronic access below)