Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMMS.pdf: 957649 bytes, checksum: 26153578cc56d59b9fd242494f3cd28d (MD5) Previous issue date: 2007-03-09 / Financiadora de Estudos e Projetos / Due to the great economic importance of sugarcane crop in Brazil, the occurrence of infections by phytopathogens leading to decreased productivity and quality remains a serious problem. As the plants have natural mechanisms of defense against the attack of fungi and insects, amongst which the inhibitors of proteases are distinguished, the use of these substances in the development of resistant plants or in pesticide production may be an interesting alternative. One of the major classes of protease inhibitors acting against the attack of pathogens is the cystatins, proteins that inhibit cysteine proteases specifically. Canecystatin was the first cysteine protease inhibitor characterized from sugarcane. This gene codes for a ~ 14 kDa protein that contains conserved regions common to the cystatin family. Although the protein has previously been produced in a bacterial system of expression, in this work we use this sugarcane cystatin as a model for the implementation of a heterologous protein expression system in insect cells. This system has some advantages relatively to the prokaryotic system such as the possibility of posttranslational modifications. The recombinant protein was expressed in this system in a soluble form and purified using affinity chromatography in a nickel column, rendering approximately 23 mg/L of pure protein. The activity of the protein was assayed against papain, being capable of inhibiting the activity of this cysteine protease efficiently. Furthermore, the stability of the protein was analyzed in different conditions of pH and temperature. We conclude that the canecystatin is a good model for the implementation of the Baculovirus Expression System at the Molecular Biology Laboratory of the UFSCar / Devido à grande importância da cultura da cana-de-açúcar no Brasil, a ocorrência de infecções por fitopatógenos constitui um grave problema que acarreta queda na produtividade e na qualidade da lavoura canavieira. Uma vez que as plantas têm mecanismos naturais de defesa contra o ataque de fungos e insetos, dentre os quais se destacam os inibidores de proteases, a utilização dessas substâncias no desenvolvimento de plantas resistentes ou na produção de pesticidas seria uma alternativa interessante. Um tipo de inibidor de protease que atua na proteção contra o ataque de patógenos e como proteínas de reservas em algumas sementes são as cistatinas, proteínas que inibem especificamente cisteínoproteases. A Canacistatina foi o primeiro inibidor de cisteíno-protease caracterizado originado da cana-de-açúcar. Apesar de já ter sido anteriormente produzida em sistema bacteriano de expressão, a Canacistatina foi utilizada, nesse trabalho, como modelo de estudo para implementação do sistema de expressão de proteínas heterólogas em células de inseto. Esse sistema apresenta algumas vantagens sobre o sistema procariótico como a possibilidade de realizarem modificações pós-traducionais. A proteína recombinante foi expressa nesse sistema na forma solúvel e purificada em cromatografia de afinidade em coluna de níquel, resultando em um rendimento de 23 gramas por litro de cultura. A proteína purificada foi submetida a testes de inibição enzimática contra a papaína, sendo capaz de inibir satisfatoriamente a atividade dessa cisteíno-protease. Também foram realizados testes de estabilidade desse inibidor em diferentes condições de pH e temperatura, mostrando-se estável. A Canacistatina foi um modelo de estudo adequado para a implementação do sistema de expressão de proteínas no Laboratório de Biologia Molecular da UFSCar

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCWR.pdf: 2377767 bytes, checksum: 22e5ef2553191133e9dfe9a15fc8707a (MD5) Previous issue date: 2007-03-19 / Universidade Federal de Sao Carlos / Sugarcane is a plant of great economical importance, mainly in Brazil, which is currently the largest producer of this crop in the world. However, sugarcane farming has suffered attacks from pests and pathogens, leading to considerable economical losses. Therefore, a number of studies have focused on the development of more resistant sugarcane varieties. Our laboratory has been working on a sugarcane protein (CaneCPI- 1), which is a cystein-protease inhibitor protein. Based on studies that indicate that insects belonging to the order Coleoptera possess cystein-proteases in their mid-gut and with the knowledge that some species of Coleoptera are sugarcane pests, a transgenic sugarcane plant overexpressing the CaneCPI-1 gene was developed under the control of maize ubiquitin promoter. CaneCPI-1 was fused to a His-tag to facilitate further purification through affinity chromatography. The calli transformation was performed through biobalistics. The transformed plants were then selected by polymerase chain reaction. Positive plants were further selected by Semi-quantitative PCR and Western blotting. A transformed plant expressing a His-tagged CaneCPI-1 was selected for purification of the recombinant protein in a nickel column, enabling purification of HISCaneCPI-1 from plant leaves in a single step. The yield was about 6mg of pure protein per kilogram of sugarcane leaves. The HISCaneCPI-1 purified from the transformed sugarcane demonstrated inhibitory activity on the human cysteine protease cathepsin L. These studies demonstrate that the sugarcane can be a safe and viable expression system for recombinant protein production, and are the first step in the establishment of a sugarcane plant that is more resistant to pathogens. / A cana-de-açúcar é uma planta de grande importância econômica, principalmente no Brasil, que hoje é o maior produtor mundial desta cultura. Porém, as lavouras de canade- açúcar estão cada vez mais sendo atacadas e destruídas por pragas e patógenos, causando grandes perdas econômicas para os produtores. Assim, vários estudos estão focados no desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar mais resistentes. Nosso laboratório tem trabalhado com a proteína CaneCPI-1, uma proteína inibidora de cisteíno-protease. Baseado em estudos que indicam que insetos pertencentes à ordem Coleoptera possuem enzimas proteolíticas do tipo cisteíno-proteases em seu trato digestivo e, sabendo que algumas espécies de Coleoptera são pragas de cana-de-açúcar e que causam sérios danos aos canaviais, foi desenvolvida uma cana-de-açúcar transgênica superexpressando o gene da CaneCPI-1 sobre controle do promotor da ubiquitina do milho. A CaneCPI-1 foi também fusionada a uma his-tag para facilitar a posterior purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Para a transformação genética dos calos foi utilizado o método de biobalística e, após isto, foi feita uma seleção das plantas transformadas através de uma reação de PCR. As plantas que apresentaram resultado positivo foram selecionadas por PCR Semi-quantitativo e ensaios de Western blotting. Uma planta transformada expressando a proteína CaneCPI- 1 com his-tag foi selecionada para a purificação da proteína recombinante em coluna de afinidade ao níquel, possibilitando a purificação da HISCaneCPI-1 em um único passo. O rendimento foi de 6mg de proteína pura por kilograma de folhas de cana-de-açúcar. A HISCaneCPI-1 purificada demonstrou atividade inibitória contra a enzima catepsina L, uma cisteíno-protease humana. Estes resultados mostram que a cana-de-açúcar pode ser usada como um sistema de expressão seguro e viável para a produção de proteínas recombinantes e é o primeiro passo para o estabelecimento de uma cana-de-açúcar resistente à pragas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1017.pdf: 995026 bytes, checksum: ef148f947991d5158178e2648da65639 (MD5) Previous issue date: 2006-03-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / Canecystatin (CC) is a competitive and reversible protease inhibitor which blocks the proteolytic enzymes activities of insets, fungus e nematodes, prejudicing thus the growth, development and reproduction from these pathogenics organisms. CC is produced by sugarcane, but with limited production, difficulting extraction and purification for production of commercials products, so recombinant DNA technology is one alternative for increase of CC production. Nowadays, CC is produced in the Molecular Biology Laboratory of the Department of Genetic and Evolution of UFSCar (LBM-DGE/UFSCar) from E. coli BL21(DE3) in shaker, utilizing a high cost commercial culture medium (Circlegrow®). With the purpose of produce CC in higher scale, the aim of present work was the study the CC expression in E. coli BL21(DE3), evaluating different carbon source, kind of inductor and induction moment in shaker, as well as confirming the expression conditions in airlift bioreactor of 6 L working volume. In the experiments carried out in shaker were obtained similar cellular growth when utilized glycerol, glucose, fructose e fructose + glucose, and low cellular growth when utilized galactose. It was observed high expression when galactose was utilized as carbon source and IPTG 0,4 mM as inductor. When lactose at 4 e 40 mM was utilized as inductor, CC expression occurred only in the culture containing galactose as carbon source. Volumetric production (in mg/L) of CC up to 61% those from standard culture was obtained, with exception the culture that utilized galactose induced with 0,4 mM of IPTG and 4 mM of lactose, and specific production (mgCC/gcells) greater 75% from standard culture. With respect of cultures in airlift bioreactor, CC expression was superior to expression culture carried out in shaker utilizing glucose with carbon source, approximately 80% of CC concentration obtained in the standard culture after 1 hour of induction and achieving more than 90% in the second hour of induction. In terms of specific production, in this culture was obtained 79,9 mgCC/gcell, value approximately 25% superior to the standard culture. / A canacistatina (CC) é um inibidor competitivo e reversível de proteases, que bloqueia a atividade proteolítica de enzimas de insetos, fungos e nematóides, prejudicando assim o crescimento, desenvolvimento e reprodução destes organismos patogênicos. É produzida em quantidades limitadas pela cana-de-açúcar, inviabilizando sua extração e purificação para produção de produtos comerciais, sendo a tecnologia de DNA recombinante uma alternativa para o aumento da sua produção. Atualmente, a CC é produzida no laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Genética e Evolução da UFSCar (LBM-DGE/UFSCar) por de E. coli BL21(DE3) em mesa incubadora rotativa utilizando o meio de cultura comercial (Circlegrow®) de alto custo. Com a finalidade de se produzir CC em maior escala, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da expressão de CC em E. coli BL21(DE3), avaliandose diferentes fontes de carbono, tipo de indutor e momento de indução, em mesa incubadora rotativa no sentido de se avaliar a expressão, bem como comprovar as novas condições de expressão em biorreator airlift de 6 L de capacidade útil. Nos ensaios em mesa incubadora rotativa foram obtidos crescimentos celulares semelhantes quando se utilizou glicerol, glicose, frutose e frutose + glicose, e baixo crescimento celular quando se utilizou galactose. Foi observada uma alta expressão quando se utilizou galactose como fonte de carbono e IPTG 0,4 mM como indutor. Quando foi utilizada lactose como indutor em concentrações de 4 e 40 mM, observou-se expressão de CC apenas nos cultivos com galactose como fonte de carbono. Foram obtidas produções volumétricas (mg/L) no máximo de 61% da concentração de CC obtida no cultivo padrão, com exceção dos cultivos com galactose induzidos com 0,4 mM de IPTG e 4 mM de lactose, e produção específica (mgCC/gcélula) com valores superiores a 75% do obtido no cultivo padrão. Quanto aos cultivos em biorreator airlift, expressão de CC foi superior à do cultivo realizado em mesa incubadora rotativa utilizando glicose como fonte de carbono, em torno de 80% da produção obtida no cultivo padrão após 1 hora de indução, alcançando 90% na segunda hora. Em termos de produção específica, nesse cultivo obteve-se 79,9 mgCC/gcélula após 2 horas de indução, cerca de 25% superior ao cultivo padrão.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4058.pdf: 1157673 bytes, checksum: 2346bf567a5ddfbb9217c250df00ce8e (MD5) Previous issue date: 2011-09-09 / Universidade Federal de Sao Carlos / Saccharomyces cerevisiae is the most important microorganism used in alcoholic fermentation process. A strain of Saccharomyces cerevisiae widely used to produce alcohol in Brazil is the PE-2, due to its high fermentation capacity. The goal of this study was to develop an expression system for recombinant proteins using the industrial strain of Saccharomyces cerevisiae, PE-2. The protein chosen to be used as a model for this system was the Cane-CPI-1, an inhibitor of cysteine protease. Initially the construction of plasmids containing CaneCPI-1 gene was performed and yeast cells were transformed with pYADE4-CaneCPI-1 construction. The transformed strain was submitted to expression analyses during batch fermentative process with cell recycle. The recombinant protein was expressed in yeast cells and it was possible to purify the recombinant protein by affinity chromatography on nickel column. This purified protein was immunodetected using a polyclonal anti-CaneCPI-1antibody and monoclonal anti His-Tag antibody, which were also able to detect the CaneCPI-1 in a crude extract from Saccharomyces cerevisiae cells. Assays of inhibitory activity performed with the purified CaneCPI-1 revealed its ability to inhibit the catalytic activity of a cysteine proteinase. This study showed that the use of transformed strain did not affect the fermentation process and that the PE-2 industrial strain of S. cerevisiae can be a viable expression system for recombinant protein production and open perspectives for production of any protein of biotechnological applications during fermentation alcoholic process. / Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais importante usado no processo de fermentação alcoólica. Uma linhagem de S. cerevisiae amplamente utilizado para produzir álcool no Brasil é a PE-2, devido à sua alta capacidade de fermentação e persistência no sistema. Neste trabalho utilizou-se esta linhagem industrial de levedura como um sistema de expressão de proteínas de interesse biotecnológico. A proteína escolhida como modelo para este sistema foi a CaneCPI-1, uma cistatina de cana-de-açúcar que possui ação inseticida. Inicialmente, foi realizada a construção de um plasmídeo contendo o gene que codifica para a proteína CaneCPI-1 e este foi utilizado para transformar células da levedura S.cerevisiae linhagem PE-2. Posteriormente foram realizados sucessivos ciclos de fermentação (5 ciclos) com esta levedura transformada e as células fermentadas foram submetidas a análises de expressão da proteína CaneCPI-1. Foi possível purificar a proteína recombinante por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Anticorpo policlonal anti-CaneCPI-1 e anticorpo monoclonal anti-His-Tag foram capazes de imunodetectar a proteína purificada e no extrato proteico bruto do último ciclo fermentativo. Ensaios da atividade inibitória mostraram que a CaneCPI-1 purificada foi capaz de inibir a atividade hidrolítica da papaína. A utilização da linhagem transformada não afetou a eficiência do processo fermentativo durante os quatro primeiros reciclos. A produção da CaneCPI-1 em uma linhagem industrial de S. cerevisiae ao longo do processo fermentativo se mostrou viável, abrindo-se novas perspectivas para a produção de qualquer proteína de aplicações biotecnológicas durante o processo de fermentação alcoólica.