A homocistinúria (HHCY) é uma desordem metabólica causada algum tipo de deficiência no metabolismo da metionina, folato ou vitamina B12, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína (Hcy) e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a relação entre HHCY e desordens no sistema nervoso, entre eles podemos destacar mecanismos glutamatérgicos, mobilização de Ca+2 e envolvimento de espécies reativas de oxigênio (ROS). Considerando que o citoesqueleto é um importante alvo para a sinalização celular em inúmeras doenças neurodegenerativas, nosso estudo investigou os possíveis efeitos tóxicos da Hcy sobre alguns parâmetros bioquímicos do citoesqueleto neural. Ratos submetidos a um tratamento crônico com Hcy apresentam uma marcada seletividade na alteração da expressão gênica das subunidades dos filamentos intermediários (FIs) estudados, tanto no extrato tecidual total como na fração citoesquelética de hipocampo e córtex cerebral, refletindo uma maior susceptibilidade do hipocampo nessas alterações. Estudos in vitro mostraram que a Hcy 100 e 500 μM, relacionadas a homocistinuria (HHCY) moderada e grave respectivamente, são capazes de causar hiper (Hcy 100 μM) ou hipofosforilação (Hcy 500 μM) das subunidades dos neurofilamentos e da proteina glial fibrilar ácida, FIs do citoesqueleto de neurônios e astrócitos respectivamente. Estes efeitos são dependentes da idade dos ratos e da estrutura cerebral, manifestando-se em hipocampo de ratos de 17 dias de idade. Resultados em fatias de hipocampo mostraram que a ação das duas concentrações de Hcy é mediada por mecanismos dependentes do influxo de Ca2+ por receptores NMDA e por canais de Ca2+ dependentes de voltagem, assim como da liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, enfatizando a alta suscetibilidade e complexidade das vias de sinalização ativadas por Ca2+ no hipocampo. Além disso, estudos morfológicos em astrócitos e células de glioma C6 mostraram que células glias em cultura também são alvo para as ações da Hcy, reorganizando seu citoesqueleto e alterando o sistema fosforilante associado ao mesmo através de mecanismos envolvendo excitotoxicidade, estresse oxidativo e mecanismos glutamatérgicos. Estes estudos mostram que a integridade estrutural do citoesqueleto é da maior importância para o funcionamento neuronal e qualquer distúrbio na dinâmica desta estrutura poderia ativar processos de reparação plástica manifestados como alterações na expressão, localização e metabolismo das proteínas do citoesqueleto. No entanto, os mecanismos através dos quais o desequilíbrio do citoesqueleto é capaz de induzir a disfunção neural ainda não foram esclarecidos e a exata dimensão destas alterações precisa ser determinada. / The homocystinuria (HHCY) is a metabolic disorder caused by deficiency in the metabolism of methionine, vitamin B12 or folate, which leads to tissue accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine. Homocystinuric patients usually present mental retardation, cerebral ischemia, seizures, and atherosclerosis. Several mechanisms have been proposed to explain the relationship between HHCY and nervous system disorders, among them we can highlight glutamatergic mechanisms, mobilization of Ca+2 and involvement of reactive oxygen species (ROS). Considering that the cytoskeleton is an important target for cellular signaling in many neurodegenerative diseases, our study investigated the possible toxic effects of Hcy on some biochemical parameters of the neural cytoskeleton. Initially, we demonstrated that rats subjected to chronic model of Hcy showed a marked selectivity in alterations of gene expression, total immunocontent and cytoskeletal fraction of subunits of intermediate filaments (IFs) studied, reflecting a greater susceptibility of the hippocampus in these changes. In vitro studies showed that 100 and 500 μM Hcy associated with moderate and severe HHCY respectively, was able to induced hyperphosphorylation (Hcy 100 μM) and hypophosphorylation (Hcy 500 μM) of neurofilaments subunits and glial fibrillary acidic protein, IFs of neuronal and astrocytic cytoskeleton. These effects are dependentents of age and cerebral structure of rats: hippocampus of 17 day old rats are sensible. Results in slices of hippocampus showed that the action of Hcy is mediated by mechanisms dependent of influx of Ca2+ by NMDA receptors and Ca2+ channels voltage-dependent and release of Ca2+ from intracellular stores, emphasizing the high susceptibility and complexity of signaling pathways activated by Ca2+ in the hippocampus. In addition, glial cells were also target for the actions of Hcy, reorganizing their cytoskeleton and changing the phosphorylation system associated to cytoskeleton through mechanisms involving excitotoxicity, oxidative stress and glutamatergic mechanisms. The cytoskeleton may represent a target to HHCY and your dysfunction can have an important role in neurodegeneration characteristic of the disease. However, the mechanisms by which disruption of the cytoskeleton proteins is able to induce neural dysfunction have not yet been clarified and the exact extent of these changes need to be determined.

Um possível mecanismo de dano ao tecido induzido por hiperglicemia persistente na diabetes mellitus é a formação de produtos avançados de glicação (AGEs). Endogenamente, açúcares reduzidos reagem não enzimaticamente com grupos amino de proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos através de uma série de reações que formam bases de Shiff seguida da formação de produtos de Amadori para a produção de AGEs. O glioxal e o metilglioxal são espécies reativas de carbonilas com ação de glicação, formados pela degradação de proteínas glicadas, intermediários glicolíticos e peroxidação lipídica e reagem com proteínas para formar os AGEs. No presente estudo nós avaliamos os efeitos dos glioxais in vitro sobre o metabolismo dos aminoácidos glicina, leucina e alanina, bem como sobre o metabolismo da glicose, lactato, acetato e glutamina em córtex cerebral de ratos Wistar de 10 dias de idade pós-natal e aos 3 meses de idade pós natal. Para verificar estes efeitos na incorporação à proteínas, síntese lipídica e produção de CO2 utilizamos os seguintes substratos: 0,2 mM de alanina, 0,2 mM glicina, 0,2 mM leucina, 2,0 mM glutamina, 5mM de glicose, ou 10mM de lactato ou 1mM de acetato As fatias de córtex cerebral foram incubadas com os substratos descritos a 37ºC em ambiente fechado. O CO2 captado foi determinado em contador de cintilação líquida. O homogeneizado foi lavado com TCA 10% para a extração dos lipídios com Clorofórmio:Metanol (2:1), e acrescentado o líquido de cintilação, a radioatividade incorporada foi determinada em contador de cintilação líquida. O precipitado resultante foi dissolvido em ácido fórmico para medida de incorporação a proteínas. Concluímos que os efeitos do glioxal foram superiores aos efeitos do metilglioxal sobre o metabolismo dos aminoácidos estudados; Os glioxais (glioxal e metilglioxal) não tiveram efeitos sobre os parâmetros estudados no metabolismo da glicose, lactato e acetato; Os glioxais não alteraram o metabolismo da glicina e da glutamina em córtex cerebral de ratos adultos; A utilização de antioxidantes (N-acetilcisteína e trolox) no meio de incubação não modificou os efeitos dos glioxais sobre o metabolismo dos aminoácidos; A N-acetilcisteína e a penicilamina exerceram um acentuado efeito sobre o metabolismo dos aminoácidos. O estudo não estabeleceu um mecanismo para os efeitos do glioxal. Especulamos que a quantidade do antioxidante trolox usada não foi suficiente. A N-acetilcisteína e a penicilamina tiveram um efeito próprio que impossibilitou uma conclusão. / A possible way of tissue damage induced by persistent hyperglycemia in diabetes mellitus is the production of advanced glycation end products (AGEs). Endogenously, reduced sugar, like glucose, react not enzimatically with amino groups of proteins, lipids and nucleic acids trough a plenty of reactions which form Shiff bases follow the formation of Amadori products to the next production of AGEs. The glyoxal and mthylglyoxal are reactive carbonyl species with a potential glycation action. They are formed by the degradation of glycated proteins, glycolitic intermediates and lipid peroxidation and react with protein to form AGEs. In the present study we evaluate the effects of the glyoxals in vitro on the metabolism of the amino acids glycine, leucine and alanine and on the metabolism of glucose, lactate, acetate and glutamine in cerebral cortex of Wistar mouse with 10 day old and with 3 months old. To verify this effect on the protein incorporation, lipid synthesis and production of CO2, we used the follow substrates: 2 mM of alanine, or glycine, or leucine, or glutamine, or 5mM of glucose, or 10 mM of lactate or 1mM of acetate. The slices of cerebral cortex were incubated with those substrates at 37ºC. The CO2 captured was determined in a liquid-scintillation counter. The homogenized was washed with TCA 10% for the extraction of lipids with Clorform:Methanol (2:1), and it was add scintillation liquid, the radioactivity incorporated was determined in a liquid-scintillation counter The result precipitate was dissolved in formic acid to the measure of the incorporation to protein. We could conclude that the effects of glyoxal were higher to the effects of methylglioxal on the metabolism of the amino acids studied; Glyoxal and Methylglyoxal didn't show effects on the metabolism of glucose, lactate and acetate; Glyoxals didn't change the metabolism of glycine and glutamine in cerebral cortex of adults Wistar mouse; The utilization of anti-oxidants (N-acetylcysteine and trolox) didn't change the effects of the glyoxals on the metabolism of the amino acids; N-acetylcysteine and penicillamine showed an accentuate effect on the metabolism of the amino acids. This data didn't establish a mechanism for the effects of glyoxal. We speculate that the amount of the antioxidant trolox used in the research wasn't sufficient. The N-acetilcysteine and penicilaminne showed an own effect the reason why we could not find a conclusion.

A homocistinúria (HHCY) é uma desordem metabólica causada algum tipo de deficiência no metabolismo da metionina, folato ou vitamina B12, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína (Hcy) e de metionina. Os pacientes afetados por essa doença apresentam principalmente retardo mental, isquemia cerebral, convulsões e aterosclerose. Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a relação entre HHCY e desordens no sistema nervoso, entre eles podemos destacar mecanismos glutamatérgicos, mobilização de Ca+2 e envolvimento de espécies reativas de oxigênio (ROS). Considerando que o citoesqueleto é um importante alvo para a sinalização celular em inúmeras doenças neurodegenerativas, nosso estudo investigou os possíveis efeitos tóxicos da Hcy sobre alguns parâmetros bioquímicos do citoesqueleto neural. Ratos submetidos a um tratamento crônico com Hcy apresentam uma marcada seletividade na alteração da expressão gênica das subunidades dos filamentos intermediários (FIs) estudados, tanto no extrato tecidual total como na fração citoesquelética de hipocampo e córtex cerebral, refletindo uma maior susceptibilidade do hipocampo nessas alterações. Estudos in vitro mostraram que a Hcy 100 e 500 μM, relacionadas a homocistinuria (HHCY) moderada e grave respectivamente, são capazes de causar hiper (Hcy 100 μM) ou hipofosforilação (Hcy 500 μM) das subunidades dos neurofilamentos e da proteina glial fibrilar ácida, FIs do citoesqueleto de neurônios e astrócitos respectivamente. Estes efeitos são dependentes da idade dos ratos e da estrutura cerebral, manifestando-se em hipocampo de ratos de 17 dias de idade. Resultados em fatias de hipocampo mostraram que a ação das duas concentrações de Hcy é mediada por mecanismos dependentes do influxo de Ca2+ por receptores NMDA e por canais de Ca2+ dependentes de voltagem, assim como da liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, enfatizando a alta suscetibilidade e complexidade das vias de sinalização ativadas por Ca2+ no hipocampo. Além disso, estudos morfológicos em astrócitos e células de glioma C6 mostraram que células glias em cultura também são alvo para as ações da Hcy, reorganizando seu citoesqueleto e alterando o sistema fosforilante associado ao mesmo através de mecanismos envolvendo excitotoxicidade, estresse oxidativo e mecanismos glutamatérgicos. Estes estudos mostram que a integridade estrutural do citoesqueleto é da maior importância para o funcionamento neuronal e qualquer distúrbio na dinâmica desta estrutura poderia ativar processos de reparação plástica manifestados como alterações na expressão, localização e metabolismo das proteínas do citoesqueleto. No entanto, os mecanismos através dos quais o desequilíbrio do citoesqueleto é capaz de induzir a disfunção neural ainda não foram esclarecidos e a exata dimensão destas alterações precisa ser determinada. / The homocystinuria (HHCY) is a metabolic disorder caused by deficiency in the metabolism of methionine, vitamin B12 or folate, which leads to tissue accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine. Homocystinuric patients usually present mental retardation, cerebral ischemia, seizures, and atherosclerosis. Several mechanisms have been proposed to explain the relationship between HHCY and nervous system disorders, among them we can highlight glutamatergic mechanisms, mobilization of Ca+2 and involvement of reactive oxygen species (ROS). Considering that the cytoskeleton is an important target for cellular signaling in many neurodegenerative diseases, our study investigated the possible toxic effects of Hcy on some biochemical parameters of the neural cytoskeleton. Initially, we demonstrated that rats subjected to chronic model of Hcy showed a marked selectivity in alterations of gene expression, total immunocontent and cytoskeletal fraction of subunits of intermediate filaments (IFs) studied, reflecting a greater susceptibility of the hippocampus in these changes. In vitro studies showed that 100 and 500 μM Hcy associated with moderate and severe HHCY respectively, was able to induced hyperphosphorylation (Hcy 100 μM) and hypophosphorylation (Hcy 500 μM) of neurofilaments subunits and glial fibrillary acidic protein, IFs of neuronal and astrocytic cytoskeleton. These effects are dependentents of age and cerebral structure of rats: hippocampus of 17 day old rats are sensible. Results in slices of hippocampus showed that the action of Hcy is mediated by mechanisms dependent of influx of Ca2+ by NMDA receptors and Ca2+ channels voltage-dependent and release of Ca2+ from intracellular stores, emphasizing the high susceptibility and complexity of signaling pathways activated by Ca2+ in the hippocampus. In addition, glial cells were also target for the actions of Hcy, reorganizing their cytoskeleton and changing the phosphorylation system associated to cytoskeleton through mechanisms involving excitotoxicity, oxidative stress and glutamatergic mechanisms. The cytoskeleton may represent a target to HHCY and your dysfunction can have an important role in neurodegeneration characteristic of the disease. However, the mechanisms by which disruption of the cytoskeleton proteins is able to induce neural dysfunction have not yet been clarified and the exact extent of these changes need to be determined.

A hiperprolinemia tipo II é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência severa na atividade da enzima ∆1 – pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, o que resulta em acúmulo tecidual de prolina. Muitos pacientes apresentam manifestações neurológicas como epilepsia e retardo mental. Embora as manifestações neurológicas sejam encontradas em um considerável número de pacientes hiperprolinêmicos, os mecanismos pelos quais estas ocorrem são pouco compreendidos. O estresse oxidativo é um importante processo que vem sendo relatado na patogênese de algumas condições que afetam o sistema nervoso central (SNC), como é o caso das doenças neurodegenerativas, epilepsia e demência. Este fato torna-se facilmente compreensível, visto que o SNC é altamente sensível ao estresse oxidativo, em face do alto consumo de oxigênio; do alto conteúdo lipídico, principalmente de ácidos graxos poliinsaturados, dos altos níveis de ferro e da baixa defesa antioxidante. Considerando que: a) pouco se sabe a respeito dos altos níveis de prolina no SNC, b) a prolina ativa receptores NMDA e é epileptogênica e c) o estresse oxidativo está associado com doenças que afetam o SNC, no presente estudo investigamos os efeitos in vivo e in vitro da prolina sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, como a quimiluminescência, o potencial antioxidante total (TRAP), e sobre as atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSH-Px) e superóxido dismutase (SOD) em córtex cerebral de ratos Wistar. Os resultados mostraram que a administração aguda de prolina aumentou significativamente a quimiluminescência e reduziu o TRAP em córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias. Em contraste, a administração crônica de prolina não alterou estes parâmetros. Todavia, a presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias aumentou significativamente a quimiluminescência e reduziu o TRAP em concentrações de prolina semelhantes àquelas encontradas nos tecidos de pacientes hiperprolinêmicos (0,5 – 1,0 mM). Nossos resultados também mostraram que a administração aguda de prolina não alterou as atividades das enzimas GSH-Px e SOD em córtex cerebral de ratos de 10 e 29 dias, mas diminuiu significativamente a atividade da CAT em ratos de 29 dias. Por outro lado, a administração crônica de prolina não alterou a atividade da enzima SOD, mas significativamente aumentou a atividade da CAT e reduziu a atividade da GSH-Px. Em adição, a presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral reduziu significativamente a atividade da SOD em ratos de 10 dias, permanecendo as atividades da CAT e GSH-Px inalteradas. Todavia, as atividades das enzimas antioxidantes não foram alteradas na presença de prolina no homogeneizado de córtex cerebral de ratos de 29 dias. Os resultados obtidos em nosso trabalho sugerem que o estresse oxidativo induzido pela prolina pode estar envolvido na disfunção cerebral observada na hiperprolinemia tipo II.

A tirosinemia tipo II é um erro inato do metabolismo que se caracteriza por altos níveis plasmáticos e teciduais de tirosina, cujo efeito sobre o Sistema Nervoso Central pode variar de retardo mental leve a grave, podendo estar associado com outras anomalias neurológicas. No presente estudo nosso objetivo foi investigar in vitro e in vivo os efeitos de elevadas concentrações de tirosina sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos de 14 dias de idade. Os resultados mostraram que 1,0-2,0 mM de tirosina inibe in vitro a atividade da creatinaquinase (CK) citosólica e mitocondrial em um padrão dependente da concentração e que esta inibição é prevenida por glutationa reduzida (GSH), sugerindo a alteração de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Os resultados também indicam que somente a atividade da CK mitocondrial é inibida pela tirosina em uma maneira dependente do tempo. Além disso, uma única injeção de L-tirosina metil éster (TME) diminuiu a atividade da CK citosólica e mitocondrial em córtex cerebral de ratos. Observou-se que 2,0 mM de tirosina inibe in vitro a atividade da piruvatoquinase (PK) e que esta inibição é prevenida por GSH nos tempos de 30, 60 e 90 min de pré-incubação. Além disso, a administração TME reduziu a atividade da PK e essa redução é prevenida pelo pré-tratamento com creatina. Por outro lado, a tirosina não alterou a atividade da adenilatoquinase (AK) in vitro, mas a administração de TME aumentou a atividade da AK. Finalmente, administração de TME diminuiu a atividade da CK da fração citosólica e mitocondrial e esta diminuição é prevenida pelo pré-tratamento com creatina. Considerando os resultados em conjunto, podemos presumir que a tirosina altera grupos sulfidrilas essenciais para a atividade da CK e PK, possivelmente por estresse oxidativo. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes com tirosinemia tipo II, é possível que alterações no metabolismo energético contribuem, pelo menos em parte, para a disfunção neurológica característica dessa doença metabólica. / Tyrosinemia type II is an inborn error of metabolism, where tyrosine levels are highly elevated in tissues and physiological fluids of affected patients. The central nervous system involvement can range from mild to severe mental retardation and may be associated with other neurologic abnormalities. The present study investigated the in vitro and in vivo effects of high concentrations of tyrosine on important parameters of energy metabolism in cerebral cortex homogenates from 14-day-old Wistar rats. It was observed that 1.0-2.0 mM tyrosine inhibit in vitro the enzymatic activity of mitochondrial and cytosolic creatine kinase (CK) in a concentration-dependent pattern and that this inhibition is prevented by reduced glutathione (GSH), suggesting that creatine kinase inhibition was caused by altering essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Results also indicate that mitochondrial, but not cytosolic CK activity is inhibited by tyrosine in a time-dependent way. In addition, a single injection of L-tyrosine methyl ester (TME) decreased cytosolic and mitochondrial CK activities of brain cortex from rats. It was observed that 2.0 mM tyrosine inhibit the pyruvate kinase (PK) activity in vitro and that this inhibition is prevented by GSH at 30 min, 60 and 90 min of pre-incubation. Moreover, TME administration reduced the PK activity and this reduction is prevented by pre-treatment with creatine. On the other hand, tyrosine did not alter the adenylate kinase (AK) activity in vitro, but the administration of TME increased the activity of AK. Finally, TME administration decreased the CK activity of cytosolic and mitochondrial fractions and this decrease is prevented by creatine pre-treatment. Taken together all the results, it can be presumed that tyrosine alters sulfhydryl groups essential for CK and PK functions possibly through oxidative stress. If these effects also occur in patients with tyrosinemia type II, it is possible that energy metabolism alterations contribute, at least in part, to the neurological dysfunction characteristic of this metabolic disease.

A histidinemia é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causado pela deficiência na atividade da enzima histidase no fígado e na pele, levando ao acúmulo de histidina no plasma e nos tecidos. É uma doença de caráter autossômico recessivo usualmente considerada inofensiva aos pacientes e a seus filhos; entretanto, alguns pacientes e crianças nascidas de mães histidinêmicas apresentam leves alterações neurológicas. Considerando que a histidinemia é uma das mais frequentes doenças metabólicas, no presente estudo nós investigamos o efeito da sobrecarga de L-histidina a ratas fêmeas durante a gestação e a lactação em alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral e hipocampo da prole. As atividades da piruvatoquinase e da creatinaquinase citosólica e mitocondrial diminuíram em córtex cerebral e hipocampo dos ratos da prole aos 21 dias de idade e esse padrão permaneceu em ambas as estruturas aos 60 dias de idade. Além disso, a atividade da adenilatoquinase foi reduzida em córtex e hipocampo da prole aos 21 dias, enquanto a atividade aumentou nos dois tecidos aos 60 dias de vida. Estes resultados sugerem que a administração de L-histidina às ratas fêmeas no curso da gravidez e da amamentação prejudica a homeostasia energética em córtex cerebral e hipocampo dos ratos nascidos de mães tratadas. Considerando que a histidinemia é geralmente uma condição benigna e que pouca atenção tem sido dada à histidinemia materna, parece importante que mais estudos sejam realizados em crianças nascidas de mães histidinêmicas. / Histidinemia is an inborn error of metabolism of amino acids caused by deficiency of histidase activity in liver and skin with consequent accumulation of histidine in plasma and tissues. Histidinemia is an autosomal recessive trait usually considered harmless to patients and their offspring, but some patients and children born from histidinemic mothers have mild neurologic alterations. Considering that histidinemia is one of the most frequently identified metabolic conditions, in the present study we investigated the effect of L-histidine load to female rats during pregnancy and lactation on some parameters of energy metabolism in cerebral cortex and hippocampus of the offspring. Pyruvate kinase, cytosolic and mitochondrial creatine kinase activities decreased in cerebral cortex and in hippocampus of rats at 21 days of age and this pattern remained in the cerebral cortex and in hippocampus at 60 days of age. Moreover, adenylate kinase activity was reduced in the cerebral cortex and in hippocampus of the offspring at 21 days of age, whereas the activity was increased in the two tissues at 60 days of age. These results suggest that administration of L-histidine to female rats in the course of pregnancy and lactation impaired energy homeostasis in the cerebral cortex and hippocampus of the offspring. Considering that histidinemia is usually a benign condition and little attention has been given to maternal histidinemia, it seems important to perform more studies in the children born from histidinemic mothers.

β–alanina é um β-aminoácido derivado da degradação da pirimidina uracila. Em altas concentrações desenvolve uma desordem muito rara da via de degradação das pirimidinas, conhecida como β–alaninemia. O acúmulo do β–aminoácido pode causar consequências bioquímicas como: depleção dos níveis de taurina, aumento de espécies reativas e excreção aumentada de GABA. Essas alterações levam a um distúrbio no desenvolvimento neurológico, contribuindo para a patologia da doença. A β–alanina também é utilzada como suplemento nutricional por atletas visando melhor desempenho físico. Em nosso estudo avaliamos o efeito in vitro e in vivo da β–alanina sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar de 21 dias de idade. Os animais receberam três injeções subcutâneas de β–alanina (300 mg/Kg de peso corporal) e os controles receberam o mesmo volume de solução salina (NaCl 0.85%) em intervalos de três horas. Nos experimentos in vitro verificamos a influência de diferentes concentrações de β–alanina (0,5 e 1.0 mM), onde observamos que o β–aminoácido possui capacidade de alterar a homeostasia das enzimas antioxidantes CAT e SOD, pois em ambos tecidos estudados a atividades da CAT foi inibida e da SOD aumentada na concentração mais alta (1,0 mM). Verificamos que a β–alanina in vitro diminui a oxidação do DCFH em cerebelo e aumenta o conteúdo total de GSH em cortéx cerebral, não alterando os outros parâmetros analisados, entretanto, não foi o observado na administração aguda de β–alanina. Nos experimentos in vivo observamos que o DCFH juntamente com o conteúdo total de tióis aumentaram nos dois tecidos estudados. Não observamos diferença significativa quanto aos níveis de GSH e TBARS. O mecanismo de ação da β–alanina sobre a atividade das enzimas antioxidantes foi diferente nos dois experimentos, pois no modelo agudo a atividade da CAT aumentou, no entanto, a atividade da SOD foi inibida pela β–alanina em cortéx cerebral e cerebelo. Portanto, observamos que a β–alanina altera a atividade das enzimas antioxidantes, aumentando com isso o conteúdo de espécies reativas e gerando possivelmente estresse oxidativo. Esses achados podem contribuir em partes com as alterações neurológicas encontrada em pacientes com β–alaninemia. Além disso, os possíveis efeitos secundários da suplementação nutricional de β-alanina necessitam de mais atenção. / β–alanine is an β-amino acid derived from the degradation of pyrimidine uracil. In high concentrations develops a very rare disorder of pyrimidine degradation pathway, known as β-alaninemia. The accumulation of β-amino acid can cause biochemical consequences such as: depletion of taurine levels, increase of reactive species and increased excretion of GABA. These conditions may cause neurological disturbances, contributing to the pathology of the disease. The β-alanine is also used as a nutritional supplement by athletes seeking to improve physical performance. In this study we evaluated the in vitro and in vivo effects of β-alanine on some parameters of oxidative stress in cerebral cortex and cerebellum of 21-day-old rats. The animals received three peritoneal injections of β-alanine (300 mg /Kg of body weight) and the controls received the same volume of saline solution (NaCl 0.85%) at 3 hours intervals. In vitro experiments verified the influence of different concentrations of β-alanine (0.5 and 1.0 mM), where we observe that the β-amino acid has the ability to alter the homeostasis of enzymes SOD and CAT antioxidant, since in both tissues studied was inhibited activities of CAT and SOD increased at the highest concentration (1.0 mM). We found that the in vitro β-alanine decreases the oxidation of DCFH in cerebellum and increases the total content of GSH in cerebral cortex, without altering other parameters, however, was not observed in the acute administration of β-alanine. In vivo experiments we observed that the DCFH along with the entire content of thiols increased in both tissues studied. No significant difference in the levels of GSH and TBARS. The mechanism of action of β-alanine on the activity of the antioxidant enzymes was different in the two experiments, in acute model of CAT activity increased, however, SOD activity was inhibited by β-alanine in cerebral cortex and cerebellum. Therefore, we found that β-alanine alters the activity of enzymes antioxidants, thus increasing the content of reactive species and possibly generating oxidative stress. These findings may in part contribute to the neurological alterations found in patients with β-alaninemia. Besides, possible side effects of the nutritional supplementation of β-alanine need more attention.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é uma desordem hereditária causada pela deficiência do complexo enzimático desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, e como conseqüência ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val), e seus respectivos cetoácidos α- cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV) e α-cetoisovalérico (CIV), que caracteriza a doença. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma, retardo psicomotor e retardo mental. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença ainda não estão esclarecidos. Em estudos anteriores, realizados em nosso laboratório, observamos que os α-cetoácidos de cadeia ramificada modificaram a fosforilação dos filamentos intermediários em córtex cerebral de ratos wistar em diferentes idades, alteraram a morfologia de células gliais e provocaram estresse oxidativo em células de glioma C6. Neste estudo, nós investigamos o efeito in vitro dos aminoácidos de cadeia ramificada, nas concentrações encontradas nos pacientes afetados por DXB, sobre a fosforilação dos filamentos intermediários de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de córtex cerebral de ratos wistar de 9, 12,17 e 21 dias foram incubadas com os aminoácidos Leu, Ile e Val na presença de 32P-ortofosfato, a fração citoesquelética foi extraída e a radioatividade incorporada pelas subunidades dos filamentos intermediários foi medida. Os resultados obtidos não demonstraram alterações significativas no parâmetro estudado. Também foram realizados estudos morfológicos em cultura de células C6 através de microscopia de contraste de fase e técnicas de imunocitoquímica. As células foram incubadas por 3, 12 ou 24 horas na presença ou na ausência dos AACR. Os resultados demonstraram que os AACR alteraram a morfologia das células de redondas para fusiformes com a presença de vários processos de um modo dependente do tempo e do tipo de AACR. A imunocitoquímica com anticorpos anti-actina e anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) demonstrou que estes metabólitos induziram uma reorganização do citoesqueleto. Além disso, observamos morte celular intensa na presença dos AACR. Por outro lado, verificamos que não houve alteração de fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) nas células C6, mas observamos que houve diminuição da glutationa e aumento da produção de óxido nítrico quando as células C6 foram incubadas por 3h com os AACR. Quando as células C6 foram tratadas com glutationa ou L-NAME e com os AACR estes antioxidantes foram capazes de prevenir as alterações metabólicas causadas por estes metabólitos, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo nas alterações causadas pelos AACR. Considerando que as células astrogliais são de fundamental importância para o desenvolvimento e o funcionamento do cérebro é provável que as alterações provocadas pelos AACR possam ter importantes conseqüências para a neurodegeneração característica dos pacientes portadores de DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a inherited disorder caused by a deficiency of the enzyme complex branched-chain α-keto acid dehydrogenase (BCKD), and consequently occurs the accumulation of branched-chain amino acids (BCAAs) leucine (Leu), isoleucina (Ile) and valine (Val), and theirs corresponding branched-chain α-keto acids (BCKAs) α-keto-isocaproic acid (KIC), α-keto-β-methyvaleric acid (CMV) and α- keto-isovaleric (KIV), that characterize the disease. Affected patients present severe neurological symptoms such as coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the physiopathologic mechanisms are unknown. In previous studies carried through in our laboratory we observed that the BCKAs had modified the phosphorylation of the intermediate filaments (IF) in cerebral cortex of rats wistar in different ages. We also verified that these metabolites altered the morphology of glial cells and provoked oxidative stress in C6 cells. In this study, we investigate the in vitro effect of BCAAs, in the concentrations found in the patients affected with MSUD, on the phosphorylation of the IF from cerebral cortex of rats during development. Slices from cerebral cortex of wistar rats of 9, 12, 17 and 21 days were incubated with the amino acids Leu, Ile and Val in the presence of 32P-ortophosphate, the cytoskeleton fraction was extracted and the radioactivity incorporated into the subunits of the IF was measured. The results obtained do not demonstrate significant alterations in this studied parameter. We also performed morphologic studies in C6 cells through analyses of imunocitochemistry and phase contrast microscopy. The cells had been incubated for 3, 12 or 24 hours in the presence or the absence of the BCAAs. The results demonstrate that the BCAAs alter the morphology of the cells from rounded to fusiformes with the presence of some processes in a dependent way of the time and the type of BCAAs. The imunocitochemistry with anti-actin and antiglial fibrilary acid protein (GFAP) antibodies demonstrates that these metabolites induce a reorganization of cytoskeleton. Moreover, we observe intense cellular death in the presence of the BCAAs. On the other hand, we verify that it does not involve an alteration of the phosphorylation of GFAP in C6 cells. We also observe a reduction of glutathione and a increase of nitric oxide production when the cells were incubated for 3 hours with the BCAAs. When the C6 cells were treated with glutathione or L-NAME in the presence of the BCAAs these antioxidants were capable to prevent the metabolic alterations caused by these metabolites, suggesting the involvement of oxidative stress in the alterations caused by the BCAAs. Considering that the astroglials cells are have fundamental importance on the development and functioning of the brain it is feasible that the alterations provoked by the BCAAs have important consequences for the neurodegeneration characteristic of MSUD patients.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é uma desordem hereditária causada pela deficiência do complexo enzimático desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, e como conseqüência ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina (Leu), isoleucina (Ile) e valina (Val), e seus respectivos cetoácidos α- cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV) e α-cetoisovalérico (CIV), que caracteriza a doença. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma, retardo psicomotor e retardo mental. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos da doença ainda não estão esclarecidos. Em estudos anteriores, realizados em nosso laboratório, observamos que os α-cetoácidos de cadeia ramificada modificaram a fosforilação dos filamentos intermediários em córtex cerebral de ratos wistar em diferentes idades, alteraram a morfologia de células gliais e provocaram estresse oxidativo em células de glioma C6. Neste estudo, nós investigamos o efeito in vitro dos aminoácidos de cadeia ramificada, nas concentrações encontradas nos pacientes afetados por DXB, sobre a fosforilação dos filamentos intermediários de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. Fatias de córtex cerebral de ratos wistar de 9, 12,17 e 21 dias foram incubadas com os aminoácidos Leu, Ile e Val na presença de 32P-ortofosfato, a fração citoesquelética foi extraída e a radioatividade incorporada pelas subunidades dos filamentos intermediários foi medida. Os resultados obtidos não demonstraram alterações significativas no parâmetro estudado. Também foram realizados estudos morfológicos em cultura de células C6 através de microscopia de contraste de fase e técnicas de imunocitoquímica. As células foram incubadas por 3, 12 ou 24 horas na presença ou na ausência dos AACR. Os resultados demonstraram que os AACR alteraram a morfologia das células de redondas para fusiformes com a presença de vários processos de um modo dependente do tempo e do tipo de AACR. A imunocitoquímica com anticorpos anti-actina e anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP) demonstrou que estes metabólitos induziram uma reorganização do citoesqueleto. Além disso, observamos morte celular intensa na presença dos AACR. Por outro lado, verificamos que não houve alteração de fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) nas células C6, mas observamos que houve diminuição da glutationa e aumento da produção de óxido nítrico quando as células C6 foram incubadas por 3h com os AACR. Quando as células C6 foram tratadas com glutationa ou L-NAME e com os AACR estes antioxidantes foram capazes de prevenir as alterações metabólicas causadas por estes metabólitos, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo nas alterações causadas pelos AACR. Considerando que as células astrogliais são de fundamental importância para o desenvolvimento e o funcionamento do cérebro é provável que as alterações provocadas pelos AACR possam ter importantes conseqüências para a neurodegeneração característica dos pacientes portadores de DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a inherited disorder caused by a deficiency of the enzyme complex branched-chain α-keto acid dehydrogenase (BCKD), and consequently occurs the accumulation of branched-chain amino acids (BCAAs) leucine (Leu), isoleucina (Ile) and valine (Val), and theirs corresponding branched-chain α-keto acids (BCKAs) α-keto-isocaproic acid (KIC), α-keto-β-methyvaleric acid (CMV) and α- keto-isovaleric (KIV), that characterize the disease. Affected patients present severe neurological symptoms such as coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the physiopathologic mechanisms are unknown. In previous studies carried through in our laboratory we observed that the BCKAs had modified the phosphorylation of the intermediate filaments (IF) in cerebral cortex of rats wistar in different ages. We also verified that these metabolites altered the morphology of glial cells and provoked oxidative stress in C6 cells. In this study, we investigate the in vitro effect of BCAAs, in the concentrations found in the patients affected with MSUD, on the phosphorylation of the IF from cerebral cortex of rats during development. Slices from cerebral cortex of wistar rats of 9, 12, 17 and 21 days were incubated with the amino acids Leu, Ile and Val in the presence of 32P-ortophosphate, the cytoskeleton fraction was extracted and the radioactivity incorporated into the subunits of the IF was measured. The results obtained do not demonstrate significant alterations in this studied parameter. We also performed morphologic studies in C6 cells through analyses of imunocitochemistry and phase contrast microscopy. The cells had been incubated for 3, 12 or 24 hours in the presence or the absence of the BCAAs. The results demonstrate that the BCAAs alter the morphology of the cells from rounded to fusiformes with the presence of some processes in a dependent way of the time and the type of BCAAs. The imunocitochemistry with anti-actin and antiglial fibrilary acid protein (GFAP) antibodies demonstrates that these metabolites induce a reorganization of cytoskeleton. Moreover, we observe intense cellular death in the presence of the BCAAs. On the other hand, we verify that it does not involve an alteration of the phosphorylation of GFAP in C6 cells. We also observe a reduction of glutathione and a increase of nitric oxide production when the cells were incubated for 3 hours with the BCAAs. When the C6 cells were treated with glutathione or L-NAME in the presence of the BCAAs these antioxidants were capable to prevent the metabolic alterations caused by these metabolites, suggesting the involvement of oxidative stress in the alterations caused by the BCAAs. Considering that the astroglials cells are have fundamental importance on the development and functioning of the brain it is feasible that the alterations provoked by the BCAAs have important consequences for the neurodegeneration characteristic of MSUD patients.

A tirosinemia tipo II é um erro inato do metabolismo que se caracteriza por altos níveis plasmáticos e teciduais de tirosina, cujo efeito sobre o Sistema Nervoso Central pode variar de retardo mental leve a grave, podendo estar associado com outras anomalias neurológicas. No presente estudo nosso objetivo foi investigar in vitro e in vivo os efeitos de elevadas concentrações de tirosina sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos de 14 dias de idade. Os resultados mostraram que 1,0-2,0 mM de tirosina inibe in vitro a atividade da creatinaquinase (CK) citosólica e mitocondrial em um padrão dependente da concentração e que esta inibição é prevenida por glutationa reduzida (GSH), sugerindo a alteração de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Os resultados também indicam que somente a atividade da CK mitocondrial é inibida pela tirosina em uma maneira dependente do tempo. Além disso, uma única injeção de L-tirosina metil éster (TME) diminuiu a atividade da CK citosólica e mitocondrial em córtex cerebral de ratos. Observou-se que 2,0 mM de tirosina inibe in vitro a atividade da piruvatoquinase (PK) e que esta inibição é prevenida por GSH nos tempos de 30, 60 e 90 min de pré-incubação. Além disso, a administração TME reduziu a atividade da PK e essa redução é prevenida pelo pré-tratamento com creatina. Por outro lado, a tirosina não alterou a atividade da adenilatoquinase (AK) in vitro, mas a administração de TME aumentou a atividade da AK. Finalmente, administração de TME diminuiu a atividade da CK da fração citosólica e mitocondrial e esta diminuição é prevenida pelo pré-tratamento com creatina. Considerando os resultados em conjunto, podemos presumir que a tirosina altera grupos sulfidrilas essenciais para a atividade da CK e PK, possivelmente por estresse oxidativo. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes com tirosinemia tipo II, é possível que alterações no metabolismo energético contribuem, pelo menos em parte, para a disfunção neurológica característica dessa doença metabólica. / Tyrosinemia type II is an inborn error of metabolism, where tyrosine levels are highly elevated in tissues and physiological fluids of affected patients. The central nervous system involvement can range from mild to severe mental retardation and may be associated with other neurologic abnormalities. The present study investigated the in vitro and in vivo effects of high concentrations of tyrosine on important parameters of energy metabolism in cerebral cortex homogenates from 14-day-old Wistar rats. It was observed that 1.0-2.0 mM tyrosine inhibit in vitro the enzymatic activity of mitochondrial and cytosolic creatine kinase (CK) in a concentration-dependent pattern and that this inhibition is prevented by reduced glutathione (GSH), suggesting that creatine kinase inhibition was caused by altering essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Results also indicate that mitochondrial, but not cytosolic CK activity is inhibited by tyrosine in a time-dependent way. In addition, a single injection of L-tyrosine methyl ester (TME) decreased cytosolic and mitochondrial CK activities of brain cortex from rats. It was observed that 2.0 mM tyrosine inhibit the pyruvate kinase (PK) activity in vitro and that this inhibition is prevented by GSH at 30 min, 60 and 90 min of pre-incubation. Moreover, TME administration reduced the PK activity and this reduction is prevented by pre-treatment with creatine. On the other hand, tyrosine did not alter the adenylate kinase (AK) activity in vitro, but the administration of TME increased the activity of AK. Finally, TME administration decreased the CK activity of cytosolic and mitochondrial fractions and this decrease is prevented by creatine pre-treatment. Taken together all the results, it can be presumed that tyrosine alters sulfhydryl groups essential for CK and PK functions possibly through oxidative stress. If these effects also occur in patients with tyrosinemia type II, it is possible that energy metabolism alterations contribute, at least in part, to the neurological dysfunction characteristic of this metabolic disease.