Made available in DSpace on 2014-06-12T23:15:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9192_1.pdf: 1720847 bytes, checksum: acfe1f00e7a4a0aff148faf1a5df5733 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / O presente trabalho descreve a síntese, a caracterização e o estudo das propriedades fotofísicas dos criptatos de lantanídeo [Ln⊂(bipy)2py(CO2Et)2]3+ e [Ln⊂(bipy)2py(CONHCH2CH2NH2)2]3+ com Ln = Eu3+, Tb3+ e Gd3+, os quais atuam como eficientes dispositivos moleculares conversores de luz em solução aquosa. As análises espectroscópicas de emissão e medidas de tempos de vida a 298K e 77K desses criptatos ajudaram a elucidar a posição e a natureza dos níveis de energia dos ligantes e níveis emissores dos íons lantanídeos. Uma maior eficiência na transferência de energia foi observada entre os níveis triplete do ligante e o nível emissor do criptato de Térbio (T→5D4), com aumento nos valores de rendimento quântico de emissão em solução aquosa. Para o criptato Tb⊂(bipy)2py(CO2Et)2 3+ obteve-se 25% de rendimento quântico enquanto o análogo de Európio produziu 14%. Os criptatos [Ln⊂(bipy)2py(CONHCH2CH2NH2)2]3+ com os lantanídeos Ln = Eu3+ e Tb3+ foram conjugados a lectina Con A e espectroscopicamente caracterizados. Através da técnica de dicroísmo circular pôde-se observar a manutenção da estrutura secundária da Con A. As medidas de fluorescência e fosforescência deste complexo com a proteína forneceram indícios da integridade de sua estrutura terciária e foram empregadas também para avaliar o grau de conjugação do criptato. O conjugado Con A-criptato foi empregado em teste histoquímico, onde o criptato atuou como marcador luminescente no reconhecimento de um tumor de mama. O criptato [Tb⊂(bipy)2py(CO2Et)2]3+ foi conjugado a microcistina-LR (uma toxina produzida por algas azuis) para o desenvolvimento de um novo método de detecção delas em amostras de água

[EN] The main objective of this work focuses on the use of biotechnology to develop new varieties of sugarcane for increasing productivity as well as the genetic variability that is narrow in this crop. With this purpose we have evaluated the genetic diversity in a population of 204 varieties (putative use as parental), using three molecular markers (CV29, CV37 and CV38) which showed an average polymorphic information content (PIC) of 0.37 indicating that they were able to identify polymorphisms in the population. After calculating the genetic similarity between the varieties and based on it, they were organized into 20 groups. Moreover, the Bru1 marker associated with resistance of a fungal disease known as brown rust was used to analyze 303 varieties (including the 204 previously used). We obtained amplification in 77. The comparison with phenotypic data recorded during four years at two locations confirmed that these 77 varieties were resistant. However, those that did not amplify showed resistance and susceptibility (in 7%), indicating the putative presence of different alleles of resistance. With the above information we design and conduct 22 cross whose offspring F1 were evaluated for four consecutive years recording with the average of each family to features like Brix (%), plant height, stem diameter, number of stems per meter and incidence of major diseases. From 22 crosses, 18 families showed brix equal or higher than CP72-2086 (the control variety), indicating that could overcome their sugar yield as a result of higher sugar content in their stems, although did not exceed in mass of cane. Several varieties with high Brix and tolerance to different diseases have been selected. Another important problem in sugarcane is the propagation of materials from plants that were pathogen infected but do not manifest disease symptoms. In this work the DBIA (Dot Blot Immunoassay) methodology and the PCR was used for detect Xantomonas albilineans; RT-PCR was used for detect SCYLV (Sugar Cane Yellow Leaf Virus). We performed a Radom screening to evaluate the incidence of both pathogens confirming their presence in plants symptomless. Sequencing X. albilineans isolates we found that in Guatemala a minimum of two strains are present. We have compared termoterapy in combination or not with meristem culture for plant sanitation. Whereas meristem culture was more appropriated for rescue plants free of X. albilineans, thermotherapy is sufficient for obtaining virus (SCYLV) free plant. The achievement of pathogen free plants let us to use in vitro culture techniques for conservation and micropropagation. Sanitated plants are maintained in vitro at a temperature of 18ºC. We evaluated several factors that may influence the adventitious regeneration from leaf explants (that may increase multiplication). These factors included genotype, explant position, combinations of growth regulators in the induction medium and auxin type for rooting. A great influence of genotype was manifested as well as the position of the explant and the concentration and type of some growth regulators were also influencing both the percentages of induction and subsequent development of the plants. In the best combination 32 plants per explant were regenerated. The protocols developed in this work are of interest to increase multiplication rates of sanitized materials and are a good base to use them in the future sugarcane improvement through genetic transformation. / [ES] El objetivo principal de este trabajo se centra en el aprovechamiento de técnicas biotecnológicas para el desarrollo de nuevas variedades de caña de azúcar en Guatemala que contribuyan a aumentar la productividad incrementando la variabilidad genética que no es elevada en este cultivo. Para ello se ha evaluado la diversidad genética en una población de 204 variedades de uso potencial como parentales, utilizando tres marcadores moleculares, CV29, CV37 y CV38 que mostraron un contenido de información polimórfica (PIC) medio de 0,37 lo cual indica que fueron capaces de identificar polimorfismos en la población. Tras calcular la similitud genética entre las variedades y en base a ella, se organizaron en 20 grupos. Por otra parte se utilizó el marcador Bru1 asociado a la resistencia de una enfermedad de origen fúngico conocida como Roya Marrón para analizar 303 variedades (incluidas las 204 anteriores), 77 de las cuales amplificaron el marcador. La comparación con datos fenotípicos registrados durante 4 años en dos localidades confirmó que estas 77 variedades eran resistentes. Sin embargo, de las variedades que no amplificaron el alelo de resistencia, solo un 7 % se mostraron susceptibles, lo que indica la posible presencia en estas variedades de otro alelo de resistencia distinto. Con la información anterior se diseñaron y realizaron 22 cruzas cuyas descendencias F1 fueron evaluadas durante dos años consecutivos registrando el promedio de cada familia para características como brix (%), altura de planta, diámetro de tallo, número de tallos por metro e incidencia de las principales enfermedades. Se obtuvieron 18 familias con brix igual o superior a la variedad control CP72-2086, lo que indica que podrían superar su rendimiento de azúcar como consecuencia del mayor contenido de azúcar en sus tallos, aunque no la superen en rendimiento de caña. De estos ensayos se han seleccionado cruzas en las que se ha obtenido tolerancia para distintas enfermedades y un buen brix (%) superior a la variedad control. En este trabajo también se ha comparado la metodología DBIA (Dot Blot Immunoassay) y PCR para diagnosticar la presencia de Xantomonas albilineans y la amplificación de cDNA del RNA vírico para determinar la presencia del virus de la hoja amarilla (SCYLV). Se ha llevado a cabo un muestreo aleatorio para detectar la incidencia de estos patógenos detectando plantas infectadas que no mostraban ninguna sintomatología y, tras la secuenciación de muestras de X. albilineans, se ha confirmado la presencia en Guatemala de al menos dos variantes. También se ha comparado distintos tratamientos térmicos combinados o no con cultivo de meristemos para el saneamiento de plantas infectadas siendo el cultivo de meristemos más adecuado para materiales infectados con la bacteria y la termoterapia suficiente para la obtención de plantas libres de SCYLV. Por último, la obtención de materiales saneados, nos condujo a plantear su conservación y micropropagación utilizando técnicas de cultivo in vitro. Las plantas saneadas y comprobadas como libres de virus se mantienen in vitro a una temperatura de 18oC. Se han evaluado también distintos factores que pueden influir en la regeneración adventicia a partir de explantes de hoja, entre ellos, el genotipo, posición del explante, combinaciones de reguladores de crecimiento en el medio de inducción y tipo de auxina para el enraizamiento de las plantas. Se ha visto un claro efecto del genotipo, de la posición del explante y de la concentración y tipo de algunos reguladores de crecimiento tanto en los porcentajes de inducción como en el posterior desarrollo de las plantas. Se han obtenido en las mejores combinaciones hasta 32 plantas por explante. Los protocolos desarrollados son de gran interés para incrementar las tasas de multiplicación del material saneado o utilizarlos en un futuro para la mejora biotecnológica de la caña mediante transformación genética. / [CAT] L'objectiu principal d'aquest treball es centra a l'aprofitament d' la biotecnología per al desenvolupament de noves varietats de canya més productives i a l'hora amb més variabilitat genética que és escasa en aquest cultiu. En primer lloc, s'ha avaluat la diversitat genètica en una població de 204 varietats de potencial us com a parentals. S'han utilitzat tres marcadores moleculars, CV29, CV37 i CV38 que mostraren un contingut d'informació polimòrfica (PIC) de 0,37 en promedi, la cual cosa indica que es varen identificar polimorfismes a la población en estudi. Es va calcular la similitud genètica entre les varietats i en base a ella, s'obingueren 20 agrupaments. D'un altra banda va utilitzar-se el marcador Bru1 associat a la resistència d'una enfermetat d'origen fúngic coneguda com Roya Marró per a genotipar 303 varietats (que incloïen les 204 d'avans) i, en 77, es va amplificar el esmentat marcador. La comparació amb dades fenotípiques registrades durant 4 anys en dues localitats va confirmar que les 77 varietats eren resistents però no totes aquelles que en les que no s'havia observat amplificació eren susceptibles, de fet, tan sols un 7 % ho eren. Aquest resultat és indicatiu de la possible presencia d'un altre alel de resistència diferent a Bru1. Amb la informació obtesa es disenyaren i realitzaren 22 creuaments i les descendencies F1 es van analitzar en dues anualitats registrant dades relacionades amb el rendiment en sucre: brix (%), altura de planta, diàmetre de la tija, nombre de tiges per metre i l'incidencia de las principals enfermetats que afecten a aquest cultiu. S'obtingueren 18 families amb brix equivalent o superior a la varietat control CP72-2086, que podrien superar el rendiment en sucre, encara que no la superen en rendiment en canya. En aquest treball s'han sel.leccionat creuaments que han mostrat tolerancia a diferents enfermetats i un bon brix (%) superior a la varietat control. Un altre problema comú al cultiu de la canya és la propagació vegetativa a partir de plantes infectades amb patògens que s'hi troben en estat de latencia. En aquest treball s'ha comparat la DBIA (Dot Blot Immunoassay) i la PCR per a diagnosticar la presència de Xantomonas albilineans i s'ha utilitzat l'amplificació de cDNA del RNA víric per determinar la presencia del virus de la fulla groga (SCYLV). S'ha fet un anàlisi aleatori en diferents zones de cultiu per a determinar la incidencia d'aquestos patògens detectant-se plantes infectades que no mostraven síntomes. La sequenciació de mostres de X. albilineans, ha confirmat també la presència a Guatemala de al menys dues variants del bacteri. També s'han comparat diferents tractaments tèrmics en combinació o no de cultiu de meristems per obtenir plantes sanejades sent el cultiu de meristems més adecuat en el cas del bacteri i la termoterapia suficient per a la virosi. L'obtenció de materials sanejats ens va portar a plantejar la seua conservació en cultiu in vitro. Les plantes sanejades es mantenen a una temperatura de 18oC. També en aquest contexte, s'han avaluat diferents factors que poden influenciar amb la regeneració adventicia a partir de segments de fulla, entre ells: el genotip, la posició de l'explant a la planta, les combinacions de reguladors de creixement, i el tipus d'auxina per enrailar les plantes. S'ha vist un marcat efecte del genotip, de la posició de l'explant i de la contcentració d'alguns reguladors de creixement tant en els porcentajes d'inducció com en el posterior desenvolupament de les plantes. S' ha obtés en la millor combinació fins a 32 plantes per explant. Els protocols de regeneració adventicia que s'han desenvolupat són de gran interés per a incrementar la multiplicació del material sanejat aixi com per a utilitzarlos en un futur per a la millora biotecnològica de la canya mitjançant la transformació genètica. / Molina Monterroso, LG. (2016). Desarrollo y aplicación de técnicas biotecnológicas para la caracterización, selección y mejoramiento genético de la caña de azúcar en Guatemala [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63252 / TESIS

?-glucosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glucosídicas ?-1,4, ?-1,3 e ?-1,6 a partir da extremidade não redutora de oligossacarídeos de cadeias pequenas, alquil e aril ?-D-glucosídeos e dissacarídeos. Além de serem enzimas chave do complexo celulolítico, apresentam funções importantes como o melhoramento de aromas de vinhos e a hidrólise de antocianinas. Malbranchea pulchella usualmente é encontrado em fragmentos vegetais em decomposição ou material rico em celulose, podendo ser considerado promissor à produção de enzimas de interesse biotecnológico. Neste contexto, o objetivo desse projeto foi a caracterização funcional de uma ?-glucosidase de M. pulchella e sua aplicação na hidrólise de resíduos agroindustriais e de antocianinas. Uma BGL da família GH3 foi purificada com um fator de purificação 6,32 e recuperação de aproximadamente 35 %. A sua massa molecular aproximado foi de 100 kDa, e o Km, Vmáx e Kcat foram calculadas em 0,33 mM, 13,67 U/mg, 26,5 s-1 respectivamente. O dicroísmo circular revelou uma estrutura composta por aproximadamente 25% de ?-hélices e 20% de ?-folhas. A BGL apresentou pH e temperatura ótimos igual a 6,0 e 50 °C; e foi estável a 40 °C e apresentou boa estabilidade nos pH 5,0 a 8,0, por 24 horas. Nenhum dos sais de íons metálicos ativou a enzima e apenas o HgCl2 inibiu a atividade em 90%. A enzima não apresentou inibição em presença de glucose (0,1-1M) por até 24 horas. Além disso, a GH3 mostrou-se glicosilada e a proporção de açúcar corresponde a 15% massa da enzima. O efeito da celobiose (C) e do bagaço de cana-de-açúcar in natura (BCAN) na produção das BGLs foram avaliados em um DCCR, que indicou um modelo reduzido com influência das duas variáveis. A melhor condição de cultivo para a produção de BGLs foi 0,6% de C (p/v) e 4% de BCAN (p/v). Por meio de um planejamento de mistura, os resíduos BCAN, a casca de soja moída (CS) e o bagaço de cevada (BCev), foram avaliados quanto ao potencial de hidrólise a partir das enzimas presentes no extrato enzimático, resultando no maior potencial de hidrólise sobre o BCev, com a produção de aproximadamente 2 mg/mL de açúcares redutores em 48 horas. As BGLs presentes no extrato enzimático otimizado foram imobilizadas em suporte MANAE-agarose, Concanavalina A-Sepharose e BrCN-Sepharose. Os derivados BGL-MANAE e BGL-ConA foram ativados aproximadamente 10 e 3 vezes, respectivamente. BGL-MANAE e BGL-ConA foram mais estáveis que o controle BGLBrCN em todos os pH testados em 24 horas e, além disso, BGL-ConA permaneceu com 100% de sua atividade em temperaturas de 40 °C, 50 °C e 60 °C, já o BGL-MANAE mostrou-se estável a 40 °C permanecendo com 83% de sua atividade, ambos em 24 horas. BGL-MANAE e BGL-ConA apresentaram menor efeito inibitório em presença de diferentes concentrações de glucose e etanol quando comparados ao BGL-BrCN, e esses resultados indicaram que a imobilização de alguma forma colaborou para uma maior estabilidade ao pH e à temperatura, bem como ao aumento da tolerância por glucose e etanol. Os derivados puderam ser reutilizados por até 20 vezes e quando avaliados quanto à capacidade de clarificar vinhos e sucos de uva (hidrólise de antocianinas), BGL-MANAE clarificou 52% o vinho, 71% o vinho diluído, 77% o suco de uva e 56% o suco de uva diluído, e BGL-ConA em contrapartida clarificou 41% o vinho, 46% o vinho diluído, 63% o suco de uva e 23% o suco de uva diluído. BGL-MANAE foi mais eficiente que BGL-ConA na clarificação de vinhos e sucos de uva podendo ser considerado um biocatalisador promissor na hidrólise de antocianinas e, consequentemente, para a produção de vinhos brancos e rose a partir de diferentes variedades de uvas. Este trabalho pelo que sabemos, é o primeiro a usar BGLs imobilizadas com aplicação na clarificação de sucos de uva e vinhos, podendo ser considerado um trabalho inovador, e de grande importância para a indústria de alimentos e bebidas. / ?-glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of ?-1,4, ?-1,3 and ?-1,6 glucosidic linkages, from the non-reducing end of short chain oligosaccharides, alkyl and aryl ?-D-glucosides and disaccharides. Besides being complex key cellulolytic enzymes, they have important functions such as the improvement of wine flavors and anthocyanins hydrolysis. Malbranchea pulchella is usually found in decaying plant debris or in material rich in cellulose, for this reason it can be considered promising for the production of enzymes of biotechnological interest. In this context, the aim of this project was the functional characterization of a ?-glucosidase from M. pulchella and its application in the organic residues and anthocyanins hydrolysis. A BGL GH3 family produced by M. pulchella was purified with a purification factor and recovery of about 6.32 and 35 times. Its approximate molecular mass was 100 kDa, and Km, Vmax and kcat were 0.33 mM, 13.67 U/mg, 26.5 s-1, respectively. The circular dichroism revealed a structure composed of approximately 25% of ?-helix and 20% of ?-sheets. BGL presented optimum pH and temperature at 6.0 and 50 °C; and it was stable at 40 °C. It also showed good stability at pH 5.0 to 8.0, for 24 hours. None of the metal ions salts activated the enzyme and HgCl2 inhibited the activity by 90%. The enzyme showed no inhibition in the presence of glucose (0,1-1M) for 24 hours. Furthermore, it is glycosylated and the sugar proportion correspondsto 15% of the enzyme mass. The effect of cellobiose (C) and sugarcane bagasse in natura (BCAN) in the production of BGLs were evaluated in a CCRD, which indicated a reduced model of influence of the two variables. The best culture condition for BGLs production was 0.6% of C (w/v) and 4% (w/v) of BCAN. Through a mixture design, using the BCAN, ground soybean hulls (CS) and barley bagasse (BCev) were used to evaluate the potential of hydrolysis of these residues in the presence of enzymes present in the enzymatic extract, resulting in a greater efficiency of (BCev) hydrolysis, producing approximately 2 mg/mL of reducing sugars in 48 hours. The BGLs present in the optimized enzyme extract were also used in the immobilization on ionic support MANAE-agarose and affinity support Concanavalin A-Sepharose (ConA-Sepharose). The BGL-MANAE and BGL-ConA derivatives were activated approximately 10 and 3 times, respectively. BGL-MANAE and BGL-ConA were more stable than BGL-BrCN control in all pH tested within 24 hours. In addition, BGL-ConA remained 100% of its activity at 40 °C, 50 °C and 60 °C , and BGL-MANAE was stable at 40 °C and remained 83% of its activity, both in 24 hours. BGL-MANAE and BGL-ConA showed lower inhibitory effect in the presence of different glucose and ethanol concentrations when compared to BGL-BrCN and these results indicate that the immobilization, somehow, cooperated to a greater pH and temperature stability, as well as to increased tolerance by glucose and ethanol. The derivatives could be reused up to 20 times and when they were tested for their capacity to clarify wine and grape juice (anthocyanins hydrolysis), BGL-MANAE clarified 52% wine, 71% diluted wine, 77% grape juice and 56% diluted grape juice. On the other hand, BGL-ConA clarified 41% wine, 46% diluted wine, 63% grape juice and 23% diluted grape juice. BGL-MANAE was more efficient than BGL-ConA in clarifying wines and grape juices and it may be considered a promising biocatalyst in the anthocyanins hydrolysis, and consequently in the production of white and rose wines from different varieties of grapes. This work as we know, is the first to use immobilized BGLs applied in the clarification of grape juice and wine, for this reason, it can be considered an innovative work, and of great importance to the food and beverage industry

?-glucosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glucosídicas ?-1,4, ?-1,3 e ?-1,6 a partir da extremidade não redutora de oligossacarídeos de cadeias pequenas, alquil e aril ?-D-glucosídeos e dissacarídeos. Além de serem enzimas chave do complexo celulolítico, apresentam funções importantes como o melhoramento de aromas de vinhos e a hidrólise de antocianinas. Malbranchea pulchella usualmente é encontrado em fragmentos vegetais em decomposição ou material rico em celulose, podendo ser considerado promissor à produção de enzimas de interesse biotecnológico. Neste contexto, o objetivo desse projeto foi a caracterização funcional de uma ?-glucosidase de M. pulchella e sua aplicação na hidrólise de resíduos agroindustriais e de antocianinas. Uma BGL da família GH3 foi purificada com um fator de purificação 6,32 e recuperação de aproximadamente 35 %. A sua massa molecular aproximado foi de 100 kDa, e o Km, Vmáx e Kcat foram calculadas em 0,33 mM, 13,67 U/mg, 26,5 s-1 respectivamente. O dicroísmo circular revelou uma estrutura composta por aproximadamente 25% de ?-hélices e 20% de ?-folhas. A BGL apresentou pH e temperatura ótimos igual a 6,0 e 50 °C; e foi estável a 40 °C e apresentou boa estabilidade nos pH 5,0 a 8,0, por 24 horas. Nenhum dos sais de íons metálicos ativou a enzima e apenas o HgCl2 inibiu a atividade em 90%. A enzima não apresentou inibição em presença de glucose (0,1-1M) por até 24 horas. Além disso, a GH3 mostrou-se glicosilada e a proporção de açúcar corresponde a 15% massa da enzima. O efeito da celobiose (C) e do bagaço de cana-de-açúcar in natura (BCAN) na produção das BGLs foram avaliados em um DCCR, que indicou um modelo reduzido com influência das duas variáveis. A melhor condição de cultivo para a produção de BGLs foi 0,6% de C (p/v) e 4% de BCAN (p/v). Por meio de um planejamento de mistura, os resíduos BCAN, a casca de soja moída (CS) e o bagaço de cevada (BCev), foram avaliados quanto ao potencial de hidrólise a partir das enzimas presentes no extrato enzimático, resultando no maior potencial de hidrólise sobre o BCev, com a produção de aproximadamente 2 mg/mL de açúcares redutores em 48 horas. As BGLs presentes no extrato enzimático otimizado foram imobilizadas em suporte MANAE-agarose, Concanavalina A-Sepharose e BrCN-Sepharose. Os derivados BGL-MANAE e BGL-ConA foram ativados aproximadamente 10 e 3 vezes, respectivamente. BGL-MANAE e BGL-ConA foram mais estáveis que o controle BGLBrCN em todos os pH testados em 24 horas e, além disso, BGL-ConA permaneceu com 100% de sua atividade em temperaturas de 40 °C, 50 °C e 60 °C, já o BGL-MANAE mostrou-se estável a 40 °C permanecendo com 83% de sua atividade, ambos em 24 horas. BGL-MANAE e BGL-ConA apresentaram menor efeito inibitório em presença de diferentes concentrações de glucose e etanol quando comparados ao BGL-BrCN, e esses resultados indicaram que a imobilização de alguma forma colaborou para uma maior estabilidade ao pH e à temperatura, bem como ao aumento da tolerância por glucose e etanol. Os derivados puderam ser reutilizados por até 20 vezes e quando avaliados quanto à capacidade de clarificar vinhos e sucos de uva (hidrólise de antocianinas), BGL-MANAE clarificou 52% o vinho, 71% o vinho diluído, 77% o suco de uva e 56% o suco de uva diluído, e BGL-ConA em contrapartida clarificou 41% o vinho, 46% o vinho diluído, 63% o suco de uva e 23% o suco de uva diluído. BGL-MANAE foi mais eficiente que BGL-ConA na clarificação de vinhos e sucos de uva podendo ser considerado um biocatalisador promissor na hidrólise de antocianinas e, consequentemente, para a produção de vinhos brancos e rose a partir de diferentes variedades de uvas. Este trabalho pelo que sabemos, é o primeiro a usar BGLs imobilizadas com aplicação na clarificação de sucos de uva e vinhos, podendo ser considerado um trabalho inovador, e de grande importância para a indústria de alimentos e bebidas. / ?-glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of ?-1,4, ?-1,3 and ?-1,6 glucosidic linkages, from the non-reducing end of short chain oligosaccharides, alkyl and aryl ?-D-glucosides and disaccharides. Besides being complex key cellulolytic enzymes, they have important functions such as the improvement of wine flavors and anthocyanins hydrolysis. Malbranchea pulchella is usually found in decaying plant debris or in material rich in cellulose, for this reason it can be considered promising for the production of enzymes of biotechnological interest. In this context, the aim of this project was the functional characterization of a ?-glucosidase from M. pulchella and its application in the organic residues and anthocyanins hydrolysis. A BGL GH3 family produced by M. pulchella was purified with a purification factor and recovery of about 6.32 and 35 times. Its approximate molecular mass was 100 kDa, and Km, Vmax and kcat were 0.33 mM, 13.67 U/mg, 26.5 s-1, respectively. The circular dichroism revealed a structure composed of approximately 25% of ?-helix and 20% of ?-sheets. BGL presented optimum pH and temperature at 6.0 and 50 °C; and it was stable at 40 °C. It also showed good stability at pH 5.0 to 8.0, for 24 hours. None of the metal ions salts activated the enzyme and HgCl2 inhibited the activity by 90%. The enzyme showed no inhibition in the presence of glucose (0,1-1M) for 24 hours. Furthermore, it is glycosylated and the sugar proportion correspondsto 15% of the enzyme mass. The effect of cellobiose (C) and sugarcane bagasse in natura (BCAN) in the production of BGLs were evaluated in a CCRD, which indicated a reduced model of influence of the two variables. The best culture condition for BGLs production was 0.6% of C (w/v) and 4% (w/v) of BCAN. Through a mixture design, using the BCAN, ground soybean hulls (CS) and barley bagasse (BCev) were used to evaluate the potential of hydrolysis of these residues in the presence of enzymes present in the enzymatic extract, resulting in a greater efficiency of (BCev) hydrolysis, producing approximately 2 mg/mL of reducing sugars in 48 hours. The BGLs present in the optimized enzyme extract were also used in the immobilization on ionic support MANAE-agarose and affinity support Concanavalin A-Sepharose (ConA-Sepharose). The BGL-MANAE and BGL-ConA derivatives were activated approximately 10 and 3 times, respectively. BGL-MANAE and BGL-ConA were more stable than BGL-BrCN control in all pH tested within 24 hours. In addition, BGL-ConA remained 100% of its activity at 40 °C, 50 °C and 60 °C , and BGL-MANAE was stable at 40 °C and remained 83% of its activity, both in 24 hours. BGL-MANAE and BGL-ConA showed lower inhibitory effect in the presence of different glucose and ethanol concentrations when compared to BGL-BrCN and these results indicate that the immobilization, somehow, cooperated to a greater pH and temperature stability, as well as to increased tolerance by glucose and ethanol. The derivatives could be reused up to 20 times and when they were tested for their capacity to clarify wine and grape juice (anthocyanins hydrolysis), BGL-MANAE clarified 52% wine, 71% diluted wine, 77% grape juice and 56% diluted grape juice. On the other hand, BGL-ConA clarified 41% wine, 46% diluted wine, 63% grape juice and 23% diluted grape juice. BGL-MANAE was more efficient than BGL-ConA in clarifying wines and grape juices and it may be considered a promising biocatalyst in the anthocyanins hydrolysis, and consequently in the production of white and rose wines from different varieties of grapes. This work as we know, is the first to use immobilized BGLs applied in the clarification of grape juice and wine, for this reason, it can be considered an innovative work, and of great importance to the food and beverage industry

Biotechnological and genetic patents: legal and ethical approachBiotechnology’s entry to patentable inventions field and ethical questions generated are studied from the analysis between moral and legal order relationship. There are several cases where standards concerning patents came into conflict with public order idea or moral concerns, such as human cloning processes or genetic identity modification of human beings or animals. Among these problems, patenting of human genetic material is pointed out. Different views on the issue are carefully analyzed; this piece of writing a does not pretend to close the debate but to expose the key points involved. / Desde el análisis de la relación entre moral y orden jurídico, se analiza el ingreso de la biotecnología al campo de las invenciones patentables y los cuestionamientos éticos que ha generado. Varios son los casos en los que las normas relativas a las patentes fueron colisionando con la concepción de orden público o la moral, como, por ejemplo, los procedimientos de clonación humana o de modificación de identidad genética de humanos o animales. Entre estos problemas destaca el referente al patentabilidad del material genético humano. Las posiciones sobre el tema son expuesta con detenimiento y el artículo no pretende cerrar el debate, sino exponer sus aspectos más importantes.

Neste trabalho, avaliaram-se o crescimento e a capacidade de biosorção de metais de Pleurotus sajor-caju PS 2001, em meios de cultivo líquido e sólido, contendo sulfatos de cobre II, de ferro II, de alumínio, de zinco, de cromo II e de níquel II, em concentrações de 30 ou 60mg.100mL-1 . O crescimento e a massa micelial foram avaliados aos 7, 14 e 21 dias de desenvolvimento para cultivo líquido sendo que para cada etapa de desenvolvimento foram retiradas amostras que foram submetidas a metodologia PIXE para determinação da biosorção dos elementos presentes nas amostras. No cultivo sólido, após 21 dias forampara os corpos de frutificação dos cultivos sólidos. Para cada etapa de de do trabalho desenvolveu-se um método que se mostrou adequado para quantificar indiretamente a massa fúngica. Os diferentes tratamentos foram propostos seguindo o método de análise de superfície de Box-Wilson, possibilitou a otimização do meio de crescimento ao indicar que adições de sais nas concentrações variáveis presentes nos fermentadores e aplicadas nos tratamentos otimizados de T1 até T5, correspondentes a (NH4)2SO4: T1 = 20,50mg a T5 = 24,48mg; MnSO4: T1 = 0,0235mg T5 = 0,0275mg e CuSO4.5 H2O : T1 = 0,024mg a T5 = 0,030mg, possibilitaram um aumento de até três vezes da massa fúngica de P. sajor-caju, nos primeiros 15 dias de crescimento, em relação aos meios sem adição. Os diferentes tratamentos também apresentaram variação favorável para a secreção das enzimas lacases que tiveram sua produção aumentada em valores de 75% até 200%; a secreção das enzimas manganês peroxidases apresentaram aumento variável de 25% até 90%, indicando que as variações nas adições dos sais empregados nos tratamentos originaram diferentes valores para as secreções enzimáticas. Adicionalmente, constatou-se que a adição de sulfato de cromo III e sulfato de níquel II aos meios de cultivo na ordem de 9,41 mg/ favorece a produção de massa fúngica, bem como a secreção de lacases e manganês peroxidases. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-19T16:54:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Stela Maris da Silva.pdf: 1824607 bytes, checksum: 1e6abbbc92abcf6cd0bba5a861e37b93 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-19T16:54:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Stela Maris da Silva.pdf: 1824607 bytes, checksum: 1e6abbbc92abcf6cd0bba5a861e37b93 (MD5) / In this work, Pleurotus sajor-caju PS2001 was cultivated in solid-state, in a medium formulated with sawdust of Pinus spp and wheat bran, to which had been added cupric sulphate, manganese sulphate and ammonium sulphate. Different treatments had been made with these salts, aiming at the solid cultive medium otimization for attainment of bigger productivity in the commercial production of mushrooms. In the first stage of the work a method was developed that was adequate to quantify indirectly the fungi mass indirectly. This method was based on the amount of chitin of the fungi wall which was estimated by the evaluation of the free N-acetilglucosamine concentration released for enzymatic hydrolysis. Different treatments had been considered following the methodology of Box-Wilson, who indicated the amounts of salts ideals to the medium, which allowed an increase of up to three times in the content of fungus mass during the first 15 days of growth. The treatments had also shown to favorable variation for the secretion of lacases and manganese peroxidases, indicating the potential use of these mushrooms also for the production of these enzymes and purpose of biorremediation. Additionally, one evidenced that the phenol addition to the cultive medium favors the production of fungus mass as well as the secretion of lacases and manganese peroxidases.

Neste trabalho, avaliaram-se o crescimento e a capacidade de biosorção de metais de Pleurotus sajor-caju PS 2001, em meios de cultivo líquido e sólido, contendo sulfatos de cobre II, de ferro II, de alumínio, de zinco, de cromo II e de níquel II, em concentrações de 30 ou 60mg.100mL-1 . O crescimento e a massa micelial foram avaliados aos 7, 14 e 21 dias de desenvolvimento para cultivo líquido sendo que para cada etapa de desenvolvimento foram retiradas amostras que foram submetidas a metodologia PIXE para determinação da biosorção dos elementos presentes nas amostras. No cultivo sólido, após 21 dias forampara os corpos de frutificação dos cultivos sólidos. Para cada etapa de de do trabalho desenvolveu-se um método que se mostrou adequado para quantificar indiretamente a massa fúngica. Os diferentes tratamentos foram propostos seguindo o método de análise de superfície de Box-Wilson, possibilitou a otimização do meio de crescimento ao indicar que adições de sais nas concentrações variáveis presentes nos fermentadores e aplicadas nos tratamentos otimizados de T1 até T5, correspondentes a (NH4)2SO4: T1 = 20,50mg a T5 = 24,48mg; MnSO4: T1 = 0,0235mg T5 = 0,0275mg e CuSO4.5 H2O : T1 = 0,024mg a T5 = 0,030mg, possibilitaram um aumento de até três vezes da massa fúngica de P. sajor-caju, nos primeiros 15 dias de crescimento, em relação aos meios sem adição. Os diferentes tratamentos também apresentaram variação favorável para a secreção das enzimas lacases que tiveram sua produção aumentada em valores de 75% até 200%; a secreção das enzimas manganês peroxidases apresentaram aumento variável de 25% até 90%, indicando que as variações nas adições dos sais empregados nos tratamentos originaram diferentes valores para as secreções enzimáticas. Adicionalmente, constatou-se que a adição de sulfato de cromo III e sulfato de níquel II aos meios de cultivo na ordem de 9,41 mg/ favorece a produção de massa fúngica, bem como a secreção de lacases e manganês peroxidases. / In this work, Pleurotus sajor-caju PS2001 was cultivated in solid-state, in a medium formulated with sawdust of Pinus spp and wheat bran, to which had been added cupric sulphate, manganese sulphate and ammonium sulphate. Different treatments had been made with these salts, aiming at the solid cultive medium otimization for attainment of bigger productivity in the commercial production of mushrooms. In the first stage of the work a method was developed that was adequate to quantify indirectly the fungi mass indirectly. This method was based on the amount of chitin of the fungi wall which was estimated by the evaluation of the free N-acetilglucosamine concentration released for enzymatic hydrolysis. Different treatments had been considered following the methodology of Box-Wilson, who indicated the amounts of salts ideals to the medium, which allowed an increase of up to three times in the content of fungus mass during the first 15 days of growth. The treatments had also shown to favorable variation for the secretion of lacases and manganese peroxidases, indicating the potential use of these mushrooms also for the production of these enzymes and purpose of biorremediation. Additionally, one evidenced that the phenol addition to the cultive medium favors the production of fungus mass as well as the secretion of lacases and manganese peroxidases.

Cleome dendroides é uma espécie endêmica da Mata Atlântica dos estados do Rio de Janeiro e Espírito Santo, bioma alterado por intensa atividade antrópica, o que constitui uma ameaça à preservação de suas populações. Não existem estudos dos pontos de vista fisiológico, biotecnológico, fitoquímico ou farmacológico sobre a espécie. Considerando-se o perfil fitoquímico e o potencial medicinal do gênero, torna-se relevante definirem-se protocolos para a produção de plantas e metabólitos de C. dendroides utilizando diferentes sistemas de cultivo in vitro. No presente trabalho, foram realizados estudos sobre a germinação in vivo da espécie, avaliando-se a influência do substrato, temperatura e luz. Não se observou qualquer tipo de dormência, sendo as temperaturas de 20, 25 e 20-30C, em areia ou vermiculita, apropriadas para a germinação in vivo. Definiu-se também uma metodologia eficiente de germinação sob condições in vitro, e as plântulas obtidas foram utilizadas como fonte de explantes para os estudos de propagação in vitro. A resposta morfogênica foi avaliada considerando-se a origem e tipo do explante, tipos e concentrações de reguladores de crescimento e número de subculturas. A metodologia empregada mostrou-se eficiente para a produção de brotos e manutenção de estoques de plantas in vitro que serviram como fonte de explantes. A melhor condição para a propagação in vitro foi definida em meio solidificado contendo BA, independentemente do tipo de explante e da origem. Os brotos obtidos foram alongados, enraizados e aclimatizados. Também foi estabelecida a cultura de raízes e a regeneração de brotos a partir destas culturas. Avaliou-se o efeito da origem do explante, assim como dos tipos e concentrações de fitorreguladores sobre a proliferação de raízes e a regeneração de brotos. O fitorregulador AIB propiciou maior multiplicação das raízes, enquanto BA mostrou-se eficiente na regeneração de brotos a partir das raízes recém-formadas. Foi estabelecido ainda um protocolo de cultura de calos e de suspensões celulares. Avaliou-se o efeito da origem e do tipo de explante, dos tipos e das concentrações de fitorreguladores sobre a calogênese. A combinação de PIC com KIN foi a mais eficiente para a indução de calos em explantes de plântulas obtidas a partir de germinação in vitro, produzindo calos que foram mantidos por pelo menos dois anos. As suspensões celulares também foram estabelecidas em meio contendo PIC + KIN, mantendo uma produção de biomassa de cerca de cinco vezes o peso fresco inicial por três sucessivas subculturas. Análises histoquímicas e fitoquímicas revelaram a presença de alcaloides nos calos e nas suspensões celulares. Foram realizadas análises fitoquímicas de plantas de campo, plantas aclimatizadas, plantas mantidas em estoque in vitro e culturas de raízes, as quais indicaram a presença de derivados de glicosinolatos. Os resultados demonstraram a viabilidade de produção de material vegetal de C. dendroides por meio de métodos biotecnológicos e a produção in vitro de metabólitos de importância medicinal / Cleome dendroides is an endemic species of the Atlantic Forest of Rio de Janeiro and Espírito Santo states, biome changed by intense human activities that threaten its populations. There are no physiological, biotechnological, phytochemical or pharmacological studies of this specie. Considering the phytochemical profile and the medical potential of the genus, it becomes relevant to establish protocols for the production of plants and metabolites of C. dendroides using different in vitro culture systems. In this work, studies were performed on the in vivo germination of the species evaluating the influence of the substrate, temperature and light. There was no dormancy, and germination was achieved at 20, 25 and 20-30C, on sand or vermiculite substrates. An efficient methodology of germination under in vitro conditions was defined by comparing the different stages of post-seminal development with seedlings from germination under in vivo conditions. The plantlets obtained from the in vitro germination were used as a source of explants for in vitro propagation system. The morphogenic response was evaluated considering the source and type of explant, types and concentrations of growth regulators and number of subcultures. The methodology was efficient for the production of shoots and maintenance of in vitro plants. The best condition for in vitro propagation was using solidified medium supplemented with BA, regardless of the tested explants. The shoots were efficiently elongated, rooted and acclimatized. It was also established an efficient protocol for root culture and shoots regeneration from these cultures. The effect of source of explant, the types and growth regulator concentrations on the proliferation of roots and shoot regeneration was evaluated. IBA provided higher multiplication rates of the roots, whereas BA was effective in the regeneration of shoots from the newly formed roots. A protocol of callus culture and cell suspension culture was established. The effect of the origin and type of explant, the types and concentrations of growth regulators on callus formation was evaluated. PIC + KIN was the most efficient combination for callus induction from explants derived from in vitro germinated seedlings. Callus cultures were maitained for at least two years. Cell suspension cultures were established with the same combination of growth regulators (PIC + KIN), maintaining a biomass of about five times the initial fresh weight of three successive subcultures. Histochemical and phytochemical analysis revealed the presence of alkaloids in callus and suspension cell cultures. Phytochemical analyses of field plants, acclimatization in vitro plant and culture roots were performed, which indicated the presence of glucosinolate derivatives. The results demonstrated the possibility of producing medicinal important metabolites from C. dendroides by biotechnological methods

Cleome dendroides é uma espécie endêmica da Mata Atlântica dos estados do Rio de Janeiro e Espírito Santo, bioma alterado por intensa atividade antrópica, o que constitui uma ameaça à preservação de suas populações. Não existem estudos dos pontos de vista fisiológico, biotecnológico, fitoquímico ou farmacológico sobre a espécie. Considerando-se o perfil fitoquímico e o potencial medicinal do gênero, torna-se relevante definirem-se protocolos para a produção de plantas e metabólitos de C. dendroides utilizando diferentes sistemas de cultivo in vitro. No presente trabalho, foram realizados estudos sobre a germinação in vivo da espécie, avaliando-se a influência do substrato, temperatura e luz. Não se observou qualquer tipo de dormência, sendo as temperaturas de 20, 25 e 20-30C, em areia ou vermiculita, apropriadas para a germinação in vivo. Definiu-se também uma metodologia eficiente de germinação sob condições in vitro, e as plântulas obtidas foram utilizadas como fonte de explantes para os estudos de propagação in vitro. A resposta morfogênica foi avaliada considerando-se a origem e tipo do explante, tipos e concentrações de reguladores de crescimento e número de subculturas. A metodologia empregada mostrou-se eficiente para a produção de brotos e manutenção de estoques de plantas in vitro que serviram como fonte de explantes. A melhor condição para a propagação in vitro foi definida em meio solidificado contendo BA, independentemente do tipo de explante e da origem. Os brotos obtidos foram alongados, enraizados e aclimatizados. Também foi estabelecida a cultura de raízes e a regeneração de brotos a partir destas culturas. Avaliou-se o efeito da origem do explante, assim como dos tipos e concentrações de fitorreguladores sobre a proliferação de raízes e a regeneração de brotos. O fitorregulador AIB propiciou maior multiplicação das raízes, enquanto BA mostrou-se eficiente na regeneração de brotos a partir das raízes recém-formadas. Foi estabelecido ainda um protocolo de cultura de calos e de suspensões celulares. Avaliou-se o efeito da origem e do tipo de explante, dos tipos e das concentrações de fitorreguladores sobre a calogênese. A combinação de PIC com KIN foi a mais eficiente para a indução de calos em explantes de plântulas obtidas a partir de germinação in vitro, produzindo calos que foram mantidos por pelo menos dois anos. As suspensões celulares também foram estabelecidas em meio contendo PIC + KIN, mantendo uma produção de biomassa de cerca de cinco vezes o peso fresco inicial por três sucessivas subculturas. Análises histoquímicas e fitoquímicas revelaram a presença de alcaloides nos calos e nas suspensões celulares. Foram realizadas análises fitoquímicas de plantas de campo, plantas aclimatizadas, plantas mantidas em estoque in vitro e culturas de raízes, as quais indicaram a presença de derivados de glicosinolatos. Os resultados demonstraram a viabilidade de produção de material vegetal de C. dendroides por meio de métodos biotecnológicos e a produção in vitro de metabólitos de importância medicinal / Cleome dendroides is an endemic species of the Atlantic Forest of Rio de Janeiro and Espírito Santo states, biome changed by intense human activities that threaten its populations. There are no physiological, biotechnological, phytochemical or pharmacological studies of this specie. Considering the phytochemical profile and the medical potential of the genus, it becomes relevant to establish protocols for the production of plants and metabolites of C. dendroides using different in vitro culture systems. In this work, studies were performed on the in vivo germination of the species evaluating the influence of the substrate, temperature and light. There was no dormancy, and germination was achieved at 20, 25 and 20-30C, on sand or vermiculite substrates. An efficient methodology of germination under in vitro conditions was defined by comparing the different stages of post-seminal development with seedlings from germination under in vivo conditions. The plantlets obtained from the in vitro germination were used as a source of explants for in vitro propagation system. The morphogenic response was evaluated considering the source and type of explant, types and concentrations of growth regulators and number of subcultures. The methodology was efficient for the production of shoots and maintenance of in vitro plants. The best condition for in vitro propagation was using solidified medium supplemented with BA, regardless of the tested explants. The shoots were efficiently elongated, rooted and acclimatized. It was also established an efficient protocol for root culture and shoots regeneration from these cultures. The effect of source of explant, the types and growth regulator concentrations on the proliferation of roots and shoot regeneration was evaluated. IBA provided higher multiplication rates of the roots, whereas BA was effective in the regeneration of shoots from the newly formed roots. A protocol of callus culture and cell suspension culture was established. The effect of the origin and type of explant, the types and concentrations of growth regulators on callus formation was evaluated. PIC + KIN was the most efficient combination for callus induction from explants derived from in vitro germinated seedlings. Callus cultures were maitained for at least two years. Cell suspension cultures were established with the same combination of growth regulators (PIC + KIN), maintaining a biomass of about five times the initial fresh weight of three successive subcultures. Histochemical and phytochemical analysis revealed the presence of alkaloids in callus and suspension cell cultures. Phytochemical analyses of field plants, acclimatization in vitro plant and culture roots were performed, which indicated the presence of glucosinolate derivatives. The results demonstrated the possibility of producing medicinal important metabolites from C. dendroides by biotechnological methods