A Paracoccidioidomicose é uma doença granulomatosa crônica que induz uma resposta inflamatória e imune específica. A participação do óxido nítrico (NO), produto da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), como uma importante molécula fungicida contra o fungo Paracoccidioides brasiliensis tem sido demonstrada. Com o objetivo de melhor caracterizar as lesões bucais da Paracoccidioidomicose e esclarecer a dinâmica da resposta imune neste sítio inflamatório, propusemo-nos a identificar e quantificar as células iNOS+, CD45RO+, CD3+, CD8+, CD20+, CD68+ e mastócitos em 20 amostras de Paracoccidioidomicose bucal (forma crônica) e 8 amostras de mucosa bucal clinicamente saudável (Controle) utilizando a técnica de imuno-histoquímica, por meio da imunoperoxidase. O número de fungos viáveis foi verificado em todas as amostras de Paracoccidioidomicose, e estas foram distribuídas em cinco grupos: 1 (1-50 fungos por mm2), 2 (51-100 fungos por mm2), 3 (101-200 fungos por mm2), 4 (201-400 fungos por mm2) e 5 (401-800 fungos por mm2). Nossos resultados demonstraram leve imunomarcação para iNOS em todos os aglomerados de células epitelióides e células gigantes multinucleadas (CGMN), bem como forte imunomarcação em escassas células mononucleares (MN) localizadas na periferia dos granulomas. Não foi observado significante aumento na proporção de células MN e CGMN iNOS+ nos grupos de Paracoccidioidomicose bucal quando comparados individualmente com o grupo Controle. Nossos resultados também demonstraram que, embora em baixo número, os polimorfonucleares neutrófilos (PMN) presentes nos granulomas e microabscessos são fortemente iNOS+. Adicionalmente, nosso estudo revelou similaridade no número de células CD4+ quando se considerava os grupos de amostras de Paracoccidioidomicose bucal com elevado número de fungos (grupos 4 e 5) e o grupo Controle. Nossos achados sugerem que a baixa expressão de iNOS por macrófagos e CGMN na Paracoccidioidomicose bucal e o pouco número de células CD4+ nas lesões com elevado número de fungos podem representar uma falha da ativação do sistema imune local, o que permitiu a multiplicação e disseminação do fungo e manutenção das lesões bucais ativas. / Paracoccidioidomycosis is a chronic granulomatous disease that induces a specific inflammatory and immune response. The participation of nitric oxide (NO), a product of the inducible nitric oxide synthase enzyme (iNOS), as an important fungicidal molecule against Paracoccidioides brasiliensis has been demonstrated. In order to further characterize the oral lesions of Paracoccidioidomycosis and elucidate the dynamics of the immune response occurring at the site of inflammation, iNOS+, CD45RO+ (active/memory T lymphocyte), CD3+ (T lymphocyte), CD8+ (cytolytic T lymphocyte), CD20+ (B lymphocyte) and CD68+ (macrophage) cells and mast cells were identified and quantified by immunohistochemistry in 20 samples of Oral Paracoccidioidomycosis (OP) and 8 clinically healthy oral tissues (Control), by means of immunoperoxidase. The number of viable fungi was verified in all OP samples, which were divided into five groups: 1 (1-50 yeast cells/mm2), 2 (51-100 yeast cells/mm2), 3 (101-200 yeast cells/mm2), 4 (201-400 yeast cells/mm2) and 5 (401-800 yeast cells/mm2). The results showed weak immunolabeling for iNOS in all aggregations of epithelioid and multinucleated giant cells (MNGC), as well as strong immunolabeling in scarce mononuclear (MN) cells located at the periphery of the granuloma. No significant increase was observed in the proportion of MN and MNGC iNOS+ cells in the OP groups when individually compared to the Control group. The results further demonstrated that, despite their low number, the polymorphonuclear neutrophils (PMN) found in the granulomas and micro-abscesses were strongly iNOS+ . Additionally, the investigation revealed similarity in the number of CD4+ cell between the OP groups with higher numbers of fungi (Groups 4 and 5) and the Control group. The findings suggest that low expression of iNOS by macrophages and MNGC in OP and the small number of CD4+ T cells in OP lesions with higher numbers of fungal cells may represent a failure of the local immune system, which allowed local fungal multiplication and maintenance of active oral lesions.

A Paracoccidioidomicose é uma doença granulomatosa crônica que induz uma resposta inflamatória e imune específica. A participação do óxido nítrico (NO), produto da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), como uma importante molécula fungicida contra o fungo Paracoccidioides brasiliensis tem sido demonstrada. Com o objetivo de melhor caracterizar as lesões bucais da Paracoccidioidomicose e esclarecer a dinâmica da resposta imune neste sítio inflamatório, propusemo-nos a identificar e quantificar as células iNOS+, CD45RO+, CD3+, CD8+, CD20+, CD68+ e mastócitos em 20 amostras de Paracoccidioidomicose bucal (forma crônica) e 8 amostras de mucosa bucal clinicamente saudável (Controle) utilizando a técnica de imuno-histoquímica, por meio da imunoperoxidase. O número de fungos viáveis foi verificado em todas as amostras de Paracoccidioidomicose, e estas foram distribuídas em cinco grupos: 1 (1-50 fungos por mm2), 2 (51-100 fungos por mm2), 3 (101-200 fungos por mm2), 4 (201-400 fungos por mm2) e 5 (401-800 fungos por mm2). Nossos resultados demonstraram leve imunomarcação para iNOS em todos os aglomerados de células epitelióides e células gigantes multinucleadas (CGMN), bem como forte imunomarcação em escassas células mononucleares (MN) localizadas na periferia dos granulomas. Não foi observado significante aumento na proporção de células MN e CGMN iNOS+ nos grupos de Paracoccidioidomicose bucal quando comparados individualmente com o grupo Controle. Nossos resultados também demonstraram que, embora em baixo número, os polimorfonucleares neutrófilos (PMN) presentes nos granulomas e microabscessos são fortemente iNOS+. Adicionalmente, nosso estudo revelou similaridade no número de células CD4+ quando se considerava os grupos de amostras de Paracoccidioidomicose bucal com elevado número de fungos (grupos 4 e 5) e o grupo Controle. Nossos achados sugerem que a baixa expressão de iNOS por macrófagos e CGMN na Paracoccidioidomicose bucal e o pouco número de células CD4+ nas lesões com elevado número de fungos podem representar uma falha da ativação do sistema imune local, o que permitiu a multiplicação e disseminação do fungo e manutenção das lesões bucais ativas. / Paracoccidioidomycosis is a chronic granulomatous disease that induces a specific inflammatory and immune response. The participation of nitric oxide (NO), a product of the inducible nitric oxide synthase enzyme (iNOS), as an important fungicidal molecule against Paracoccidioides brasiliensis has been demonstrated. In order to further characterize the oral lesions of Paracoccidioidomycosis and elucidate the dynamics of the immune response occurring at the site of inflammation, iNOS+, CD45RO+ (active/memory T lymphocyte), CD3+ (T lymphocyte), CD8+ (cytolytic T lymphocyte), CD20+ (B lymphocyte) and CD68+ (macrophage) cells and mast cells were identified and quantified by immunohistochemistry in 20 samples of Oral Paracoccidioidomycosis (OP) and 8 clinically healthy oral tissues (Control), by means of immunoperoxidase. The number of viable fungi was verified in all OP samples, which were divided into five groups: 1 (1-50 yeast cells/mm2), 2 (51-100 yeast cells/mm2), 3 (101-200 yeast cells/mm2), 4 (201-400 yeast cells/mm2) and 5 (401-800 yeast cells/mm2). The results showed weak immunolabeling for iNOS in all aggregations of epithelioid and multinucleated giant cells (MNGC), as well as strong immunolabeling in scarce mononuclear (MN) cells located at the periphery of the granuloma. No significant increase was observed in the proportion of MN and MNGC iNOS+ cells in the OP groups when individually compared to the Control group. The results further demonstrated that, despite their low number, the polymorphonuclear neutrophils (PMN) found in the granulomas and micro-abscesses were strongly iNOS+ . Additionally, the investigation revealed similarity in the number of CD4+ cell between the OP groups with higher numbers of fungi (Groups 4 and 5) and the Control group. The findings suggest that low expression of iNOS by macrophages and MNGC in OP and the small number of CD4+ T cells in OP lesions with higher numbers of fungal cells may represent a failure of the local immune system, which allowed local fungal multiplication and maintenance of active oral lesions.

FRUTUOSO, Mércia Sindeaux. Efeito adjuvante da lectina de Canavalia brasiliensis no tratamento de Leishmaniose cutânea experimental. 2016. 117 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T19:05:19Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) / Rejected by Jairo Viana (jairo@ufc.br), reason: Está faltando título em inglês on 2017-09-19T19:06:36Z (GMT) / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T19:07:21Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-19T19:08:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T19:08:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_msfrutuoso.pdf: 247932 bytes, checksum: dab45373eaaf1211d8520597a25ac2da (MD5) Previous issue date: 2017 / The leishmaniases are importante public health problem, comprising a very wide spectrum of clinical presentations. The host protection and cure, depend on his or her capacity to mount an imune response type Th1, and IFN-γ is a key molecule on this protective response. The drugs of first choice for the treatment are the pentavalent antimonials, which cause several side effects and the most concerning side effect is the cardiotoxic ones. On the search for alternative treatment, fluconazole has shown promising results, however it has to be given for a longer time and in higher doses to achieve a better response. The Canavalia brasiliensis lectin (ConBr) has been described as a potent immune modulator, as it induces lymphocytic proliferation, with the production of IFN-γ. Based on these data we studied, if ConBr would potentiate the effect of fluconazole on the treatment of experimental cutaneous leishmaniasis, caused by L. braziliensis. To evaluate this, BALB/c mices (n=40) were infected with L. braziliensis and were divide randomly 10 days post-infection, in 5 groups, with the following treatments: 1- fluconazole (30mg/Kg/day/10days, per os); 2- Glucantime® (60mg/Kg/day/10days, intramuscular); 3- ConBr (10μg/50μl/day/5days, intramuscular); 4- Fluconazole (30mg/Kg/day/10days, per os) plus ConBr (10μg/50μl/day/5days, intramuscular); 5- Saline solution per os. The parameters evaluated on the 200 day post infection were: the thickness of the lesion every third day; parasite load on the draining lymph node; production of IFN-γ, IL-10, and TGF-β in cell culture of the draining lymph node supernatant, stimulated in vitro with promastigotes of L. braziliensis; relative liver and spleen weight and histopathological analysis of the lesions. Animals that were treated with the association of fluconazole and ConBr, when compared with those treated with saline solution, presented a significant reduction on the parasite load on the draining lymph nodes (p=0,006), reduction in lesion size (p=0,03) and higher production of IFN-γ on the supernatant of cell culture of regional lymph nodes (p=0,03). Similar data were observed on the group treated with Glucantime®, and all together, demonstrate that the association of fluconazole and ConBr was capable of inducing a therapeutic response similar to the one seen in the group treated with Glucantime®, which is considered the gold standard in the treatment for leishmaniasis. / As leishmanioses constituem grande problema de saúde pública, compreendendo um amplo espectro de síndromes clínicas que pode ter manifestações diversas. Proteção e cura do hospedeiro se correlacionam com o desenvolvimento de resposta imune tipo Th1, e IFN-γ é considerada uma molécula chave nesta resposta protetora. A droga de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses é o antimonial pentavalente, que possui vários efeitos colaterais, especialmente seu efeito cardiotóxico. Na busca de novas alternativas de tratamento, o fluconazol vem apresentando dados promissores, porém necessita de um maior tempo de tratamento ou de doses mais elevadas para apresentar uma melhor resposta. A lectina de Canavalia brasilienses (ConBr) tem sido descrita como potente imunomodulador, pois induz proliferação linfocitária com produção de IFN-γ. Com base nesses dados, buscou-se avaliar se ConBr potencializaria o efeito do Fluconazol no tratamento da leishmaniose cutânea experimental por Leishmania (Viannia) braziliensis. Para isso, camundongos BALB/c (n=40) foram infectados com L. braziliensis e divididos aleatoriamente, após 10 dias de infecção, em cinco grupos, com os seguintes tratamentos: 1- Fluconazol (30mg/Kg/dia/10dias, por via oral); 2- Glucantime® (60mg/Kg/dia/10dias, por via intramuscular); 3- ConBr (10µg/50µl/dia/5dias, por via intramuscular); 4- Fluconazol (30mg/Kg/dia/10dias, por via oral) associado com ConBr (10µg/50µl/dia/5dias, intramuscular); 5- solução salina por via oral. Os parâmetros avaliados no 20o dia pós-infecção foram: a espessura das lesões a cada três dias; a carga parasitária no linfonodo de drenagem; secreção de IFN-γ, IL-10, TGF-β no sobrenadante de culturas de células do linfonodo de drenagem reestimulados in vitro com promastigotas de L. braziliensis; peso relativo do fígado e do baço e análise histopatológica das lesões. Os animais que foram tratados com a associação Fluconazol-ConBr, quando comparados com o grupo tratado com salina, apresentaram uma redução significativa da carga parasitária do linfonodo de drenagem (p=0,006), redução no tamanho da lesão (p=0,03) e maior síntese de IFN-γ no sobrenadante das culturas de células do linfonodo regional (p=0,03). Dados semelhantes foram observados no grupo tratado com Glucantime®, o que em conjunto, demonstra que a associação Fluconazol-ConBr foi capaz de induzir uma resposta terapêutica semelhante ao tratamento com Glucantime®, considerado padrão ouro.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-31Bitstream added on 2014-06-13T19:01:44Z : No. of bitstreams: 1 valerio_mja_dr_botfm.pdf: 1362288 bytes, checksum: 92bb90e388b3c540e45ec3f19d6b0e1d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Na paracoccidioidomicose, os estudos sobre os mecanismos de defesa do hospedeiro destacam o papel das células fagocitárias que participam ativamente dos mecanismos efetores diretos contra o fungo e da modulação da resposta inflamatória. Dentre essas células, nos últimos anos, os estudos têm se voltado para os neutrófilos, que exercem um importante papel efetor e modulador principalmente durante os estágios iniciais da infecção. As funções dessas células, incluindo as antimicrobicidas, podem ser reguladas por citocinas pró e anti-inflamatórias. Apesar dos mecanismos celulares e moleculares desse processo não estarem completamente entendidos, trabalhos nos últimos anos têm mostrado de forma bastante consistente o envolvimento dos “Toll Like Receptors” (TLRs). Neste contexto, os objetivos do presente trabalho foram: 1- Avaliar a expressão de TLR2 e TLR4 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a ou IFN-g e desafiados com cepa virulenta de Paracoccidioides brasiliensis cepa 18 (Pb18). 2- Avaliar a participação desses receptores na atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas: IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a, IFN-g e desafiados com Pb18. Nos ensaios referentes ao primeiro objetivo, as células foram tratadas por 18 horas com cada uma das citocinas ou LPS, posteriormente desafiadas com Pb 18 por 4 horas e avaliadas quanto a expressão de TLR2 e TLR4 por citometria de fluxo. Nos referentes ao segundo objetivo, as células foram ativadas com os mesmos estímulos, submetidas ao bloqueio de TLR2 e TLR4, através da incubação das células com anticorpos monoclonais específicos, desafiadas com Pb18 por 4 horas e analisadas quanto a atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10, por Elisa. Os resultados... / In paracoccidioidomycosis, phagocytic cells appear to provide one of the major lines of host defense. In this context, in last years, various studies have focused on the role of neutrophils that are involved in primary response to the fungus. Neutrophil functions are regulated by pro and anti-inflammatory cytokines. The molecular and cellular mechanisms involved in this process are not fully understood, but there are strong evidences about the involvement of “Toll Like Receptors” (TLRs). In this context, we aimed to evaluate TLR2 and TLR4 expression on human neutrophils primed with the cytokines GM-CSF, IL- 15, TNF-a or IFN-g and challenged with a virulent strain of Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Moreover, we asked if these receptors have a role on fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by primed and challenged cells. In first assays, neutrophils were incubated with each of cytokines or LPS by 18 h, challenged with Pb18 by 4 h and evaluated by TLR2 and TLR4 expression by flow cytometry. In other assays, cells were incubated with each of cytokines or LPS by 18h, submitted to TLR2 and TLR4 blocking by specific monoclonal antibodies, challenged with Pb18 for 4 h and evaluated for fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by ELISA. All cytokines increased TLR2 and TLR4 expression. Pb18 increased TLR2 expression inducing an additional effect to that of cytokines. On the contrary, it inhibited TLR4 expression. All cytokines increased neutrophils fungicidal activity, but this process was not associated with TLR2 or TLR4 expression. All cytokines and Pb18 increased H2O2 production, but in the same manner to fungicidal activity, the process was not associated to TLR2 or TLR4 expression. Neutrophils activation with GM-CSF and TNF-a resulted in a significative increase on IL-8... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-20Bitstream added on 2014-06-13T20:12:20Z : No. of bitstreams: 1 tavian_eg_me_botfm.pdf: 871930 bytes, checksum: 342b3c01d67e8458e6f2f4a552e5764b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A IL-15 é uma citocina próinflamatória produzida principalmente por monócitos e macrófagos em resposta a agentes infecciosos, desempenhando importante papel modulador na imunidade inata e adaptativa. No caso de infecções por microrganismos intracelulares como algumas bactérias, protozoários e fungos destaca-se o papel da IL-15 no mecanismo de ativação de monócitos/ macrófagos e neutrófilos, processo que representa um importante mecanismo de defesa já em períodos precoces da infecção durante o desenvolvimento da resposta imune inata. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da IL-15 sobre a atividade fungicida de neutrófilos humanos desafiados com cepa virulenta do P. brasiliensis (Pb 18). Adicionalmente, testamos se essa atividade seria mediada por produtos do metabolismo oxidativo como anion superóxido e H2O2 e se estaria associada a alterações nos níveis das citocinas IL-8 e TNF- alfa. Neutrófilos do sangue periférico de indivíduos saudáveis , foram incubados na ausência ou presença de IL-15 (12,5 a 250 ng/mL) por 18h a 370C em tensão de 5% de CO2, infectados com Pb 18 por 4h e avaliados quanto a atividade fungicida , produção de ânion superóxido, H2O2 e quantificação nos sobrenadantes das citocinas TNF-a e IL-8. A préincubação de neutrófilos com IL-15 induziu um aumento significativo na atividade fungicida dessas células de maneira dose dependente. Adicionalmente após a ativação, foi detectado um aumento na produção de 51 anion superóxido e H2O2 por essas células, sugerindo a participação desses metabólitos como moléculas efetoras da atividade fungicida. O desafio das células em presença de catalase, levou a uma diminuição significativa da atividade fungicida comprovando o papel da H2O2 nesse processo. No entanto, os níveis de... / Interleukin-15 is a cytokine produced by a wide range of different cell types, including macrophages in response to lipopolysaccharide or microbial infection. This cytokine may play a crucial role in the activation of phagocytic cells against pathogens, mainly during innate immune response. The effects of IL-15 on human polimorphonuclear leukocyte fungicidal activity against high virulent P. brasiliensis strain were investigated. Prétreatment with IL-15 for 18h, increased neutrophils fungicidal activity in a concentration dependent manner. In addition, exposure to IL-15 induced enhanced neutrophil oxidative burst evaluated by superóxide anion and H2O2 release. Catalase inhibits fungicidal activity confirming a role for H2O2 in fungus Killing. In contrast, IL-8 and TNF-alfa levels were not affected by IL-15 suggesting that its effects were not mediated by these cytokines. Together, the results showed that IL-15 is a potent stimulant of antifungal activities of human neutrophils, at least in part, by a mechanism dependent on oxidative metabolism.

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Wafa Hanna Koury Cabrera / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Resumo: A IL-15 é uma citocina próinflamatória produzida principalmente por monócitos e macrófagos em resposta a agentes infecciosos, desempenhando importante papel modulador na imunidade inata e adaptativa. No caso de infecções por microrganismos intracelulares como algumas bactérias, protozoários e fungos destaca-se o papel da IL-15 no mecanismo de ativação de monócitos/ macrófagos e neutrófilos, processo que representa um importante mecanismo de defesa já em períodos precoces da infecção durante o desenvolvimento da resposta imune inata. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da IL-15 sobre a atividade fungicida de neutrófilos humanos desafiados com cepa virulenta do P. brasiliensis (Pb 18). Adicionalmente, testamos se essa atividade seria mediada por produtos do metabolismo oxidativo como anion superóxido e H2O2 e se estaria associada a alterações nos níveis das citocinas IL-8 e TNF- alfa. Neutrófilos do sangue periférico de indivíduos saudáveis , foram incubados na ausência ou presença de IL-15 (12,5 a 250 ng/mL) por 18h a 370C em tensão de 5% de CO2, infectados com Pb 18 por 4h e avaliados quanto a atividade fungicida , produção de ânion superóxido, H2O2 e quantificação nos sobrenadantes das citocinas TNF-a e IL-8. A préincubação de neutrófilos com IL-15 induziu um aumento significativo na atividade fungicida dessas células de maneira dose dependente. Adicionalmente após a ativação, foi detectado um aumento na produção de 51 anion superóxido e H2O2 por essas células, sugerindo a participação desses metabólitos como moléculas efetoras da atividade fungicida. O desafio das células em presença de catalase, levou a uma diminuição significativa da atividade fungicida comprovando o papel da H2O2 nesse processo. No entanto, os níveis de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Interleukin-15 is a cytokine produced by a wide range of different cell types, including macrophages in response to lipopolysaccharide or microbial infection. This cytokine may play a crucial role in the activation of phagocytic cells against pathogens, mainly during innate immune response. The effects of IL-15 on human polimorphonuclear leukocyte fungicidal activity against high virulent P. brasiliensis strain were investigated. Prétreatment with IL-15 for 18h, increased neutrophils fungicidal activity in a concentration dependent manner. In addition, exposure to IL-15 induced enhanced neutrophil oxidative burst evaluated by superóxide anion and H2O2 release. Catalase inhibits fungicidal activity confirming a role for H2O2 in fungus Killing. In contrast, IL-8 and TNF-alfa levels were not affected by IL-15 suggesting that its effects were not mediated by these cytokines. Together, the results showed that IL-15 is a potent stimulant of antifungal activities of human neutrophils, at least in part, by a mechanism dependent on oxidative metabolism. / Doutor

Resumo: Na paracoccidioidomicose, os estudos sobre os mecanismos de defesa do hospedeiro destacam o papel das células fagocitárias que participam ativamente dos mecanismos efetores diretos contra o fungo e da modulação da resposta inflamatória. Dentre essas células, nos últimos anos, os estudos têm se voltado para os neutrófilos, que exercem um importante papel efetor e modulador principalmente durante os estágios iniciais da infecção. As funções dessas células, incluindo as antimicrobicidas, podem ser reguladas por citocinas pró e anti-inflamatórias. Apesar dos mecanismos celulares e moleculares desse processo não estarem completamente entendidos, trabalhos nos últimos anos têm mostrado de forma bastante consistente o envolvimento dos "Toll Like Receptors" (TLRs). Neste contexto, os objetivos do presente trabalho foram: 1- Avaliar a expressão de TLR2 e TLR4 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a ou IFN-g e desafiados com cepa virulenta de Paracoccidioides brasiliensis cepa 18 (Pb18). 2- Avaliar a participação desses receptores na atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas: IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10 por neutrófilos humanos pré-ativados com GM-CSF, IL-15, TNF-a, IFN-g e desafiados com Pb18. Nos ensaios referentes ao primeiro objetivo, as células foram tratadas por 18 horas com cada uma das citocinas ou LPS, posteriormente desafiadas com Pb 18 por 4 horas e avaliadas quanto a expressão de TLR2 e TLR4 por citometria de fluxo. Nos referentes ao segundo objetivo, as células foram ativadas com os mesmos estímulos, submetidas ao bloqueio de TLR2 e TLR4, através da incubação das células com anticorpos monoclonais específicos, desafiadas com Pb18 por 4 horas e analisadas quanto a atividade fungicida, produção de H2O2 e das citocinas IL-6, IL-8 e TNF-a e IL-10, por Elisa. Os resultados... (REsumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In paracoccidioidomycosis, phagocytic cells appear to provide one of the major lines of host defense. In this context, in last years, various studies have focused on the role of neutrophils that are involved in primary response to the fungus. Neutrophil functions are regulated by pro and anti-inflammatory cytokines. The molecular and cellular mechanisms involved in this process are not fully understood, but there are strong evidences about the involvement of "Toll Like Receptors" (TLRs). In this context, we aimed to evaluate TLR2 and TLR4 expression on human neutrophils primed with the cytokines GM-CSF, IL- 15, TNF-a or IFN-g and challenged with a virulent strain of Paracoccidioides brasiliensis (Pb18). Moreover, we asked if these receptors have a role on fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by primed and challenged cells. In first assays, neutrophils were incubated with each of cytokines or LPS by 18 h, challenged with Pb18 by 4 h and evaluated by TLR2 and TLR4 expression by flow cytometry. In other assays, cells were incubated with each of cytokines or LPS by 18h, submitted to TLR2 and TLR4 blocking by specific monoclonal antibodies, challenged with Pb18 for 4 h and evaluated for fungicidal activity, H2O2 and IL-6, IL-8, TNF-a and IL-10 production, by ELISA. All cytokines increased TLR2 and TLR4 expression. Pb18 increased TLR2 expression inducing an additional effect to that of cytokines. On the contrary, it inhibited TLR4 expression. All cytokines increased neutrophils fungicidal activity, but this process was not associated with TLR2 or TLR4 expression. All cytokines and Pb18 increased H2O2 production, but in the same manner to fungicidal activity, the process was not associated to TLR2 or TLR4 expression. Neutrophils activation with GM-CSF and TNF-a resulted in a significative increase on IL-8... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Luciene Alarcão Dias Melicio / Banca: José Maurício Sforci / Banca: Sueli Aparecida Calvi / Banca: Gil Bernardi / Banca: Wafa Hanna Koury Cabrera / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:14:33Z : No. of bitstreams: 1 theodoro_rc_me_botib.pdf: 1627532 bytes, checksum: 84aa1424194b14fdd0953c57c4c5c2a6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fungo termo dimórfico, Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais prevalente da América Latina. Este fungo vem sendo frequentemente isolado de amostras clínicas, tecidos de tatu (Dasypus novemcinctus) e recentemente foi também isolado de cão. Este trabalho avaliou a transição de micélio para levedura (M-L), a termo tolerância e o perfil de virulência em nove isolados de P. brasiliensis (quatro de pacientes humanos, quatro de tatus e um de cão), bem como a sua relação com a seqüência parcial e expressão do gene hsp70 (Heat Shock Protein 70) através de Real Time RT-PCR. Tanto os dados morfológicos como moleculares se mostraram variáveis dentre os diferentes isolados. Alguns destes dados, como sequenciamento e morfologia leveduriforme corroboram com a divisão de nossos isolados nas duas espécies crípticas simpátricas previamente propostas por Matute et al (2006). Nossos resultados confirmam que a HSP70 pode ser um importante fator de virulência por estar associado à termo tolerância, mas sua expressão parece não ser diretamente associada a altos padrões de virulência. / The thermo dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The previous phylogenetic species recognition proved the existence of, at least, three cryptic species in this pathogen. In this work we evaluated the mycelia to yeast (M-Y) transition, thermo tolerance and virulence profiles of nine isolates of P. brasiliensis, (including members of two of the three species) as well as its relation to the partial sequence and expression of hsp70 gene. It was observed a large phenotypic variability concerning the M-Y transition. The isolates Bt84 and T10 took more time to convert to the yeast form. These same isolates presented stretched yeast cells at 36°C, instead of the typical round cells. It was also observed arthroconidia production during the M-Y transition for some of the nine isolates studied. The hsp70 expression showed to be variable among our isolates. The partial sequencing of hsp70 gene resulted in a Neighbour Joining tree that divided our isolates in two main groups. Our data confirm that hsp70 gene might be an important virulence factor, associated with the thermo tolerance, but its expression does not seem to be directly related to high virulence profiles. We also presented some preliminary results about mycological characters that could be important candidates for morphologic markers for species recognition, as well as the partial sequencing of one member of the hsp70 gene family that allowed the separation of our isolates in two clusters, that correspond to the two sympatric cryptic species that occur in our PCM hyper endemic area (Botucatu, SP, Brazil).

Resumo: O fungo termo dimórfico, Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais prevalente da América Latina. Este fungo vem sendo frequentemente isolado de amostras clínicas, tecidos de tatu (Dasypus novemcinctus) e recentemente foi também isolado de cão. Este trabalho avaliou a transição de micélio para levedura (M-L), a termo tolerância e o perfil de virulência em nove isolados de P. brasiliensis (quatro de pacientes humanos, quatro de tatus e um de cão), bem como a sua relação com a seqüência parcial e expressão do gene hsp70 (Heat Shock Protein 70) através de Real Time RT-PCR. Tanto os dados morfológicos como moleculares se mostraram variáveis dentre os diferentes isolados. Alguns destes dados, como sequenciamento e morfologia leveduriforme corroboram com a divisão de nossos isolados nas duas espécies crípticas simpátricas previamente propostas por Matute et al (2006). Nossos resultados confirmam que a HSP70 pode ser um importante fator de virulência por estar associado à termo tolerância, mas sua expressão parece não ser diretamente associada a altos padrões de virulência. / Abstract: The thermo dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The previous phylogenetic species recognition proved the existence of, at least, three cryptic species in this pathogen. In this work we evaluated the mycelia to yeast (M-Y) transition, thermo tolerance and virulence profiles of nine isolates of P. brasiliensis, (including members of two of the three species) as well as its relation to the partial sequence and expression of hsp70 gene. It was observed a large phenotypic variability concerning the M-Y transition. The isolates Bt84 and T10 took more time to convert to the yeast form. These same isolates presented stretched yeast cells at 36°C, instead of the typical round cells. It was also observed arthroconidia production during the M-Y transition for some of the nine isolates studied. The hsp70 expression showed to be variable among our isolates. The partial sequencing of hsp70 gene resulted in a Neighbour Joining tree that divided our isolates in two main groups. Our data confirm that hsp70 gene might be an important virulence factor, associated with the thermo tolerance, but its expression does not seem to be directly related to high virulence profiles. We also presented some preliminary results about mycological characters that could be important candidates for morphologic markers for species recognition, as well as the partial sequencing of one member of the hsp70 gene family that allowed the separation of our isolates in two clusters, that correspond to the two sympatric cryptic species that occur in our PCM hyper endemic area (Botucatu, SP, Brazil). / Orientador: Eduardo Bagagli / Coorientador: Ivan de Godoy Maia / Banca: Everaldo dos Reis Marques / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Mestre

A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção sistêmica que tem como agente etiológico o P. brasiliensis e afeta os pulmões, áreas mucocutâneas e o sistema mononuclear-fagocitário. Trabalhos anteriores usando camundongos BALB/c atímicos e eutímicos demonstraram que os animais deficientes de células T são mais suscetíveis à infecção pelo P. brasiliensis e indicaram que a imunidade celular e natural são fundamentais para promover a resistência e o controle da doença. Com base nestes dados, nosso trabalho teve por objetivo demonstrar a importância de alguns mediadores da resposta imune natural durante a PCM murina. Utilizamos como abordagem experimental a depleção de IFN-γ, IL-12, leucócitos PMN e células NK em camundongos BALB/c atímicos e eutímicos infectados por via intratraqueal com leveduras de P. brasiliensis. Nossos resultados indicaram que a depleção de leucócitos PMN não alterou a gravidade da doença, entretanto essas células parecem exercer importante papel na modulação da síntese de citocinas em animais atímicos. A IL-12, por sua vez, demonstrou ter ação relevante na resposta ao P. brasiliensis em animais deficientes de células T, pois a sua neutralização levou ao aumento do número de leveduras viáveis recuperadas nos órgãos de disseminação (fígado e baço). Os animais eutímicos que foram tratados com AcM anti IL-12 apresentaram exacerbação da doença pulmonar e esplênica mas em ambas as linhagens não encontramos quaisquer alterações nas reações de HTT e no tempo de sobrevida. Os nossos experimentos confirmaram o papel fundamental do IFN-γ no controle doença tanto nos animais eutímicos que apresentaram redução das reações de HTT e exacerbação da doença, como também nos deficientes de células T que demonstraram, além do aumento da gravidade da doença, a redução do tempo de sobrevida. Analisamos também a participação da célula NK por serem consideradas fontes expressivas da síntese de IFN-γ. Observamos a exacerbação da doença pulmonar e a disseminação do fungo para o fígado e baço nos animais atímicos. A depleção dessas células em animais eutímicos induziu somente o agravamento da infecção pulmonar, sem maior comprometimento de outros órgãos. A reação de HTT e a taxa de mortalidade não sofreram alterações em ambas as linhagens. As células NK demonstraram atuar como moduladoras da síntese de imunoglobulinas em animais atímicos e de citocinas em eutímicos e também participaram da quimiotaxia de leucócitos PMN nos períodos iniciais da PCM. Em conclusão, usando um modelo experimental homogêneo (cepa infectante e linhagens de hospedeiros definidos) pudemos, pela primeira vez, demonstrar que o IFN-γ é o mais importante mediador da imunidade natural na imunoproteção ao P. brasiliensis. Verificamos também a contribuição relativa da IL-12 e dos leucócitos PMN na proteção da PCM pulmonar. Além disso, também pela primeira vez, foi caracterizada in vivo a importância das células NK no controle da infecção pelo P. brasiliensis. / The Paracoccidioidomicose (PCM) is a systemic infection caused by P. brasiliensis and affects the lungs, mucocutaneous areas and the mononuclear-phagocitary system. Previous works using athymics and euthymics BALB/c mice demonstrated that T cells deficient animals are more susceptible to the infection and indicated that the cellular and natural immunity is essential to promote the resistance and the control of disease. Based in these data, the objective of our work was demonstrated the importance of some natural mediators during murine PCM immune response. As experimental protocols we used the systemic depletion of IFN-γ, IL-12, PMN leukocytes and NK cells in athymics and euthymics BALB/c mice infected by intratracheal route with P. brasiliensis yeasts. Our results indicated that PMN leukocytes depletion did not alter the severity of infection; however these cells showed to exert important function in the cytokines synthesis modulation in athymics mice. In turn, the IL-12 demonstrated relevance action in T cells deficient mice response to P. brasiliensis infection, its neutralization induces an increased of viable yeasts numbers recovered in the dissemination organ (liver and spleen). The euthymics animals treated with anti IL-12 MAb presented an exacerbation of pulmonary and spleenic disease but in both species did not finds any alteration in the HTT reaction or survival times. Our experiments confirm the fundamental action of IFN-γ in disease control in both strains that showed decreased in the HTT reaction, disease exacerbation. These depletion in T cells deficient mice it also induced a decreased in survival times. We also analyzed the NK cells participation because are considered important sources of IFN-γ synthesis. We observed in athymics mice an exacerbation of pulmonary disease and fungal dissemination to liver and spleen. This depletion, in euthymics, mice induces only the pulmonary infection aggravation, other organs were not affected. The HTT reaction and mortality alterations were not observed in both strains. We demonstrated that NK cells acting as immunoglobulins synthesis modulators in athymics mice and the cytokines in euthymics mice and also participated of PMN leukocytes attractive in early PCM. In conclusion, using an experimental homogeneous model (infectant agent and strains hosts defined) we demonstrated for the first time that the IFN-γ is the most important mediator of the natural immunity in the immunoprotection to the P. brasiliensis. We also verificated the relative contribution of IL-12 and PMN leukocytes in the PCM pulmonary protection. Moreover, we also characterized, for the first time in vivo, the NK cells importance to the control of P. brasiliensis infection.