A urease de Canavalia ensiformis é de relevância histórica tendo sido a primeira proteína a ser cristalizada, feito realizado por Sumner em 1926 comprovando assim a natureza protéica das enzimas. Essa proteína também foi a primeira enzima contendo níquel a ser identificada. As ureases são amplamente encontradas em vegetais, bactérias e fungos, apresentando um alto grau de homologia entre si. Esta similaridade de seqüência primária indica um processo conservativo durante a Evolução e um papel fisiológico importante destas enzimas. As ureases microbianas estão envolvidas em processos patogênicos como formação de cálculos urinários, incrustação de catéter, pielonefrites, úlceras pépticas e possivelmente, na formação de tumores de estômago. Em vegetais, pouco se sabe a respeito da função biológica das ureases, embora sua presença em tecidos vegetais seja freqüente. Postula-se seu envolvimento na biodisponibilidade de nitrogênio; ou mesmo como mecanismo de defesa dos vegetais. A canatoxina, uma isoforma de urease isolada da C. ensiformis, é tóxica para insetos e possui outras atividades biológicas de interesse, dentre as quais destacam-se: 1) atividade secretagoga e pró-agregante em plaquetas de coelho; 2) atividade hemaglutinante indireta para hemácias de coelho; 3) propriedade próinflamatória, evidenciada nos modelos de edema de pata e pleuresia em ratos. Este estudo propõe-se a investigar se ureases bacterianas apresentariam propriedades biológicas como as da canatoxina; e se essas propriedades são dependentes ou não da atividade enzimática dessas ureases.

A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular. / Jackbean (Canavalia ensiformis) is a legume highly resistant to insects. Contributing to this resistance, the plant contains urease isoforms that are entomotoxic upon the release of internal peptides by insect’s digestive cathepsin-like enzymes. A recombinant peptide, called Jaburetox-2Ec, was built based on urease’s sequence and this peptide is poisonous to all insects tested. The hemipteran bug Oncopeltus fasciatus is one of our models of study. In this work we aimed to identify the main digestive peptidases of O. fasciatus, helping to elucidate the insecticidal mechanism of action of these toxins, and to test the effects of urease and derived peptides upon isolated organs. When fed with different Jackbean major urease (JBU) concentrations, O. fasciatus nymphs showed a mortality rate higher than 80% after two weeks. When injected with Jaburetox-2Ec the mortality rate was 100% after 48 hours. Homogenates of midguts dissected from fourth instars were used to perform proteolytic activity assays. The homogenates hydrolyzed JBU in vitro, yielding a fragment similar in size to known entomotoxic peptides. The major proteolytic activity at pH 4.0 upon protein substrates was blocked by specific aspartic and cysteine peptidases inhibitors, but was not affected by a metalopeptidase inhibitor (EDTA). The optimal activity upon a fluorogenic substrate specific for cysteine peptidases was at pH 5.0, being completely inhibited by E-64 at all pH values tested. The optimal activity upon a fluorogenic substrate designed for aspartic peptidases was again at pH 5.0, being partially blocked by Pepstatin A in the pH range 2 to 10. Fluorogenic substrates corresponding to the Nand C-terminal regions flanking the entomotoxic peptide within urease sequence were also tested. While the N-terminal peptide was not hydrolyzed by the midguts homogenate, the C-terminal peptide was cleaved maximally at pH 4.0-5.0, with complete inhibition by E-64. The midguts homogenate was submitted to ion exchange chromatography followed by gel filtration yielding a 22 kDa protein peak. After SDSPAGE this band was excised from the gel, digested with trypsin and the peptides were analyzed by mass spectrometry. A Cathepsin L was identified. The results suggest that susceptibility of O. fasciatus nymphs to JBU is, like in other insect models, due to limited proteolysis of ingested protein and subsequent release of entomotoxic peptides by Cathepsin-like digestive enzymes. Moreover, we performed in situ localization of Jaburetox-2Ec after injection in the hemolymph, and we observed immunoreactive processes in O. fasciatus nymphs’ central nervous system, indicating that the peptide could be acting there. Besides the poisonous effects caused by urease derived peptides, effects caused by the intact molecule were already described. Hence we tested urease’s effect upon O. fasciatus isolated midguts contractions. We observed that urease is capable of inhibiting, at some concentrations, serotonin excitatory effect on muscular contractions, activity that was not shared with Jaburetox-2Ec. We concluded from the data of this study and previous studies, that urease’s toxicity is not only due to proteolytic activation and release of toxic peptides, but also to the intact molecule, which seems to be causing disturbances in cell signalling.

A cultura algodoeira tem significativa participação na economia mundial. O algodão (Gossypium hirsutum) é predado por uma grande variedade de insetos, entre eles o percevejo manchador Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). O hábito alimentar deste inseto provoca danos nas sementes e fibras depreciando-as para a utilização comercial. Como alternativa para o aumento da resistência das plantas ao ataque de insetos predadores, estratégias biotecnológicas vêm sendo consideradas. A Canavalia ensiformis é fonte de proteínas com atividade inseticida como a urease, a canatoxina e a concanavalina-A. Tanto a canatoxina como a urease exercem efeitos tóxicos em ninfas deste percevejo, causando mortalidade e atraso no desenvolvimento dos insetos sobreviventes. De maneira análoga a outros modelos de insetos já estudados, a toxicidade em D. peruvianus dependeria da ativação proteolítica das proteínas por enzimas digestivas (catepsinas) do inseto e formação de um peptídeo tóxico. Neste trabalho, estudos de hidrólise in vitro na presença de inibidores seguidos por SDS-page e Western-blot confirmaram a ativação proteolítica da urease por enzimas do tipo catepsina-B. O homogeneizado de intestinos de ninfas hidrolisa também substratos típicos para catepsinas, como hemoglobina e Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, e a atividade proteolítica é bloqueada por pepstatina-A e E-64, inibidores específicos para aspártico e cisteíno proteinases, respectivamente. Duas cisteíno proteinases (DpQ-NR e DpQ-E) de intestinos de ninfas de D. peruvianus foram parcialmente purificadas e caracterizadas. Ambas apresentaram pH ótimo de atividade proteolítica entre 4,5 e 6,5, na presença de DTT e foram totalmente inibidas por E-64. No entanto o perfil de inibição evidencia a presença de outras enzimas nas frações. Ensaios de especificidade da fração DpQ-NR revelaram a preferência da enzima por substratos contendo resíduo hidrofóbico em P2, enquanto a enzima DpQ-E tem preferência por substratos contendo aminoácidos básicos em P1. Assim, o trabalho desenvolvido sugere a presença de proteinases múltiplas no sistema digestivo de D. peruvianus e o possível envolvimento destas peptidases na ativação proteolítica da urease. / Cotton (Gossypium hirsutum), an important agricultural commodity, is attacked by a number of pests, such as the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) which may cause severe losses in cotton plantations. Bug feeding on the cotton seeds and stains the cotton fibers resulting in damage to the seed, besides being a vector for phytopathogenic bacteria and fungi. Biotechnology strategies focusing on plant defensive molecules are being considered as an alternative to increase host plant resistance against this pest. The jack bean Canavalia ensiformis is the source of proteins displaying insecticidal activity such as urease, canatoxin and concanavalin-A. Canatoxin and urease were shown to cause lethality and severe detrimental effects in surviving insects, delaying the development stages of D. peruvianus. As in other insect models studied previously, this would depend on the proteolytic activation of the protein by insect cathepsin-like digestive enzymes to produced toxic peptides. The in vitro hydrolysis of urease in the presence of inhibitors, followed by SDS-page and Wester-blot confirm the proteolytic activation by insect cathepsin B-like enzymes. A nymphal gut extract hydrolysed typical cathepsin substrates, such as hemoglobin and Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, and hydrolysis was blocked by pepstatin-A and E-64, specific inhibitors of aspartic and cysteine proteinases. Two cysteine peptidases (DpQ-NR and DpQ-E) of D. peruvianus nymphs were partially purified and characterized. Both enzymes showed maximum activities at pH 4.5-5.0 and 5.5-6.5 in the presence of dithiotreitol and were totally inhibited by E-64. However, the inhibition profile points out to the presence of other types of proteinases in both fractions. DpQ-NR preferentially hydrolysed substrate with hydrophobic amino acids in P2, while DpQ-E had preference for substrate with basic residues in P1. Therefore, our work suggests the presence of multiple proteinases with distinct biochemical properties in the digestive system of D. peruvianus and the potencial involvement of these peptidases on the proteolytic activation of urease.

A urease de Canavalia ensiformis é de relevância histórica tendo sido a primeira proteína a ser cristalizada, feito realizado por Sumner em 1926 comprovando assim a natureza protéica das enzimas. Essa proteína também foi a primeira enzima contendo níquel a ser identificada. As ureases são amplamente encontradas em vegetais, bactérias e fungos, apresentando um alto grau de homologia entre si. Esta similaridade de seqüência primária indica um processo conservativo durante a Evolução e um papel fisiológico importante destas enzimas. As ureases microbianas estão envolvidas em processos patogênicos como formação de cálculos urinários, incrustação de catéter, pielonefrites, úlceras pépticas e possivelmente, na formação de tumores de estômago. Em vegetais, pouco se sabe a respeito da função biológica das ureases, embora sua presença em tecidos vegetais seja freqüente. Postula-se seu envolvimento na biodisponibilidade de nitrogênio; ou mesmo como mecanismo de defesa dos vegetais. A canatoxina, uma isoforma de urease isolada da C. ensiformis, é tóxica para insetos e possui outras atividades biológicas de interesse, dentre as quais destacam-se: 1) atividade secretagoga e pró-agregante em plaquetas de coelho; 2) atividade hemaglutinante indireta para hemácias de coelho; 3) propriedade próinflamatória, evidenciada nos modelos de edema de pata e pleuresia em ratos. Este estudo propõe-se a investigar se ureases bacterianas apresentariam propriedades biológicas como as da canatoxina; e se essas propriedades são dependentes ou não da atividade enzimática dessas ureases.

Ureases, apesar de sua importância histórica para a Bioquímica, ainda são enigmáticas. Pouco se sabe a respeito de suas propriedades não-catalíticas, por exemplo. Nesse contexto, o presente trabalho submeteu uma urease de Canavalia ensiformis (JBURE-IIB) a simulações de dinâmica molecular, nos níveis de detalhamento atomístico e coarse-grained, buscando obter uma caracterização conformacional dessa urease, tanto como monômero quanto como trímero. Os dados assim obtidos sugerem que os domínios da proteína apresentam diferentes mobilidades, sendo o domínio γ o mais flexível. Esse domínio é também o principal responsável pela compactação do monômero da urease isolado, quando comparado à sua conformação cristalográfica. A mobilidade do domínio γ foi também associada ao processo de oligomerização da enzima. A forma trimérica da urease de C. ensiformis também se tornou mais compacta após a simulação, apontando as ureases como moléculas altamente flexíveis, principalmente devido às regiões de alças que conectam domínios estruturais, no caso de ureases vegetais. Sendo uma propriedade não necessariamente associada à catálise, a análise de tal flexibilidade pode auxiliar tentativas futuras de explicar a participação não-catalítica da urease em suas propriedades multifuncionais. / Ureases, despite their historical importance in biochemistry, are still enigmatic. For instance, little is known about their non-catalytic properties. In this context, the current work submitted a Canavalia ensiformis urease (JBURE-IIB) to molecular dynamics simulations at both atomistic and coarse-grained levels in order to obtain a conformational characterization of such urease in both monomeric and trimeric forms. The data suggest that the domains of the protein present different mobilities, with the γ domain being the most flexible one. This domain is also the main responsible for the compactness of the isolated urease monomer when compared to its crystallographic conformation. The γ domain mobility was also associated with the oligomerization process of the enzyme. The trimeric form of C. ensiformis urease also became more compact after simulation, pointing to ureases as highly flexible molecules, mainly due to coiled regions connecting the structural domains, in the case of plant ureases. As a property not necessarily related to catalysis, the analysis of this flexibility may enlighten further efforts to solve the non-catalytic aspects of urease in its moonlighting properties.

Resumo não disponível.

O presente trabalho teve como ênfase avaliar a atividade herbicida de aleloquímicos em extratos aquosos de sementes da Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) através de ensaios de alelopatia e determinação de compostos fenólicos com atividade alelopática, utilizando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Com este objetivo realizaram-se bioensaios de germinação, medida do crescimento da radícula e produção de biomassa em placas de Petri, usando como substrato solo e papel e como planta alvo as ervas daninhas corda-de-viola (Ipomoea sp.) e trapoeraba (Commelinna sp). Para os ensaios de alelopatia foram preparados extratos aquosos de sementes de Canavalia ensiformis em diferentes concentrações. Os bioensaios mostraram que os aleloquímicos presentes no extrato de feijão-de-porco quando aplicado em solo, têm um efeito fitotóxico menor do que aqueles bioensaios realizados em papel. Os resultados apontam que a espécie estudada apresenta potencial alelopático. Dentre os metabólitos secundários responsáveis pela atividade alelopática observada nos extratos desta espécie, estão os compostos fenólicos: ácido clorogênico, ácido ferúlico, ácido p-anísico e genisteína. As concentrações determinadas para os compostos fenólicos foram de 13,78 mg L-1 para o ácido clorogênico, 3,75 mg L-1 para o ácido ferúlico, 35,34 mg L-1 para o ácido p-anísico e 7,83 mg L-1 para a genisteína. Esses compostos apresentaram-se como fortes inibidores de germinação. Esta investigação mostra que na presença de solo os aleloquímicos presentes nesta leguminosa possivelmente diminuem sua atividade fitotóxica. / The objective of the present work was to study the herbicide activity of the allelochemicals in aqueous extracts from Canavalia ensiformis seeds through the allelopathy assays and phenolic compounds determination with allelopathi c activity, by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). With this goal, germination bioassays, radicle length and biomass production in Petri plates were done, using paper and soil as substrate and the weeds species Ipomoea grandifolia and Commelinna benghalensis as target plants. For the allelopathy assays aqueous extracts from Canavalia ensiformis seeds were prepared in different concentrations. The bioassays showed that the allelochemicals present in the Canavalia ensiformis seeds, has a less phytotoxic effect compared to the bioassays done in paper. The results show that the studied specie has allelopathi c potential. Among the secondary metabolites responsibles for that allelopathic activity in this specie, are founded the phenolic compounds: chlorogenic acid, ferulic acid, p-anisic acid and genistein. The concentrations for the phenoli c compounds were determined: 13,78 mg L-1 for chlorogenic acid, 3,75 mg L-1 for ferulic acid, 35,34 mg L-1 for p-anisic acid and 7,83 mg L-1 for genistein. These compounds present themselves as strong germination inhibitors. This study shows that the allelochemicals present in the Canavalia ensiformis seeds have a lesser phytotoxic activity in soil.

Made available in DSpace on 2015-04-17T14:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In many parts of the world leguminous plant is one of the most widely known plants previously reported. There are many different types of plants in the family leguminous used as food, in this case, the genus Canavalia comprises a group of some 48 species. The term lectin (derived from the latin word legere, meaning, among other things, to select) represent a heterogeneous group of proteins ranging from size, structure, molecular organization and constitution of interaction points as well as performing several biological activities such as anti-inflammatory, antifungal and antibiotic. Until now, the lectins of plants are one of the most studied, although some lectins in animals are well-specified. This research aim to isolate, purify and define biological activities of a new lectin present in the seeds of the Canavalia maritime. The results indicate the presence of a new lectin with a preference to agglutinate native erythrocytes of rabbit. These lectins were both purified in column chromatography of Sephadex G-50 and chitin, molecular exclusion in HPLC system, respectively. The purity and molecular weight (approximate) of the new lectin (from 50 to 55 kDa) was detected by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The new lectin did not cause hemolysis in human erythrocytes type A, O and AB, it reflects the interaction level of the sugars. According to sugar inhibition assays, the new lectin (content 71,5μg) indicates it is specific for arabinose, fructose, maltose, saccharose and xylose. On the other hand, the new lectin did not prevent the growth of tested bacterial strains, however, it is able to promote the proliferation these microorganisms. It also presented an anti-inflammatory activity as peritonitis induced by carrageenan in mice reducing the migration of neutrophils in the peritoneum of mice and permeability of the blood vessels. It also produced antifungal activity on the growth of the fungus C. neoformans, on its growth assay, evidenced by CIM determination, in this case, the results demonstrates no growth in the presence of the new lectin. / As leguminosas estão entre as plantas mais conhecidas pelas pessoas de diversas partes do mundo. Nesta família, muitas são as plantas que usamos como alimento. O gênero Canavalia ao qual pertence o feijão da praia, dentro da família Leguminosae, é formado por um pequeno grupo de 48 espécies. O termo lectina (do latim legere , que significa escolher, selecionar), representa um grupo heterogêneo de proteínas que variam amplamente em tamanho, estrutura, organização molecular, bem como na constituição de seus sítios de interação, desempenhando atividades biológicas diversas como antiinflamatórias, antifúngicas e antibióticas. As lectinas de plantas são as mais estudadas até então, embora algumas presentes em animais e microorganismos já tenham sido bem caracterizadas. O objetivo geral deste trabalho foi isolar, purificar e determinar atividades biológicas de uma nova lectina presente em sementes da leguminosa Canavalia maritima. Os resultados indicaram a presença de uma nova lectina com preferência em aglutinar eritrócitos nativos de coelho, purificada através de cromatografias de afinidade em Sephadex G-50 e quitina, e de exclusão molecular em sistema HPLC, respectivamente. Por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, foi constatada a pureza e o peso molecular aproximado da nova lectina de 50 a 55 kDa. A nova lectina não promoveu hemólise em eritrócitos humanos dos tipos A, O e AB, em graus variáveis, o que reflete a sua especificidade de interação com diferentes açúcares. Com uma composição de 71,5 μg de carboidratos, a nova lectina demonstrou, pelo teste de inibição por açúcares, especificidade para os açúcares arabinose, frutose, maltose, sacarose e xilose. Por outro lado, a nova lectina, não inibiu o crescimento das linhagens bacterianas testadas, entretanto, observou-se que ela é capaz de promover a proliferação destes microorganismos. Apresentou atividade antiinflamatória, no modelo de peritonite induzido por carragenina em camundongos, reduzindo a migração dos neutrófilos no peritônio de camundongos e a permeabilidade dos vasos sanguíneos. Também produziu atividade antifúngica sobre o crescimento dos fungos C. neoformans, nos ensaios de crescimento das cepas, evidenciado pela determinação da CIM, onde os resultados demonstraram que não houve crescimento na presença da nova lectina.

LEITÃO, Cíntia Camurça Fernandes. Caracterização estrutural parcial e biológica de duas lectinas do gênero Canavalia. 2015. 80 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Vitor Campos (vitband@gmail.com) on 2016-09-01T23:25:08Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_ccfleitao.pdf: 6460190 bytes, checksum: 6ff95b685ea2f9836771bc15fb9edf9f (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T21:25:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_ccfleitao.pdf: 6460190 bytes, checksum: 6ff95b685ea2f9836771bc15fb9edf9f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T21:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_ccfleitao.pdf: 6460190 bytes, checksum: 6ff95b685ea2f9836771bc15fb9edf9f (MD5) Previous issue date: 2015 / Lectins are proteins that bind carbohydrates specifically and reversibly. The legume lectins represent the best studied and established group, from the point of view of physical-chemical and biological and structural, where a well-studied group of these proteins involves lectin obtained from members of the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true regarding biological activities. This variability, as a rule, is in the detail that can be analyzed in structures based studies. In this context, multiple cardiovascular disease and inflammatory processes, particularly chronic and recurrent nature, arouse the interest of the scientific community because they require a wider range of drugs for therapeutic alternatives. In this sense, they become important research seeking new compounds with vasorelaxant and anti-inflammatory action. The present paper describes the partial structural and biological characterization of two lectins present in Canavalia virosa and Canavalia oxyphylla seeds, belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, Phaseoleae tribe, subtribe Diocleinae. The lectin from Canavalia virosa seeds (ConV) was purified in a single step by affinity chromatography on mannose-Sepharose 4B column. ConV strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by monosaccharide (D-mannose, D-glucose and α-methyl-D-manosídeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). SDS-PAGE revealed three bands, corresponding to three chains (α, β, γ and) confirmed by ESI mass spectrometry with masses of 25.480 ± 2 Da, 12.864 ± 1 Da and 12,633 ± 1 Da, respectively. The hemagglutination activity of ConV is great in pH 7.0 to 9.0, stable at a temperature of 80° C, and is not affected by EDTA. ConV showed no toxicity against Artemia sp. and relaxed the endothelized rat aorta, with the participation of the lectin domain. In our tests, the lectin immobilized on CNBr-Sepharose was able to bind 0.8 mg of ovalbumin by chromatography, allowing the use of ConV as a tool to capture and purification of glycoproteins. Moreover, the lectin from Canavalia oxyphylla (CoxyL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. SDS-PAGE showed that pure lectin consists of a major band of 30 kDa (α chain) and two minor components (β and γ chains) of 16 and 13 kDa, respectively. These data were further confirmed by mass spectrometry via electrospray ionization. Compared to the average molecular weight of the α chains, the partial amino acid sequence obtained corresponds to about 45% of the total sequence CoxyL. CoxyL showed hemagglutinating activity was specifically inhibited by monosaccharide (D-glucose, D-mannose and methyl-α-D-manosídeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Furthermore, CoxyL proved to be heat stable at 60° C, and its activity is optimal at pH 7.0. CoxyL caused toxicity in Artemia sp. and induced paw edema in rats. / Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos de forma específica e reversível. As lectinas de leguminosas representam o grupo mais bem estudado e estabelecido, tanto do ponto de vista de caracterização físico-química e biológica como estrutural, onde um grupo bem estudado destas proteínas envolve lectinas obtidas de membros da subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porém o mesmo não se observa quanto às atividades biológicas. Esta variabilidade, via de regra, está em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, múltiplos processos patológicos cardiovasculares e inflamatórios, principalmente de natureza crônica e recorrente, despertam o interesse da comunidade científica por requererem uma maior variedade de fármacos para alternativas terapêuticas. Neste sentido, tornam-se importantes pesquisas que busquem novos compostos, com ação vasorrelaxante e anti-inflamatória. Assim, o presente trabalho descreve a caracterização estrutural parcial e biológica de duas lectinas presentes em sementes de Canavalia virosa e Canavalia oxyphylla, pertencentes à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Canavalia virosa (ConV) foi purificada em uma única etapa através de cromatografia de afinidade em coluna Sepharose-mannose 4B. ConV aglutinou fortemente eritrócitos de coelho e foi inibida por monossacarídeos (D-manose, D-glicose e α-metil-D-manosídeo) e glicoproteínas (ovalbumina e fetuína). SDS-PAGE revelou três bandas, correspondentes a três cadeias (α, β, e γ) confirmadas por espectrometria de massas ESI com massas de 25,480±2 Da, 12,864±1 Da e 12,633±1 Da, respectivamente. A atividade hemaglutinante da ConV é ótima nos pH 7.0 a 9.0, estável a uma temperatura de 80 ºC, e não é afetada pelo EDTA. ConV não demonstrou toxicidade contra náuplios de Artemia sp. e relaxou a aorta endotelizada de ratos, com a participação do domínio da lectina. Em nossos testes, a lectina imobilizada em CNBr-Sepharose foi capaz de se ligar a 0,8 mg de ovalbumina por cromatografia, permitindo o uso de ConV como uma ferramenta para a captura e purificação de glicoproteínas. Por outro lado, a lectina de Canavalia oxyphylla (CoxyL) foi purificada em um único passo através de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50.SDS-PAGE mostrou que a lectina pura consiste de uma principal banda de 30 kDa (cadeia α) e dois componentes menores (cadeias β e γ) de 16 e 13 kDa, respectivamente. Estes dados foram adicionalmente confirmados por espectrometria de massas por ionização por eletropulverização. Em comparação com a massa molecular média das cadeias α, a sequência parcial de aminoácidos obtida corresponde a aproximadamente 45% da sequência total de CoxyL. CoxyL apresentou atividade hemaglutinante que foi especificamente inibida por monossacarídeos (D-glicose, D-manose, e α-metil-D-manosídeo) e glicoproteínas (ovalbumina e fetuína). Além disso, CoxyL mostrou ser termoestável a 60° C, e sua atividade é ótima no pH 7,0. CoxyL causou toxicidade em náuplios de Artemia sp. e induziu edema de pata em ratos.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1333665 bytes, checksum: 2f915f0ace8bbb6bb5fbbb794e7c40d5 (MD5) Previous issue date: 2013-06-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In many parts of the world leguminous plant is one of the most widely known plants previously reported. There are many different types of plants in the family leguminous used as food, in this case, the genus Canavalia comprises a group of some 48 species. The term lectin (derived from the latin word legere, meaning, among other things, to select) represent a heterogeneous group of proteins ranging from size, structure, molecular organization and constitution of interaction points as well as performing several biological activities such as anti-inflammatory, antifungal and antibiotic. Until now, the lectins of plants are one of the most studied, although some lectins in animals are well-specified. This research aim to isolate, purify and define biological activities of a new lectin present in the seeds of the Canavalia maritime. The results indicate the presence of a new lectin with a preference to agglutinate native erythrocytes of rabbit. These lectins were both purified in column chromatography of Sephadex G-50 and chitin, molecular exclusion in HPLC system, respectively. The purity and molecular weight (approximate) of the new lectin (from 50 to 55 kDa) was detected by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The new lectin did not cause hemolysis in human erythrocytes type A, O and AB, it reflects the interaction level of the sugars. According to sugar inhibition assays, the new lectin (content 71,5μg) indicates it is specific for arabinose, fructose, maltose, saccharose and xylose. On the other hand, the new lectin did not prevent the growth of tested bacterial strains, however, it is able to promote the proliferation these microorganisms. It also presented an anti-inflammatory activity as peritonitis induced by carrageenan in mice reducing the migration of neutrophils in the peritoneum of mice and permeability of the blood vessels. It also produced antifungal activity on the growth of the fungus C. neoformans, on its growth assay, evidenced by CIM determination, in this case, the results demonstrates no growth in the presence of the new lectin. / As leguminosas estão entre as plantas mais conhecidas pelas pessoas de diversas partes do mundo. Nesta família, muitas são as plantas que usamos como alimento. O gênero Canavalia ao qual pertence o feijão da praia, dentro da família Leguminosae, é formado por um pequeno grupo de 48 espécies. O termo lectina (do latim legere , que significa escolher, selecionar), representa um grupo heterogêneo de proteínas que variam amplamente em tamanho, estrutura, organização molecular, bem como na constituição de seus sítios de interação, desempenhando atividades biológicas diversas como antiinflamatórias, antifúngicas e antibióticas. As lectinas de plantas são as mais estudadas até então, embora algumas presentes em animais e microorganismos já tenham sido bem caracterizadas. O objetivo geral deste trabalho foi isolar, purificar e determinar atividades biológicas de uma nova lectina presente em sementes da leguminosa Canavalia maritima. Os resultados indicaram a presença de uma nova lectina com preferência em aglutinar eritrócitos nativos de coelho, purificada através de cromatografias de afinidade em Sephadex G-50 e quitina, e de exclusão molecular em sistema HPLC, respectivamente. Por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, foi constatada a pureza e o peso molecular aproximado da nova lectina de 50 a 55 kDa. A nova lectina não promoveu hemólise em eritrócitos humanos dos tipos A, O e AB, em graus variáveis, o que reflete a sua especificidade de interação com diferentes açúcares. Com uma composição de 71,5 μg de carboidratos, a nova lectina demonstrou, pelo teste de inibição por açúcares, especificidade para os açúcares arabinose, frutose, maltose, sacarose e xilose. Por outro lado, a nova lectina, não inibiu o crescimento das linhagens bacterianas testadas, entretanto, observou-se que ela é capaz de promover a proliferação destes microorganismos. Apresentou atividade antiinflamatória, no modelo de peritonite induzido por carragenina em camundongos, reduzindo a migração dos neutrófilos no peritônio de camundongos e a permeabilidade dos vasos sanguíneos. Também produziu atividade antifúngica sobre o crescimento dos fungos C. neoformans, nos ensaios de crescimento das cepas, evidenciado pela determinação da CIM, onde os resultados demonstraram que não houve crescimento na presença da nova lectina.