Introdução: Agregação familial é observada em cerca de 10% dos casos de câncer e 1 a 3% é hereditário. O tipo difuso pode estar relacionado à agregação familial e a alterações genéticas no gene CDH1, que codifica a proteína E-caderina. Alterações na imunoexpressão de Beta-catenina e p53 também são observadas. Objetivos: Analisar a imunoexpressão da E-caderina, Beta-catenina e TP53 em adenocarcinomas gástricos de pacientes com câncer gástrico familial e comparar com os dados clinicopatológicos, além dos achados das alterações genéticas destes pacientes, estudadas previamente nesta Instituição. Casuística e Métodos: Vinte e seis casos de adenocarcinoma gástrico em blocos de parafina de pacientes do HC-FMUSP foram submetidos ao estudo imunoistoquímico para detecção e análise do padrão de imunoexpressão da E-caderina, Beta-catenina e TP53 através do método da streptavidina-biotina-peroxidase. A análise da imunoexpressão dos marcadores foi classificada segundo escala de intensidade e distribuição e os testes estatísticos utilizados foram o Teste t de Student e Exato de Fisher. Resultados: A localização predominante do tumor foi no antro (61,5%). 11 (42,3%) casos alterados para a imunoexpressão da E-caderina, sendo todos do tipo difuso; 15 (57,7%) casos normais, sendo 9 do tipo difuso e 6 do tipo intestinal (p=0,02). Em estudo prévio realizado nesta instituição, uma mutação missense no exon 12 do gene CDH1, códon 617, nucleotídeo 1849 G>A foi encontrada no mesmo caso em que foi observada ausência de imunorreatividade da E-caderina. 11 (42,3%) casos alterados para a imunoexpressão de Beta-catenina e 46,2% de imunorreatividade nuclear positiva para TP53. Conclusões: 1) O tipo difuso de Laurén está associado à alteração da imunoexpressão da E-caderina no Câncer Gástrico Familial; 2) Não houve associação entre a imunoexpressão da E-caderina, idade, gênero e localização do tumor; tampouco houve associação entre a imunoexpressão da Beta-catenina e os dados clínico-patológicos; houve associação inversa entre a imunoexpressão da E-caderina e TP53; 3) Nos casos em que foram detectadas alterações na imunoexpressão, parece haver duas rotas distintas de carcinogênese envolvidas no CGF. / Introduction: Familial clustering is observed in about 10% of the gastric cancer cases and 1-3% is hereditary. Diffuse type gastric cancer is related to genetic alterations in CDH1 gene, which translates the E-cadherin protein. The abnormal expression of E-cadherin is characterized by low expression of cytoplasmatic staining, or loss of membranous immunoreactivity. Aim: to analyze the immunoexpression of E-cadherin, Beta-catenin and TP53 in gastric adenocarcinomas in patients with Familial Gastric Cancer and compare with clinical-pathologic data, including the genetic alterations of these patients, found previously on this institution. Methods: 26 cases of paraffin-embedded gastric adenocarcinoma tissue of patients of Hospital das Clinicas - School of Medicine of University of Sao Paulo underwent immunostaining to detect the presence and to analyze the pattern of immunoexpression of E-cadherin, Beta-catenin and TP53 using Streptavidine-Biotine-Peroxidade technique. The immunoexpression evaluation was performed utilizing a semiquantitative scale for intensity and distribution. The statistical analysis was done through Students t test and Fishers Exact test. Results: E-cadherin immunoexpression was negative in 11 cases (42.3%), and all of them were diffuse type of Laurén. 15 cases (57.7%) were positive for E-cadherin, from which 9 were of the diffuse type and 6 of intestinal type (p=0.02). In previous study performed on this institution, one missense mutation in exon 12 of CDH1 gene, codon 617, nucleotide 1849 G>A was found on the same case that absence of E-cadherin immunostaining was observed. 61.5% of the tumors were located in the antrum. Beta-catenin immunoexpression was altered in 43.2% and TP53 nuclear immunoreactivity was positive in 46.2% of the tumors. TP53 was solely detected in 12 (46.2%) of the tumors, while E-cadherin was altered in 10/26 (38.5%) negative TP53 tumors, p=0.01. Conclusions: 1) Diffuse type of Laurén is associated to E-cadherin immunoexpression alteration in Familial Gastric Cancer; 2) There was no association between E-cadherin immunoexpression and age, gender or tumor location, as well as there was no association between Beta-catenin and the clinical-pathologic data; there was an inverse association between immunoexpression of TP53 and E-cadherin; 3) There may be two distinct carcinogenesis pathways on familial gastric cancer cases that imunoexpression alterations were detected.

Les récepteurs ionotropiques du glutamate peuvent être compartimentés de manière très spécifique au niveau des différentes afférences synaptiques d’un neurone. Dans les neurones pyramidaux de CA3, les récepteurs de type kaïnate (rKA) post-synaptiques sont localisés à la synapse formée entre les fibres moussues et les cellules pyramidales de CA3 (synapse FM-CA3) mais ils sont totalement absents des autres afférences glutamatergiques sur ce même neurone. Nous avons cherché à comprendre les mécanismes moléculaires de cette compartimentation subcellulaire. En réalisant une cartographie fonctionnelle des récepteurs du glutamate par décageage focalisé de glutamate dans les cellules pyramidales de CA3, nous avons montré que les rKA présentent une localisation subcellulaire strictement confinée dans les excroissances épineuses, éléments post-synaptiques des synapses FM-CA3, et sont exclus des compartiments somato-dendritiques, contrairement aux récepteurs AMPA. Nous avons identifié une séquence du domaine C-terminal de GluK2a nécessaire pour la stabilisation des rKA. Cette séquence est responsable d’une interaction avec la protéine d’adhérence N-cadhérine. L’altération de la fonction de la N-cadhérine dans les cellules pyramidales de CA3 entraine une déstabilisation des rKA à la synapse FM-CA3. Ces travaux suggèrent que plusieurs mécanismes participent à la compartimentation des rKA à la synapse FMCA3 impliquant le recrutement et la stabilisation des rKA par les N-cadhérines. / Distinct subtypes of ionotropic glutamate receptors can be segregate to specific synaptic inputs in a given neuron. In CA3 pyramidal cells (PCs), kainate receptors (KARs) are present at mossy fiber (mf) synapses and absent from other glutamatergic inputs. The mechanisms for such a constrained subcellular segregation is not known. We have investigated the molecular determinants responsible for the subcellular segregation of KARs at mf-CA3 synapses. Using functional mapping of glutamate receptors by focal glutamate uncaging we show that KARs display a strictly confined expression on thorny excrescences, the postsynaptic elements of mf-CA3 synapses, being excluded from extrasynaptic somatodendritic compartments, at variance with AMPA receptors. We have identified a sequence in the GluK2a C-terminal domain necessary for restricted expression of KARs which is responsible for GluK2a interaction with N-Cadherin. Targeted deletion of N-Cadherin or overexpression of a dominant negative N-Cadherin in CA3 PCs greatly induce a destabilization of KARs at the mf-CA3 synapses. Our findings suggest that multiple mechanisms combine to control the compartmentalization of KARs at mf-CA3 synapses, including a stringent control of the amount of GluK2 subunit in CA3 PCs, a limited number of slots for KARs, and the recruitment/stabilization of KARs by N-Cadherins.

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In der vorliegenden Arbeit wurden Myokardproben des rechtsventrikulären Ausflusstraktes von Patienten mit Fallot’scher Tetralogie sowie Double Outlet Right Ventricle vom Fallot - Typ untersucht. Hintergrund der Studie waren Untersuchungen anderer Autoren an Cx43 - knock - out Mäusen, die dort Veränderungen des kardialen Phänotyps beschrieben, die sie als Fallot - artig interpretierten. Daraus wurde die Hypothese entwickelt, dass Änderungen auf der Ebene des Connexin 43 ursächlich mit der Fallot’schen Tetralogie verbunden sein könnten. Es erfolgte eine histologische Analyse von 25 Patientenproben im Hinblick auf die Lokalisation von Connexin 43 sowie N - Cadherin. Es zeigte sich eine altersabhängige Verteilung von Connexin 43 und N - Cadherin. Insbesondere Patienten der Gruppe 1 (jünger als zwei Jahre) zeigten eine Verteilung sowohl an der lateralen Zellseite, als auch am Pol der Kardiomyozyten. Mit zunehmendem Alter beschränkten sich sowohl Connexin 43 als auch N - Cadherin auf die Disci intercalares zwischen den Kardiomyozyten und befanden sich dort in enger Nachbarschaft zueinander. Des Weiteren erfolgte eine Analyse der codierenden Region des Connexin 43 Gens mittels High Resolution Melting - PCR und sich daran anschließender Sequenzierung. Es zeigten sich sowohl bei den Kontrollen als auch den Patienten bereits bekannte Single Nucleotide Polymorphismen sowie bis dato unbekannte Sequenzvariationen. Allerdings wurden keine homozygoten Veränderungen der DNA festgestellt. Auch fand sich keine der heterozygoten Veränderungen in allen untersuchten Patienten. Somit ist es unwahrscheinlich, dass ein einzelner Basenaustausch zum komplexen Krankheitsbild der Fallot’schen Tetralogie beziehungsweise zum Double Outlet Right Ventricle vom Fallot - Typ führt.

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24879号 / 医博第5013号 / 新制||医||1068(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 後藤 慎平, 教授 渡邊 直樹, 教授 平井 豊博 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Yes / Skin pigmentation is directed by epidermal-melanin units, characterized by long-lived and dendritic epidermal melanocytes (MC) that interact with viable keratinocytes (KC) to contribute melanin to the epidermis. Previously we reported that MC:KC contact is required for melanosome transfer, that this can be enhanced by filopodial and by UVR/UVA irradiation, which can up-regulate melanosome transfer via Myosin X-mediated control of MC filopodia. Both MC and KC express Ca2+-dependent E-cadherins. These homophilic adhesion contacts induce transient increases in intra-KC Ca2+, while ultraviolet radiation (UVR) raises intra-MC Ca2+ via calcium selective ORAI1 ion channels; both are associated with regulating melanogenesis. However, how Ca2+ triggers melanin transfer remains unclear, and here we evaluated the role of E-Cadherin in UVR-mediated melanin transfer in human skin cells. MC and KC in human epidermis variably express filopodia-associated E-Cadherin, Cdc42, VASP and β-catenin, all of which were upregulated by UVR/UVA in human MC in vitro. Knockdown of E-cadherin revealed that this cadherin is essential for UVR-induced MC filopodia formation and melanin transfer. Moreover, Ca2+ induced a dose-dependent increase in filopodia formation and melanin transfer, as well as increased β-catenin, Cdc42, Myosin X, and E-Cadherin expression in these skin cells. Together these data suggest that filopodial proteins and E-Cadherin, which are upregulated by intracellular (UVR-stimulated) and extracellular Ca2+ availability, are required for filopodia formation and melanin transfer. This may open new avenues to explore how Ca2+ signalling influences human pigmentation.

Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique. / Since the discovery of the first protein tyrosine kinase [PTK] in 1980, the importance of these proteins and of tyrosine phosphorylation cascades in the regulation of intracellular signaling events has been well-established. The protein tyrosine phosphatases [PTPs], whose existence was only revealed ten years later, have been regarded for a long time as passive PTKs conteracting enzymes. It is now evident that PTPs activities are specific, exquisitely regulated, and that they have to be coordinated with PTKs activities for an appropriate regulation of intracellular signaling events. Despite these findings, the contribution of PTPs to the regulation of many fundamental physiological processes is not well-characterized. This is the case of angiogenesis, the process whereby new vessels are generated from pre-existing ones. Vascular endothelial growth factor (VEGF), one of the most important angiogenic factors, is known to induce its biological effects mainly by activating VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). As angiogenesis is involved in the development of a multitude of pathologies, including tumoral progression, a better characterization of PTPs, which ensure the quality of the angiogenic response by acting together with VEGFR2, is crucial to refine current therapeutic tools. Expression of a PTP called DEP-1 correlates with dephosphorylation of VEGFR2, and contributes to the inhibition of VEGF-induced endothelial cell proliferation at high cell confluence. However, the specific contribution of DEP-1 to the regulation of signaling pathways and biological responses induced by VEGF remained unknown. The research presented in this thesis demonstrates that DEP-1 negatively regulates the tyrosine kinase activity of VEGFR2 by dephosphorylating the specific tyrosine residues Y1054/Y1059 in its activation loop. Consequently, this leads to a global decrease in the phosphorylation of the receptor and to a reduced activation of most of the signaling cascades induced by VEGF, including the mitogenic PLCγ- ERK1/2 pathway. Moreover, despite this negative role, our work reveals for the first time that DEP-1 contributes in a positive way to promote the survival of endothelial cells via the activation of the Src-Gab1-Akt pathway downstream of VEGFR2. This survival function of DEP-1 in endothelial cells is accomplished by the dephosphorylation of the Src inhibitory tyrosine (Y529). During our study, we identified two residues in the carboxy-terminal tail of DEP-1, Y1311 and Y1320, whose phosphorylation is dependent on Src. These two phosphorylated tyrosine residues bind to the SH2 domain of Src, and our work also revealed that mostly Y1320 is required for Src and Akt activation upon VEGF stimulation of endothelial cells. These findings represent a major step forward in our understanding of the molecular mechanisms by which DEP-1 may regulate the VEGF-dependent angiogenic program. Moreover, the discovery of a positive role for DEP-1 in the survival of endothelial cells could lead to the development of new therapeutic approaches to inhibit this specific function of DEP-1 in order to block pathological angiogenesis.

Les autotransporteurs monomériques représentent le système de sécrétion le plus simple et le plus utilisé chez les bactéries à Gram négatif. Les autotransporteurs monomériques sont des protéines modulaires qui contiennent toute l’information pour leur sécrétion dans leur séquence. Les phénotypes associés à l’expression d’un autotransporteur peuvent être très variés et, souvent, les autotransporteurs sont des protéines multifonctionnelles. C’est le cas notamment des autotransporteurs AIDA-I, TibA et Ag43 d’Escherichia coli qui promouvoient l’adhésion et l’invasion de cellules épithéliales, l’auto-agrégation des bactéries et la formation de biofilm. Ces trois autotransporteurs ont d’ailleurs été regroupés dans une même famille, appelée les autotransporteurs auto-associatifs (SAATs). À cause de leur fonctionnalité, les SAATs sont considérés comme étant d’importants facteurs de virulence d’Escherichia coli. Toutefois, il existe plusieurs différences entre les SAATs qui ne sont pas bien comprises, si bien que leur rôle pour les bactéries n’est toujours pas bien compris. Nous avons donc d’abord caractérisé TibA, le membre des SAATs le moins bien étudié à l’aide d’une étude structure-fonction. Nous avons observé que TibA était une protéine modulaire et que son domaine fonctionnel était composé de deux modules : un module d’auto-agrégation en N-terminal et un module d’adhésion en C-terminal. En comparant nos résultats avec ceux obtenus pour les autres SAATs, nous avons réalisé que l’organisation des trois SAATs était très variée, c’est-à-dire que les trois SAATs sont composés de modules différents. Nous avons par ailleurs observé cet arrangement en modules lorsque nous avons analysé plusieurs séquences d’aidA, suggérant qu’un mécanisme d’échange et d’acquisition de modules était à la base de l’évolution des SAATs. Sans surprise, nous avons aussi observé que la famille des SAATs ne se limitait pas à AIDA-I, TibA et Ag43 et ne se limitait pas à Escherichia coli. La comparaison a aussi révélé l’importance du phénotype d’auto-agrégation dans la fonctionnalité des SAATs. Nous avons donc entrepris une étude du mécanisme d’auto-agrégation. Nos résultats on montré que l’auto-agrégation était le résultat d’une interaction directe SAAT/SAAT et ont mis en évidence un mécanisme similaire à celui utilisé par les cadhérines eucaryotes. De plus, nous avons observé que, comme les cadhérines, les SAATs étaient impliqués dans des interactions homophiliques; un SAAT interagit donc spécifiquement avec lui-même et non avec un différent SAAT. Finalement, les SAATs font parties des quelques protéines qui sont glycosylées chez Escherichia coli. Nous avons déterminé que le rôle de la glycosylation de TibA était de stabiliser la protéine et de lui donner la flexibilité nécessaire pour moduler sa conformation et, ainsi, être pleinement fonctionnelle. Globalement, nos résultats suggèrent que les SAATs sont des molécules « cadhérines-like » qui permettent la reconnaissance de soi chez les bactéries. Une telle habilité à discriminer entre le soi et le non-soi pourrait donc être utilisée par les bactéries pour organiser les communautés bactériennes. / Autotransporters are versatile virulence factors of Gram-negative bacteria and use one of the simplest and most widespread secretion system in bacteria. The name autotransporter originate from the observation that all the information needed for the secretion of the protein is encoded in its own sequence, meaning that autotransporters do not need a specialized secretion apparatus. Many autotransporters are multifunctional proteins and can perform a large variety of functions. The self-associating autotransporters (SAATs), represented by AIDA-I, TibA and Ag43, are such multifunctional proteins and can mediate the adhesion and invasion of epithelial cells, the auto-aggregation of bacteria and the formation of biofilm. Because of these functionalities, SAATs are considered important virulence factors of Escherichia coli. However, there are many differences between the SAATs and we still do not know their exact role for the bacteria. Therefore, we have realized a structure-function study of TibA, the least studied SAAT. Our study showed that TibA is a modular protein and that the functional domain of TibA is composed of two modules: an N-terminal module responsible for auto-aggregation and a C-terminal module responsible for adhesion. Our results showed that the organization of AIDA-I, TibA and Ag43 is different and that the SAATs represent different assemblies of modules. We also observed the modular organization when we analyzed various sequence of aidA, suggesting that the SAATs have evolved by a mechanism of domain shuffling. Not surprisingly, we have found new SAATs in Escherichia coli and in other proteobacteria. Our results also highlighted the importance of auto-aggregation in the functionality of the SAATs. We therefore assessed the mechanism of SAAT-mediated auto-aggregation of bacteria. Our results showed that SAATs mediate auto-aggregation of bacteria through direct SAAT/SAAT interactions and that these interactions were reminiscent of the interactions made by cadherin molecules in eukaryotes. We further observed that the SAATs were involved in homophilic interactions, as it is the case with cadherin molecules. SAATs are part of the few proteins that are glycosylated in Escherichia coli. We therefore characterized the glycosylation of TibA and found that glycosylation of TibA stabilized the protein and allowed the protein to modulate its conformation, resulting in a fully functional protein. Taken together, our results suggest that the SAATs may be cadherin-like molecules by bacteria in order to discriminate between self and non-self. Such an ability to discriminate self from non-self is rarely evoked in bacteria, but could play a role in the organization of multicellular communities.