Biosurfactants are natural amphipathic molecules thus they can reduce the surface and interfacial tensions. They are produced by a variety of microorganisms, mostly by bacteria and yeasts. The aim of this study was to evaluate the biosurfactant production from the submerged fermentation process by Aureobasidium thailandense, isolated from Cashew stalk (Anacardium occidentale L.) using organic residues as carbon and nitrogen source. The first experiments were conducted in order to select the sources of nutrients from the following sources: molasses, waste water from the production of olive oil (olive mill wastewater - OMW), glucose, yeast extract and corn steep liquor (CSL). The study conducted using a fractional factorial 23-1 to analyze the effect of nitrogen sources (yeast extract and corn steep liquor) and olive mill wastewater concentrations in the medium. CSL obtained negative effect on the production of the biosurfactant. A central composite rotated design (CCRD - 22) including 4 trials in the axial conditions and three repetitions at the central point, was performed to optimize the yeast extract and olive mill wastewater concentration. The real values obtained from fermentation using the concentrations of 2 g/L of yeast extract, 1.5% (v/v) of OMW, 6 g/L of glucose and 1 g/L of KH2PO4 were 27 Â 2 5 mN/m and 28 Â 2.6 mN/m at 24 and 48 h, respectively. The maximum reduction in surface tension values of the fermentation broth generated were estimated at 27 mN/m (24 hours) and 28.2 mN/m (48 hours).The biosurfactant produced by A. thailandense showed a critical micelar concentration (CMC) of 550 mg/L, reducing the water surface tension from 72 Â 0.8 mN/m to 33 mN/m. The structure of the molecule represents CH3 â (CH2)10 â, where its ester portion has not yet been identified. The emulsifying ability was verified comparing the produced surfactant against the synthetic surfactant SDS (E24 = 57 Â 0.57%) at 10 mg/mL. It was obtained a E24 = 49 Â 0.4%. The surfactant produced by A. thailandense caused a 86% dispersion of crude oil in plate and its action after 24 hours remained stable, SDS surfactant showed no dispersion in the same time interval. / Os biossurfactantes sÃo molÃculas anfipÃticas que atuam na reduÃÃo da tensÃo superficial e interfacial de lÃquidos. SÃo produzidos por uma diversidade de microrganismos, em sua maioria por bactÃrias e leveduras. O objetivo desse trabalho foi avaliar a produÃÃo de biossurfactante por Aureobasidium thailandense isolado do pedÃnculo do caju (Anacardium occidentale L.) utilizando resÃduos agroindustriais como fonte de carbono e nitrogÃnio a partir do processo de fermentaÃÃo submersa. Os primeiros experimentos foram realizados a fim de selecionar as fontes de nutrientes a partir: melaÃo, Ãgua residual da produÃÃo de azeite (olive mill wastewater - OMW), glicose, extrato de levedura e Ãgua de maceraÃÃo de milho (CSL). A partir desse estudo preliminar foi realizado um fatorial fracionado 23-1, incluindo 3 repetiÃÃes no ponto central, totalizando 7 ensaios para selecionar a fonte de nitrogÃnio (CSL e extrato de levedura). O CSL obteve efeito negativo na produÃÃo do biossurfactante. Dessa forma pode-se realizar um planejamento fatorial completo (DCCR- 22) para otimizar as concentraÃÃes de extrato de levedura e de OMW. Os valores obtidos para reduÃÃo de tensÃo superficial do caldo fermentado foram 27 Â 2,5 mN/m e 28 Â 2,6 mN/m em 24 e 48 h, respectivamente e os estimados pelo planejamento foram de 27 mN/m (24 horas) e 28,2 mN/m (48 horas). Dessa forma o meio de fermentaÃÃo foi otimizado nas seguintes concentraÃÃes: 2 g/L de extrato de levedura, 1,5% (v/v) de OMW, 6 g/L de glicose e 1 g/LKH2PO4. O biossurfactante produzido por A. thailandense apresentou uma concentraÃÃo micelar crÃtica (CMC) de 550 mg/L, reduzindo a tensÃo superficial da Ãgua de 72 Â 0,8 mN/m para 33 mN/m. A estrutura da molÃcula nÃo foi completamente elucidada, sabe-se que a cadeia carbÃnica CH3 â (CH2)10 â liga-se a uma porÃÃo Ãster. A aÃÃo emulsificante foi comparada ao surfactante sintÃtico SDS (E24 = 57 Â 0,57 %) na concentraÃÃo de 10 mg/mL, obtendo um E24 de 49 Â 0,4 %. O surfactante produzido por A. thailandense promoveu a dispersÃo de 86% do petrÃleo bruto em placa e apÃs 24 horas sua aÃÃo manteve-se estÃvel, o surfactante SDS nÃo apresentou a dispersÃo nesse mesmo intervalo de tempo.

Orientadores: Valéria Maia de Oliveira, Suzan Pantaroto de Vasconcellos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T10:57:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dellagnezze_BrunaMartins_M.pdf: 2605800 bytes, checksum: 9f658e8eb7ad92524b8042afa7233e71 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Bioemulsificantes ou biossurfactantes são compostos sintetizados por micro-organismos que aumentam a biodisponibilidade de hidrocarbonetos, promovendo a estabilização de substâncias com diferentes polaridades, como por exemplo, emulsões água-óleo existentes nos reservatórios de petróleo. As amostras utilizadas neste trabalho foram coletadas na Bacia Potiguar (RN), e empregadas como inóculo para a realização de enriquecimentos anaeróbios e aeróbios da microbiota do petróleo. A amostra de óleo selecionada (GMR 75) foi obtida a partir de um poço com nível de biodegradação moderado. Após o período de incubação dos enriquecimentos, foi realizada a extração de DNA dos mesmos e a construção das bibliotecas de fosmídios, utilizando-se kit de clonagem comercial. A avaliação da produção de emulsificantes pelos clones fosmidias provenientes das bibliotecas metagenômicas foi realizada através de dois tipos de ensaios de triagem, um teste baseado em atividade biológica e outro em similaridade de sequência. O teste funcional, denominado "colapso da gota", apresenta caráter qualitativo e foi utilizado para a triagem preliminar de 2.880 clones, gerando 2.104 resultados positivos. Para o teste baseado em seqüência, os clones que se mostraram positivos no teste funcional foram avaliados através de reações de PCR utilizando primers homólogos a regiões conservadas de genes para a síntese de biossurfactantes. Entretanto, nenhum sinal positivo de amplificação foi observado com os primers utilizados. Ensaios de tensiometria, utilizando meio mineral e hexadecano como única fonte de carbono e energia, foram realizados para a confirmação da produção dos emulsificantes pelos clones. Nove clones capazes de reduzir a tensão interfacial de 45 mN\m para 30 mN/m foram selecionados e submetidos aos ensaios de emulsificação utilizando petróleo, óleo diesel e hexadecano. Os resultados demonstraram a formação de emulsão, principalmente em óleo diesel, sugerindo poder emulsificante sobre este composto. As análises colorimétricas dos biossurfactantes produzidos pelos nove clones revelaram proporções similares de carboidratos, proteínas e ácidos urônicos, não permitindo resultados conclusivos sobre a composição destes compostos. / Abstract: Bioemulsifiers or biosurfactants are compounds produced by microorganisms which enhance the bioavailability of hydrophobic substances promoting the stabilization of substances with different polarities, like oil-in-water emulsion occurring in petroleum reservoirs. The samples used in this work were collected in the Potiguar Basin (RN, Brazil), and employed as inoculum for aerobic and anaerobic enrichments of the petroleum microbiota. The selected oil sample (GMR 75) was obtained from a reservoir presenting a moderate biodegradation level. After the incubation period of the microbial enrichments, total DNA was extracted and used for the assembly of the metagenomic libraries by using a comercial kit. The evaluation of the potential for emulsifier production by the fosmid clones derived from the metagenomic libraries was performed by means of two screening assays, one based on biological activity and another based on sequence similarity. The functional assay, named "drop collapse", has a qualitative character and was used for the preliminary screening of 2,880 clones, yielding 2,104 positive results. For the sequence-based assay, clones shown to be positive in the functional assay were evaluated through PCR reactions using primers homologous to conserved regions of genes for biosurfactant synthesis. However, no positive amplification signal was observed with the primers used. Tensitometric assays, using mineral medium and hexadecane as sole carbon and energy source, were performed to confirm the production of the biosurfactants by the clones. Nine clones able to reduce the interfacial tension from 45 mN\m to 30 mN/m were selected and subsequently submitted to emulsification assays using petroleum, diesel oil and hexadecane. Results demonstrated the formation of an emulsion, mainly in diesel oil, suggesting the emulsifier power of the biosurfactants over this substance. Colorimetric analyses of the biosurfactants produced by the clones revealed similar proportion of carbohydrates, proteins and uronic acids, not allowing conclusive characterization of their composition. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Gláucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T02:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_DianeTeode_D.pdf: 21600008 bytes, checksum: 9d2d940e83841a4b2fb091014e2703ef (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O lipoheptapeptídeo cíclico surfactina é produzido por diferentes cepas de Bacillus subtilis. Em uma concentração de 20 mM, a surfactina é capaz de reduzir a tensão superficial da água de 72 mN/m para 27 mN/m. Isto faz da surfactina o biossurfactante com maior potencial conhecido. O conjunto multienzimático, responsável pela síntese da surfactina, consiste de três grandes NRPSs: SrfA-A (402kDa), SrfA-B (401kDa) e SrfA-C (144 kDa), compreendendo um total de sete módulos. Os genes NRPSs correspondentes estão organizados no operon srfA. A produção de surfactina por B.subtilis é usualmente baixa e a produção em sistemas de expressão heterólogos como E.coli não é viável. Portanto, uma opção para aumentar a produção de surfactina seria o uso de sistemas de expressão utilizando o próprio Bacillus, colocando o operon srfA sob controle de um forte promotor que pode funcionar independentemente da regulação por feedback negativo endógeno. Para esta proposta, o promotor nativo do operon responsável pela síntese da surfactina em B.subtilis LB5a foi substituído pelo promotor Pgrac, o qual pode ser induzido por análogos de lactose. Este sistema de expressão é baseado em um forte promotor que não é inibido por fatores endógenos e, deve fornecer uma nova ferramenta para produzir altos níveis de surfactina em Bacillus subtilis. A eficácia do lipopeptídeo produzido pela cepa recombinante de B.subtilis pGrac-SrfA foi demonstrada usando testes de atividade hemolítica e avaliação da tensão superficial do meio. Os picos do lipopeptídeo obtido por HPLC para a cepa recombinante pGrac-SrfA apresentaram perfis semelhantes aos obtidos a partir da cepa selvagem. Análises de espectrometria de massas confirmaram a presença de uma série homóloga de lipopeptídeos com variações no tamanho da cadeia hidrocarbônica caracterizando o composto como surfactina. Verificou-se a predominância do homólogo de massa molecular de 1000,18 u. A produção de surfactina pela cepa de B.subtilis recombinante foi cerca de 57% superior ao da cepa selvagem, quando induzida por isopropil b-D-1-tiogalactopiranosídeo / Abstract: The cyclic lipoheptapeptide surfactin is produced by different Bacillus subtilis strains. At a concentration of 20µM, this biosusrfactant is able to reduce the surface tension of water from 72 mN/m to 27 mN/m. This makes surfactin one the most powerful biosurfactants known so far. The surfactin synthetase is a large multienzyme complex consisting of three enzymatic subunits, SrfA (402 kDa), SrfB (401 kDa), and SrfC (144 kDa), comprising of a total of seven modules. The corresponding NRPS genes are organized in the srfA operon. Surfactin production from Bacillus strains is usually low and production of such large proteins in a heterologous system such as E. coli is not viable. One option to improve surfactin production would be to use Bacillus subtilis itself as an expression system and to place the srfA operon under the control of a strong promoter that can function independently of endogenous negative feedback regulation. For this purpose, the native promoter of the surfactin operon in B.subtilis LB5a was replaced by the promoter Pgrac, which can be induced by lactose analogs. This expression system is based on a strong promoter and is not expected to be inhibited by endogenous factors and, should provide a new tool for producing higher levels of surfactin in Bacillus subtilis.The efficacy of the lipopeptide produced for the recombinant B.subtilis pGrac-SrfA was demonstrated using tests of hemolytic activity and evaluation of the surface tension of the medium. HPLC peaks of surfactin gotten of the genetically modified strain showed patterns of lipopeptides similar to those of the wild-type strain, and mass spectrometry analysis confirmed the presence of a lipopeptide homologous serie with variations in the hydrocarbon chain length, known as surfactin. Was verified the predominance of a homologue with a molecular mass of 1000.18 u. The surfactin production of the recombinant bacterium was up to about 57% greater than that of wild-type strain when it was induced by isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Cesar Costapinto Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T08:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Perna_RafaelFirmani_M.pdf: 5058153 bytes, checksum: 4dda3e93c531c037f99cf72569d68ec3 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo principal o estudo da separação e concentração do biossurfactante surfactina, sintetizado por fermentação através da bactéria Bacillus subtilis, utilizando-se o processo de fracionamento em coluna de bolhas e espuma, operada de modo semi-batelada, a fim de se otimizar o enriquecimento e a recuperação do bioproduto. O processo envolve a injeção de gás nitrogênio nas vazões de 20, 40 e 60 mL/min pela base da coluna de líquido que contém a solução de surfactina pH 7,0 nas concentrações iniciais de 240, 400 e 700 mg/L. O gás ascende na forma de bolhas e, durante o seu trajeto, moléculas de surfactina são adsorvidas na interface gás-líquido, devido às suas características anfifílicas. No topo da coluna de bolhas, forma-se uma coluna de espuma concentrada no biossurfactante adsorvido que, então, pode ser recuperado pela remoção e rompimento mecânico da espuma. Valores de enriquecimento e recuperação de surfactina foram determinados para diferentes condições experimentais. Os valores médios de enriquecimento ficaram entre 1,9 a 52,5 vezes, enquanto que a recuperação total de surfactina variou de 80,5 a 98,3 %. O maior valor de enriquecimento foi alcançado para soluções diluídas de surfactina operando a coluna a baixa vazão de gás e com temperatura relativamente elevada. Os resultados indicaram que o processo que utiliza coluna de bolhas e espuma se mostra promissor na etapa de concentração do biossurfactante. Foram obtidas as isotermas de Gibbs para a surfactina nas temperaturas de 15, 25 e 35 °C e ajustadas de acordo com o modelo de isoterma de adsorção de Langmuir. A aplicação da análise de variância mostrou que o modelo se ajustou satisfatoriamente aos resultados experimentais e a equação que o descreve apresentou significância estatística. Portanto, as moléculas do biossurfactante foram adsorvidas em monocamadas na interface gás-líquido. Desenvolveu-se, também, um modelo matemático para os fenômenos de convecção, difusão e equilíbrio, que foi aplicado para simular as curvas de depleção para a surfactina. O modelo representou satisfatoriamente os resultados experimentais quando comparados aos resultados simulados / Abstract: Foam fractionation of biosurfactant surfactin solutions obtained from fermentation with Bacillus subtilis bacteria was experimentally studied. A bubble and foam column system was mounted and operated in a semi-batch mode aiming at to optimize the concentration enrichment and the recovery of the bioproduct. The process involves the injection of gaseous nitrogen through a sparger in the basis of the column containing the surfactin liquid solutions. Gas flow rates of 20, 40 and 60 mL/min and initial concentrations of 240, 400 and 700 mg/L were used in the experimental runs. Temperatures of 15, 25 and 35 °C were used in the experiments. With the bubbles ascending in the column, a convection phenomena is produced from the liquid to the gas and due the amphiphilic property of the surfactant, solute molecules are adsorbed at the gas-liquid interface of the bubbles. A foam column on the top of the liquid column is also formed and after drainage phenomena and a break procedure of the foam, a surfactant concentrated solution is obtained. Surfactin enrichment and recovery from the initial solution were determined for several experimental conditions. Average values for the enrichment are in the range of 1,9 to 52,5 times and recovery are in the range from 80,5 to 98,3 %. The higher values of enrichment are got with diluted solutions runs operated at low gas flow rates and higher temperatures. The results indicates this process as very promising in the concentration of surfactin solutions. Using Gibbs adsorption theory for the gas-liquid interface, gas-liquid isotherms were obtained in the temperatures of 15, 25 and 35 °C and adjusted by the Langmuir model. A variance analysis from experimental planning was performed and showed a good agreement with experimental results. A mathematical modeling for the convection, adsorption and equilibrium represented satisfactorily the depletion curves in the bubble column / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Lúcia Regina Durrant / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:44:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faria_AndreiaFonsecade_D.pdf: 11493166 bytes, checksum: e3cd66f7090b963f62e89ca35a7c600a (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os biossurfactantes são compostos amplamente estudados em todo o mundo. Suas características o tornam muito atrativo em relação aos surfactantes sintéticos. Dentre essas características podemos citar, a baixa toxicidade, boa compatibilidade com a pele e olhos, biodegradabilidade e produção a partir de substratos renováveis. No entanto, o custo de produção dos biossurfactantes ainda inviabiliza sua produção em escala industrial. Tradicionalmente, os hidrocarbonetos têm sido os substratos escolhidos para a produção de biossurfactantes e bioemulsicadores. É assumido que a produção de biossurfactantes é induzida para tornar o substrato hidrofóbico acessível a célula. Contudo, substratos solúveis em água também podem ser utilizados para a produção dos surfactantes biológicos. Esses últimos são mais baratos do que os hidrocarbonetos e preferidos em processos fermentativos, devido ao fato de que as fermentações monofásicas são mais simples do que as fermentações bifásicas. Além disso, o uso de hidrocarbonetos são inaceitáveis para a produção de biossurfactantes destinados a aplicações em alimentos, cosméticos e produtos farmacêuticos. Uma grande variedade de matérias-primas estão atualmente disponíveis como substrato orgânico para fermentações industriais, dentre as quais podemos destacar os resíduos agroindustriais. Essas matérias-primas possuem vantagens de serem encontradas em excesso e produzidas em regiões de clima tropical ou temperado. Atualmente, com o aumento da demanda de produção de biodiesel, o glicerol tem ganhado atenção no cenário de bioprocessos, demonstrando ser uma matéria-prima de grande disponibilidade para produção de biomoléculas de interesse industrial. Segundo a Agência Nacional de Petróleo (ANP-Brasil), o Brasil é ranqueado como o maior produtor e consumidor de biodiesel do mundo: 1,2 bilhões de litros/ano em 2008, gerando de 120.000 toneladas de glicerina residual nesse processo. Logo, o presente trabalho teve como objetivo selecionar um substrato orgânico de baixo custo, de forma a tornar viável a produção e comercialização dos biossurfactantes em larga escala. Dentre as 19 linhagens microbianas avaliadas, o microrganismo Bacillus subtilis LSFM_05 foi selecionado para a produção de biossurfactantes, utilizando glicerina residual bruta como substrato orgânico. A temperatura de 32oC e concentração de glicerina de 5% v/v foram designadas como condições ótimas para a produção de biossurfactantes, através do planejamento experimental. A produção dos biossurfactantes foi realizada em fermentador um litro nas rotações de 150, 250 e 350 rev.min -1. A fermentação conduzida à 250 rev.min-1 apresentou melhor desempenho na formação de espuma e produção de biossurfactante. Em seguida, essa condição foi reproduzida em fermentador de 10 litros, que apresentou rendimento de 0,69 g.L-1. Após a execu-ção dos processos fermentativos, os biossurfactantes foram recuperados por precipitação ácida, puri_cados em coluna de adsorção e caracterizados utilizando Espectrometria no Infravermelho com Transformada de Fourier (IV-FT), Espectrometria de Ressonância Magnética (1H e 13C RMN) e Espectrometria de Massa (ESI-MS/MS). O biossurfactante foi caracterizado como uma isoforma do lipopeptídio surfactina, contendo 14 átomos de carbono na cadeia lipídica e sete aminoácidos do anel peptíco. A espectrometria de massa foi capaz de elucidar a composição e sequência de aminoácidos do peptídio cíclico GluOMe(1)/Leu(2)/Leu(3)/Val(4)/Asp(5)/Leu(6)/Leu(7) e os espectros de 1H e 13C - RMN foram de extrema importância para comprovar a esteri_cação do aminoácido ácido glutâmico. O microrganismo Bacillus subtilis LSFM_05 também foi caracterizado como co-produtor de fengicina. A espectrometria de massa apresentou ser uma técnica sensível e rápida para a caracterização dos homólogos A e B de fengicina. A surfactina C14/Leu7 foi avaliada com relação a toxicidade ambiental sobDaphnia similis, apresentando EC50 em 1500 mg.L-1. A surfactina apresentou atividade antiviral contra o vírus envelopado Herpervirus bovino (BoHV-1), inibindo 100% da infectividade do vírus na concentração de 0,25 _M, porém, não apresentou atividade antimicrobiana para os microrganismos avaliados até a concentração de 1mg.mL-1. A surfactina também foi avaliada com relação a citotoxicidade sob _broblastos c3T3 de camundongos, e o valor de EC50 não foi determinado na faixa de concentração estudada, indicando níveis de toxicidade para esse tipo de célula. No âmbito na nanotecnologia, o extrato bruto contendo os biossurfactantes mostrou-se uma ferramenta útil na dispersão de nanotubos de carbono, em água de cultivo de Daphnia, tornando possível o estudo de ecotoxicologia desses nanomateriais / Abstract: In recent years biosurfactants have attracted considerable attention because they o_er several advantages in comparison with synthetic surfactants: low toxicity, greater biodegradability, better environmental compatibility, greater foaming, speci_c activity at extreme temperatures, pH and salinity, and the possibility of being produced from renewable sources and industrial wastes However, biosurfactants have not yet been employed extensively in industry because of their relatively high production and recovery costs. The cost can be reduced by strain improvement, optimizing medium composition by statistical methods or by using alternative inexpensive substrates. Traditionally, hydrocarbons have been the substrates of choice to produce biosurfactants and bioemulsi_ers. It is assumed that surfactant production is induced to render hydrophobic substrates accessible to the cell, but water-soluble substrates such as molasses, cassava waste-water and potato substrates have also been used for biosurfactant production. The latter are cheaper than hydrocarbons and are the preferred substrates, because single-phase fermentation is simpler than biphasic fermentation and in addition the hydrocarbon substrates are unacceptable for many applications, such as in foods, cosmetics and pharmaceutical products. One alternative substrate aimed at decreasing costs in the production of biosurfactants could be the waste glycerol obtained from the biodiesel industry. Brazil is ranked amongst the greatest producers and consumers of biodiesel in the world: 1.2 billion liters /year in 2008, according to the National Petroleum Agency-Brazil (ANP) generating 120,000 tons of waste glycerol in this process. The data described above may support the idea of applying the raw glycerol in the production of biosurfactant on a large-scale. This present study aimed to select an low cost organic substrate, in order to become viable the biosurfactant production on a large scale. Among the 19 microbial strains evaluated, the microorganism Bacillus subtilis LSFM-05 was selected for the biosurfactant production using raw glycerol as organic substrate. The temperature of 32oC and glycerol concentration of 5% v/v were designated as optimal conditions for the production of biosurfactants, by response surface methodology. The production of biosurfactants was carried out by one liter fermentor at 150, 250 and 350 rev.min-1. The 250 rev.min-1 fermentation was the best performance in foaming and biosurfactant production. Then, this condition was reproduced in 10 liter fermentor, with yield of 0.69 g.L-1. After the fermentation processes, the biosurfactants were recovered by acid precipitation, puri_ed by adsorption column and characterized using Infrared Spectroscopy Fourier Transform (FT-IR), Magnetic Resonance Spectroscopy ( 1H and 13C NMR) and Mass Spectrometry (ESI-MS/MS). The biosurfactant was characterized as a surfactin isoform, containing14 carbon atoms in the lipid chain and 7 aminoacids in the peptide portion. The mass spectrometer was able to elucidate the composition and aminoacids sequence in the cyclic peptide GluOMe(1)/Leu(2)/Leu(3)/Val(4)/Asp(5)/Leu(6)/Leu(7). The microorganism Bacillus subtilis LSFM-05 was characterized as a fengycin co-producer. The mass spectrometry have been a sensitive and rapid technique for fengycin homologues characterization. The C14/Leu7 surfactin presented EC50 value of the 1500 mg.L-1 against Daphnia similis in ecotoxicological studies. The surfactin showed antiviral activity against enveloped bovine herpesvirus (BoHV-1), inhibiting 100 % of the infectivity at concentration of 0.25 _M, however, it didn't show antimicrobial activity for microorganisms evaluated until concentration of 1mg.mL-1. The surfactin cytotoxicity in mice _broblasts c3T3 was evaluated as well, and the EC50 value was not determined in the studied concentration range, indicating low levels of toxicity for this cell type. Concerning to applications in nanotechnology, the biosurfactants proved to be a useful tool in the dispersion of carbon nanotubes in standard water cultivation of Daphnia, enabling future studies about the environmental toxicology of these nanomaterials / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação para ENCADERNAÇÃO_Rosicleia.pdf: 2816516 bytes, checksum: c06b197d39dc534c8deeaaaf637dc7c2 (MD5) Previous issue date: 2017-12-20 / The present dissertation relates isoptera of the Amazonian forest, oil and biosurfactants. The isoptera were the target of this investigation because they live in association with innumerous microorganisms such as bacteria, flagellated protozoa among others that give them the incredible ability to degrade ligno-cellulosic material present in their main diet: wood. Lignin and petroleum have a chemical structure composed of aromatic rings, ie the PAHs that give these compounds recalcitrance and resistance to biodegradation. Biodegradable petroleum microorganisms have some abilities that facilitate the biodegradation process, and one of the strategies used is the release into the extracellular environment of biosurfactants, which act to reduce the surface and interfacial tension of the molecules, thus causing the biodegradation of hydrophobic compounds. Termites were collected in the city of Coari, from soil habitat and tree followed for the cultivation of consortium producing biosurfactant in minimal medium and oil as the only source of carbon, later the microorganisms belonging to the selected consortium were grown individually, and the microorganism with the highest potential was identified by the sequencing of the 16 S ribosomal RNA gene revealing the bacterium Psychrobacillus psychrodurans. Tests performed as Emulsifying Activity and Cell Hydrophobicity revealed statistical differences in the experiments involving Hexane, xylene and petroleum solvents in seven days of culture. In the detection test of biosurfactant production (droplet collapse) the drop formed by the cell-free supernatant evidenced the production of biosurfactant of 0.1% compared to the SDS surfactant. The reduction of the surface tension by the Du Noyu ring method in Kruss tensiometer was demonstrated using the bacterial supernatant at distinct cultivation times 1, 7 and 12 days and indicated a reduction of the surface tension of 72 mN / m² to approximately 54, 6 mN / m² in seven days of cultivation. / A presente dissertação relaciona isópteros da floresta amazônica, petróleo e biossurfactantes. Os isópteros foram alvo desta investigação por viverem em associação a inúmeros microrganismos como bactérias, protozoários flagelados dentre outros que conferem a eles a incrível habilidade em degradar material ligno-celulósico presente em sua principal dieta alimentar: a madeira. A lignina e o petróleo possuem estrutura química composta por anéis aromáticos ou seja os HPAs que conferem a estes compostos recalcitrância e resistência a biodegradação. Microrganismos biodegradadores de petróleo possuem algumas habilidades que facilitam o processo de biodegradação, e uma das estratégias utilizadas é a liberação no meio extracelular de biossurfactantes, que atuam reduzindo à tensão superficial e interfacial das moléculas ocasionando desta forma a biodegradação de compostos hidrofóbicos. Cupins foram coletados na cidade de Coari, de habitat solo e árvore seguindo para o cultivo de consórcio produtor de biossurfactante em meio mínimo e petróleo como única fonte de carbono, posteriormente os microrganismos pertencentes ao consórcio selecionado foram cultivados individualmente, e o microrganismo com maior potencial foi identificado pelo sequenciamento do gene RNA ribossomal 16 S revelando a bactéria Psychrobacillus psychrodurans. Testes realizados como Atividade Emulsificante e Hidrofobicidade Celular revelaram através de análise estatística diferenças significativas nos experimentos envolvendo os solventes Hexano, xileno e petróleo em sete dias de cultivo. No teste de detecção de produção de biossurfactante (colapso de gota) a gota formada pelo sobrenadante livre de células evidenciou a produção de biossurfactante de 0,1 % comparado ao surfactante SDS. A redução da tensão superficial através do método do anel de Du Noyu em tensiometro Kruss foi comprovada utilizando o sobrenadante bacteriano em tempos de cultivo distintos 1, 7 e 12 dias, e apontaram a redução da tensão superficial de 72 mN∕m² para aproximadamente 54,6 mN∕m² em sete dias de cultivo.

Surfactantes de origem química e biológica são substâncias anfipáticas que se localizam em interfaces e diminuem a tensão intererficial. Este trabalho objetivou isolar microrganismos do gênero Pseudomonas, a partir de amostras ambientais; selecionar, dentre os isolados, aqueles que são capazes de produzir biossurfactante e caracterizar os biossurfactantes encontrados de acordo com suas propriedades. Foram isoladas 1713 linhagens, destas, 944 foram capazes de crescer em meio PIA. A análise do sobrenadante para presença de ácidos graxos normalmente encontrados em ramnolipídios demonstrou que em 31 linhagens, das 95 que apresentaram atividades tensoativas, foi detectada a presença de 3-hidroxidecanoato (3HD) e outras 56 não apresentaram picos característicos de ácidos graxos característicos de ramnolipídios. Foram selecionadas 10 linhagens para caracterização dos biossurfactantes produzidos por elas. Foi confirmada a produção de ramnolipídios por 3 linhagens e foi possível identificar um novo composto com tensoatividade, o 2-acetilfurano. / Biological and chemical surfactants are anphipatic compounds whitch reduce interfaces tension. The present work aimed to isolate microorganisms of samples from diverse environments, chosing among the isolated ones, those capaple of producing biosurfactants and characterizing it according to some of their properties. From 1713 isolated strains, 944 were capable of growing in PIA medium. The supernatant analysis for the presence of fatty acids usually found in rhamnolipds showed that 31 of the 87 strains that presented tensoactive activities, had 3-hydroxyalkanoates (3HD) detected in their supernatant. Other 56 strains did not present characteristic rhamnolipid fatty acids peaks. Based in this resoults 10 isolates were selected for a better characterization of their biosurfactants. The producton os RHLs were confirmed for 3 diferent strains. It was possible to identify a new compound called 2-acethylfuran that was not mentioned by other authors as a possible biosurfactant or as produced by Pseudomonas.

Orientadores: Glaucia Maria Pastore, Marta Cristina Teixeira Duarte / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-26T06:56:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simiqueli_AnaPaulaResende_D.pdf: 14118088 bytes, checksum: fde7134a6bda63a14dbd09e77af4109b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Nos últimos anos, produtos naturais como os biossurfactantes e óleos essenciais têm sido objeto de intensa investigação científica. As suas atividades antimicrobianas e antiadesivas fazem com que eles apresentem potencial para serem utilizados para o controle de fungos fitopatógenos na agricultura e combate à micro-organismos multirresistentes e biofilmes na área médica e em indústrias de alimentos. Apesar da surfactina produzida por Bacillus subtilis possuir elevadas atividades superficiais e biológicas e ser um dos biossurfactantes mais estudados atualmente, os seus altos custos de produção e baixo rendimento tornam impraticável a sua produção em escala industrial. Deste modo, este trabalho estudou a produção contínua de surfactina e coprodução de amilases e proteases por B. subtilis utilizando manipueira como substrato em diferentes taxas de alimentação, visando à redução dos custos de processo e ao melhor aproveitamento do arsenal metabólico do micro-organismo. As suas atividades antimicrobiana e antibiofilme do biossurfactante produzido foram estudadas em conjunto com dez óleos essenciais extraídos plantas medicinais e aromáticas. Os valores de produção de biossurfactantes e atividades enzimáticas foram crescentes com o aumento da taxa de diluição empregada, encontrando-se os valores máximos de 2,9 mg.h-1, 938,3 U.mL-1 e 3,6 U.mL-1 para a produção de biossurfactantes e atividades amilolítica e proteolítica, respectivamente. O biossurfactante produzido demonstrou atividade antibacteriana contra Bacillus cereus, Rhodococcus equi e Listeria innocua e inibiu a formação de biofilmes de Staphylococcus aureus e Escherichia coli em até 92 e 78 %, respectivamente. Além disso, ele apresentou efeito sinérgico com os óleos essenciais de Aloysia gratissima e Cymbopogon winterianus para a inibição de R. equi, L. innocua e B. subtilis, com os óleos essenciais de Cinnamomum burmannii, Cymbopogon citratus e Lippia sidoides para a inibição dos fungos fitopatógenos Alternaria solani, Alternaria alternata e Mucor hiemalis e com o óleo essencial de C. winterianus para a inibição da formação de biofilme por E. coli / Abstract: In recent years, natural products such as biosurfactants and essential oils have been the subject of intense scientific research. Due to their antimicrobial and anti-adhesive activities, they show potential for controlling the growth of phytopathogenic fungi in agriculture and combating multi-drug resistant microorganisms and biofilms in medicine and food industries. Despite the high superficial and biological activities possessed by surfactin produced by Bacillus subtilis, their low yields and high production costs hamper their production on a commercial scale. Thus, this work studied the continuous production of surfactin and co-production of amylases and proteases by B. subtilis LB5a using cassava wastewater as substrate varying the dilution rate, in order to reduce production costs and improve the utilization of metabolic arsenal from the microorganism. The antimicrobial and anti-biofilm activities of the biossurfactant produced were studied in blends with ten essential oils extracted from medicinal and aromatic plants. Biossurfactant production values and enzymatic activities were higher with the increase of dilution rate, reaching the maximum values of 2,9 mg.h-1, 938,3 U.mL-1 and 3,6 U.mL-1 for the production of biossurfactants and amylolitic and proteolitic activities, respectively. The biossurfactant showed antibacterial activity against Bacillus cereus, Rhodococcus equi and Listeria innocua and inhibited up to 92 e 78 % of biofilm formation by Staphylococcus aureus and Escherichia, respectively. Moreover, it presented synergistic with the essential oils of Aloysia gratissima and Cymbopogon winterianus for the inhibition of R. equi, L. innocua and B. subtilis, with the essential oils of Cinnamomum burmannii, Cymbopogon citratus and Lippia sidoides for the inhibition of the phytopathogenic fungi Alternaria solani, Alternaria alternata and Mucor hiemalis and with the essential oil of C. winterianus for the prevention of biofilm formation by E. coli / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:22:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_GiselleAparecidaNobre_M.pdf: 32192539 bytes, checksum: 829ea1e46916c727a5cca642b084be51 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Biossurfatantes são compostos anfipáticos de origem biológica que apresentam uma porção hidrofílica e outra hidrofóbica. Esta propriedade lhes confere a capacidade de diminuir a tensão superficial e interfacial. de um meio liquido. Na busca de fontes alternativas para a produção de compostos de interesse biotecnológico, o uso de subprodutos de processamento agrícola ou industrial apresenta um vasto campo a ser explorado. A industrialização da mandioca, em farinha e fécula, gera aproximadamente 240.000 L de resíduo/mês. Este resíduo, a manipueira, é altamente tóxico (devido à presença de glicosídeos cianogênicos) e poluente (dado a altas concentrações de matéria orgânica não esgotada que podem atingir 100 g DQO/L). A possibilidade da utilização deste resíduo como substrato para microrganismos e o interesse na produção de compostos biotecnologicamente relevantes nos incentivou a investigar a produção de biossurfatantes pela cepa Bacillus subtilis LB5a. Definidas as condições e cinética da fermentação, foi obtido uma produção de 2,5 g/L de surfatante em 36 horas de cultivo. O tensoativo se mostrou capaz de reduzir a tensão superficial do meio de 47,74 mN/m, para 25,96 mN/m, CMD-1 de 26,19 e CMD-2 de 29,47 mN/m, com tensão interfacial contra hexadecano de 0,76 mN/m, além de CMC de 10 mg/L. O extrato apresentou estabilidade a altas concentrações de sal (>15%), elevadas temperaturas (135ºC), ampla faixa de pH (6-12) e foi estável a variadas concentrações de enzimas do tipo cisteína-proteases. A análise de aminoácidos do produto purificado, revelou a presença de ácido glutâmico, ácido aspártico, valina e leucina na proporção 1:1:1:4, caracterizando o produto como um lipopeptídeo. Por espectrometria de massas foi confirmada a presença de uma série homóloga de lipopeptídeos com variações no tamanho da cadeia hidrocarbônica caracterizando o composto como o tensoativo surfactina. Além disso, verificou-se a predominância do homólogo de massa molecular 1036 g/Mol. O biossurfatante de B.subtilis LB5a, apresentou capacidade de formar emulsões estáveis em óleos, hidrocarbonetos e combustíveis; revelou-se como substância potencial para utilização na recuperação melhorada de petróleo (MEOR) e em biorremediação, avaliado a partir da remoção de óleo bruto de areias contaminadas. Além disso, apresentou atividade antimicrobiana contra bactérias gram positivas e negativas e apresentou ação antitproliferativa sobre células tumorais humanas. Os resultados descritos neste trabalho fornecem dados relevantes acerca do potencial do biossurfatante surfactina e suas possíveis aplicações. Além disso, evidenciam a manipueira como um excelente substrato para a produção de biossurfatante pela cepa estudada, possibilitando uma grande redução de custos de produção através da utilização de um resíduo como substrato, bem como pelo processo de obtenção do produto por métodos bastante simplificados / Abstract: Biosurfactants are amphypatic compounds from biologycal source showing both hydrophilic and lipophilic groups. Due to this feature, the biosurfactants acts decreasing the surface and interfacial tension of a liquid. The byproducts of agricola and industrial processing are an underexplored new sources to the production of biotechnological interesting compounds. The cassava industrialization yields c.a. 240.000L of residue by month. This residue, cassava wastewater (manipueira), is highly toxic (due to the presence of cianogenic glycosides) and poluent (due to high concentrations of organic matter, that may reach 100 gDQO/L). The possibility of the utilization of manipueira as substract for microorganism growth and the interest in the production of biotecnologically important aducts, encourage us to investigate the biosurfactants production by Bacillus subtilis LB5a strain. After the growing conditions optimizations, 2,5 g/L of surfactant was obtained in 36 hours. The biosurfactant have reduced the surface tension of the medium from 47,74 mN/m to 25,96 mN/m, CMD-1 of 26,19 and CMD-2 of 29,47 mN/m, with interfacial tension against hexadecane of 0,76 mN/m and CMC of 10 mg.L-1. The extract show stability with respect to high salt concentration, high temperature, wide range of pH (6-12) and to several concentrations of diferent cysteine proteases. The aminoacids analysis of purified product, revealed the presence of glutamic acid, aspartic acid, valine and leucine at a 1:1:1:4 ratio, characterizing the product as a lipopetide. Mass spectrometry analysis confirmed the presence of a lipopeptide homologous serie with variations in the hydrocarbon chain lenght, known as surfactin. Furthemore, was verified the predominance of the 1036 g.Mol-1 molecular mass homologous. The biosurfactant from LB5a strain was able to produce stable emulsions in oils, hydrocarbons and fuels, bioremediation and Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR), potential were observed by the remotion of crude oil from contaminated sand. The surfactin also showed antibacterial activity agains gram positive and negative bacterias and showed antiproliferative activity agains human tumoral cells. The results described herein give important data reflecting the surfactant potential of the surfactin and its applications. Moreover, they reveal the manipueira as an excellent substrate to the biosurfactant production by the studied strain. The utilization of an industrial residue as substrate allows a strong cost reduction to the sufactant production and consists a potentially alternative to the treatment of this effluent / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-18T13:15:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_CristianoJosede_M.pdf: 12087429 bytes, checksum: e7e52d39533950f814bfe0b0170abd81 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os parâmetros ótimos de desodorização (temperatura, porcentagem de vapor e pressão de operação) são determinados de acordo com o tipo de óleo e o processo de refino selecionado. O refino do óleo de palma é realizado preferencialmente através do refino físico, pois sua elevada acidez pode provocar uma perda excessiva de óleo neutro no caso da utilização do refino químico. O refino físico de óleos vegetais consiste num processo de esgotamento ou stripping, no qual sob pressões reduzidas e elevadas temperaturas os compostos voláteis são removidos do óleo neutro através da utilização de um agente de arraste, que pode ser um gás ou vapor. No entanto, estas condições de processo também facilitam a ocorrência de volatilização de valiosos compostos minoritários como esqualeno, tocoferóis, tocotrienóis, fitoesteróis, bem como uma pequena porção dos acilgliceróis. Desta forma, este trabalho apresenta a aplicação da metodologia de superfície de resposta (MSR) no estudo dos efeitos de três variáveis de processo (temperatura, porcentagem de vapor e fração estearina/oleína), sobre a perda/transferência de compostos graxos durante a desacidificação física. As respostas de interesse foram acidez final do óleo e perda de óleo neutro (PON). Os resultados revelaram que a composição do óleo é um fator importante e estatisticamente significante a ser considerado na seleção de variáveis de processo mais adequadas, além da temperatura e da porcentagem de vapor. Na segunda etapa, foi realizado um estudo detalhado da degradação térmica dos carotenóides no óleo de palma considerando-se temperaturas variando na faixa de 170 ºC a 230 ºC. O processo de aquecimento foi realizado com injeção de nitrogênio e a coleta de amostra foi feita a cada 20 min durante um período de aquecimento total de 140 min. Os dados experimentais foram então comparados com dados da literatura relacionados à degradação de carotenóides. A degradação térmica dos carotenóides mostrou uma melhor adequação a uma ordem de reação superior a 1. Em uma etapa posterior, a metodologia de superfície de resposta (MSR) foi aplicada para o refino físico de amostras de óleo de palma de diferentes qualidades, medidas através de sua acidez inicial. Foram consideradas a influência de duas condições de operação e um terceiro parâmetro de qualidade, sendo estes: temperatura, porcentagem de vapor e acidez inicial das amostras. As respostas de interesse foram acidez final do óleo, retenção de tocóis, perda de óleo neutro (PON) e retenção de carotenóides. Os resultados mostraram que a acidez inicial é um parâmetro estatisticamente importante para a obtenção de valores aceitáveis de acidez final. Este parâmetro está diretamente relacionado à concentração de componentes minoritários no óleo, pois caso o valor de acidez final não tenha atendido aos padrões pré-determinados, o óleo deve ser submetido a tratamentos subseqüentes utilizando-se temperaturas mais elevadas ou maiores tempo de processo, portanto, acarretando a redução dos compostos minoritários. Para finalizar este trabalho foi avaliada a ocorrência da reação de hidrólise de óleo neutro durante o processo de desacidificação física. Os resultados revelaram que as maiores concentrações de ácidos graxos livres (AGL) no óleo e as menores concentrações de AGL no destilado foram obtidas para as maiores vazões de vapor e menores tempos de processo. Observou-se também, que a geração de AGL aumenta com o aumento da porcentagem de vapor e da temperatura do processo. Através da análise da cinética da hidrólise de óleo neutro, foi possível verificar uma boa adequação dos dados à equação de primeira-ordem / Abstract: Optimal deodorizing parameters (temperature, steam percentage, and operating pressure) are determined by the type of oil and the selected refining process. Refining of palm oil is preferably performed by physical means since its high acidity can lead to excessive losses of neutral oil in case of the caustic refining process. Physical refining of vegetable oils is a stripping process in which, under low absolute pressure and high temperatures, the accompanying lower boiling compounds are distilled off from neutral oil, by using gas or steam, as effective stripping agent. However, these processing conditions also increase the occurrence of volatilization of the valuable minor components present in the oil such as squalene, tocopherols, phytosterols, as well as some portion of acylglycerols. Thus, this work presents the application of response surface methodology (RSM) to the study of the effects of three factors (temperature, percentage of stripping steam and the stearin/olein ratio) on the losses/transfer of fatty compounds during the steam deacidification. The responses of interest were the final oil acidity and the loss of neutral oil (NOL). The results revealed that the oil composition was an important and statistically significant factor in the selection of more suitable processing variables, besides temperature and steam. In the second step, a detailed study was performed for carotene thermal degradation in palm oil at four temperatures ranging from 170 ºC to 230 ºC. The heating process was carried out with injection of nitrogen and the samples were collected every 20 min during a total heating period of 140 min. The experimental data were then compared to literature data concerning carotenoids thermal degradation. The thermal degradation kinetics of carotenoids in palm oil followed an order superior to 1. In the next step of this work, response surface methodology (RSM) was applied to study the physical refining process of palm oil samples of different qualities, measured by their initial acidity. The influence of two operative conditions and a third quality parameter are considered: the temperature, the steam percentage, and the initial FFA. Their effect on the final FFA, tocols retention, neutral oil loss (NOL), and carotene retention was investigated. The results revealed that the initial FFA is a statistically important parameter to obtain acceptable values for final FFA, which has directly relation with the concentration of minor components in the oil by the submission to higher temperatures or longer refining periods, in order to reach the standard values. To end this work, it was evaluated the occurrence of hydrolysis of neutral oil during the steam deacidification. The results revealed that the highest percentages of FFA into the oil and the lowest percentages of FFA on the distillate were obtained when applying high steam flow rates associated with reduced stripping times. It was also observed that the generation of free fatty acids increases with the increasing of the percent of steam injected into the oil as well as with the increasing of the process temperature. The kinetic investigation revealed that the hydrolysis of neutral oil follows a first-order reaction / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos