Le mélanome uvéal, qui origine de la transformation anormale des mélanocytes de l’uvée, et représente la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte. Plus de 40% des patients ne ressentent ni douleur, ni troubles visuels lors du développement de la tumeur oculaire, ce qui explique le dépistage tardif de ce cancer et la présence de métastases au foie lors du diagnostic initial dans près de la moitié des cas. Une méta-analyse a souligné l’inefficacité des thérapies disponibles étant donné le peu d’études cliniques de phase III complétées dans les 30 dernières années pour traiter le mélanome uvéal métastatique. L’objectif général de mon projet de doctorat consistait à caractériser des mécanismes moléculaires à potentiel thérapeutique dans la progression des métastases du mélanome uvéal qui pourraient être ciblés pour traiter les patients ayant reçu un mauvais pronostic. Mon premier objectif consistait à caractériser les effets de la répression pharmacologique du récepteur 2B de la sérotonine (HTR2B) dans les cellules cancéreuses métastatiques du mélanome uvéal. Nous avons démontré que l’antagoniste sélectif PRX-08066 réduit la viabilité des cellules du mélanome uvéal et la population en mitose et altère leur potentiel d’auto-renouvellement et de migration avec une sensibilité variable d’une lignée à l’autre. De plus, nous avons observé une diminution de la phosphorylation de kinases des voies de signalisation classiquement activées par HTR2B, ainsi que des kinases β-caténine, PYK2 et STAT5 dans les cellules traitées. Mon second objectif consistait à caractériser le profil d’hydroxyméthylation (5-hmC) de l’ADN durant la progression du mélanome uvéal. Nous avons montré une réduction du niveau global de 5-hmC dans les lignées cancéreuses du mélanome uvéal comparativement à la choroïde et aux mélanocytes. De plus, nos analyses ont révélé une diminution de l’expression de l’enzyme IDH1 dans les cellules cancéreuses et une seule lignée comportait une mutation dans ce gène. Mon troisième objectif consistait à tester différents taux d’oxygène (3% vs 21%O2) pour la culture in vitro des lignées mélanocytaires. Nous avons démontré que la morphologie des mélanocytes et leur pigmentation sont légèrement changées lorsqu’exposés à 3% O2 comparativement aux cellules cancéreuses. De plus, leur temps de doublage était significativement plus rapide dans ces conditions. Le profilage génique des mélanocytes choroïdiens n’a pas révélé une longue liste de transcrits considérablement dérégulés entre les deux concentrations d’oxygène : seul le transporteur de lactate MCT4 était dérégulé de manière significative à 3% O2 chez tous les donneurs. Mes travaux de doctorat ont donc permis l’avancement des connaissances sur le promoteur de métastases HTR2B de la signature moléculaire pronostique, l’hydroxyméthylation de l’ADN et l’hypoxie dans le mélanome uvéal, ce qui contribuera au développement d’une thérapie adjuvante ou épigénétique pour améliorer la survie des patients. / Uveal melanoma (UM) originates from the abnormal transformation of uveal melanocytes and is the most common intraocular tumor in adults. More than 40% of patients do not experience pain or visual disturbances during the development of their ocular tumor, which explains the late detection of this cancer in nearly half of the cases, and the presence of liver metastases at the initial diagnosis. A meta-analysis highlighted the ineffectiveness of available therapies given the limited number of phase III clinical studies completed in the past 30 years to treat metastatic UM. The general objective of my PhD project was to characterize molecular mechanisms with therapeutic potential in the metastatic progression of UM that could be targeted to treat patients with poor prognosis. My first objective was to characterize the effects of the pharmacological repression of the serotonin 2B receptor (HTR2B) in metastatic UM cells. We demonstrated that the selective antagonist PRX-08066 reduces both the viability of UM cells and the population in mitosis, and alters their potential for self-renewal and migration, with an interindividual variability in sensitivity. In addition, we observed a decrease in the phosphorylation of kinases of the signaling pathways classically activated by HTR2B, as well as new targets such as β-catenin, PYK2 and STAT5 in the treated cells. My second objective was to characterize the DNA hydroxymethylation profile (5-hmC) during UM progression. We have shown a reduction in the overall level of 5-hmC in UM cell lines compared to choroid and uveal melanocytes. Furthermore, our analyzes revealed a decrease in the expression of the IDH1 enzyme in UM cells and only one UM cell line showed a mutation in this gene. My third objective was to test different levels of oxygen (3% vs 21% O2) for the in vitroculture of melanocytic lines. We showed that the morphology of melanocytes and their pigmentation are slightly changed when exposed to 3% O2compared to UM cells. Moreover, their doubling time was significantly faster under these conditions. The gene profiling of choroidal melanocytes did not reveal a long list of significantly deregulated transcripts between both oxygen concentrations : only the lactate transporter MCT4 was significantly deregulated in all donors at 3% O2. My doctoral work enabled the advancement of knowledge on the HTR2B metastasis promoter from the prognostic molecular signature, DNA hydroxymethylation and hypoxia in UM, which will contribute to the development of an adjuvant or epigenetic therapy to improve patient survival.

Le cancer de l’ovaire représente 4% de tous les cancers chez la femme et est la première cause de décès parmi les tumeurs gynécologiques en occident. Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) représente 90% de toutes les tumeurs de l’ovaire. Malgré les avancées médicales et chirurgicales, le taux de survie à long terme demeure décevant en raison de la nature asymptomatique de la maladie. Le traitement repose sur la chirurgie cytoréductive suivie de la chimiothérapie combinant les dérivés de platine et de taxanes avec un taux de réponse de plus de 80%. Cependant, la des patientes font une récidive par l’émergence de la résistance à ces drogues conventionnelles. Les bases moléculaires du déclenchement et de la progression du cancer de l’ovaire sont encore méconnues. Au cours d’un cancer, l’hyperméthylation des ilots CpG de certains promoteurs géniques conduit souvent à l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeur. Parallèlement, l’hypométhylation des ilots CpG de certains promoteurs est également impliquée dans la réactivation des proto-oncogènes et des gènes pro-métastatiques. La technologie des micropuces à ADN est grandement utilisée au niveau de la recherche sur le cancer, y compris celles portant sur les mécanismes et les biomarqueurs associés à la progression et à la chimiorésistance dans les cancers ovariens. Dans ce travail de thèse, nous avons évalué le profil de méthylation abberante dans les différents grades des tumeurs de CEO de type séreux par rapport aux tissus normaux de l’ovaire, et dans les cellules primaires post-chimiothérapeutiques par rapport aux cellules primaires pré-chimiothérapeutiques de l’ovaire de deux patientes. Nos résultats ont montré que l’hyperméthylation est un événement très précoce de la carcinogenèse avec suppression des gènes ayant un rôle protecteur. Alors que l’hypométhylation massive est associée à la phase avancée de la maladie avec la surexpression des gènes impliqués dans l’invasion et la métastase. Découlant de ces études, RUNX1 et RUNX2 ont été identifiés comme des gènes hypométhylés dans les cellules post-chimiothérapeutiques. Les études fonctionnelles ont montré que ces deux gènes sont associés à la prolifération, la migration et l’invasion cellulaire dans le CEO. Cependant, ces effets similaires sont exercés par des mécanismes moléculaires différents. / Ovarian cancer accounts for 4% of all cancers in women and is the leading cause of death among Gynecologic tumours in the western countries. The epithelial ovarian cancer (EOC), which represents 90% of all ovarian tumors. Despite advances in medical and surgical treatment, long term survival rate remains disappointing due to the asymptomatic nature of the disease. The treatment uses cytoreductive surgery followed by chemotherapy combining derivatives of platinum and taxanes with a response rate of over 80%. However, the most part of the patients have a recurrence by the emergence of resistance to these conventional drugs. The molecular basis of the initiation and progression of ovarian cancer are still unknown. During cancer, hypermethylation of gene promoter CpG islands often leads to inactivation of some tumor suppressor genes. At the same time, CpG islands hypomethylation is also associated to reactivation of proto-oncogenes and pro-metastatiques genes. The microarray technology has been successfully used in cancer research, including studies on mechanisms and biomarkers linked to ovarian cancer progression and chemoresistance. In this study, we have evaluated the aberrant DNA methylation profile in tumour grades of serous type EOC compared to normal ovarian tissue, and primary cells culture prior to and post chemotherapy (CT) treatment from 2 EOC patients. Our results showed that hypermethylation is an early event in carcinogenesis with down-regulation of genes having a protective role. While massive hypomethylation is associated with advanced serous EOC with upregulation of genes involved in cell invasion and metastasis. From these studies, we identified RUNX1 and RUNX2 as hypomethylated genes in post-chemotherapy primary cells culture. Sebsequent functional analyses pointed to RUNX1 and RUNX2 association with EOC cell proliferation (including cell cycle control for RUNX1), migration and invasion. However, RUNX1 and RUNX2 display overlapping functions in EOC dissemination, these nevertheless employ distinct molecular mechanisms, specific for each gene. Our data are indicative of strong oncogenic potential of both transcription factors in EOC progression.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) représente 4% de tous les cancers chez la femme et est la première cause de décès parmi les tumeurs gynécologiques. Dans la plupart part des cas le CEO est diagnostiqué dans les stades avancés de la maladie. Le traitement repose sur la chirurgie cytoréductive suivie de la chimiothérapie combinant les dérivés de platine et de taxanes avec un taux de réponse de plus de 80%, cependant, la plupart part des patientes font une récidive par l’émergence de la résistance. Les bases moléculaires du déclenchement et de la progression du cancer de l’ovaire sont encore mal connues empêchant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques et de diagnostique. Au cours d’un cancer, l’hyperméthylation des ilots CpG de certains promoteurs géniques conduit souvent à l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeur. L’hypométhylation des ilots CpG de certains promoteurs est également impliquée dans la réactivation des proto-oncogènes et des gènes pro-métastatiques. Cependant l’hypométhlation de l’ADN dans le cancer de l’ovaire est très peu étudiée. En utilisant la méthode d’immunoprécipitation de l'ADN méthylée combinée à une analyse sur puce (MeDIP-chip), nous avons trouvé que l’hyperméthylation de l'ADN se produit dans les stades précoces du cancer ovarien, tandis que les stades avancés de la maladie sont liés à l’hypométhylation de l’ADN des oncogènes impliqués dans la progression de la tumeur, l’invasion/métastase et probablement dans la chimiorésistance. Cette approche épigénomique a conduit à l’identification de nouveaux oncogènes hypométhylés dans le CEO. Dans cette étude, RUNX2 est identifié comme un gène hypométhylé dans les cellules post-chimiothérapeutiques et GALNT3 et BCAT1 sont parmi les gènes hypométhylés identifiés particulièrement dans le CEO de type séreux. L’analyse fonctionnelle de ces trois gènes montre qu’ils sont associés à la prolifération (y compris le contrôle du cycle cellulaire pour GALNT3 et BCAT1), de la migration et de l'invasion cellulaire dans le CEO séreux, suggérant qu’ils ont un fort potentiel oncogène dans la progression de la tumeur et pourraient être des nouvelles cibles thérapeutiques au niveau du CEO. / Epithelial ovarian cancer (EOC) accounts for 4% of all cancers in women and is the leading cause of death from gynecologic malignancies. Most of EOC cases are diagnosed at advanced stage, which is associated with poor outcome. Despite the good initial response to chemotherapy, recurrence occurs in the majority of patients, resulting in chemotherapy resistance leading to a fatal disease. The molecular basis of EOC initiation and progression is still poorly understood, thus hindering the development of new diagnostic and therapeutic strategies for more effective EOC treatment. In cancer, the hypermethylation of gene promoter CpG islands leads to inactivation of tumor suppressor genes, and CpG islands hypomethylation is associated with proto-oncogenes and pro-metastasis genes. Similar to all malignancies, aberrant DNA methylation occurs in EOC. However, DNA hypomethylation in ovarian cancer is very briefly studied. Using methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) coupled to CpG island tiling arrays, we found that DNA hypermethylation occurred in less invasive/early stages of ovarian tumorigenesis, while advanced disease was associated with DNA hypomethylation of a number of oncogenes, implicated in cancer progression, invasion/metastasis and probably chemoresistance. This epigenomic approach has led to the identification of a number of novel oncogenes hypomethylated in EOC. In this thesis study, RUNX2 gene was identified as hypomethyleted gene in post-chemotherapy primary cells cultures and GALNT3 gene and BCAT1 gene were among the genes identified to be notably hypomethylated in serous EOC tumors. Subsequent functional analyses of these three genes demonstrated that they were associated with EOC cell proliferation (including cell cycle control for GALNT3 and BCAT1), migration and invasion, suggesting that they have strong oncogenic potential in serous EOC progression and that they might be novel EOC therapeutic targets.

Le cancer du sein (BCa) est une maladie complexe, avec des taux de survie qui diminuent à mesure que la maladie progresse. Dans le BCa, la rigidité tissulaire et la densité de la matrice extracellulaire sont des caractéristiques tumorales utilisées pour la détection et l'évaluation des risques. Ces changements dans le microenvironnement tumoral déclenchent une réponse cellulaire, entraînant une augmentation de la prolifération, de la survie et du potentiel invasif des cellules tumorales, réduisant ainsi l'efficacité du traitement. Alors que les cellules tumorales tentent de s'adapter à leur nouvel environnement plus rigide, elles deviennent plus contractiles, ce qui peut potentiellement entraîner un stress mécanique intracellulaire. Le co-chaperon moléculaire BAG3 et ses protéines partenaires sont des composantes clés de la réponse cellulaire adaptative au stress, notamment dans les cellules musculaires hautement contractiles qui sont soumises à un stress mécanique médié par l'actine. Notre laboratoire a récemment montré que BAG3 joue un rôle critique dans la régulation de la dynamique de l'actine pendant la division cellulaire dans les cellules tumorales. Cependant, son rôle dans l'adaptation des cellules aux changements de rigidité du microenvironnement tumoral et à leur résistance au stress mécanique demeure méconnu. Dans ce contexte, cette étude vise à définir le rôle de BAG3 dans la régulation de la réponse des cellules BCa à l'augmentation de la rigidité de la matrice extracellulaire. Nous émettons l'hypothèse que BAG3 régule la réponse mécanique des cellules tumorales à une augmentation de rigidité du microenvironnement tumoral. Pour analyser cette hypothèse, la présente étude comporte deux objectifs spécifiques : 1. Analyser l'impact de BAG3 sur la régulation de la contractilité cellulaire des cellules invasives du cancer du sein ; 2. Analyser la régulation de BAG3 par la rigidité de la matrice extracellulaire. En utilisant la microscopie de force de traction et les essais de compaction du collagène, nos résultats expérimentaux montrent que des substrats de matrice extracellulaire plus rigides augmentent les niveaux de contractilité cellulaire des deux lignées cellulaires de cancer du sein triple négatif (TNBC) étudiées, soit les cellules triple négatif MDA-MB-231 et MDA-MB-468. Notamment, la réduction des niveaux de BAG3 à l'aide d'ARN interférents a diminué les niveaux de contractilité cellulaire dans les cellules MDA-MB-231 qui présentent un phénotype mésenchymal. Dans ces cellules, la déplétion de BAG3 a également réduit la localisation nucléaire du facteur co-transcriptionnel YAP, un régulateur clé de la réponse mécanique cellulaire. Cependant, la déplétion de BAG3 n'a pas affecté la contractilité cellulaire et la localisation de YAP dans les cellules MDA-MB-468 présentant un phénotype épithélial. De manière consistante, nous avons observé que la rigidité de la matrice extracellulaire régule les niveaux de BAG3 dans les cellules MDA-MB-231, mais pas dans les cellules MDA-MB-468. Ces résultats suggèrent que BAG3 est mécaniquement régulée et contrôle la réponse cellulaire adaptative à la rigidité du substrat, d'une manière qui dépend du contexte cellulaire. Les résultats obtenus dans cette étude révèlent une interaction entre la fonction du co-chaperon BAG3 et les propriétés mécaniques du microenvironnement tumoral qui pourrait influencer le potentiel invasif des TNBC. / Breast cancer (BCa) is a multifaceted disease, with survival rates decreasing as the disease progresses. In BCa, changes in tissue stiffness and extracellular matrix density are characteristics used for detection and risk assessment. Changes in tumor mechanics trigger a cellular adaptive response, resulting in increased proliferation, survival, and invasiveness which may reduce therapy efficiency. As tumor cells try to adapt to their new stiffer environment, they become more contractile, potentially resulting in intracellular mechanical stress. The BAG3 cochaperone and its partner proteins are key components of the adaptive stress response, notably in highly contractile muscle cells subjected to actin-mediated mechanical stress. Our lab recently showed that BAG3 is critical in regulating actin dynamics during cell division in tumor cells. However, the role of BAG3 in the adaptation of cells to changes in the rigidity of the tumor microenvironment and their resistance to mechanical stress remains to be determined. In this context, this project aims to investigate the role of BAG3 in regulating BCa cell response to increasing substrate stiffness. We hypothesize that BAG3 regulates the mechanical response of tumor cells to increased stiffness of the tumor microenvironment. To analyze this hypothesis, the present study has two specific objectives: 1. Analyze the impact of BAG3 on cell contractility regulation in invasive breast cancer cells; 2. Analyze the regulation of BAG3 by the stiffness of the extracellular matrix. Using traction force microscopy and collagen compaction assays, our experimental results show that stiffer extracellular matrix substrates increase cellular contractility levels in two triple-negative BCa (TNBC) cell lines, namely MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells. Notably, the downregulation of BAG3 using small interfering RNAs resulted in decreased cell contractility only in the MDA-MB-231 cells showing a mesenchymal phenotype. In these cells, BAG3 depletion also reduced the nuclear localization of the co-transcriptional regulator YAP, a key regulator of the mechanical cell response. However, the depletion of BAG3 did not affect cell contractility and YAP localization in MDA-MB-468 cells, which exhibit an epithelial phenotype. Consistently, we observed that the stiffness of the extracellular matrix regulates BAG3 levels in MDA-MB-231 cells, but not in MDA-MB-468 cells. These results suggest that BAG3 is mechanically regulated and controls the adaptive cellular response to substrate stiffness in a manner that depends on the cellular context. Our results have unraveled an interplay between the function of the cochaperone BAG3 and the mechanical properties of the tumor microenvironment that may be significant for TNBC cell invasiveness.

Le mélanome uvéal (MU) est le cancer intraoculaire primaire le plus fréquent chez l'adulte et représente 5% des mélanomes. La moitié des patients développent des métastases et 90% de celles-ci sont localisées dans le foie. Le MU métastatique est résistant aux traitements anticancéreux incluant l'immunothérapie. Le foie est un organe où l'immunité est finement régulée grâce à l'activité immunosuppressive de cellules immunitaires et des cellules stellaires hépatiques (CSH). Ces cellules peuvent favoriser une immunosuppression locale par le biais de l'expression de protéines immuno-régulatrices. Mon projet visait à mieux comprendre les mécanismes cellulaires/moléculaires qui mènent à une immunosuppression dans le MU métastatique et comportait deux objectifs spécifiques : 1) l'analyse du microenvironnement tumoral dans des métastases hépatiques de patients à l'aide de marquages immunohistochimiques et 2) l'optimisation d'un modèle *in vitro* de cocultures avec des cellules cancéreuses du MU (CCMU), des CSH et des cellules immunitaires pour étudier les mécanismes immunosuppressifs dans la niche hépatique. D'abord, des coupes histologiques de métastases hépatiques prélevées sur 11 patients ont été analysées par des méthodes bio-informatiques à la suite de marquages immunohistochimiques pour quantifier les lymphocytes, macrophages, cellules endothéliales et CSH activées. Deux sous-groupes de métastases ont pu être identifiés selon que l'infiltrat immunitaire intra-tumoral était fort ou faible. Les métastases présentant un faible infiltrat immunitaire étaient caractérisées par une forte densité de cellules immunitaires dans la marge. Une haute densité en CSH activées était retrouvée dans la métastase et dans la marge, suggérant une implication des CSH dans l'exclusion des cellules immunitaires de la métastase. Ensuite, un modèle *in vitro* impliquant la stimulation de cellules immunitaires par des CSH préalablement activées par le milieu conditionné de CCMU a été optimisé. Des analyses de cytométrie en flux du phénotype immunosuppressif des CSH ont révélé une expression élevée de PD-L1 sur ces cellules. Ces expériences ont permis le développement de méthodes d'analyses bioinformatiques de marquages immunohistochimiques de métastases de patients, ainsi que l'optimisation de méthodes de cocultures et d'analyses par cytométrie en flux de différents types cellulaires impliqués dans la formation de métastases hépatiques du MU. / Uveal melanoma (UM) is the most frequent primary intraocular cancer in adults and represents 5% of all melanomas. Half of patients develop metastatic disease, and 90% of them are in the liver. Metastatic UM is remarkably resistant to any treatment currently available, including immunotherapy. The liver is an organ in which immunity is finely regulated thanks to the immunosuppressive activity of immune cells and hepatic stellate cells (HSteCs). These cells could induce immunosuppression through the production of immunoregulatory proteins. My project aimed to get a better understanding of the cell/molecular mechanisms leading to immunosuppression in metastatic UM, and included two specific objectives: 1) the analysis of the tumoral microenvironment in hepatic metastases from patients using immunohistochemical staining and 2) the optimization of an *in vitro* model of cocultures with UM cells, HSteCs and immune cells to study the immunosuppressive mechanisms in the hepatic niche. First, histological sections of hepatic metastases from 11 UM patients were analyzed using computational methods following immunohistochemical staining to quantify lymphocytes, macrophages, endothelial cells and activated HSteCs. Two subsets of metastases were identified based on whether the intra-tumoral immune infiltrate was strong or weak. Metastases with weak immune infiltrate had a high density of immune cells in the margin. A high density of activated HSteCs was found within the metastasis and the margin, suggesting the involvement of activated HSteCs in the exclusion of immune cells from the metastasis. Next, an *in vitro* model involving the stimulation of immune cells by HSteCs activated beforehand by the conditioned medium of UM cells was optimized. Flow cytometry analyses characterizing the immunosuppressive phenotype of activated HSteCs revealed a high expression of PD-L1 on these cells. These experiments enabled the development of bioinformatics analysis methods for immunohistochemical stainings of patients' metastases, as well as the optimization of coculture methods and flow cytometry analyses of different cell types involved in UM metastasis formation.

Les bases moléculaires de l’initiation et de la progression du cancer ovarien épithélial (COE) sont pauvrement comprises. Un élément pathogénique clé dans le cancer est l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs, fréquemment due à l’hyperméthylation de leur région promotrice. Dans ce contexte, nous avons utilisé une approche épigénomique pour trouver des gènes hyperméthylés dans le COE. Nous avons employé un agent déméthylant, 5-aza-dC, pour réactiver les gènes hyperméthylés dans quatre lignées cellulaires du COE (SKOV3, OVCAR3, TOV112 et TOV21). Nous avons trouvé plusieurs cibles potentielles d’hyperméthylation qui pourraient jouer un rôle fonctionnel dans la suppression tumorale, l’apoptose ou la réparation de l’ADN. Nous avons évalué leur statut de méthylation par MSP (methylation-specific PCR) et BSP (bisulfite-sequencing PCR) avec des échantillons normaux et tumoraux et deux lignées cellulaires du COE. Parmi ces cibles, le gène DOK1 a démontré une évidence de méthylation de la région promotrice des échantillons tumoraux comparativement à celle de ceux qui sont normaux. Des clones surexprimant et d’autres sous-exprimant DOK1 ont été construits et validés. Son rôle potentiel dans la prolifération cellulaire, dans la sensibilité au taxol et au cisplatin, et dans le cycle cellulaire a été évalué par des études fonctionnelles et une légère implication a été détectée dans ces fonctions. Les changements d’expressions globales reliés à l’expression de ce gène ont également été analysés par la technologie de micropuces de l’ADN. Nos données montrent que DOK1 est touché par une hyperméthylation de sa région promotrice potentielle dans les tumeurs du COE. Par contre, cette hyperméthylation ne semble pas influencer son niveau d'expression. Au contraire, son expression augmente dans le cancer ovarien. Cette augmentation serait reliée à une diminution des risques de progression du COE. Cette observation confirme le rôle potentiel de suppresseur de tumeur de DOK1 dans le COE. / The molecular basis of the epithelial ovarian cancer (EOC) initiation and progression are still poorly understood. A key pathogenic element in cancer is the inactivation of tumours suppressor genes, frequently due to the hypermethylation of their promoter sequence. In this context, we used an epigenomic approach to identify hypermethylated genes in the EOC. We used the demethylating agent, 5-aza-dC, to reactivate hypermethylated genes in four cells lines of EOC (SKOV3, OVCAR3, TOV112 and TOV21). We identified several targets genes potentially hypermethylated that could play a functional role in ovarian tumorigenesis suppression, apoptosis or DNA repair. We evaluated their methylation status by MSP (methylation-specific PCR) and BSP (bisulfite-sequencing PCR) within normal and tumoral ovarian samples and in two EOC cells lines. Among these targets, the DOK1 gene showed an evidence of methylation of the promoter region in the tumour samples compared to the normal ones. Clones over-expressing and others under-expressing DOK1 were built and validated. The potential role of this gene in cellular proliferation, sensitivity to taxol and cisplatin, and in the cell cycle was evaluated by functional studies and a little implication of the DOK1 gene was detected in these functions. The global expression changes connected to the expression of the DOK1 gene were also analyzed by the microarray genomics technology. Our data show that DOK1 is affected by hypermethylation of its potential promoter region in EOC tumors. This hypermethylation do seems not to influence its expression levels. On the contrary, its expression level increases in ovarian cancer. This increase would be connected to a reduction in the risks of progression of the COE. Moreover, this observation confirms the potential role of DOK1 as tumor suppressor in EOC.

La perte de l’intégrité et de la perméabilité sélective de la barrière endothéliale est un évènement précoce dans la séquence des lésions oxydatives responsables de l’athérosclérose, de l’hypertension et de l’épanchement de cellules cancéreuses durant la dissémination métastatique. Nous avons déjà démontré que la phosphorylation de la Ser283 de la tropomyosine-1 (Tm1) par la DAPK1, en aval de la voie ERK1/2, est nécessaire à la formation de fibres de stress dans les cellules endothéliales exposées aux stress oxydant. La perméabilité endothéliale et la migration transendothéliale de carcinomes du côlon ont été mesurées par des essais de perméabilité et de migration en chambre de Boyden. L’usage d’ARNi et des formes sauvages et mutantes de la Tm1 ont permis de démontrer que la phosphorylation de la Tm1 est un évènement clé nécessaire dans les mécanismes de protection contre la dysfonction endothéliale lorsque l’endothélium est soumis à un stress oxydant. / Loss of endothelial cell integrity and selective permeability barrier is an early event in the sequence of oxidant-mediated injury and may result in atherosclerosis, hypertension, and facilitation of transendothelial migration of cancer cells during metastasis. We already showed that phosphorylation of tropomyosin-1 (Tm1) at Ser283 by DAPK1, downstream of the ERK1/2 pathway, is necessary to stress fibers formation in endothelial cells in response to oxidative stress. Endothelial permeability and transendothelial migration of colon cancer cells were evaluated by Boyden chamber assays. Use of siRNA and wild-type and mutated forms of Tm1 provide evidence indicating that phosphorylation of Tm1 is a key event required inside protection mechanism against endothelial barrier dysfunction associated with oxidative stress injury.

La base moléculaire de la progression du cancer ovarien epithelial (COE) est encore peu comprise. Récemment, l'importance de la perturbation épigénétique de la régulation de gènes par l'hypométhylation globale du génome a commencé à être plus appréciée. L'hypométhylation est très peu étudiée dans le COE bien que l'on ait déjà montré qu'il existe une relation entre hypométhylation de l'ADN et la progression, l'invasion tumorale ainsi que la formation de métastases. Cette étude vise à identifier des gènes qui pourraient être activés par l'hypométhylation de leur région promotrice, ce qui contribuerait à la progression tumorale. Afin d'identifier de nouveaux gènes hypométhylés, quatre lignées cellulaires ovariennes (Skov3, Tovll2, Tov21 et Ovcar3) ont été traitées avec un donneur de groupement méthyl, du S-Adenosylmethionine (AdoMet), afin d'inhiber la déméthylation de l'ADN. Plusieurs gènes sous-exprimés après traitement ont été identifiés par l'analyse de l'expression génique globale en utilisant la technique de micropuces à ADN. Cette analyse a permis d'identifier le gène TMPRSS3 comme une cible potentielle d'hypométhylation dans le COE. Le gène TMPRSS3-D est connu pour son implication dans la migration et invasion dans le COE. Le statut de méthylation de la région promotrice du gène TMPRSS3 a été vérifié par analyse Methylation-Spécific PCR (MSP) et par Bisulfite Specific PCR (BSP). L'évaluation de son rôle potentiel dans l'étiologie du COE a été faite par la technique d'interférence à l'ARN. L'analyse d'expression génique globale en utilisant le clone où l'expression de TMPRSS3-D a été supprimée et son contrôle correspondant a permis de mieux comprendre l'effet moléculaire de TMPRSS3-D. Pris ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire confirment le rôle potentiel du gène TMPRSS3-D dans l'invasion et métastase du COE et plus important, nos données indiquent que la surexpression de TMPRSS3-D dans le COE est due aux mécanismes épigénétiques reliés à l'hypométhylation de sa région promotrice.

À la suite d'un diagnostic de cancer de l'ovaire, la prise en charge thérapeutique constitue une étape déterminante dans la survie des patientes atteintes. Actuellement, la plupart de celles-ci subiront une cytochirurgie suivie d'une chimiothérapie standard comprenant du Cisplatin (ou Carboplatin) et du Paclitaxel. Malgré une réponse initiale adéquate, il a été démontré que 75-80% d'entre elles récidiveront peu de temps après la fin de leurs ("leurs" prend un "s" si chaque femme à plusieurs traitements) traitements. Dans ces cas de récidive, la plupart des patientes développeront aussi une résistance à la chimiothérapie. A ce stade, l'administration d'un traitement efficace devient donc un problème de taille pour les oncologues. La technologie des micropuces à ADN est grandement utilisée au niveau de la recherche sur le cancer, y compris celles portant sur les mécanismes et les biomarqueurs associés à la chimiorésistance dans les cancers ovariens. Dans notre programme de recherche, nous avons évalué le profil d'expression génique de six paires de tumeurs prélevées avant et après la chimiothérapie (CT) de six patientes atteintes d'un cancer épithéliale de l'ovaire (CEO), dans le but de pouvoir caractériser moléculairement les récidives résistantes de l'ovaire. Nos résultats ont montré la présence d'une signature moléculaire spécifique dans les tumeurs post-CT présentant une surexpression de gènes associés à des mécanismes connues de chimiorésistance et à la régulation négative de la prolifération. D'autres gènes liés à la réponse aux traitements, à l'apoptose, au contrôle du cycle cellulaire et à la régulation positive de la prolifération sont sous-exprimés dans ces mêmes tumeurs. Nous avons aussi analysé le profil d'expression génique de tumeurs primaires de l'ovaire de type séreux présentant différentes réponses aux agents chimiothérapeutiques, dans le but d'identifier une signature moléculaire spécifique associée à la réponse aux traitements primaires. Nos résultats suggèrent que la chimiorésistance innée peut être attribuée à une action combinée de différents facteurs liés au transport de la drogue (acquisition/excrétion), à la prolifération cellulaire ainsi qu'à des altérations dans le métabolisme, la réponse inflammatoire et l'apoptose. Une liste prédictive contenant 43 gènes a été développée et possède la capacité de pouvoir classifier les patientes ayant une tumeur séreuse de l'ovaire selon leur risque de récidiver tôt ou tard à la suite de leurs CT Découlant de ces études, plusieurs biomarqueurs associés à la chimiorésistance ont été identifiés. L'expression de certains d'entre eux a été validée dans une cohorte contenant 166 patientes atteintes de CEO présentant différents temps de survie (survie avec ou sans progression de la maladie) suivant leurs (idem) traitements de CT initiaux. Sur une liste contenant 15 candidats potentiels, nous avons observé qu'une plus faible expression protéique du biomarqueur HSP10 ainsi qu'une diminution de la prolifération cellulaire (via une plus faible expression du marqueur Ki67) prédisent une plus faible survie sans progression de la maladie et donc, par déduction, une plus grande chance de développer une chimiorésistance. L'expression protéique d'autres biomarqueurs (CTSL2 et MUC1) a été évaluée dans notre cohorte et nous avons trouvé que ceux-ci montraient une tendance à être associés avec la survie des patientes. Ceux-ci devront cependant être revalidés dans une plus grande cohorte de patientes. L'analyse des profils d'expression génique des tumeurs chimiorésistance de l'ovaire a aussi mené à l'identification de l'utilisation de médicaments anti-inflammatoires (Célébrex) en termes de traitement potentialisateurs pouvant augmenter l'effet cytotoxique du Cisplatin sur les cellules de cancer de l'ovaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la réponse immédiate des cellules de cancer de l'ovaire aux traitements de CT ainsi que l'émergence d'une chimiorésistance précoce, nous avons étudié les profils d'expression génique de sphéroïdes dérivés de six lignées cellulaires de cancer de l'ovaire suivant un traitement avec des agents chimiothérapeutiques couramment utilisés dans le traitement des CEO (Cisplatin, Paclitaxel et Topotecan). Nous avons trouvé que l'induction de gènes liés aux mécanismes de réplication et de réparation de l'ADN dans les sphéroïdes traités avec du Cisplatin et du Topotecan pourraient être associée avec la réponse immédiate aux traitements et pourrait être liée à un mécanisme précoce de résistance. De façon similaire, la surexpression de différents isotypes de tubulines suivant un traitement des sphéroïdes avec du Paclitaxel pourrait représenter un effet compensatoire précoce à l'action de cette drogue. Finalement, les conditions de croissance en sphéroïde, condition reconnue pour altérer l'expression génique, pourrait substantiellement contribuer à réduire l'efficacité des agents chimiothérapeutiques sur les sphéroïdes de cancer de l'ovaire. Pris ensemble, les résultats présentés dans cette thèse aideront à mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés à la chimiorésistance dans les cancers ovariens et aideront à définir de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour ce type de patientes.

Cette étude a permis de démontrer les fonctions et les mécanismes de la 17bêtahydroxystéroïde déshydrogénase de type 1 (17β-HSD1) et de la stéroïde sulfatase (STS) au niveau du cancer du sein, y compris la cinétique moléculaire et cellulaire, la liaison du ligand étudiée par la titration de fluorescence, la régulation des stéroïdes et la régulation mutuelle entre les enzymes stéroïdiennes et les cellules cancéreuses du sein. 1), L’inhibition de la 17β-HSD1 par son substrat a été démontrée par la cinétique enzymatique au niveau cellulaire pour la première fois, soutenant ainsi la fonction biologique de l’inhibition produite par le substrat. 2), En tant qu’inhibiteur, la dihydrotestostérone (DHT) n’a pas affecté la concentration du substrat estrone (E1) à laquelle l’activité enzymatique a commencé à diminuer, mais certaines augmentations de vitesse ont été observées, suggérant une diminution significative de l’inhibition par le substrat. 3), Les résultats de la modulation de l’ARNm ont démontré que la transcription du gène codant la 17β-HSD7 diminuait en réponse à l’inhibition de la 17β-HSD1 ou au knockdown dans les cellules du cancer du sein par la modification estradiol (E2). 4), L’expression de la STS est stimulée par E2 de manière à générer une rétroaction positive, ce qui favorise la biosynthèse de E2 dans les cellules de cancer du sein. 5), L’inhibition conjointe de la STS et de la 17β-HSD7 pourrait bloquer leurs activités enzymatiques, diminuant ainsi la formation de E2, mais rétablissant la formation de DHT, réduisant de façon synergique la prolifération cellulaire et induisant l’arrêt du cycle cellulaire en G0 / G1. 6), Les 17β-HSD7 et STS synthétisent E2 et sont toutes deux régulées par E2. Ainsi, elles forment un groupe fonctionnel d’enzymes mutuellement positivement corrélées, l’inhibition de l’une peut réduire l’expression d’une autre, amplifiant ainsi potentiellement les traitements inhibiteurs. 7), Le recepteur estrogenique α ERα a été non seulement régulés à la baisse par E2, mais également réduits par la DHT grâce à l’activation des récepteurs aux androgènes (AR). En conclusion, la 17β-HSD1 et la 17β-HSD7 jouent des rôles essentiels dans la conversion et la régulation des hormones sexuelles, et l’inhibition conjointe de la STS et de la 17β-HSD7 constitue une nouvelle stratégie pour le traitement hormonal des cancers du sein sensibles aux estrogènes. / Human 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (17β-HSD1), 17betahydroxysteroid dehydrogenase type 7 (17β-HSD7) and steroid sulfatase (STS) play a crucial role in regulating estrogen synthesis for breast cancer (BC). However, mutual regulation of enzymes and the interaction of these steroids (estrogens, androgens and their precursor dehydroepiandrosterone (DHEA)) are not clear. This study demonstrated the functions and mechanisms including kinetics at molecular level and in cells, ligand binding using fluorescence titration, regulation of steroids and mutual regulation between steroid enzymes in BC cells: 1) Substrate inhibition of 17β-HSD1 was shown for the first time by enzyme kinetics at the cell level, supporting the biological function of substrate inhibition. 2) As an inhibitor, dihydrotestosterone (DHT) did not affect the estrone (E1) substrate concentration at which the enzyme activity started to decrease, but some increases in velocity were observed, suggesting a corresponding decrease in substrate inhibition 3) The mRNA modulation results demonstrated that 17β-HSD7 transcription decreased in response to 17β-HSD1 inhibition or knockdown in BC cells due to estradiol (E2) concentration decrease. 4) The expression of STS is stimulated by E2 in a positive-feedback manner which finally promotes E2 biosynthesis within BC cells. 5) The joint inhibition of STS and 17β-HSD7 could block the activities of these enzymes, thus decreasing E2 formation but restoring DHT formation, to synergistically reduce cell proliferation and induce G0/G1 cell cycle arrest. 6) 17β-HSD7 and STS can synthesize E2 and are all regulated by E2. Thus, they form a functional group of enzymes mutually positively correlated, inhibition of one can reduce the expression of the other, thereby potentially amplifying the inhibitory effects. 7) Estrogen Receptor α (ERα) is not only down-regulated by E2, but also reduced by DHT though androgen receptor (AR) activation. In conclusion, 17β-HSD1 and 17β-HSD7 play essential roles in sex-hormone conversion and regulation, and the joint inhibition of STS and 17β-HSD7 constitutes a novel strategy for hormonal treatment of estrogen-receptor positive BC