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O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) é um grupo de 17 espécies intimamente relacionadas que estão associadas à deterioração pulmonar e aumento da mortalidade em pacientes com Fibrose Cística (FC). Essas espécies variam entre si em relação à prevalência, quadros clínicos e virulência. Pouco é conhecido em relação ao perfil de resistência aos antimicrobianos. Uma vez estabelecida a infecção, a abordagem terapêutica e as medidas de controle atualmente adotadas são baseadas no CBc, sem considerar cada espécie em particular. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência das espécies do CBc em pacientes atendidos em dois centros de referência no Rio de Janeiro, bem como estabelecer perfis de resistência a antimicrobianos e avaliar a diversidade molecular entre as espécies. Cem amostras do CBc isoladas de 38 pacientes com FC no período de janeiro de 2010 a fevereiro de 2012 foram identificadas por métodos fenotípicos e pelo sequenciamento do gene recA. As CIMs para amicacina, aztreonam, ceftazidima, trimetoprim/sulfametoxazol e tobramicina foram determinadas por microdiluição e a genotipagem das espécies foi realizada por PFGE com a enzima SpeI. B. vietnamiensis (44%) foi a espécie mais prevalente, seguida de B. cenocepacia IIIA (36%), B. multivorans (10%), B. cenocepacia IIIB (1%) e B. stabilis (1%). Cinco por cento das amostras não foram identificadas. B. vietnamiensis foi identificada em mais da metade dos pacientes (58,3%). Foram observadas diferenças no perfil de susceptibilidade entre as espécies do CBc. B. cenocepacia IIIA foi a espécie que apresentou as maiores taxas de resistência aos antimicrobianos, sobretudo para trimetoprim/ sulfametoxazol (80,5%), principal antimicrobiano utilizado no tratamento de infecções causadas pelo CBc. Amostras com perfis MDR ocorreram em todas as espécies, destacando-se o perfil A, resistente simultaneamente aos cinco antimicrobianos, observado em 58,8% das amostras de B.cenocepacia IIIA. A análise do polimorfismo genético mostrou que, apesar de B. vietnamiensis ter sido a espécie mais prevalente, a ocorrência de nove grupos clonais sugere que a aquisição dessas cepas tenha se dado a partir de uma fonte ambiental comum. Para B. cenocepacia IIIA, 52,9% das amostras foram atribuídas a um mesmo grupo clonal (BcA), compartilhado entre nove pacientes atendidos em um mesmo centro de referência. Oitenta por cento dessas amostras apresentaram ainda resistência a todos os antimicrobianos testados. Os dados mostram que, mesmo com o emprego de técnicas moleculares, é difícil a identificação do CBc em nível de espécie; que B. cenocepacia IIIA é caracterizada por índices de resistência superiores às outras espécies e que a transmissão cruzada entre os indivíduos aponta para a necessidade do estabelecimento de medidas de vigilância do CBc nos centros de referência. / The Burkholderia cepacia complex (BCC) is a group of 17 closely related species that are associated with pulmonary deterioration and increased mortality in patients with Cystic Fibrosis (CF). These species differ from each other in prevalence, clinical status and virulence. Little is known about the profile of antimicrobial resistance. Once the infection, the therapeutic approach and the control measures currently adopted are based on BcC, without considering each particular species. The aim of this study was to determine the prevalence of BcC species in patients from two reference centers in Rio de Janeiro, as well as establishing antimicrobial resistance profiles and assess the molecular diversity among them. One hundred samples of BcC isolates from 38 CF patients from January 2010 to February 2012 were identified by phenotypic methods and by sequencing the recA gene. The MIC for amikacin, aztreonam, ceftazidime, trimethoprim /sulfamethoxazole and tobramycin were determined by microdilution species and genotyping was carried out by PFGE with the enzyme SpeI. B. vietnamiensis (44%) was the most prevalent species, followed by B. cenocepacia IIIA (36%), B. multivorans (10%), B. cenocepacia IIIB (1%) and B. stabilis (1%). Five percent of the samples were not identified. B. vietnamiensis was identified in over half of patients (58.3%). There were differences in susceptibility profiles among BcC species. B. cenocepacia IIIA showed the highest rates of antimicrobial resistance, particularly to trimethoprim/ sulfamethoxazole (80.5%), primary antimicrobial used to treat infections caused by BcC. Samples with MDR profiles were observed for all species, highlighting the profile A, simultaneously resistant to five antibiotics, observed in 58.8% of B.cenocepacia IIIA samples. The analysis of genetic polymorphism showed that despite B. vietnamiensis was the most prevalent species, the occurrence of nine clonal groups suggests that these strains acquisition has taken place from a common environmental source. For B. cenocepacia IIIA, 52.9% of the samples were assigned to the same clonal group (BcA), shared among nine patients treated at a single referral center. Eighty percent of these samples also showed resistance to all antimicrobials tested. The data show that, even with the use of molecular techniques, the identification of BcC on species level is difficult; that B. cenocepacia IIIA is characterized by higher levels of resistance to other species and that the cross transmission between individuals points to the need for the establishment of BcC surveillance in reference centers.

O Complexo Burkholderia cepacia (CBc) é um grupo de 17 espécies intimamente relacionadas que estão associadas à deterioração pulmonar e aumento da mortalidade em pacientes com Fibrose Cística (FC). Essas espécies variam entre si em relação à prevalência, quadros clínicos e virulência. Pouco é conhecido em relação ao perfil de resistência aos antimicrobianos. Uma vez estabelecida a infecção, a abordagem terapêutica e as medidas de controle atualmente adotadas são baseadas no CBc, sem considerar cada espécie em particular. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência das espécies do CBc em pacientes atendidos em dois centros de referência no Rio de Janeiro, bem como estabelecer perfis de resistência a antimicrobianos e avaliar a diversidade molecular entre as espécies. Cem amostras do CBc isoladas de 38 pacientes com FC no período de janeiro de 2010 a fevereiro de 2012 foram identificadas por métodos fenotípicos e pelo sequenciamento do gene recA. As CIMs para amicacina, aztreonam, ceftazidima, trimetoprim/sulfametoxazol e tobramicina foram determinadas por microdiluição e a genotipagem das espécies foi realizada por PFGE com a enzima SpeI. B. vietnamiensis (44%) foi a espécie mais prevalente, seguida de B. cenocepacia IIIA (36%), B. multivorans (10%), B. cenocepacia IIIB (1%) e B. stabilis (1%). Cinco por cento das amostras não foram identificadas. B. vietnamiensis foi identificada em mais da metade dos pacientes (58,3%). Foram observadas diferenças no perfil de susceptibilidade entre as espécies do CBc. B. cenocepacia IIIA foi a espécie que apresentou as maiores taxas de resistência aos antimicrobianos, sobretudo para trimetoprim/ sulfametoxazol (80,5%), principal antimicrobiano utilizado no tratamento de infecções causadas pelo CBc. Amostras com perfis MDR ocorreram em todas as espécies, destacando-se o perfil A, resistente simultaneamente aos cinco antimicrobianos, observado em 58,8% das amostras de B.cenocepacia IIIA. A análise do polimorfismo genético mostrou que, apesar de B. vietnamiensis ter sido a espécie mais prevalente, a ocorrência de nove grupos clonais sugere que a aquisição dessas cepas tenha se dado a partir de uma fonte ambiental comum. Para B. cenocepacia IIIA, 52,9% das amostras foram atribuídas a um mesmo grupo clonal (BcA), compartilhado entre nove pacientes atendidos em um mesmo centro de referência. Oitenta por cento dessas amostras apresentaram ainda resistência a todos os antimicrobianos testados. Os dados mostram que, mesmo com o emprego de técnicas moleculares, é difícil a identificação do CBc em nível de espécie; que B. cenocepacia IIIA é caracterizada por índices de resistência superiores às outras espécies e que a transmissão cruzada entre os indivíduos aponta para a necessidade do estabelecimento de medidas de vigilância do CBc nos centros de referência. / The Burkholderia cepacia complex (BCC) is a group of 17 closely related species that are associated with pulmonary deterioration and increased mortality in patients with Cystic Fibrosis (CF). These species differ from each other in prevalence, clinical status and virulence. Little is known about the profile of antimicrobial resistance. Once the infection, the therapeutic approach and the control measures currently adopted are based on BcC, without considering each particular species. The aim of this study was to determine the prevalence of BcC species in patients from two reference centers in Rio de Janeiro, as well as establishing antimicrobial resistance profiles and assess the molecular diversity among them. One hundred samples of BcC isolates from 38 CF patients from January 2010 to February 2012 were identified by phenotypic methods and by sequencing the recA gene. The MIC for amikacin, aztreonam, ceftazidime, trimethoprim /sulfamethoxazole and tobramycin were determined by microdilution species and genotyping was carried out by PFGE with the enzyme SpeI. B. vietnamiensis (44%) was the most prevalent species, followed by B. cenocepacia IIIA (36%), B. multivorans (10%), B. cenocepacia IIIB (1%) and B. stabilis (1%). Five percent of the samples were not identified. B. vietnamiensis was identified in over half of patients (58.3%). There were differences in susceptibility profiles among BcC species. B. cenocepacia IIIA showed the highest rates of antimicrobial resistance, particularly to trimethoprim/ sulfamethoxazole (80.5%), primary antimicrobial used to treat infections caused by BcC. Samples with MDR profiles were observed for all species, highlighting the profile A, simultaneously resistant to five antibiotics, observed in 58.8% of B.cenocepacia IIIA samples. The analysis of genetic polymorphism showed that despite B. vietnamiensis was the most prevalent species, the occurrence of nine clonal groups suggests that these strains acquisition has taken place from a common environmental source. For B. cenocepacia IIIA, 52.9% of the samples were assigned to the same clonal group (BcA), shared among nine patients treated at a single referral center. Eighty percent of these samples also showed resistance to all antimicrobials tested. The data show that, even with the use of molecular techniques, the identification of BcC on species level is difficult; that B. cenocepacia IIIA is characterized by higher levels of resistance to other species and that the cross transmission between individuals points to the need for the establishment of BcC surveillance in reference centers.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-11-28T12:42:51Z No. of bitstreams: 1 Walkiria Alves da Silva.pdf: 874748 bytes, checksum: 5da61c26a69ee185c1ff223877497242 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-28T12:42:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Walkiria Alves da Silva.pdf: 874748 bytes, checksum: 5da61c26a69ee185c1ff223877497242 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / The onion is the third vegetable in economic importance on the world, with emphasis on Brazil as one of the most economically important vegetable, both by the volume and the income produced. This culture can be affected by various diseases, especially the scale rot, caused by bacteria of the Burkholderia cepacia complex. In an attempt to determine the favorable conditions for the development of epidemics, the knowledge of host-pathogen-environment interaction is essential. Thus, the appropriate inoculum concentration, the temperature range, the period of humidification exposure and the age, which the plant host becomes more susceptible to the establishment of high levels of disease, should be identified for each host-pathogen association. Although these epidemiological characteristics are the key factors for infection and subsequent development of rot in scale, there is no consistent information about the influence of these parameters on the behavior of the disease. Therefore, this study aimed to select and identify six isolates of B. cepacia complex, and determine the in vitro temperature, evaluate the effect of the inoculum concentration, temperature, presence and exposure to moisture chamber and the age of the bulbs in the severity of scale rot onion. Through Bayesian inference, the isolates CRMB31, and CRMB109 CRMB259 were identified as B. cenocepacia, while the isolates CRMB76, and CRMB199 CRMB222 were identified as B. arboris. The optimum temperature for in vitro growth of the isolates B. cenocepacia was 30°C, while for the isolates of B. arboris was 28°C. The conditions that predispose the occurrence of rot severity scale at higher inoculum were load of 108 CFU/mL, together on a wetness of 48 h, temperature between 35 and 40°C and more young tissues. To our knowledge, this is the first study to determine the environmental factors favorable to the development of rot in onion scale. In addition, the information obtained in this study will be useful for understanding the epidemics of the rot in scale and will assist in the implementation of strategies to control the disease. / A cebola é a terceira hortaliça em importância econômica no mundo, tendo destaque no Brasil como uma das hortaliças economicamente mais importantes, tanto pelo volume produzido como pela renda gerada. Esta cultura pode ser acometida por várias doenças, destacando-se a podridão em escama causada por bactérias do complexo Burkholderia cepacia. Na tentativa de determinar as condições favoráveis ao desenvolvimento de epidemias, o conhecimento da interação patógeno-hospedeiro-ambiente é imprescindível. Assim sendo, a concentração de inóculo adequada, a faixa de temperatura, o período de exposição à umidificação e a idade em que a planta hospedeira se torna mais suscetível para o estabelecimento de altos níveis de doença devem ser definidos para cada associação patógeno-hospedeiro. Embora essas características epidemiológicas sejam fatores primordiais para infecção e posterior desenvolvimento da podridão em escama, não existem informações consistentes a respeito da influência desses parâmetros sobre o comportamento da doença. Portanto, o presente trabalho teve como objetivos selecionar e identificar seis isolados do complexo B. cepacia e determinar a temperatura in vitro, avaliar o efeito da concentração de inóculo, temperatura, presença e tempo de exposição à câmara úmida e idade dos bulbos na severidade da podridão em escama da cebola. Por meio de Inferência Bayesiana, os isolados CRMB31, CRMB109 e CRMB259 foram identificados como B. cenocepacia, enquanto os isolados CRMB76, CRMB199 e CRMB222 foram identificados como B. arboris. A temperatura ideal de crescimento in vitro para os isolados de B. cenocepacia foi de 30°C, enquanto para os isolados de B. arboris foi de 28°C. As condições que predispuseram a ocorrência de severidade da podridão em escama mais elevadas foram carga de inóculo de 108 UFC/mL, em conjunto com um período de molhamento de 48 h, temperaturas entre 35 e 40°C e tecidos mais novos. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo realizado para determinação dos fatores ambientais favoráveis ao desenvolvimento da podridão em escama da cebola. Além disso, as informações obtidas neste estudo serão úteis para o entendimento de epidemias da podridão em escama e auxiliarão a implementação de estratégias para o controle da doença.

Cystic Fibrosis (CF) is a common autosomal genetic disorder in Caucasian populations. CF is caused by mutations in the cftr gene, which encodes the CF transmembrane conductance regulator (CFTR). CFTR regulates chloride and sodium ion transport across the epithelial cells lining the exocrine organs. Mutations in the cftr result in a failure to mediate chloride transport, which leads to dehydration of the mucus layer surrounding the epithelial cells. The mucus coating in the lung epithelia provides a favorable environment for invasion and growth of several opportunistic bacterial pathogens resulting in life threatening respiratory infections in CF patients. Pseudomonas aeruginosa(Pa) and Burkholderia cepacia complex (Bcc) are associated with chronic lung infections and are responsible for much of the mortality in CF. Little is known about interactions between these two, often co-infecting, species. When in competition, it is not known whether Bcc replaces the resident Pa or if the two species co-exist in the CF lung. Bacteriocins are potent toxins produced by bacteria. They have a quite narrow killing range in comparison to antibiotics and have been implicated in intra-specific and inter-specific bacterial competition brought on by limited nutrients or niche space. Both Pa and Bcc produce bacteriocins known as pyocins and cepaciacins, respectively. More than 90% of Pa strains examined to date produce one or more of three pyocin types: R, F, and S. A limited number of phenotypic surveys suggest that approximately 30% of Bcc also produce bacteriocins. The goals of my thesis study were to determine if clinical strains of Pa and Bcc produce bacteriocins and to determine whether these toxins play a role in mediating intra- and inter-specific bacterial interactions in the CF lung. The final goal was to identify novel bacteriocins from clinical Pa and Bcc strains. First, I designed a phenotypic bacteriocin survey to evaluate bacteriocin production in 66 clinical Pa (38) and Bcc (28) strains procured from CF patients. This study revealed that 97% of Pa strains and 68% of Bcc strains produce bacteriocin-like inhibitory activity. Further phenotypic and molecular based assays showed that the source of inhibition is different for Pa and Bcc. In Pa, much of the inhibitory activity is due to the well known S- and RF-type pyocins. S-and RF pyocins were the source of within species inhibitory activity while RF pyocins were primarily implicated in the between species inhibitory activity of Pa strains. In contrast, Bcc inhibition appeared to be due to novel inhibitory agents. Finally, I constructed genome libraries of B. multivorans, B. dolosa, and B. cenocepacia to screen for genes responsible for the inhibitory activity previously described in Bcc. ~10,000 clones/genome were screened, resulting in fifteen clones with the anticipated inhibition phenotype. Of these fifteen, only five clones had stable inhibitory activity. These clones encoded proteins involved in various metabolic pathways including bacterial apoptosis, amino acid biosynthesis, sugar metabolism, and degradation of aromatic compounds. Surprisingly, none of Bcc clones possessed typical bacteriocin-like genes. These data suggest that, in contrast to all bacterial species examined in a similar fashion to date, Bcc may not produce bacteriocins. Instead, Bcc may be using novel molecular strategies to mediate intra- and inter-specific bacterial interactions.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil e nos últimos anos está recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da área cultivada e produção de etanol para uso como biocombustível. Considerando-se sua importância econômica e a possibilidade do uso de plantas geneticamente modificadas, essa cultura tem se tornado foco de pesquisas relacionadas à produtividade e sustentabilidade. Neste contexto, o estudo de comunidades microbianas associadas à cana-de-açúcar é de fundamental importância, pois além dessas comunidades desempenharem importante papel funcional na interação com a planta, os estudos realizados nas condições tropicais são limitados. Comunidades de fungos e bactérias associadas à cana-de-açúcar geneticamente modificada IMI-1 e sua isolinha convencional SP80-1842 foram sistematicamente isoladas de plantas cultivadas em área experimental em Piracicaba, SP, Brasil. Por meio de isolamento e PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) foi verificado que a transgenia não afeta a diversidade da comunidade fúngica associada à cana-deaçúcar. A diversidade dessas comunidades foi descrita e caracterizada molecularmente. O fungo Fusarium moniliforme apresentou alta freqüência de isolamento e também foi observado que o gene da endopoligalacturonase, pgIII, desempenha um importante papel no tipo de associação, endofítica ou patogênica, do F. moniliforme e a planta. O complexo Burkholderia cepacia constitui uma importante fração da comunidade de bactérias associada à cana-de-açúcar no Brasil e isolados deste complexo são capazes de inibir o crescimento do patógeno F. moniliforme. Análises filogenéticas indicaram que os isolados de bactérias endofíticas de Burkholderia são proximamente relacionados com linhagens-tipo do complexo B. cepacia isoladas de pacientes de fibrose cística. / In Brazil, the sugarcane is one of the most important cultivated crops. The sugarcane has received increased interest in the last years because of increase of the cultivated area and ethanol production to be used as biofuel. Considering its economical importance and the possibility of the use of the genetically modified plants; this crop has become the aim of current research for productivity and sustainability. In this context, the work on microbial communities associated with sugarcane is remarkable, because both, these communities play important functional role in the interaction with the plant, and studies performed in tropical conditions are limited as well. Fungal and bacterial communities associated with genetically modified sugarcane IMI-1 and its conventional isoline SP80-1842 were systematically isolated from plants cultivated in an experimental area in Piracicaba, SP, Brazil. The fungal communities associated with sugarcane were accessed by means of cultivation approach and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis; the results revealed that these communities are not affected by transgeny. The microbial communities\' diversity was characterized and identified by using molecular tools. The fungus Fusarium moniliforme showed high frequency in association with the plant and it was observed that the endopolygalacturonase gene, pgIII, plays important role in order to determine the sort of association, either endophytic or pathogenic, between F. moniliforme and the host. The Burkholderia cepacia complex is an integral part of the endophytic bacterial community of sugarcane in Brazil and isolates of this complex are able to control F. moniliforme growth. Phylogenetic analyses indicated that the endophytic Burkholderia are closely related to clinical isolates of the B. cepacia complex isolated from cystic fibrosis patients.

Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil e nos últimos anos está recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da área cultivada e produção de etanol para uso como biocombustível. Considerando-se sua importância econômica e a possibilidade do uso de plantas geneticamente modificadas, essa cultura tem se tornado foco de pesquisas relacionadas à produtividade e sustentabilidade. Neste contexto, o estudo de comunidades microbianas associadas à cana-de-açúcar é de fundamental importância, pois além dessas comunidades desempenharem importante papel funcional na interação com a planta, os estudos realizados nas condições tropicais são limitados. Comunidades de fungos e bactérias associadas à cana-de-açúcar geneticamente modificada IMI-1 e sua isolinha convencional SP80-1842 foram sistematicamente isoladas de plantas cultivadas em área experimental em Piracicaba, SP, Brasil. Por meio de isolamento e PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) foi verificado que a transgenia não afeta a diversidade da comunidade fúngica associada à cana-deaçúcar. A diversidade dessas comunidades foi descrita e caracterizada molecularmente. O fungo Fusarium moniliforme apresentou alta freqüência de isolamento e também foi observado que o gene da endopoligalacturonase, pgIII, desempenha um importante papel no tipo de associação, endofítica ou patogênica, do F. moniliforme e a planta. O complexo Burkholderia cepacia constitui uma importante fração da comunidade de bactérias associada à cana-de-açúcar no Brasil e isolados deste complexo são capazes de inibir o crescimento do patógeno F. moniliforme. Análises filogenéticas indicaram que os isolados de bactérias endofíticas de Burkholderia são proximamente relacionados com linhagens-tipo do complexo B. cepacia isoladas de pacientes de fibrose cística. / In Brazil, the sugarcane is one of the most important cultivated crops. The sugarcane has received increased interest in the last years because of increase of the cultivated area and ethanol production to be used as biofuel. Considering its economical importance and the possibility of the use of the genetically modified plants; this crop has become the aim of current research for productivity and sustainability. In this context, the work on microbial communities associated with sugarcane is remarkable, because both, these communities play important functional role in the interaction with the plant, and studies performed in tropical conditions are limited as well. Fungal and bacterial communities associated with genetically modified sugarcane IMI-1 and its conventional isoline SP80-1842 were systematically isolated from plants cultivated in an experimental area in Piracicaba, SP, Brazil. The fungal communities associated with sugarcane were accessed by means of cultivation approach and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis; the results revealed that these communities are not affected by transgeny. The microbial communities\' diversity was characterized and identified by using molecular tools. The fungus Fusarium moniliforme showed high frequency in association with the plant and it was observed that the endopolygalacturonase gene, pgIII, plays important role in order to determine the sort of association, either endophytic or pathogenic, between F. moniliforme and the host. The Burkholderia cepacia complex is an integral part of the endophytic bacterial community of sugarcane in Brazil and isolates of this complex are able to control F. moniliforme growth. Phylogenetic analyses indicated that the endophytic Burkholderia are closely related to clinical isolates of the B. cepacia complex isolated from cystic fibrosis patients.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns Bastonetes Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicação em infecções é subestimada. Devido à similaridade fenotípica, mudanças taxonômicas, baixa reatividade bioquímica e limitações nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificação de BGNNF é frequentemente equivocada, culminando com a denominação de diferentes micro-organismos apenas como BGNNF, por falta de melhor diferenciação. O objetivo desse estudo foi avaliar, por métodos fenotípico convencional, proteômico e molecular, a identificação de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitário no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratório clinico como BGNNF para a identificação por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotípicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espécies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espécies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotípicos incluíram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordância com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nível de espécie foi de 64% (n=30) e apenas em gênero a concordância foi de 17% (n=8). A análise comparativa geral da identificação por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nível de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordância em nível de espécie para 60%. As discordâncias parecem ser devido às diferenças nos perfis proteicos das amostras em relação às amostras-referência do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualização de perfis no sistema. A análise do polimorfismo genético de B. contaminans mostrou a ausência de um clone disseminado causando surto, além da provável origem ambiental das infecções. Os setores de nefrologia e hemodiálise contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as culturas, respectivamente. As discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificação das espécies do CBc. Os BGNNF incomuns são de difícil caracterização independente da metodologia usada e nenhum método por si só foi capaz de identificar todas as amostras. / Some nonfermenting Gram-negative Bacilli (NFGNB) are considered of low clinical significance, and their implication in infections is usually underestimated. Due to their phenotypic similarities, frequent taxonomic changes and low biochemical reactivity, as well as to limitations of bacterial identification commercial system databases, these NFGNB are frequently misidentified and are collectively referred to as NFGNB group, in the lack of a better differentiation. The aim of the present study was to evaluate the performance of the conventional phenotypic method, the proteomic matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectometry method (MALDI-TOF MS) and of molecular methods (16S RNA and recA gene sequencing) in the identification of 78 unusual NFGNB isolated from blood cultures of pacients treated at an university hospital in Rio de Janeiro. Clonality of the predominant species identified within these isolates was determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). By the 16S rRNA gene sequence analysis, most strains (n = 31; 40%) were included in the Burkholderia spp. followed by Pseudomonas stutzeri (n = 8; 10%), Delftia acidovorans (n = 3; 4%) and Stenotrophomonas maltophilia (n = 3; 4%). The remaining bacterial isolates were included in 27 different species. By the recA gene sequencing technique, most bacteria from the Burkholderia cepacia complex (BCC), samples were classified as Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Phenotypic tests provided accurate identification of all 31 isolates included in the BCC by the 16S rRNA gene sequence analysis. For the other 47 samples, agreement of the results obtained with these two techniques in species and genus level identifications occurred in 30 (63,8%) and 17 samples (36,2%), respectively. The results obtained by the MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene sequencing methods agreed at species and genus levels in 33 (42%) and 35 isolates (45%), respectively. When bacteria from the BCC were excluded from the analysis, the agreement between the two techniques at species level increased to 60%. Misidentification by the MALDI-TOF MS method may be due to differences in protein spectra between the samples and the reference strains in the equipment database. PFGE analysis of B. contaminans isolates revealed the absence of a disseminate clone causing an outbreak, and the probable environmental source of infections. The nefrology ang dialisis sectors contributed to the greatest number of patients with positive cultures (5 pacients and 9 isolates). Clones BcoD and BcoE were found in blood cultures of pacientes treated in a same sector with differences of 4 months (BcoD, nefrology) and 1.5 year (BcoE, dialisis). The misidentifications occurred mainly due to the hard differentiation of BCC species. Unusual NFGNB are of difficult characterization whatever the methodology used and no method alone was able to identify all the isolates.