O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de utilização de marcadores moleculares em genes candidatos da calpaína (CAPN) e calpastatina (CAST) como ferramenta auxiliar para programas de melhoramento de características relacionadas ao crescimento e maciez da carne. Foram avaliados 605 bovinos da raça Nelore, pertencentes à Agropecuária CFM Ltda, com idade média ao abate de 24 meses. Após a extração do DNA de amostras de sangue, por desproteinização em presença de NaCl, a identificação e determinação do polimorfismo para os marcadores moleculares CAPN316, CAPN530, CAPN4751, CAPN4753 e UOGACAST1, foi realizada pelo sistema de detecção TaqManTM utilizando-se PCR em Tempo Real. A análise de maciez da carne, aos 7, 14 e 21 dias de maturação, foi realizada com amostras de carne do Longissimus dorsi, retiradas entre a 12ª e 13ª costela e cisalhadas utilizando-se um Warner Bratzler Shear Force. Nenhum efeito significativo dos marcadores avaliados foi observado para as características de crescimento. Foi verificado efeito significativo, em relação à maciez da carne, para os seguintes polimorfismos: aos 7, 14 e 21 dias de maturação para o marcador CAPN4751; aos 21 dias para o marcador CAPN4753 e aos 14 e 21 dias para o marcador UOGCAST1. Em relação aos efeitos das combinações genotípicas para os marcadores dois a dois, os resultados foram significativos para a combinação CAPN4751/UOGCAST1 nos três tempos de maturação. Para a combinação de marcadores CAPN4753/UOGCAST1 também foram verificados resultados significativos para carnes maturadas aos 14 e 21 dias. Os resultados observados neste trabalho sugerem a possibilidade da utilização de seleção assistida por marcadores (MAS), visando o aumento da qualidade da carne em bovinos da raça Nelore. / The objective of this study was to evaluate the potential utilization of molecular markers on candidate calpain and calpastati n genes as an auxiliary tool for breeding programs on traits related to growth and meat tenderness. A total of 605 Nellore animals, raised by CFM Agro-pecuária Ltda, were used in this study and slaughtered with 24 months in average. After DNA blood samples extraction, by desproteinization in presence of NaCl, the polymorphism (CAPN316, CAPN530, CAPN4751, CAPN4753 and UOGACAST1) identification and determination was realized by TaqManTM detection system using real time PCR. The meat tenderness analysis, at the 7, 14 and 21 days of maturation was realized with Longissimus dorsi meat samples, taken at the 12th and 13th rib interval and Warner Bratzler Peak Shear Force measurements were used. There were no significant effects of molecular markers in growth traits. There were significant effects, regarding to meat tenderness, for following polymorphisms: at 7, 14 and 21 days of maturation, for CAPN4751 marker; at 21 days of maturation, for CAPN4753, and finally, at 14 and 21 days of maturation, for UOGCAST1 marker. In respect to genotypic combination effects analysis for pairwise marker, the results were significant for CAPN4751/UOGCAST1 in three days of maturation. In combination effects for CAPN4753/UOGCAST1 markers, significant effects were also observed for meat tenderness at 14 and 21 days. Theses results suggest that marked selection assisted (MAS) can be used to improve meat quality in Nellore beef cattle.

Submitted by CRUZ ELENA ENRÍQUEZ VALENCIA null (crucita01@hotmail.com) on 2016-07-22T16:18:25Z No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 1054537 bytes, checksum: 7dec2790aa8a6f7dc9e2010c1e059d9f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-28T15:54:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 enriquezvalencia_ce_dr_jabo.pdf: 1054537 bytes, checksum: 7dec2790aa8a6f7dc9e2010c1e059d9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T15:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 enriquezvalencia_ce_dr_jabo.pdf: 1054537 bytes, checksum: 7dec2790aa8a6f7dc9e2010c1e059d9f (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / Pró-Reitoria de Extensão Universitária (PROEX UNESP) / Com o intuito de estudar o potencial de aplicação de genes candidatos na seleção animal para o melhoramento genético da qualidade de carne de bovinos Nelore (Bos indicus), o presente trabalho teve como objetivos principais: (1) Avaliar em bovinos Nelore e cruzamentos Nelore x Bos taurus a ocorrência de associações entre o SNP g.98535683A>G:BTAU7 do gene CAST e as características da carne produzida e (2) quantificar a expressão gênica e proteica da cadeia pesada da miosina em bovinos Nelore com características fenotípicas contrastantes de crescimento e maciez da carne. Para o desenvolvimento do primeiro objetivo, 500 animais foram genotipados para o SNP g.98535683A>G:BTAU7 e fenotipados para força de cisalhamento (FC), índice de fragmentação miofibrilar (MFI), área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e lipídeos totais (LIP). Associação significativa entre o SNP e a maciez da carne foi observada. O genótipo AA apresentou os melhores valores em relação a esta característica. As diferenças encontradas entre os genótipos AA e AG (AA - AG) foram de - 0,19 kg e 5,31 para FC e MFI, respectivamente. O SNP não mostrou associação significativa com AOL, EGS e LIP. Para a execução do segundo objetivo, 90 bovinos Nelore terminados em confinamento foram utilizados. Levando em consideração o peso final ao abate (PF) e a FC dos 90 animais, 24 indivíduos com características contrastantes de peso e maciez da carne foram selecionados e divididos em quatro grupos experimentais (6 animais/grupo). Os grupos corresponderam a animais leves com carne macia (PF = 493,50 kg e FC = 3,76 kg), animais leves com carne dura (PF = 515,66 kg e FC = 8,06 kg), animais pesados com carne macia (PF = 604,33 kg e FC = 3,99) e animais pesados com carne dura (PF = 605,33 kg e FC = 7,83 kg). Em cada grupo, foram avaliadas características fenotípicas como MFI, AOL, EGS, LIP, índice de marmorização (IM), coloração instrumental (L*, a*, b*) e perdas por cozimento (PT). A análise de expressão dos genes MYH7, MYH2 e MYH1 foi feita por PCR em tempo real (RT-qPCR). A caracterização e quantificação proteica das isoformas da MyHC (MyHC-I, MyHC-IIa e MyHC-IIx/d) foi realizada por eletroforese SDS-PAGE. Em todas as análises (qualidade da carne e expressão gênica e proteica) não foi observada interação significativa entre crescimento e maciez da carne. Nas características AOL, EGS, IM e LIP não foi observado efeito significativo do crescimento e a maciez da carne. Porém, os animais pesados apresentaram maiores valores de L*, a* e b* em relação aos animais leves. Na maciez, o grupo de carne macia mostrou maiores valores de L* (32,29 ± 2,78) que o grupo de carne dura (29,10 ± 2,61). Por outro lado, maiores PT foram observadas em animais com carne dura em relação a animais com carne macia. Nos resultados de expressão gênica, o gene MYH7 não mostrou diferenças entre animais leves e pesados. Entretanto, a expressão dos genes MYH2 e MYH1 foi significativamente menor nos animais pesados em relação aos animais leves. Quanto à maciez da carne, a expressão dos três genes não diferiram significativamente entre grupos de carne dura e macia. Na expressão proteica, as três isoformas (MyHC-I, IIa e IIx), não mostraram diferença significativa entre animais leves e pesados. No entanto, as proporções da MyHC-I foram significativamente maiores no grupo de carne dura (16,51 ± 5,47) em relação ao grupo de carne macia (9,12 ± 3,16) e pelo contrário, as proporções da MyHC-IIa foram maiores no grupo de carne macia (73,78 ± 4,45) em relação ao grupo de carne dura (65,45 ± 8,79). A isoforma MyHC-IIx/d não mostrou efeito significativo sobre a maciez. Os resultados deste trabalho mostraram o potencial de aplicação do SNP g.98535683A>G:BTAU7 do gene CAST e da isoforma MyHC-IIa na seleção de animais para o melhoramento da maciez da carne de bovinos Nelore, além de, manifestar o diferencial de expressão dos genes MYH1 e MYH2 entre animais pesados e leves. / In order to study the potential of application of candidate genes in animal selection for breeding meat of Nellore cattle, this work had as main objectives: (1) Assess in Nellore cattle (Bos indicus) and crosses Nellore x Bos taurus the occurrence of associations between the g.98535683A>G:BTAU7 SNP in the CAST gene and traits of the meat produced and (2) quantify the gene and protein expression of myosin heavy chain in Nellore cattle with contrasting phenotypic traits of growth and meat tenderness. For the development of first objective, 500 animals were genotyped for the g.98535683A>G:BTAU7 SNP and phenotyped for shear force (SF), myofibrillar fragmentation index (MFI), ribeye area (RA), backfat thickness (BT) and total lipids (TL). Significant association between the SNP and meat tenderness was observed. The AA genotype showed the best values in relation to this trait. The differences found between genotypes AA and AG (AA - AG) were – 0.19 kg and 5.31 for SF and MFI, respectively. The SNP did not show significant association with RA, BT and TL. For the execution of the second aim, 90 feedlot Nellore cattle were used. Considering the final slaughter weight (FW) and the SF of the 90 animals, 24 individuals with contrasting characteristics of weight and tenderness of meat were selected and divided into four experimental groups (6 animals / group). The groups corresponded to lightweight animals with tender meat (FW = 493.50 kg and SF = 3.76 kg), lightweight animals with tough meat (FW = 515.66 kg and SF = 8.06 kg), heavy animals with tender meat (FW = 604.33 kg and SF = 3.99) and heavy animals with tough meat (FW = 605.33 kg and SF = 7.83 kg). In each group, were evaluated phenotypic characteristics as MFI, RA, BT, TL, marbling índex (MI), instrumental color (L*, a*, b*) and cooking losses (CL). The expression analysis of the MYH7, MYH2 and MYH1 genes was performed by Real-Time PCR (RT-qPCR). The characterization and quantification of the MyHC isoforms (MyHC-I, MyHC-IIa and MyHC-IIx/d) was carried out by SDS-PAGE. In all analyzes (meat quality and gene and protein expression) there was no significant interaction between growth and meat tenderness. In the traits MFI, RA, BT, IM and TL it was not observed significant effect of the growth and the tenderness of meat. However, the heavy animals showed higher values of L*, a* and b* than lightweight animals. In the tenderness, the tender meat group showed higher values of the L* (32.29 ± 2.78) than the tough meat group (29.10 ± 2.61). On the other hand, higher CL were observed in animals with tough meat than animals with tender meat. In the results of gene expression, the MYH7 gene did not show differences between lightweight and heavy animals. However, the expression of the MYH2 and MYH1 genes was significantly lower in heavy animals than lightweight animals. As for meat tenderness, the expression of the three genes did not differ significantly between tough and tender meat groups. In the protein expression, the three isoforms (MHC-I, IIa and IIx), did not show significant difference between lightweight and heavy animals. Nevertheless, the MyHC-I proportions were significantly higher in the tough meat group (16.51 ± 5.47) than tender meat group (9.12 ± 3.16) and on the contrary, the proportions of the MyHC-IIa were higher in tender meat group (73.78 ± 4.45) than tough meat group (65.45 ± 8.79). The MyHC-IIx isoform did not show significant effect on tenderness meat. The results of this work showed the potential of application of the g.98535683A>G:BTAU7 SNP in gene CAST and the MyHC-IIa isoform in animal selection to improve meat tenderness of Nellore cattle, in addition, it showed the differential expression of MYH1 and MYH2 genes between heavy and lightweight animals.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de utilização de marcadores moleculares em genes candidatos da calpaína (CAPN) e calpastatina (CAST) como ferramenta auxiliar para programas de melhoramento de características relacionadas ao crescimento e maciez da carne. Foram avaliados 605 bovinos da raça Nelore, pertencentes à Agropecuária CFM Ltda, com idade média ao abate de 24 meses. Após a extração do DNA de amostras de sangue, por desproteinização em presença de NaCl, a identificação e determinação do polimorfismo para os marcadores moleculares CAPN316, CAPN530, CAPN4751, CAPN4753 e UOGACAST1, foi realizada pelo sistema de detecção TaqManTM utilizando-se PCR em Tempo Real. A análise de maciez da carne, aos 7, 14 e 21 dias de maturação, foi realizada com amostras de carne do Longissimus dorsi, retiradas entre a 12ª e 13ª costela e cisalhadas utilizando-se um Warner Bratzler Shear Force. Nenhum efeito significativo dos marcadores avaliados foi observado para as características de crescimento. Foi verificado efeito significativo, em relação à maciez da carne, para os seguintes polimorfismos: aos 7, 14 e 21 dias de maturação para o marcador CAPN4751; aos 21 dias para o marcador CAPN4753 e aos 14 e 21 dias para o marcador UOGCAST1. Em relação aos efeitos das combinações genotípicas para os marcadores dois a dois, os resultados foram significativos para a combinação CAPN4751/UOGCAST1 nos três tempos de maturação. Para a combinação de marcadores CAPN4753/UOGCAST1 também foram verificados resultados significativos para carnes maturadas aos 14 e 21 dias. Os resultados observados neste trabalho sugerem a possibilidade da utilização de seleção assistida por marcadores (MAS), visando o aumento da qualidade da carne em bovinos da raça Nelore. / The objective of this study was to evaluate the potential utilization of molecular markers on candidate calpain and calpastati n genes as an auxiliary tool for breeding programs on traits related to growth and meat tenderness. A total of 605 Nellore animals, raised by CFM Agro-pecuária Ltda, were used in this study and slaughtered with 24 months in average. After DNA blood samples extraction, by desproteinization in presence of NaCl, the polymorphism (CAPN316, CAPN530, CAPN4751, CAPN4753 and UOGACAST1) identification and determination was realized by TaqManTM detection system using real time PCR. The meat tenderness analysis, at the 7, 14 and 21 days of maturation was realized with Longissimus dorsi meat samples, taken at the 12th and 13th rib interval and Warner Bratzler Peak Shear Force measurements were used. There were no significant effects of molecular markers in growth traits. There were significant effects, regarding to meat tenderness, for following polymorphisms: at 7, 14 and 21 days of maturation, for CAPN4751 marker; at 21 days of maturation, for CAPN4753, and finally, at 14 and 21 days of maturation, for UOGCAST1 marker. In respect to genotypic combination effects analysis for pairwise marker, the results were significant for CAPN4751/UOGCAST1 in three days of maturation. In combination effects for CAPN4753/UOGCAST1 markers, significant effects were also observed for meat tenderness at 14 and 21 days. Theses results suggest that marked selection assisted (MAS) can be used to improve meat quality in Nellore beef cattle.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2017-04-06T21:03:10Z No. of bitstreams: 2 Tese - Leonardo Guimarães de Oliveira - 2016.pdf: 2541166 bytes, checksum: 5b0501be9f076d03111ca00fcf4980a7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-07T11:18:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Leonardo Guimarães de Oliveira - 2016.pdf: 2541166 bytes, checksum: 5b0501be9f076d03111ca00fcf4980a7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-07T11:18:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Leonardo Guimarães de Oliveira - 2016.pdf: 2541166 bytes, checksum: 5b0501be9f076d03111ca00fcf4980a7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The protein profile of hornless Nellore cattle from a segregating population for meat tenderness of extremes shear force, low extreme group (M) and extreme high (D) group, showed differentially expressed proteins. They had greater relative abundance of proteins of the glycolytic process in group M and proteins of the oxidative metabolism evidenced more expressed in group D, fact that probably is correlated to the final tenderness of the meat. Only identified in group D, the cytochrome c protein indicates induction of the apoptotic process in this group of animals. Structural proteins were identified in group M, indicating a possible greater proteolysis. Calpastatin was only identified in group D, this protein is highly related to the final meat tenderness because it is a natural inhibitor of the calpain. Separation of calpastatin by ion exchange column chromatography of two different muscles described two peaks of calpain inhibitory activity: peak 1 (CAST1) and peak 2 (CAST2). CAST 1 activity increased during the post-mortem period in Triceps brachii and showed no difference between days in Longissimus dorsi and on the other hand, total activity of calpastatin and CAST 2 decreased during post-mortem aging. The 115 kDa band of calpastatin decreased its intensity during post-mortem aging in both muscles with more than 70% of the change occurring on the first day. The mitochondrial ATP synthase beta subunit proteins increased and Succinyl CoA ligase decreased after aging and Adenylate kinase isoenzyme decreased on day 7. Calpastatin peaks had weak phosphorylated bands and had different IP and MW patches than 2D-SDS -PAGE. During the purification process of the calpastatin peaks the activity per mg of protein increased but lost half of the total activity presented during the first purification step. For peak 2 of calpastatin the specific activity increased 139.8 times and at the end of this process 36% of the total activity remained. Purified calpastatin was identified on the second-size gel having a molecular weight similar to the western blot. Spots from calpastatin peak 1 and two from calpastatin peak 2 were identified as peptides belonging to the calpastatin molecule. Sequence of peptides identified in Spot from purified peak 1 as part of the inhibitory domain III and IV and of the C-terminus and from the purified peak 2 a sequence of peptides identified as part of the inhibitory domain I, II and III. These results lead us to believe that both peaks, in this case, are degradation products of the intact molecule, and probably the small peptides are broken down during the process. The results of the present study show that purification of distinct forms of active calpastatin is possible, however, the intact form of calpastatin was not present in this purification. The presence of peptides was not conclusive to determine the origin and composition of each active peak. / O perfil protéico de animais da raça nelore mocho de uma população segregante para a maciez da carne de extremos valores de força de cisalhamento, grupo extremo baixo (M) e grupo extremo alto (D), apresentou proteínas diferentemente expressas as quais houve maior abundância relativa de proteínas do processo glicolítico no grupo M e proteínas do metabolismo oxidativo evidenciadas mais expressas no grupo D, fato que provavelmente está correlacionado à maciez final da carne. Apenas identificada no grupo D, a proteína citocromo c indica indução do processo apoptótico neste grupo de animais. Proteínas estruturais foram identificadas no grupo M, indicando uma possível maior proteólise. A calpastatina foi somente identificada no grupo D, esta proteína está altamente relacionada com a maciez final da carne por ser inibidora natural das calpaínas. A separação de calpastatina por cromatografia em coluna de troca iônica de dois músculos diferentes descreveu dois picos de actividade inibitória de calpaínas: pico 1 (CAST1) e pico 2 (CAST2). Atividade de CAST 1 aumentada durante o período post mortem no Triceps brachii e não apresentou diferença entre os dias em Longissimus dorsi e por outro lado, a atividade total de calpastatina e CAST 2 diminuiu durante o envelhecimento post mortem. A banda de 115 kDa da calpastatina diminuiu sua intensidade durante o envelhecimento post mortem em ambos os músculos com mais de 70% da alteração ocorrendo no primeiro dia. As proteínas mitocondriais da subunidade ATP sintase beta aumentaram e a Succinil-CoA ligase diminuiu após o envelhecimento e a Adenilato quinase isoenzima diminuiu no dia 7. Os picos de calpastatina apresentavam faixas fosforiladas fracas e apresentavam manchas em IP e MW diferentes do que 2D-SDS-PAGE. Durante o processo de purificação dos picos de calpastatina a actividade por mg de proteína aumentou mas perdeu metade da atividade total apresentada durante a primeira etapa de purificação. Para o pico 2 de calpastatina a actividade específica aumentou 139,8 vezes e no final deste processo permaneceu 36% da atividade total. A calpastatina purificada foi identificada no gel de segunda dimensão com um peso molecular semelhante ao western blot. Spots do pico 1 da calpastatina e dois do pico 2 da calpastatina foram identificados como peptídeos pertencentes à molécula da calpastatina. Sequêcia de peptídeos identificados em Spot a partir do pico 1 purificado como parte do domínio inibidor III e IV e do terminal C e do pico 2 purificado uma sequêcia de peptideos identificados como parte do domínio inibidor I, II e III. Estes resultados levam-nos a crer que ambos os picos, neste caso, são produtos de degradação da molécula intacta e, provavelmente, os pequenos peptideos são quebrados durante o processo. Os resultados do presente estudo mostram que é possível a purificação de formas distintas de calpastatina activa, contudo a forma intacta de calpastatina não estava presente nesta purificação. A presença de peptídeos não foi conclusiva para determinar a origem ea composição de cada pico ativo.

O consumo alimentar residual (CAR) é uma medida de eficiência alimentar independente do crescimento e do peso à maturidade. O melhoramento genético para CAR pode reduzir o custo de alimentação de bovinos, porém uma melhor compreensão dos processos biológicos relacionados ao CAR é necessária. Além disso, associações entre CAR e qualidade de carcaça têm sido pouco investigadas em raças zebuínas. Desta forma, o objetivo com este estudo foi avaliar o metabolismo protéico, a composição corporal, as características de carcaça e a qualidade de carne em bovinos zebuínos com alto e baixo CAR. Adicionalmente, foi testada a hipótese da existência de interações entre CAR e peso vivo ao abate para características de carcaça e composição corporal. Setenta e dois novilhos da raça Nelore (16 a 21 meses de idade, 334±19 kg de peso vivo inicial [PV]) foram mantidos em confinamento e alimentados ad libitum (74,5% NDT; 14,3%PB) por 70 dias. O consumo de matéria seca (CMS) e o ganho médio de peso (GMD) diários foram medidos individualmente. Os 12 novilhos com maior CAR e os 12 com menor CAR foram classificados como grupos de alto e baixo CAR, respectivamente (fase de seleção) e foram alimentados até quando alcançassem pesos vivo ao abate de 460, 490, 520 e 550 kg (fase de terminação). Antes do abate, foi realizada colheita total de urina para a determinação da excreção diária de 3-metil-histidina e da taxa fracional de degradação miofibrilar. A composição química corporal foi estimada pelo método de diluição isotópica utilizando óxido de deutério. A maciez objetiva da carne e a atividade de proteases cálcio-dependentes foram determinadas no músculo Longissimus. Na fase de seleção, novilhos com baixo CAR tiveram menores CMS, conversão alimentar, CAR e ganho de gordura sobre a garupa que novilhos com alto CAR, mas nenhuma diferença foi observada no GMD, no PV final, na gordura subcutânea e na área do Longissimus. Na fase de terminação, nenhuma interação foi observada entre CAR e PV ao abate. Não houve diferenças entre animais mais e menos eficientes quanto ao peso e rendimento de carcaça, gordura renal, pélvica e inguinal, vísceras, área de Longissimus, gordura subcutânea, marmorização, aparas e porção comestível. Novilhos com baixo CAR apresentaram menos gordura sobre o trato gastrintestinal (TGI) que novilhos com alto CAR. Não foram observadas diferenças quanto ao índice de fragmentação miofibrilar, força de cisalhamento e atividade do sistema calpaína. As taxas fracionais de degradação, síntese e acréscimo protéico foram similares entre os grupos de CAR. Novilhos Nelore com baixo CAR depositaram menos gordura subcutânea na carcaça em pesos vivos entre 340 e 460 kg. Em pesos mais elevados (460-550 kg), as características de carcaça e a composição corporal não foram influenciadas pelo CAR, mas indivíduos menos eficientes apresentaram maior massa de gordura visceral. A seleção de bovinos zebuínos para baixo CAR pode diminuir a ingestão de alimentos e melhorar sua eficiência alimentar, sem comprometer a qualidade da carne. / Residual feed intake (RFI) is a feed efficiency trait that is independent of growth rate and mature weight. Genetic improvement in RFI may reduce the costs of feeding cattle, however a better understanding of biological processes underlying variation in RFI is necessary. Moreover, associations between RFI and carcass quality have been poorly investigated in Zebu breeds. Therefore, this study aimed to evaluate protein metabolism, body composition, carcass traits and meat quality in high- and low-RFI Zebu cattle. In addition, the hypothesis that there are interactions between RFI and harvest body weight for carcass traits and body composition was investigated. Seventy-two Nellore steers (16 to 21 month-old, 334±19 kg initial body weight [BW]) were fed a finishing ration (74.5% TDN, 14.3%CP) on an ad libitum basis, for 70 days. Daily dry matter intake (DMI) and body weight gain (ADG) were measured individually. The 12 lowest and the 12 highest RFI steers were classed as low- and high-RFI groups, respectively (selection phase), and were fed until reaching slaughter BW of 460, 490, 520 and 550 kg (finishing phase). Before slaughter, total urine was collected for determination of daily 3-methylhistidine excretion and myofibrillar protein breakdown rates. Body chemical composition was estimated by the isotope dilution method using deuterium oxide. Objective tenderness and Ca+2-dependent protease activities were measured on Longissimus muscle. In the selection phase, low-RFI steers had lower DMI, feed:gain, RFI, and ultrasound rump fat thickness gain than high-RFI cattle, but no differences were observed for ADG, final BW, ultrasound fat thickness and Longissimus area. In the finishing phase, no interactions were observed between RFI and slaughter BW. No differences between more and less efficient cattle were observed for hot carcass weight, dressing percentage, kidney, pelvic and inguinal fat, visceral mass, Longissimus area, backfat thickness, marbling score, trimmings and retail product yield. Low-RFI steers presented less fat on the gastrointestinal tract (GIT) than high-RFI cattle. No differences were observed for myofibrillar fragmentation index, Warner-Bratzler shear force and calpain system activities. Fractional rates of protein degradation, synthesis and accretion were similar between high- and low-RFI cattle. Low-RFI Nellore steers may store less subcutaneous carcass fat at body weights ranging from 340 and 460 kg. At higher body weights (460-550 kg), carcass traits and body composition are not affected by RFI, but least efficient cattle present greater visceral fat mass. Breeding zebu cattle for improved RFI may decrease feed intake and improve feed efficiency without compromising meat quality.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5633.pdf: 1339694 bytes, checksum: c96c2cb2d5b7dcda944ea18353c62f47 (MD5) Previous issue date: 2013-08-02 / The Meat tenderness, a trate of economic importance in animal production, is influenced by the intensity of the degradation of myofibrillar proteins in post-mortem. The &#956;-calpain is the main enzyme responsible for meat tenderness of skeletal muscle, and, conversely, the calpastatin, which is encoded by the CAST gene, acts as endogenous inhibitor of calpain and thus decreases the extent of proteolysis in skeletal muscle. Polymorphisms in CAST were associated with enzyme activity and shear force, indicating the great importance of the study of CAST gene regulation. It is known that the transcription of most genes is stably suppressed in most tissues and only remains active in their tissue of expression and in certain developmental stages, and that can be controlled by epigenetic events such as methylation of DNA cytosine that is identified by sequencing of bisulfite-treated DNA. The aim of this study was to evaluate if there was preferential expression, of tissue, genotype and stage of development for the CAST gene in liver, muscle and skin of fetuses and muscle and liver of homozygous and heterozygous adult cattle for the A> G exon 30/3'UTR polymorphism, evaluated by real-time PCR with SYBR ® fluorophore, and to verify if the differential expression is regulated by the methylation status of promoter region. Differential gene expression analyses were normalized to the reference gene RPS-9. When we analyzed the tissue-specific expression in fetuses, the CAST gene was 2 times more expressed in liver than in skin (p <0.05) and almost two times more expressed in liver than in muscle (p <0.05). It was also found that this gene was 1.83 x up regulated in adult muscle when compared to fetal muscle (p <0.05), showing differential expression in the developmental stage. Differences in expression between genotypes were also found, when comparing the homozygous genotype to the heterozygous genotype (used as calibrator). Fetal samples of muscle and skin of individuals with GG genotype presented higher expression (p <0.05) of CAST gene (2x and 1,74 x, respectively, compared to heterozygous) and muscle of animals with AA genotypes also presented higher expression (1.4x compared to AG). In adult animals, the gene was up regulated in liver and muscle of individuals with GG genotype (2x and 1.63x more than AG, respectively) and was less expressed in the liver of homozygote AA (0,32x less than AG) (p <0.05). The presence of a CpG island in the promoter region of the gene CAST was identified and the methylation status was studied after bisulfite treatment, cloning of the fragment and sequencing of clones. The CpG island was hypomethylated in different tissues: 0.63% of methylated CpG dinucleotides in fetal muscle, 0.43% in fetal liver and 0.61% in adult muscle. According to the different genotypes the island was methylated in 0.61%, 0 49%, 0.60% in animal with AA genotype, 0.81%, 0.35%, 0.34% in AG, 0.4%, 0.45% ,0.9% in GG in fetal muscle, fetal liver and adult muscle respectively. In our results we show that the CpG island is hypomethylated and can allow transcription of the gene but the methylation does not explain the differences in expression within tissues, developmental stage and genotypes of the CAST gene. / A maciez da carne, uma característica de grande interesse econômico, é influenciada pela intensidade da degradação de proteínas miofibrilares no período pós-mortem. A &#956;-calpaína é a principal enzima responsável pelo amaciamento do músculo esquelético, e de maneira oposta, a calpastatina que é codificada pelo gene CAST, atua como inibidor endógeno das calpaínas e, portanto, diminui a taxa e extensão da proteólise no músculo esquelético. Polimorfismos no gene CAST já foram associados à atividade da enzima e à força de cisalhamento, indicando a grande importância no estudo da regulação desse gene. Sabe-se que a transcrição da maior parte dos genes é reprimida estavelmente na maioria dos tecidos e só permanece ativa nos seus tecidos de expressão e em determinados estádios do desenvolvimento, e que isso pode ser controlado por eventos epigenéticos como a metilação de citosinas do DNA, passível de identificação por sequenciamento de DNA tratado com bissulfito. Os objetivos deste estudo foram avaliar se ocorre expressão preferencial de tecido, de genótipo e de estádio do desenvolvimento para o gene CAST em fígado, músculo e pele de fetos e músculo e fígado de animais adultos em bovinos homozigotos e heterozigotos para o polimorfismo A>G no éxon 30/3 UTR por meio de PCR em tempo real com o fluoróforo SYBR®. Além disso, foi verificado se a expressão diferencial do gene é regulada pelo status de metilação no seu promotor. Todas as expressões foram normalizadas para o gene referência RPS-9. Em fetos o gene CAST foi duas vezes mais expresso (p<0,05) em fígado do que em pele e quase duas vezes mais expresso (p<0,05) em fígado do que em músculo. Também foi encontrado aumento na expressão do gene de 1,83 x (p<0,05) em músculo adulto quando comparado a músculo fetal, evidenciando expressão diferencial de estádio de desenvolvimento. Quando analisadas as diferenças de expressão entre genótipos, comparando o genótipo homozigoto com o genótipo heterozigoto (usado como calibrador) foi encontrado, em amostras de fetos, um aumento de expressão (p<0,05) do gene CAST em músculo e pele de indivíduos GG (2x e 1,74x, respectivamente, em relação a heterozigotos) e músculo de indivíduos AA (1,4x em reação a AG). Em amostras de animais adultos, o gene foi mais expresso em fígado e músculo de indivíduos GG (2x e 1,63x mais que AG, respectivamente) e foi menos expresso (p<0,05) em fígado de indivíduos homozigotos AA (0,32x menos que AG). Foi identificada a presença de uma ilha CpG na região promotora do gene CAST e foi realizado tratamento do DNA com bissulfito, a clonagem do fragmento e o sequenciamento de clones. A ilha CpG mostrou-se hipometilada nos diferentes tecidos: 0,63% de dinucleotídeos CpG metilados em músculo fetal, 0,43% em fígado fetal e 0,61% em músculo adulto; e nos diferentes genótipos: 0,61%, 0,49% e 0,60% em AA, 0,81%, 0,35%, 0,34% em AG, 0,4%, 0,45% e 0,9% em GG em músculo fetal, fígado fetal e músculo adulto respectivamente. Assim a hipometilação da ilha CpG pode permitir a transcrição do gene, mas não explica as diferenças de expressão entre tecidos, estádio de desenvolvimento e genótipo para o genes CAST.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-06-09T17:05:06Z No. of bitstreams: 2 Tese - Letícia Mendes de Castro - 2016.pdf: 2261024 bytes, checksum: 4cfaccebd66c7e3ea4eda9b31d53d16d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-10T11:19:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Letícia Mendes de Castro - 2016.pdf: 2261024 bytes, checksum: 4cfaccebd66c7e3ea4eda9b31d53d16d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T11:19:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Letícia Mendes de Castro - 2016.pdf: 2261024 bytes, checksum: 4cfaccebd66c7e3ea4eda9b31d53d16d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brazil has one of the largest commercial cattle herds worldwide, but its meat quality is highly variable. The national herd is largely composed of Bos indicus breeds, which in general have less tender meat than Bos taurus cattle, decreasing the product value. This study was carried out to identify relevant regions and biological pathways associated with meat tenderness in Polled Nellore cattle. It was also aimed to evaluate the effect of different quality control protocols in GWAS for meat tenderness in Polled Nellore cattle. The data consisted of Warner-Bratzler shear force (WBSF) values of Longissimus muscle after 7 days of ageing, from 427 Polled Nellore animals. The animals were genotyped using either the Illumina BovineHD Beadchip (777k) or the GGP-Indicus Chip (77k). SNPs were excluded when Call Rate < 90%, then the imputation from the GGP to the HD Chip was performed using the FImput’s software. To study the different quality control protocols and their influence in GWAS, 590,915 markers were used. The effect of different QCs were verified using 16 protocols with three thresholds for MAF (MAF < 0.01; < 0.05 and < 0.10) and HWP (p < 0.01; < 0.0001 and < 0.00001) and their possible combinations. GWASs were performed using the PD3/EMMAx method with the remaining markers of each QC. For GWAS performed for pathway analysis, 369,007 markers were used after SNPs were excluded when Call rate < 90%, HWP p < 0.01 and MAF < 0.01. Group of slaughter and sex were included as fixed effects. Significant markers (p < 0.0001) were found in all analysis, in which the chromosomes with more significant SNPs of the different QCs were 3, 17, 20, 21, 25 and 27, and in the pathway study were located on chromosomes 3, 13, 17, 20, 21 and 25 explaining great proportion of variation, indicating possible QTLs associated with meat tenderness in those genomic regions. The analyses of different QCs showed that there is an effect of quality control over GWAS, and the filter for MAF influenced the results more broadly. A pathway enrichment analysis based on SNPs from GWAS was performed using FatiGO’s procedure. 22,365 annotated genes, including 1,010 significant genes were used. Thus, 22 GO terms and two IP entries were deemed enriched. Several of these functional categories, such as protein tyrosine and serine/threonine kinase activity, calcium ion binding and growth factors can be related to WBSF in Polled Nellore cattle. These results help to elucidate the metabolic pathways related to this trait, which is of extreme economic and social importance to Brazil as Nellore is the dominant beef cattle breed in the country. / O Brasil tem um dos maiores rebanhos bovinos comerciais do mundo, mas a qualidade da carne é altamente variável. O rebanho nacional é em grande parte composto de raças Bos indicus, que em geral têm carne menos macia do que o gado Bos taurus, diminuindo o valor do produto. Objetivou-se nesse estudo identificar regiões genômicas e vias biológicas relevantes associadas com a maciez da carne em bovinos da raça Nelore Mocho. Além disso, objetivou-se também avaliar diferentes protocolos de controle de qualidade dos SNPs e as possíveis influências nos resultados de GWAS. Os dados consistiram em valores de WBSF do músculo Longissimus dorsi, após maturação de sete dias, de 427 animais Nelore Mocho. Os animais foram genotipados em marcadores SNP Illumina BovineHD Beadchip (777k) ou Chip GGP-Indicus (77k). Todos os SNPs passaram por um Call Rate de 90% para posterior imputação utilizando o software FImput. Para averiguar os diferentes protocolos de qualidade e suas influências no GWAS foram utilizados 590.915 marcadores. Os efeitos dos diferentes QCs foram verificados utilizando 16 protocolos com três limiares para MAF (MAF < 0,01;< 0,05 e < 0,10) e HWP (p < 0,01; < 0,0001 e < 0,00001) e suas possíveis combinações. Os GWASs foram realizados utilizando método P3D/EMMAx com os marcadores restantes de cada QC. No GWAS realizado para posterior análise das vias utilizou-se 369.007 marcadores após a exclusão de SNPs baseada nos filtros Call Rate < 90%, HWP p < 0,01 e MAF < 0,01. Grupo de abate e sexo foram incluídos no modelo como efeitos fixos. Marcadores significativos (p < 0,0001) foram localizados em todas as análises, e os cromossomos com maior quantidade de SNPs significativos dos diferentes QCs foram 3, 17, 20, 21, 25 e 27. No estudo de vias foram localizados SNPs significativos nos cromossomos 3, 13, 17, 20, 21 e 25, que explicaram maior proporção da variação, indicando que existem QTLs associados à maciez da carne nessas regiões do genoma. As análises dos diferentes QCs evidenciaram efeito do controle de qualidade dos SNPs sobre o GWAS e o filtro para MAF influenciou de maneira mais ampla os resultados. Foi realizada uma análise de enriquecimento de vias baseando-se nos SNPs do GWAS, utilizando o procedimento FatiGO. Apenas os genes com no mínimo um SNP significativo (p < 0,01) foram considerados. Foram utilizados 22.365 genes anotados, incluindo 1.010 genes significativos. Um total de 22 termos GO e duas entradas IP foram consideradas enriquecidas com genes significamente associados com a maciez da carne. Várias dessas categorias funcionais como atividade da proteína tirosina quinase e serina/treonina quinase, ligantes ao íon cálcio e fatores de crescimento, podem estar relacionadas com WBFS em bovinos da raça Nelore Mocho. Estes resultados ajudam elucidar as vias relacionadas com essa característica de extrema importância econômica para o Brasil, já que o Nelore é a raça de gado de corte dominante no país.

O consumo alimentar residual (CAR) é uma medida de eficiência alimentar independente do crescimento e do peso à maturidade. O melhoramento genético para CAR pode reduzir o custo de alimentação de bovinos, porém uma melhor compreensão dos processos biológicos relacionados ao CAR é necessária. Além disso, associações entre CAR e qualidade de carcaça têm sido pouco investigadas em raças zebuínas. Desta forma, o objetivo com este estudo foi avaliar o metabolismo protéico, a composição corporal, as características de carcaça e a qualidade de carne em bovinos zebuínos com alto e baixo CAR. Adicionalmente, foi testada a hipótese da existência de interações entre CAR e peso vivo ao abate para características de carcaça e composição corporal. Setenta e dois novilhos da raça Nelore (16 a 21 meses de idade, 334±19 kg de peso vivo inicial [PV]) foram mantidos em confinamento e alimentados ad libitum (74,5% NDT; 14,3%PB) por 70 dias. O consumo de matéria seca (CMS) e o ganho médio de peso (GMD) diários foram medidos individualmente. Os 12 novilhos com maior CAR e os 12 com menor CAR foram classificados como grupos de alto e baixo CAR, respectivamente (fase de seleção) e foram alimentados até quando alcançassem pesos vivo ao abate de 460, 490, 520 e 550 kg (fase de terminação). Antes do abate, foi realizada colheita total de urina para a determinação da excreção diária de 3-metil-histidina e da taxa fracional de degradação miofibrilar. A composição química corporal foi estimada pelo método de diluição isotópica utilizando óxido de deutério. A maciez objetiva da carne e a atividade de proteases cálcio-dependentes foram determinadas no músculo Longissimus. Na fase de seleção, novilhos com baixo CAR tiveram menores CMS, conversão alimentar, CAR e ganho de gordura sobre a garupa que novilhos com alto CAR, mas nenhuma diferença foi observada no GMD, no PV final, na gordura subcutânea e na área do Longissimus. Na fase de terminação, nenhuma interação foi observada entre CAR e PV ao abate. Não houve diferenças entre animais mais e menos eficientes quanto ao peso e rendimento de carcaça, gordura renal, pélvica e inguinal, vísceras, área de Longissimus, gordura subcutânea, marmorização, aparas e porção comestível. Novilhos com baixo CAR apresentaram menos gordura sobre o trato gastrintestinal (TGI) que novilhos com alto CAR. Não foram observadas diferenças quanto ao índice de fragmentação miofibrilar, força de cisalhamento e atividade do sistema calpaína. As taxas fracionais de degradação, síntese e acréscimo protéico foram similares entre os grupos de CAR. Novilhos Nelore com baixo CAR depositaram menos gordura subcutânea na carcaça em pesos vivos entre 340 e 460 kg. Em pesos mais elevados (460-550 kg), as características de carcaça e a composição corporal não foram influenciadas pelo CAR, mas indivíduos menos eficientes apresentaram maior massa de gordura visceral. A seleção de bovinos zebuínos para baixo CAR pode diminuir a ingestão de alimentos e melhorar sua eficiência alimentar, sem comprometer a qualidade da carne. / Residual feed intake (RFI) is a feed efficiency trait that is independent of growth rate and mature weight. Genetic improvement in RFI may reduce the costs of feeding cattle, however a better understanding of biological processes underlying variation in RFI is necessary. Moreover, associations between RFI and carcass quality have been poorly investigated in Zebu breeds. Therefore, this study aimed to evaluate protein metabolism, body composition, carcass traits and meat quality in high- and low-RFI Zebu cattle. In addition, the hypothesis that there are interactions between RFI and harvest body weight for carcass traits and body composition was investigated. Seventy-two Nellore steers (16 to 21 month-old, 334±19 kg initial body weight [BW]) were fed a finishing ration (74.5% TDN, 14.3%CP) on an ad libitum basis, for 70 days. Daily dry matter intake (DMI) and body weight gain (ADG) were measured individually. The 12 lowest and the 12 highest RFI steers were classed as low- and high-RFI groups, respectively (selection phase), and were fed until reaching slaughter BW of 460, 490, 520 and 550 kg (finishing phase). Before slaughter, total urine was collected for determination of daily 3-methylhistidine excretion and myofibrillar protein breakdown rates. Body chemical composition was estimated by the isotope dilution method using deuterium oxide. Objective tenderness and Ca+2-dependent protease activities were measured on Longissimus muscle. In the selection phase, low-RFI steers had lower DMI, feed:gain, RFI, and ultrasound rump fat thickness gain than high-RFI cattle, but no differences were observed for ADG, final BW, ultrasound fat thickness and Longissimus area. In the finishing phase, no interactions were observed between RFI and slaughter BW. No differences between more and less efficient cattle were observed for hot carcass weight, dressing percentage, kidney, pelvic and inguinal fat, visceral mass, Longissimus area, backfat thickness, marbling score, trimmings and retail product yield. Low-RFI steers presented less fat on the gastrointestinal tract (GIT) than high-RFI cattle. No differences were observed for myofibrillar fragmentation index, Warner-Bratzler shear force and calpain system activities. Fractional rates of protein degradation, synthesis and accretion were similar between high- and low-RFI cattle. Low-RFI Nellore steers may store less subcutaneous carcass fat at body weights ranging from 340 and 460 kg. At higher body weights (460-550 kg), carcass traits and body composition are not affected by RFI, but least efficient cattle present greater visceral fat mass. Breeding zebu cattle for improved RFI may decrease feed intake and improve feed efficiency without compromising meat quality.