Orientadores: Ranulfo Monte Alegre, Jorge Alberto Vieira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:42:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castiglioni_GabrielLuis_D.pdf: 2848307 bytes, checksum: 09e1e37498a764f275a4ed9afe996844 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Os avanços biotecnológicos na produção industrial de lipases têm proporcionado sua aplicação nos diferentes setores. Este interesse se deve à capacidade destas enzimas catalisarem algumas reações, dentre elas a transesterificação. Esta reação é reversível e resulta em altos rendimentos a partir da otimização de parâmetros experimentais, tais como, temperatura, concentração do catalisador, razão molar álcool:óleo, entre outros. Um grande número de trabalhos voltados para a produção de biodiesel por via enzimática vem sendo feito devido às vantagens a ela associada. Tendo em vista estas observações, o presente trabalho teve por objetivo o estudo da produção de lipase microbiana e sua aplicação na síntese de biodiesel. As etapas envolvidas neste projeto foram: produção de lipase por diferentes microrganismos utilizando fermentação submersa e semi-sólida; uso de diferentes reatores e meios de cultivo; escolha e caracterização da lipase que melhor apresentou vantagens em relação à produtividade e à atividade de transesterificação; estudo de imobilização e reutilização da lipase em diferentes resinas hidrofóbicas e de troca iônica; estudo da influência do tempo de reação, temperatura, pH, concentração de água, etanol e enzima, além da adição de co-solvente, goma arábica e íons metálicos na síntese do biodiesel. Efeitos positivos nos experimentos foram verificados quando se adicionou KH2PO4 e água de maceração de milho no processo de produção de lipase pela Burkholderia cepacia. Esta cepa apresentou maior potencial de produção de lipase com atividade de transesterificação do óleo de soja e etanol comparada com os demais microrganismos estudados. A caracterização da lipase demonstrou que os melhores resultados foram a 37°C e pH 8,0, seguindo modelo de inativação enzimática de primeira ordem. A resina de poli(estireno-co-divinilbenzeno) com 35% de DVB juntamente com a Amberlit IRA-900 apresentaram maior potencial de imobilização e utilização para a síntese do biodiesel. Nos experimentos de transesterificação, as variáveis estudadas apresentaram efeito na respostas de síntese de biodiesel. Os melhores resultados encontrados foram: pH igual a 6,0, temperatura em ttorno de 50ºC, uso de éter de petróleo como co-solvente, concentração de etanol próxima à quantidade estequiométrica e concentração de aproximadamente 42% de água. Por fim, na reutilização das resinas de poli(estireno-co-divinilbenzeno) com 35% de DVB e Amberlit IRA-900, foi observada uma diminuição no rendimento da reação devido à perda de parte da enzima por lixiviação. Os resultados referentes à primeira resina mostraram que a perda da atividade está relacionada ao número de usos e segue uma função de primeira ordem. A constante de perda da atividade foi de 3,017 e o tempo de meia vida do processo 18 usos. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx determinados na reação foram de 21,98% e 14,56%p.h-1, respectivamente. Já em relação à reutilização da lipase imobilizada na segunda resina, o tempo de meia vida foi de 6 usos. Com isso o presente trabalho apresenta uma contribuição significativa no que diz respeito ao uso de lipase de Burkholderia cepacia e agrega soluções para viabilizar o processo de transesterificação com esta enzima / Abstract: The technological advancements in the industrial production of lipases have been making its application viable in different sectors. This interest is due to these enzymes capacity to catalyze some reactions, like the transesterification. This reaction is reversible and the optimization of experimental parameters such as temperature, catalyst concentration and ethanol-to-oil molar ratio results in a high production efficiency. A great number of studies about the enzymatic production of biodiesel have been done due to its related advantages. Considering these observations, the objective of this work was to study the production of microbial lipase and its application in the synthesis of biodiesel. The stages involved in this project were: lipase production by different microorganisms using submerged and semisolid fermentation; use of different reactors and cultivation media; selection and characterization of the lipase that showed advantages related to the productivity and to the transesterification activity; study of the immobilization and reutilization of the lipase in different hydrophobic and ionic exchange resins; study of the influence of reaction time, temperature, pH, water, ethanol and enzyme concentrations and the addition of cosolvents, arabic gum and metallic ions in the synthesis of biodiesel. Positive effects were verified in the experiments when KH2PO4 and corn maceration liquor were added to the process of lipase production by Burkholderia cepacia. Compared with the other microorganisms studied, that strain showed greater potential for the production of lipase with activity of transesterification of soy oil and ethanol. The characterization of the lipase showed that the best results occurred at 37°C and pH 8.0, following the model of first order enzymatic inactivation. The poly(styrene-co-divinylbenzene) resin with 35% of DVB and Amberlit IRA-900 presented greater potential for the immobilization and synthesis of the biodiesel. In the transesterification experiments, the studied variables affected the response of the biodiesel synthesis. The best results were found at pH 6.0, temperature of 50ºC, petroleum ether as co-solvent, ethanol concentration at stequiometric values and water concentration around 42%. Finally, due to the loss of enzyme by lixiviation, it was observed a decrease in the efficiency of the reaction when the poly(styrene-codivinylbenzene) resins with 35% of DVB and Amberlit IRA-900 were reused. The results referring to the first resin showed that the loss of activity is related to the number of utilizations and it follows a first order function. The activity loss rate was 3.017 and the half-life of the process was 18 uses. The kinetic parameters Km and Vmax determined for the reaction were respectively 21.98% and 14.56%p.h-1. Referring to the reutilization of the lipase immobilized in the second resin, the half-life was 6 uses. Thus, this work presents a relevant contribution to the use of the lipase of Burkholderia cepacia and adds solutions to make the process of transesterification with this enzyme viable / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Tato diplomová práce se zabývala možnostmi utilizace lignocelulosového materiálu jako obnovitelného zdroje k produkci polyhydroxyalkanoátů (PHA) biotechnologickými metodami. Teoretická část práce se zaměřuje na charakterizaci rostlinné odpadní biomasy, její enzymatickou sacharifikaci a možnosti produkce a izolace hydrolytických enzymů. Dále se pak literární rešerše zabývá bakteriální produkcí PHA a možností využití lignocelulosové biomasy pro jejich produkci. V rámci experimentální části byly vybrané odpadní substráty hydrolyzovány chemickou a enzymatickou cestou. Jako odpadní substráty byly použity výlisky z jablek, hroznového vína a řepky olejné a kávová sedlina. Získané hydrolyzáty byly použity k produkci PHA bakteriálním kmenem Burkholderia cepacia. Nejslibnějším substrátem se jevily výlisky z jablek. Ukázalo se, že vybraný bakteriální kmen je schopen utilizovat odpadní substráty i bez předchozí úpravy. Supernatant po skončení kultivace jevil následující aktivity: proteasovou, lipasovou (0.47 nmol/(mL•min)), celulasovou pro CMC (6.05 nmol/(mL•min)) a filtrační papír (4.63 nmol/(mL•min)) a xylanasovou (1.71 nmol/(mL•min)). Tyto enzymy mohou představovat zajímavý vedlejší produkt výroby PHA z odpadních zemědělských materiálů. V rámci této práce byl také posouzen vliv délky kultivace a způsob hydrolýzy na výslednou produkci PHA a enzymatickou aktivitu průmyslově zajímavých enzymů.

Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2450743 bytes, checksum: 3e33726e56a8d6ec568fbe55fd680721 (MD5) Previous issue date: 2012-09-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The preparation of stable immobilized lipases is one of the great challenges for modern biotechnology that involves the use of these enzymes in biocatalyzed processes. The commercial application of these biocatalysts depends of an efficient immobilization and the appropriate use of supports to ensure stability to enzymes. This work focused on the study of the preparation of chemically modified supports derived from silica gel. The organofunctionalized silicas were prepared by silylation through of the heteregeneous route using the compounds 3-aminepropyl- and 3-chloropropyl trimethoxysilane resulting in the solids named Sil-propil-NH2 and Sil-propil-Cl, respectively. The solids Sil-propil-NH2 and Sil-propil-Cl reacted subsequently with the cyanuric chloride and 1,6 diaminehexane as spacer, followed by covalent attack of cyanuric chloride resulting in the matrices Sil-propil-N-CC and Sil-propil-Hex-CC. Silica gel and the modified solid were characterized measures of adsorption / desorption of nitrogen, CHN elemental analysis, thermogravimetry (TG), Si29 and C13 NMR and FTIR spectroscopy. The modified support were used in the immobilization of the Burkholderia cepacia lipase, and the catalytic performance and stability of the immobilized enzyme derivatives were investigated in the hydrolysis reaction of p-nitrophenylpalmitate (pNPP) in five consecutive reaction cycles. The results of the preparation of matrizes showed the anchoring of the triazine molecule onto silanized surface. For material Sil-propil-N-CC was observed the increasing of the nitrogen content as indicated CNH elemental analysis, that corresponded to 1.82% of N due the introduction of amino group and 3.08% of N after the reaction of the triazine molecule. For the material Sil-propil-Cl, it was observed the increasing in the nitrogen percentage for the support with spacer (2.13% of N) and after the reaction with cyanuric chloride (3.6% of N). The tests of catalytic activity operational stability of the immobilized enzymes onto supports were 2910, 3000 e 3430 U/g, respectively, for supports with aminopropyl and triazine molecule, chloropropyl with the spacer and for the surface with spacer and triazine molecule. For catalytic test were observed a higher tendency for loss of stability for support without spacer. The obtained results showed that the chemical modification reactions of silica gel enabled the covalent anchoring of the cyanuric chloride and the use of spacer resulted in higher catalytic activity and stability for the immobilized bio catalysts. / A obtenção de lipases imobilizadas estáveis é um dos maiores desafios para a biotecnologia moderna que envolve o emprego destas enzimas em processos biocatalisados. A aplicação comercial desses biocatalisadores depende de métodos eficientes de imobilização e da utilização de um suporte apropriado para assegurar estabilidade às enzimas. Nessa direção, o escopo do presente trabalho envolveu a preparação de suportes quimicamente modificados a partir da sílica gel. As sílicas organofuncionalizadas foram preparadas por silanização pela rota heterogênea, utilizando os compostos 3-aminopropiltrimetoxissilano e 3-cloropropiltrimetoxissilano originando os sólidos denominados Sil-propil-NH2 e Sil-propil-Cl, respectivamente. Os sólidos Sil-propil-NH2 e Sil-propil-Cl reagiram subsequentemente com cloreto cianúrico e o com o espaçador 1,6 diaminohexano, seguido do ataque covalente do cloreto cianúrico resultando nas matrizes Sil-propil-N-CC e Sil-propil-Hex-CC. A sílica gel e os sólidos modificados foram caracterizados pelas técnicas de termogravimetria, medidas de adsorção/dessorção de nitrogênio, análises elementar de CHN, ressonância magnética nuclear de Si29 e C13 e espectroscopia de absorção na região do infravermelho. Os suportes modificados foram utilizados na imobilização da lipase de Burkholderia cepacia, sendo que o desempenho catalítico e estabilidade dos derivados enzimáticos imobilizados foram investigados em reações de hidrólise do éster palmitato de p-nitrofenila (p-NPP) em cinco ciclos reacionais consecutivos. Os resultados das preparações dos suportes mostraram o ancoramento da molécula triazínica nas superfícies silanizadas. No material Sil-propil-N-CC foi observado um aumento do teor de nitrogênio obtido da análise elementar, que correspondeu a 1,82% de N referente à introdução do grupo amino e 3,08% de N após a reação com o composto triazínico. No caso do material Sil-propil-Cl, observou-se um aumento na porcentagem de nitrogênio do suporte contendo espaçador (2,13% N) e após a reação com o cloreto cianúrico (3,6% N). Os testes de atividade hidrolítica e estabilidade das lipases imobilizadas mostraram 2910, 3000 e 3430 U/g, respectivamente para os suportes contendo aminopropil e o anel triazínico, cloropropil e o espaçador e a superfície com espaçador e o anel triazínico. Nos ensaios catalíticos foi observada uma maior tendência de perda de estabilidade na ausência do espaçador. Os resultados obtidos mostraram que as reações de modificação química da superfície da sílica possibilitaram o ancoramento covalente do cloreto cianúrico e a presença de um espaçador possibilitou maior atividade e estabilidade aos biocatalisadores imobilizados.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns Bastonetes Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicação em infecções é subestimada. Devido à similaridade fenotípica, mudanças taxonômicas, baixa reatividade bioquímica e limitações nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificação de BGNNF é frequentemente equivocada, culminando com a denominação de diferentes micro-organismos apenas como BGNNF, por falta de melhor diferenciação. O objetivo desse estudo foi avaliar, por métodos fenotípico convencional, proteômico e molecular, a identificação de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitário no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratório clinico como BGNNF para a identificação por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotípicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espécies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espécies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotípicos incluíram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordância com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nível de espécie foi de 64% (n=30) e apenas em gênero a concordância foi de 17% (n=8). A análise comparativa geral da identificação por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nível de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordância em nível de espécie para 60%. As discordâncias parecem ser devido às diferenças nos perfis proteicos das amostras em relação às amostras-referência do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualização de perfis no sistema. A análise do polimorfismo genético de B. contaminans mostrou a ausência de um clone disseminado causando surto, além da provável origem ambiental das infecções. Os setores de nefrologia e hemodiálise contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as culturas, respectivamente. As discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificação das espécies do CBc. Os BGNNF incomuns são de difícil caracterização independente da metodologia usada e nenhum método por si só foi capaz de identificar todas as amostras. / Some nonfermenting Gram-negative Bacilli (NFGNB) are considered of low clinical significance, and their implication in infections is usually underestimated. Due to their phenotypic similarities, frequent taxonomic changes and low biochemical reactivity, as well as to limitations of bacterial identification commercial system databases, these NFGNB are frequently misidentified and are collectively referred to as NFGNB group, in the lack of a better differentiation. The aim of the present study was to evaluate the performance of the conventional phenotypic method, the proteomic matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectometry method (MALDI-TOF MS) and of molecular methods (16S RNA and recA gene sequencing) in the identification of 78 unusual NFGNB isolated from blood cultures of pacients treated at an university hospital in Rio de Janeiro. Clonality of the predominant species identified within these isolates was determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). By the 16S rRNA gene sequence analysis, most strains (n = 31; 40%) were included in the Burkholderia spp. followed by Pseudomonas stutzeri (n = 8; 10%), Delftia acidovorans (n = 3; 4%) and Stenotrophomonas maltophilia (n = 3; 4%). The remaining bacterial isolates were included in 27 different species. By the recA gene sequencing technique, most bacteria from the Burkholderia cepacia complex (BCC), samples were classified as Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Phenotypic tests provided accurate identification of all 31 isolates included in the BCC by the 16S rRNA gene sequence analysis. For the other 47 samples, agreement of the results obtained with these two techniques in species and genus level identifications occurred in 30 (63,8%) and 17 samples (36,2%), respectively. The results obtained by the MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene sequencing methods agreed at species and genus levels in 33 (42%) and 35 isolates (45%), respectively. When bacteria from the BCC were excluded from the analysis, the agreement between the two techniques at species level increased to 60%. Misidentification by the MALDI-TOF MS method may be due to differences in protein spectra between the samples and the reference strains in the equipment database. PFGE analysis of B. contaminans isolates revealed the absence of a disseminate clone causing an outbreak, and the probable environmental source of infections. The nefrology ang dialisis sectors contributed to the greatest number of patients with positive cultures (5 pacients and 9 isolates). Clones BcoD and BcoE were found in blood cultures of pacientes treated in a same sector with differences of 4 months (BcoD, nefrology) and 1.5 year (BcoE, dialisis). The misidentifications occurred mainly due to the hard differentiation of BCC species. Unusual NFGNB are of difficult characterization whatever the methodology used and no method alone was able to identify all the isolates.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns Bastonetes Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicação em infecções é subestimada. Devido à similaridade fenotípica, mudanças taxonômicas, baixa reatividade bioquímica e limitações nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificação de BGNNF é frequentemente equivocada, culminando com a denominação de diferentes micro-organismos apenas como BGNNF, por falta de melhor diferenciação. O objetivo desse estudo foi avaliar, por métodos fenotípico convencional, proteômico e molecular, a identificação de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitário no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratório clinico como BGNNF para a identificação por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotípicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espécies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espécies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotípicos incluíram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordância com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nível de espécie foi de 64% (n=30) e apenas em gênero a concordância foi de 17% (n=8). A análise comparativa geral da identificação por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nível de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordância em nível de espécie para 60%. As discordâncias parecem ser devido às diferenças nos perfis proteicos das amostras em relação às amostras-referência do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualização de perfis no sistema. A análise do polimorfismo genético de B. contaminans mostrou a ausência de um clone disseminado causando surto, além da provável origem ambiental das infecções. Os setores de nefrologia e hemodiálise contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as culturas, respectivamente. As discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificação das espécies do CBc. Os BGNNF incomuns são de difícil caracterização independente da metodologia usada e nenhum método por si só foi capaz de identificar todas as amostras. / Some nonfermenting Gram-negative Bacilli (NFGNB) are considered of low clinical significance, and their implication in infections is usually underestimated. Due to their phenotypic similarities, frequent taxonomic changes and low biochemical reactivity, as well as to limitations of bacterial identification commercial system databases, these NFGNB are frequently misidentified and are collectively referred to as NFGNB group, in the lack of a better differentiation. The aim of the present study was to evaluate the performance of the conventional phenotypic method, the proteomic matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectometry method (MALDI-TOF MS) and of molecular methods (16S RNA and recA gene sequencing) in the identification of 78 unusual NFGNB isolated from blood cultures of pacients treated at an university hospital in Rio de Janeiro. Clonality of the predominant species identified within these isolates was determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). By the 16S rRNA gene sequence analysis, most strains (n = 31; 40%) were included in the Burkholderia spp. followed by Pseudomonas stutzeri (n = 8; 10%), Delftia acidovorans (n = 3; 4%) and Stenotrophomonas maltophilia (n = 3; 4%). The remaining bacterial isolates were included in 27 different species. By the recA gene sequencing technique, most bacteria from the Burkholderia cepacia complex (BCC), samples were classified as Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Phenotypic tests provided accurate identification of all 31 isolates included in the BCC by the 16S rRNA gene sequence analysis. For the other 47 samples, agreement of the results obtained with these two techniques in species and genus level identifications occurred in 30 (63,8%) and 17 samples (36,2%), respectively. The results obtained by the MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene sequencing methods agreed at species and genus levels in 33 (42%) and 35 isolates (45%), respectively. When bacteria from the BCC were excluded from the analysis, the agreement between the two techniques at species level increased to 60%. Misidentification by the MALDI-TOF MS method may be due to differences in protein spectra between the samples and the reference strains in the equipment database. PFGE analysis of B. contaminans isolates revealed the absence of a disseminate clone causing an outbreak, and the probable environmental source of infections. The nefrology ang dialisis sectors contributed to the greatest number of patients with positive cultures (5 pacients and 9 isolates). Clones BcoD and BcoE were found in blood cultures of pacientes treated in a same sector with differences of 4 months (BcoD, nefrology) and 1.5 year (BcoE, dialisis). The misidentifications occurred mainly due to the hard differentiation of BCC species. Unusual NFGNB are of difficult characterization whatever the methodology used and no method alone was able to identify all the isolates.

El problema que trae aparejado la falta de un diagnóstico certero y rápido de los patógenos respiratorios en pacientes fibroquísticos tiene un fuerte impacto en el tratamiento antimicrobiano, en el control de infecciones y principalmente en la calidad de vida y sobrevida de estos pacientes. En el caso particular de los organismos del complejo Burkholderia cepacia, que colonizan a estos pacientes, son ampliamente reconocidas las dificultades y limitaciones de los métodos bioquímicos tradicionales para su identificación. En los últimos años se han puesto muchos esfuerzos en desarrollar nuevos métodos de identificación rápidos, sencillos y de bajo costo que permitan la diferenciación e identificación inequívoca de bacilos no fermentadores, pertenecientes y no pertenecientes al complejo Burkholderia cepacia. Este trabajo de tesis fue concebido con la idea de avanzar en el conocimiento general sobre las técnicas de identificación, las características genotípicas y fenotípicas de organismos del complejo B. cepacia y a su vez resolver problemas de diagnóstico del sector hospitalario y epidemiológicos de nuestro país.

Inhibition of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 by Burkholderia cepacia was evident when grown on various media (TSA, PDA, PSA, YM, KMB, PPM, NYGA, LA) with different carbon sources and under various pH and temperature conditions. In addition, B. cepacia was able to inhibit several fungal pathogens in vitro. Antagonism of B. cepacia against F. oxysporum f. sp. cubense occured at high levels of Fe³+, which may suggest that antagonism by B. cepacia did not involve siderophore production. Thin layer chromatogram (TLC) examination showed that B. cepacia produced several substances, one of which had similar R[f] value to that described for pyrrolnitrin. Cell-free supernatant of a 4-day culture of 6. cepacia was applied to an Amberlite XAD-2 column and inhibitory activity co-eluted with the 95% methanol (pH 9.5) fraction. The concentrated activated fractions showed inhibitory activity against F. oxysporum f. sp. cubense. A GC-MS chromatogram indicated numerous components in the antifungal extracts. The only compound identified in the Wiley 138 library, was 1,2- Benzenedicarboxylic acid, bis (2-Ethylhexyl) ester. Observations by light microscopy indicated that B. cepacia inhibited spore germination in F. oxysporum f. sp. cubense race 4 and retarded the mycelial growth. The interaction between the endophytic bacterium, B. cepacia and F. oxysporum f. sp. cubense race 4 was investigated with aid of scanning and transmission electron microscopy. This demonstrated that the bacterium was able to colonize the surface of hypha and macrospore of F. oxysporum f. sp. cubense. Mycelial deformation, terminal and/or intercalary swelling were evident. At later stages, hyphae of F. oxysporum f.sp. cubense, colonized by B. cepacia, were found to have collapsed. Further studies in vivo confirmed that B. cepacia colonized the hypha of F. oxysporum f. sp. cubense which had invaded banana roots. TEM observation showed that in the banana plant B. cepacia was closely associated with the healthy banana roots and a matrix was frequently found to be present between the bacterium and the plant surface. In addition, B. cepacia exists mainly in the intercellular space of the banana roots. UV irradiation treatment of B. cepacia resulted in a mutant that had lost inhibitory activity against F. oxysporum f. sp. cubense on TSA agar. Transposon mutagenesis of B. cepacia was performed by Tn5 insertion. Six mutants which had lost or had reduced inhibitory activity against F. oxysporum f. sp. cubense were generated. These mutants showed no inhibitory zones on TSA medium in the presence of the fungus. It was observed that one mutants. cepacia :: Tn5-188 appeared to lose the ability to colonize the fungal hypha, whilst a different mutant B. cepacia ::Tn5 - 217 was still able to colonize the fungal hyphae. TLC analyses showed that there was a decrease in antibiotic production in mutants B. cepacia :: Tn5 - 217 and B. cepacia - UV - 34, compared with the wild type. GC- MS analyses showed that there was no evidence of the peaks at 14.62 minutes, 20.0 minutes and 20.46 minutes in both chromatograms of mutants B. cepacia :: Tn5 -217 and 8. cepacia -UV - 34, compared with the wild type B. cepacia. No PCR products were detected using primers that were developed from sequences within the biosynthetic loci for Phi of P.fluorescens Q2-87(GenBank accession no. U41818) and PCA of P. fluorescens 2-79 (GeneBank no. L48616). Colony hybridization suggested that genomic DNA from B. cepacia could contain both Phi- and PCA probes. It was found that hybridization of genomic DNA digested with Cla-I of B. cepaca with Phl2a probe only occurred at low stringency. A hybridization signal was detected from a Cla-l fragment of approximately 2800bp. / Thesis (M.Sc.)-University of Natal, Pietermaritzburg, 1997.

Bactérias psicrotróficas foram isoladas de leite cru refrigerado oriundo de duas indústrias de beneficiamento localizadas no sul do Brasil. Contagens de bactérias psicrotróficas foram entre 4,9 e 7,8 logUFC/mL e de 5,3 a 7,2 logUFC/mL, em amostras coletadas no caminhão-tanque e no silo de armazenamento da indústria, respectivamente. Dentre as bactérias isoladas, 90% foram Gram-negativas. A maioria das cepas apresentaram baixa atividade proteolítica, mas cepas de Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca e Aeromonas sp. apresentaram valores superiores a 20 U/mL em azocaseina como substrato. Proteases das cepas selecionadas foram resistentes aos tratamentos térmicos convencionais e causaram coagulação de leite UAT depois de cinco dias de estocagem em temperatura ambiente. A atividade proteolítica de uma variedade psicrotrófica de Burkholderia cepacia isolada de leite cru refrigerado foi caracterizada. A atividade proteolítica na azocaseina apresentou atividade máxima com pH 6-7 e decréscimo com pHs ácido e alcalino. A enzima apresentou relativa estabilidade térmica entre 40-55°C durante 25 min, mantendo pelo menos 80% de sua atividade inicial a 40°C. O ensaio de coagulação do leite demostrou que a protease da B. cepacia causou coagulação do leite desnatado a partir do segundo dia, enquanto a coagulação do leite integral foi observada a partir do quinto dia. A aderência desta cepa ao aço inoxidável foi avaliada e os substratos apresentaram níveis de cerca de 107 UFC/cm², independente dos diferentes tempos de imersão. A cepa denominada de 1A4 apresentou expressiva atividade proteolítica em pH 6-7 e 40ºC, atividade de coagulação do leite e capacidade de aderir ao aço inoxidável. Estes resultados indicam que B. cepacia representa um potencial perigo a qualidade do leite e produtos lácteos. / Psychrotrophic bacteria were isolated from refrigerated raw milk of two processing plants at Southern Brazil. Psychrotrophic counts were between 4.9 and 7.8 log CFU/mL, and 5.3 to 7.2 log CFU/mL, for samples collected at the truck and the milk storage silo, respectively. Among the bacterial isolates, 90% were Gram-negative. Most strains presented low proteolytic activity, but strains of Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca and Aeromonas sp. showed higher than 20 U/mL on azocasein as substrate. Crude proteases from selected strains were resistant to conventional heat treatments and caused coagulation of UHT milk after 5 days storage at room temperature. The proteolytic activity of a psychrotrophic strain of Burkholderia cepacia isolated from refrigerated raw milk was characterized. The proteolytic activity on azocasein showed maximum activity at pH 6-7 and decrease at acid and alkaline pHs. The enzyme showed relative thermal stability in the range 40-55°C during 25 min, maintaining at least 80% its initial activity at 40°C. Milk coagulation assay showed that the crude protease from B. cepacia caused coagulation from day 2 for skimmed milk, whereas coagulation was observed from day 5 for whole milk. The adherence of this strain to stainless steel was evaluated, and the substrata had around 107CFU/cm², regardless the different immersion time evaluated. The strain 1A4 showed elevated proteolytic activity at pH 6-7 and 40ºC, high milk coagulating-activity, and elevated capability to adhere to stainless steel. These results indicate that B. cepacia may represent a potential hazadous to milk and dairy products.