Dans les derniers 20 ans, les expériences de traction sur molécule unique par l’action d’une force mécanique ont donné plein d’informations autour des propriétés mécaniques des biomolécules, des modifications structurelles induites par des contraintes mécaniques, ainsi qu’éclaircir les mécanismes d’adhésion et décohésion des paires ligand-recepteur. Suivant cette analyse microscopique, outre que révéler des propriétés biologiques intéressantes, plusieurs de ces systèmes ont montré une nouvelle face, celle de nouveaux matériaux aux propriétés parfois uniques, et ont notamment induit des spéculations sur leur possibles utilisations dans des dispositif de nanotechnologie. Dans cette thèse, par le biais de simulations de dynamique moléculaire, notamment avec les méthodes dites “steered molecular dynamics” et “umbrella sampling”, nous avons réalisé des études concernant : (a) la caractérisation structurelle et mécanique de fragments d’ADN atypiques, comme le tétramère dénommé i-motif, ainsi que (b) la reconstruction des profils d’énergie libre de la liaison et dissociation entre des paires bromodomaine – queues d’histone acétylés (H3 et H4). Nous avons ainsi étudié la structure moléculaire de ces nanostructures particulières d’ADN, formées par l’intercalation de quatre brins d’ADN en un tétramère, et nous en avons déterminé pour la première fois les propriétés mécaniques de base : module de Young, module de flexion, longueur de persistance, et résistance mécanique. Dans la dernière partie du travail, nous avons étudié la manière d’appliquer ces mêmes méthodes à l’étude de paires ligand-recepteur dans le processus de transcription de l’ADN. Nous avons montré que les expériences simulées de traction, dans lesquelles la paire ligand-recepteur est séparée de manière contrôlée par une force mécanique aux extrémités, peuvent donner des informations sur l’hypersurface d’énergie libre. Nous avons essayé, avec un partiel succès, l’application au cas de l’interaction entre bromodomaines et queues d’histones, dans des conditions comparables aux expériences. / In the past 20 years, single-molecule pulling experiments of biomolecules under mechanical forces provided a wealth of information about the mechanical properties of such molecules, and the structural changes that may happen under stress in mechanical proteins, as well as shedding light upon many receptor-ligand binding and unbinding mechanism. Upon such microscopic analysis, besides revealing interesting biological properties, many such systems appeared as unique novel materials, and suggested routes to include such materials in nanotechnology assembly processes. This thesis reports on our studies of the structural and mechanical characterization of DNA i-motif and free-energy based profiling of bromodomain and acetylated histone tails (H3 and H4) binding and dissociation, by using molecular dynamics simulations, and in particular steered “molecular dynamics” and “umbrella sampling” methods. We studied the molecular structure of a peculiar class of DNA-based nanostructures, the i-motif, resulting from the intercalation of four DNA strands into a tetramer, and obtained for the first time its basic mechanical properties: Young’s modulus, bending modulus, persistence length and mechanical toughness. In a final part of the work, we also studied the applicability of the same computational methods to ligand-binding interactions in DNA trasncription. We showed that simulated pulling experiments on ligand-binding pairs, in which the pair is taken apart in a controlled way, can give informations about its free-energy landscape. We attempted, with mixed success, the application to the case of bromodomain-histone tail interactions under conditions comparable to the experiments.

Les bactéries phytopathogènes produisent des effecteurs de type III qui sont des facteurs de virulence injectés dans la cellule hôte afin de moduler les défenses et ainsi favoriser l'infection. L'effecteur PopP2 de Ralstonia solanacearum possède une activité acétyl-transférase qui est perçue par la paire de protéines de résistance RRS1-R et RPS4 dans le noyau des cellules végétales. Cette étape de perception conduit à l'activation des réponses de défenses. GTE9 et GTE11, deux protéines à bromodomaine d'Arabidopsis thaliana, s'apparentent à des lecteurs épigénétiques ciblés par PopP2. Nos données démontrent que ces protéines GTEs (i) interagissent avec PopP2 dans le noyau des cellules végétales et (ii) sont acétylées en présence de l'effecteur. De plus, GTE9 et GTE11 se lient in vivo et in vitro à des histones H4, suggérant que PopP2 interfère avec des processus de remodelage de la chromatine. / Microbial pathogens infect host cells by delivering virulence factors (effectors) that interfere with defenses, thereby favouring infection. The Ralstonia solanacearum PopP2 effector displays an acetyltransferase activity perceived by the Arabidopsis immune receptor pair, RRS1-R with RPS4, in the plant nucleus. This recognition step leads to the activation of immunity. Two Arabidopsis bromodomain-containing proteins , called General Transcription factor with Extra-terminal domain 9 and 11 (GTE9 and GTE11), were identified as PopP2-interacting partners. GTE9 and GTE11 are considered as epigenetic readers. Our data demonstrate that these GTEs proteins (i) interact with PopP2 in the plant nucleus and (ii) are acetylated in presence of the effector. Moreover, bromodomains of GTE9 and GTE11 bind in vivo and in vitro to Histone H4. Together, these data suggest that PopP2, through the targeting of GTE9 and GTE11, likely interfere with chromatin remodeling processes to affect ETS and/or ETI-related processes.

Pour assurer la production de milliards de globules rouges, l’érythropoièse doit parfaitement contrôler les processus de prolifération et de différenciation. Ces deux processus sont régulés par l’expression de gènes spécifiques dépendant d’une coordination entre l’activité des facteurs de transcription (FT) et les fonctions épigénétiques portées par exemple par les protéines à bromodomaine. Cette étude se concentre sur les conséquences de l’association ou la dissociation du FT clef de l’érythropoièse GATA-1 avec les FT déterminant pour le cycle cellulaire, pRb et E2F. Dans la première partie de ma thèse, j’ai participé à l’étude du rôle de l’association/dissociation de GATA-1 et FOG-2 avec pRb/E2F dans le contrôle la balance prolifération/différenciation cellulaire. Nos résultats montrent que les souris exprimant une mutation de GATA-1 sur la sérine 310 (GATA-1S310A), qui a la capacité accrue à séquestrer E2F-2, présentent une anémie létale lorsqu’un mécanisme de compensation de production de E2F-2 induit par l’IGF-1 est inhibé. Puis, nous avons trouvé que les propriétés décrites pour GATA-1 sont partagées par le FT FOG-2 et montré que l’abrogation de sa fixation avec pRb induit une perturbation de l’adiposité dans des souris FOG-2pRb-. Dans la deuxième partie, l’expression de c-Myc étant régulé différentiellement par GATA-1 et E2F, j’ai testé si la drogue « JQ1 », premier inhibiteur épigenétique chimique de l’expression de c-Myc, pouvait contrôler l’érythropoièse. Pour cela, j’ai utilisé la ligné érythroleucémique UT7 qui prolifère sans se différencier en présence d’érythropoiétine (stade proérythroblaste). Les résultats montrent que le traitement par JQ1 bloque la prolifération des cellules UT7 et permet de réinitier le programme de différentiation érythroide terminale. J’ai alors recherché les mécanismes moléculaires impliqués dans cette régulation et trouvé que l’inhibition transcriptionnelle de c-Myc par JQ1 est associée à l’inhibition de l’activité transcriptionnelle de STAT5 sans modification de son état de phosphorylation. Enfin, j’ai montré que JQ1 pouvait avoir une activité comparable à celle du TGF-b mais sans implication les voies Smad. Des études in vivo montre que JQ1 augmente la viabilité cellulaire et accélère la maturation des cellules érythroides à la fois chez les souris sauvages et thalassémiques. Cette différence d’action de JQ1 sur l’érythropoièse normale et pathologique implique des modifications épigénétiques différentielles entre ces deux types cellulaires et sont à la base de nouvelles stratégies du traitement du cancer. Le rôle clef de la régulation de l’association/dissociation de GATA-1 ou FOG-2 avec pRb/E2F dans l’érythropoièse et l’adipogénèse, nous a conduit, dans une troisième partie, à déterminer in vivo, les conséquences physiologiques de la séquestration de E2F par pRb. Pour cela nous avons crée une souris transgénique exprimant de façon conditionnelle un peptide contenant la partie N terminale de GATA-1 qui se fixe à pRb (GATA-1Nter). In vitro, ce peptide séquestre E2F dans le complexe GATA-1Nter/pRb et inhibe la prolifération cellulaire de façon irréversible. In vivo, aucune souris transgéniques exprimant le peptide GATA-1Nter n’a pu être sélectionnée et une mortalité au stade embryonnaire est observée. Une expression induite de ce peptide au stade adulte ne produit que des souris chimériques avec une fréquence de recombinaison du transgène GATA-1Nter importante. L’établissement de lignées stables de souris exprimant le peptide GATA-1Nter permettra de déterminer les conséquences physiologiques de la séquestration de E2F dans le complexe GATA-1Nter/pRb. / To ensure the generation of billions of erythrocytes daily, erythropoiesis must be well controlled by proliferation and differentiation processes. These two processes are regulated by expressions of specific genes, coordinated by transcription factors (TFs) and epigenetic factors, such as bromodomain proteins. This study focused on the effects of the binding and dissociation of a key erythroid TF, GATA-1, to the crucial cell cycle TFs, pRb and E2F. In the first part of this thesis, the role of GATA-1 and FOG-2 binding to pRb/E2F in a control balances between cell proliferation and differentiation was studied. Mice bearing a GATA-1 mutation (GATA-1S310A) displayed higher levels of E2F2 sequestration and suffered from fatal anemia when the compensatory pathway of E2F2 production via IGF-1 signaling was also inhibited. The properties described for GATA-1 were found to be common to FOG-2, and the abolition of FOG-2 binding to pRb led to obesity resistance in FOG-2pRb- mice. In the second part of this work, as c-Myc is regulated by GATA-1 and E2F, the first chemical epigenetic inhibitor repressing c-Myc expression to be described, JQ1, was investigated to see if it could control erythropoiesis. The UT7 erythroleukemia cell line, which proliferates without differentiating was used. This cell line stops differentiation at the proerythroblast stage, in response to erythropoietin. JQ1 treatment inhibited UT7 proliferation and restored terminal erythroid differentiation. The molecular mechanism underlying this regulation by JQ1 was shown that the inhibition of c-Myc expression was associated with the inhibition of STAT5 transcription, with no change in the phosphorylation of this protein. It was found that JQ1 had a putative TGF--like activity, which did not involve the Smad pathway. It was shown in the ex vivo studies that JQ1 increased the viability of erythroid cells and accelerated the maturation of these cells in both WT and thalassemic mice. The observed differences between leukemic and normal erythropoiesis involved differential epigenetic modifications that could be at the basis of new strategies regarding cancer treatment.The key role of the association of GATA-1 or FOG-2 had with pRb/E2F, and the dissociation of these factors, in erythropoiesis and adipogenesis, respectively, led us to investigate, in vivo, the physiological consequences of E2F sequestration by pRb. As a result, transgenic mice displaying conditional expression of a peptide containing the N-terminal part of GATA-1 that binds to pRb (GATA-1Nter) were developed. In vitro, this peptide traps E2F in a GATA-1Nter/pRb complex, resulting in the irreversible inhibition of cell proliferation. The yield of transgenic mice expressing the GATA-1Nter peptide in vivo was unsuccessful, as this expression lead to lethality at the embryonic stage. Using an alternative approach, based on the inducible expression of the peptide in adults, chimeric mice with a high frequency of recombination of the GATA-1Nter transgene were obtained for this study. The establishment of a stable mouse line expressing the GATA-1Nter peptide should make it possible to determine the pathophysiological consequences of E2F sequestration in the GATA-1Nter/pRb complex.

BRDT et la réorganisation de la chromatine au cours de la spermatogénèsePendant la spermiogenèse, phase haploïde de la gamétogenèse mâle, le génome mâle subit une réorganisation majeure, durant laquelle la plupart des histones sont enlevées et remplacées par les protéines de transition (TP) et les protamines. Ce processus conduit à la compaction extrême du génome mâle au sein du noyau du spermatozoïde.Dans les spermatides allongées, les histones sont hyperacetylées juste avant leur éviction. Nous avons émis l'hypothèse que cette acétylation massive des histones pourrait être un signal pour l'enlèvement des histones et le recrutement de la machinerie de remodelage de la chromatine. BRDT est une protéine spécifique du testicule, appartenant à la famille BET, qui possède deux bromodomaines capables de reconnaitre les histones acétylées et qui a la capacité unique de compacter la chromatine hyperacétylée (Pivot-Pajot et al., 2003). Le premier bromodomaine de BRDT apparait crucial pour ces fonctions (Morinière et al., 2009). Les souris porteuses d'une délétion du premier bromodomaine de BRDT, BD1, présentent une stérilité des mâles associée à des anomalies survenant lors de la spermiogenèse (Shang et al, 2007). Nous avons pu caractériser la fonction physiologique du premier bromodomaine de BRDT et montrer son rôle crucial dans le remplacement des histones hyperacétylées par les TP et les protamines au cours de la spermiogenèse.Afin d'explorer les fonctions potentielles des autres domaines de BRDT, nous avons étudié des souris ayant une invalidation génétique complète de Brdt. Cette perte de BRDT engendre aussi une stérilité mâle, mais le phénotype montre une absence totale de cellules post-méiotiques. Enfin, un troisième modèle de souris a été obtenu suite à notre tentative de produire des souris porteuses d'une version tagguée de la protéine. L'exploration de ces modèles a permis de démontrer un rôle de BRDT, indépendant de la présence de BD1, dans la régulation du programme d'expression des gènes lors de l'entrée en méiose.BRDT possède à la fois une fonction méiotique et post-méiotique avec l'implication de différents domaines protéiques. / Involvement of BRDT in chromatin reorganization during spermatogenesisDuring spermiogenesis, the haploid phase of male gametogenesis, the male genome undergoes a major chromatin reorganization, during which most histones are removed and replaced by transition proteins (TP) and protamines. This process led to the extreme compaction of the genome in the male sperm nucleus.In elongating spermatids, histones are hyperacetylated just before their eviction. We have hypothesized that acetylation of histones mass could be a signal for the removal of histones and recruitment of chromatin remodeling machinery. BRDT is a testis-specific protein, xhich belongs to the BET family, which has two bromodomains able to recognize acetylated histones and has the unique ability to compact hyperacetylated chromatin (Pivot-Pajot et al., 2003). The first of bromodomain BRDT appears crucial for these functions (Morinière et al., 2009). Mice carrying a deletion of the first bromodomaine BRDT, BD1, exhibit male sterility associated with abnormalities occurring during spermiogenesis (Shang et al, 2007). We were able to characterize the physiological function of the first bromodomaine BRDT and demonstrate its crucial role in the replacement of hyperacetylated histones by TP and protamines during spermiogenesis.To explore the potential functions of other domains of the BRDT protein, we have studied mice with invalidation of the Brdt gene. This loss of BRDT also produces male sterility, but the phenotype shows a complete lack of post-meiotic cells. A third mouse model was obtained following our attempt to produce mice with a version of taggued protein. The exploration of these models has demonstrated a role of BRDT, independent of the presence of BD1, in regulating the program of gene expression during entry into meiosis.BRDT has both functions in meiotic and post-meiotic meiotic with the involvement of different protein domains.

Au cours de la maturation des gamètes mâles a lieu un événement unique : les structures classiques qui ordonnent l'ADN sont complètement bouleversées et remplacées par une nouvelle, de composition et d'agencement différents, qui permet au noyau du spermatozoïde final une compaction qui n'est retrouvée nulle part ailleurs. Les signaux épigénétiques ainsi que les événements qui se déroulent alors au niveau moléculaire ne sont pas encore bien élucidés. C'est dans l'optique d'une meilleure compréhension de ce phénomène que la protéine Atad2 a été identifiée et caractérisée. Ce facteur, qui possède un bromodomaine ainsi qu'un domaine AAA, est retrouvé sous deux formes chez la souris. La plus courte, strictement testiculaire, est capable de se lier à la chromatine acétylée. De plus, comme les autres membres de la famille des AAAATPases, Atad2 est capable de se multimériser. Cette multimérisation régule son affinité à la chromatine. Des études plus poussées ont montré un rôle dans l'activité transcriptionnelle ainsi que dans la stabilité des structures basales d'ordonnancement de l'information génétique, les nucléosomes. De plus, chez l'humain, Atad2 a été retrouvé exprimé de façon aberrante dans certaines tumeurs. L'élucidation du rôle de cette protéine dans les cellules germinales et somatiques apportera ainsi des informations sur le changement complet de la nature chromatinienne au cours de la spermatogenèse, et peut-être permettra peut-être une meilleure appréhension de l'activité génomique ayant lieux dans les cellules tumorales.

Les modifications post-transcriptionnelles qui régulent la structure et la fonction de la chromatine sont reconnues par de multiples modules protéiques, dont les bromodomaines. Alors que la reconnaissance de modifications individuelles des histones par ces modules est bien caractérisée, la reconnaissance d'histones portant plusieurs modifications est mal connue. Nous avons étudié comment Brdt s'associe à la chromatine acétylée par l'intermédiaire de ses deux bromodomaines (BD1 et BD2) pour induire sa compaction au cours des dernières étapes de la spermatogenèse. Nous avons également étudié l'effet de la mutation K61Q du premier bromodomaine de Brdt, impliquée dans certains cas d'infertilité masculine. BD1, bien que présentant une structure de bromodomaine classique, se montre sélectif pour des formes di-acétylées de la queue N terminale de l'histone H4 avec une préférence pour le peptide H4-K5/K8ac et ne montre pas d'affinité pour les peptides mono-acétylés H4-K5ac, H4-K8ac et H4-K12ac. Au contraire, BD2 présente un spécificité pour l'histone H3 mono-acétylée sur K18. La structure cristallographique du complexe Brdt-BD1/H4‑K5/K8ac révèle que les deux lysines acétylées se placent ensemble dans la cavité hydrophobe du bromodomaine. Ces observations mettent en évidence un nouveau mode de lecture du code histone par lequel un bromodomaine reconnaît spécifiquement le motif formé par l'acétylation de deux lysines adjacentes.