Les papillomavirus humains (VPHs) sont reconnus comme les agents étiologiques du cancer du col de l’utérus. Notre étude a pour but de décrire le polymorphisme de la région régulatrice virale (LCR) et du gène E6 du VPH52 chez 216 femmes canadiennes avec différents grades de lésion du col et d’établir s’il existe une association entre les variantes décrites et la présence de lésions intraépithéliales de haut-grade (CIN2,3) du col de l’utérus ou de cancer invasif. L’âge (OR 1.1, 95% CI 1.02-1.17, p=0.005) fut significativement associé à la présence de cancer invasif. Une variante de la région régulatrice virale, MTL-52-LCR-02, présentant une substitution nucléotidique au niveau du nucléotide 7436, fut aussi associée à la présence de cancer du col de l’utérus (p=0.015). Dans une analyse multivariée, après ajustement pour l’âge, l’ethnicité et le site de recrutement, une délétion au niveau du nucléotide 7695 (OR 5.7, 95% CI 1.2-27.9) ainsi qu’une substitution au niveau du nucléotide 7744 (OR 8.3, 95% CI 1.1-61.0) du LCR, et la variante K93R de la protéine E6 (OR 9.5, 95% CI 1.3-68.9) furent associées de façon significative avec la présence de CIN2,3. Ainsi, le polymorphisme du LCR et du gène E6 du VPH52 est associé avec la présence de CIN2,3 et probablement avec celle d’un cancer invasif. / Human papillomaviruses (HPVs) are the main etiological agents of cervical cancer. Our study aims to describe HPV52 polymorphism in the long control region (LCR) and in the E6 gene, and to investigate the association between LCR and E6 polymorphism and high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2,3) or invasive cervical cancer in 216 canadian women with various grades of cervical disease. Age was significantly associated with cervical cancer (OR 1.1, 95% CI 1.02-1.17, p=0.005). The MTL-52-LCR-02 variant, with a nucleotide substitution in the LCR at position 7436, was also associated with cervical cancer. MTL-52-LCR-02 has been identified in 28.6% of women with cervical cancer and in 0.0% of women without cervical cancer or CIN2,3 (p=0.015). In a multivariate analysis, after adjusting for age, ethnicity, detection of HPV16 or 18, and study site, a deletion at nucleotide position 7695 (OR 5.7, 95% CI 1.2-27.9), a variation at nucleotide position 7744 (OR 8.3, 95% CI 1.-61.0) in the LCR and the K93R variant of the protein E6 (OR 9.5, 95% CI 1.3-68.9) were associated with CIN2,3. This study confirms that HPV52 polymorphism in the LCR and in the E6 gene is associated with risk of development of CIN2,3 and possibly invasive cancer of the uterine cervix.

Le VPH-16 de même que certains VPH, dont le VPH-18, causent le cancer du col utérin. Son intégration dans le génome humain pourrait être un marqueur de progression de l’infection. Les charges virales totale et intégrée sont présentement mesurées en quantifiant par PCR en temps réel les gènes E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1) du VPH-16. Nous avons évalué l’impact du polymorphisme du gène E2 sur la quantification de l’ADN du VPH-16 dans des spécimens cliniques. Dans un premier temps, le gène E2 de 135 isolats de VPH-16 (123 appartenaient au clade Européen et 12 à des clades non- Européens) fut séquencé. Ensuite, un test de PCR en temps réel ciblant les séquences conservées dans E2 (RT-E2-2) fut développé et optimisé. Cent trente-neuf spécimens (lavages cervicaux et vaginaux) provenant de 74 participantes (58 séropositives pour le VIH, 16 séronégatives pour le VIH) ont été étudiés avec les trois tests E2 (RT-E2-2), E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1). Les ratios de la quantité d’ADN de VPH-16 mesuré avec RT-E2-2 et RT-E2-1 dans les isolats Européens (médiane, 1.02; intervalle, 0.64-1.80) et Africains 1 (médiane, 0.80; intervalle, 0.53-1.09) sont similaires (P=0.08). Par contre, les ratios mesurés avec les isolats Africains 2 (médiane, 3.23; intervalle, 1.92-3.49) ou Asiatique- Américains (médiane, 3.78; intervalle, 1.47-37) sont nettement supérieurs à ceux obtenus avec les isolats Européens (P<0.02 pour chaque comparaison). Les distributions des quantités de E2 contenues dans les 139 échantillons mesurées avec RT-E2-2 (médiane, 6150) et RT-E2-1 (médiane, 8960) étaient statistiquement différentes (P<0.0001). Nous avons observé que les charges virales totale (odds ratio (OR) OR, 2.16 95% intervalle de confiance (IC) 1.11-4.19), et épisomale du VPH-16 (OR, 2.14 95% IC 1.09-4.19), mais pas la présence de formes intégrées (OR, 3.72 95% IC 1.03-13.4), sont associées aux néoplasies intraepitheliales cervicales de haut grade (CIN-2,3), et ce, en contrôlant pour des facteurs confondants tels que l’âge, le taux de CD4 sanguin, l’infection au VIH, et le polymorphisme de VPH-16. La proportion des échantillons ayant un ratio E6/E2 > 2 pour les femmes sans lésion intraépithéliale (7 de 35) est similaire à celle des femmes avec CIN-2,3 (5 de 11, p=0.24) ou avec CIN- 1 (4 de14, P=0.65). Le polymorphisme du gène E2 est un facteur qui influence la quantification des charges intégrées de VPH-16. / Episomal and integrated HPV-16 loads are currently estimated by quantitation with real-time PCR of HPV-16 E6 (RT-E6) and E2 (RT-E2-1) DNA. We assessed the impact of HPV-16 E2 polymorphism on quantitation of integrated HPV-16 DNA in clinical specimens. First, HPV-16 E2 was sequenced from 135 isolates (123 from European and 12 from non-European lineages). A novel assay targeting conserved HPV-16 E2 sequences (RT-E2-2) was optimized and applied with RT-E6 and RTE2- 1 on 139 HPV-16-positive cervicovaginal lavages collected from 74 women (58 HIV-seropositive, 16 HIV-seronegative). Ratios of HPV-16 DNA copies measured with RT-E2-2 and RT-E2-1 with European (median, 1.02; range, 0.64-1.80) and African 1 (median, 0.80; range, 0.53-1.09) isolates were similar (P=0.08). Ratios obtained with African 2 (median, 3.23; range, 1.92-3.49) or Asian-American (median, 3.78; range, 1.47-37) isolates were greater than those with European isolates (P<0.02 for each comparison). Distributions of HPV-16 E2 copies measured in 139 samples with RT-E2-2 (median, 6150) and RT-E2-1 (median, 8960) were different (P<0.0001). HPV-16 total (odds ratio (OR) OR, 2.16 95% confidence interval (CI) 1.11-4.19), episomal (OR, 2.14 95% CI 1.09-4.19) but not integrated (OR, 3.72 95% CI 1.03-13.4) load, were associated with high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN-2,3) after controlling for age, CD4 count and HIV, and HPV-16 polymorphism. The proportion of samples with an E6/E2 ratio >2 in women without SIL (7 of 35) was similar to that of women with CIN-2,3 (5 of 11, P=0.24) or CIN-1 (4 of 14, P=0.65). E2 polymorphism was a factor that influenced measures of HPV-16 integrated load.

L' oncoprotéine E6 - qui joue un rôle crucial dans le processus d'oncogenèse induit par les papillomavirus a longtemps résisté à toute analyse. Depuis 1995 l'équipe Oncoprotéines a concentré ses efforts sur cette problématique. Ce qui a permis la résolution par RMN de la structure du domaine C-terminal de E6 en 2006. C'est dans ce cadre que j'ai commencé ce Doctorat en 2008, avec objectif de continuer la quête de données structurales sur E6 tout en acquérant des informations sur ses modes d'interaction avec ses cibles cellulaires. Les travaux de cette thèse ont permis l'obtention de la structure cristallographique de E6 (HPV16) en complexe avec un peptide de E6AP, en utilisant une approche originale capable de produire des protéines E6 stables et solubles. Cette structure constitue la première information structurale publiée sur des protéines E6 entières, attendue depuis plus de 20 ans par la communauté scientifique. J'ai effectué également durant cette thèse une analyse du système d'interaction de la protéine E6 basée sur une large étude d'interaction entre les protéines E6 (7 types) et 93 peptides porteurs de motif LxxLL.

Le cancer du col de l’utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la femme, dont l’agent étiologique majeur est l’infection par les papillomavirus humain (notamment HPV-16 et 18), qui sont de petits virus infectant les épithéliums muqueux et cutanés, et pouvant induire la formation de tumeurs. L’inducteur majeur du processus oncogène est le processus d’intégration des régions codantes pour les oncoprotéines E6 et E7, au sein de la cellule hôte suite à l’infection. Elles interférent avec le cycle cellulaire et induisent notamment l’immortalisation, voire la transformation des cellules. Les fonctions les plus connue de ces deux oncoprotéines sont la dégradation des suppresseurs de tumeur p53 et pRb, respectivement. Mon travail de thèse à consisté en la mise au point des vecteurs adénoviraux exprimant des miARN dirigés contre l’oncoprotéine E6. Exprimés in vitro ils induisent l’induction de la mort cellulaire par apoptose des cellules tumorales traitées, via l’activation de la voie de caspases, et in vivo permettent le ralentissement de la croissance de tumeurs xénogreffées à des souris Nude. De plus, la stratégie thérapeutique adénovirale a montré ses extensions possibles sur d’autres types de cancers HPV-positifs, mais également via l’expression de différentes moléculaires thérapeutiques, visant à empêcher l’interaction des oncoprotéines telles qu’E6 avec leurs partenaires cellulaires et ainsi les empêcher d’exercer les activités biologiques impliquées dans le développement de cancers. Pour finir, les adénovirus peuvent également être vu comme des outils d’extinction fonctionnels d’E6 et permettant d’étudier les répercutions sur d’autres processus cellulaires. / Cervical cancer is the third most common female cancer. Infection by human papillomavirus (mainly HPV-16 and 18), with tropisms for mucosal or cutaneous squamous surfaces, is the major etiological agent implicated in cancer and tumor development. After infection, the oncogenic process is triggered by integration of oncoproteins E6 and E7 coding regions into the host cell genome. After integration, these oncoproteins interfere with the cell cycle and induce immortalization and cellular transformation of normal cells. The best known function of these two oncoproteins is the degradation of tumors suppressors p53 and pRb respectively. My thesis project consisted in the development of adenoviral vectors expressing miRNA directed against E6 oncoprotein. Their in vitro expression resulted in cellular death by apoptosis of the treated tumor cells, and allowed reduction of tumor growth in vivo in nude mice xenografts. In addition, the adenoviral therapeutical strategy showed its possible extensions on other types of HPV-positive cancers, but also through the possible expression of different therapeutic molecules aimed at preventing the interaction of viral oncoproteins, such as E6, with their cellular partners. These abolished interactions prevent oncoproteins from exercising their biological activities implicated in the development of cancers. In conclusion, we can say that adenoviruses can also be seen as functional tools suppressing E6 and enabling to highlight the repercussions of its suppression on other cellular processes.

Ces travaux de thèse s'inscrivent dans le contexte de la prédiction de la récidive en radiothérapie du cancer de l'utérus. L'objectif était d'analyser les images de tomographie par émission de positons (TEP) au 18F-fluorodésoxyglucose (18F-FDG) en vue d'en extraire des paramètres quantitatifs statistiquement corrélés aux événements de récidive. Six études ont été réalisées afin de répondre aux différentes problématiques soulevées par l'analyse des images 18F-FDG TEP telles que la présence d'artefact, l'isolation du métabolisme tumoral ou l'évaluation du signal en cours de traitement. Les études statistiques ont porté sur l'analyse de paramètres reflétant l'intensité, la forme et la texture du métabolisme tumoral avant, et en cours de traitement. À l'issue de ces travaux, le volume métabolique tumoral pré-thérapeutique ainsi que la glycolyse totale de la lésion per-thérapeutique apparaissent comme les paramètres les plus prometteurs pour la prédiction de récidive de cancers du col de l'utérus. De plus, il apparaît que la combinaison de ces paramètres avec d'autres caractéristiques de texture ou de forme, à l'aide de modèles statistiques d'apprentissage supervisé ou de modèles de régression plus classiques, ont permis d'augmenter la prédiction des événements de récidive. / This thesis deals with the issue of predicting the recurrence within the context of cervical cancer radiotherapy. The objective was to analyze positron emission tomography (PET) with 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) to extract quantitative parameters that could show statistical correlation with tumor recurrence. Six study were performed to address 18F-FDG PET imaging issues such as the presence of bladder uptake artifacts, tumor segmentation impact, as well as the analysis of tumor evolution along the treatment. Statistical analyses were performed among parameters reflecting intensity, shape and texture of the tumor metabolism before, and during treatment. Results show that the pre-treatment metabolic tumor volume and the per-treatment total lesion glycolysis are the most promising parameters for cervical cancer recurrence prediction. In addition, combinations of these parameters with shape descriptors and texture features, using machine-learning methods or regression models, are able to increase the prediction capability.

Le virus du papillome humain (HPV) est l’infection sexuellement transmise la plus fréquente au monde. Plusieurs études ont établi son implication dans l’étiologie de pratiquement tous les cancers du col de l’utérus, une maladie qui constitue un problème de santé majeur dans les pays pauvres. Le HPV est également responsable de 90% des cancers de l’anus, 40-50% des cancers du pénis, de la vulve et du vagin, et 30% des cancers de la tête et du cou. L’objectif général de cette thèse est de combler les lacunes relatives aux connaissances sur la distribution génotypique du HPV dans les lésions néoplasiques cervicales utérines et de la tête et du cou, plus particulièrement en Afrique. Les objectifs spécifiques sont les suivants: 1) analyser la distribution génotypique du HPV dans les cancers du col de l’utérus et faire une analyse comparative de cette distribution dans cinq pays africains en fonction de la prévalence du VIH; 2) évaluer la présence du HPV dans les cancers de la tête et du cou au Sénégal; 3) faire une revue de la littérature et une méta-analyse sur la distribution du HPV dans les cancers de la tête et du cou dans toutes les régions du monde. Pour le premier et le second objectifs, qui découlent d’un large projet international coordonné par l’Institut Catalan d’Oncologie pour l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), une étude transversale multicentrique a été menée au Mali et au Sénégal pour collecter des blocs de paraffine de patientes diagnostiquées entre 2001 et 2010 du cancer invasif du col et des cancers de la tête et du cou. Pour le troisième objectif, une revue exhaustive de la littérature a permis d’identifier tous les articles qui ont été publiés sur les cancers de la tête et du cou dans tous les pays du monde et d’effectuer une méta-analyse sur la prévalence de l’ADN du HPV selon le site du cancer et la région géographique. Notre analyse montre que les principaux types de HPV ciblés dans les vaccins prophylactiques (HPV16/18) représentent la majorité des types de HPV détectés dans le cancer invasif du col de l’utérus en Afrique subsaharienne. Par contre, le HPV45 vient au second rang dans certains pays d’Afrique, dont le Mali et le Sénégal. Nos données suggèrent également que le VIH aurait un rôle dans la contribution relative du HPV18 et HPV45 dans le développement du cancer du col de l’utérus. Au Sénégal, notre étude montre que la prévalence du HPV dans les cancers de la tête et du cou est très faible et ne semble pas jouer un rôle important dans l’oncogenèse. Finalement, la méta-analyse a mesuré la prévalence des HPV dans les cancers de la cavité orale, de l’oropharynx, du larynx et de l’hypopharynx, et confirme l’importante contribution relative du HPV16 dans ces cancers. Globalement, cette thèse permet de mieux comprendre l’impact potentiel des vaccins prophylactiques sur l’incidence des cancers associés au HPV. / Human papillomavirus (HPV) infection is the most common sexually transmitted infection worldwide. Several studies have shown its involvement in the etiology of virtually all cancers of the cervix, which is a major health problem in poor countries. HPV is also responsible for 90% of anal cancers, 40-50% of penile, vulvar and vaginal cancers, and 30% of head and neck cancers. The overall objective of this thesis is to fill the gaps in knowledge on the genotype distribution of HPV in anogenital and head and neck neoplasia, especially in sub-Saharan Africa. The specific objectives are to: 1) analyze HPV genotype distribution in cervical cancer and compare this distribution in five African countries according to HIV prevalence; 2) evaluate the presence of HPV in cancers of the head and neck in Senegal; 3) review the literature on the distribution of HPV in cancers of the head and neck in all regions of the world and perform a meta-analysis. For the first and second objectives, which were derived from a larger international project coordinated by the Catalan Institute of Oncology for the World Health Organization (WHO), a cross-sectional multicentric study was conducted to collect paraffin-embedded blocks of invasive cervical cancer and head and neck cancer diagnosed between 2001 and 2010 in Mali and Senegal. For the third objective, a comprehensive search of the literature was conducted to identify all articles published to date on head and neck cancer. A meta-analysis was performed to estimate the prevalence of HPV DNA according to cancer site and geographical region. Our analysis shows that the main HPV types targeted in the prophylactic vaccines (HPV16/18) accounted for the majority of the HPV types found in invasive cervical cancer in sub-Saharan Africa. Our data also suggests that HIV may play a role in the contribution of HPV18 and HPV45 to the development of cervical cancer. However, HPV45 ranks second in many African countries, notably in Mali and Senegal. In Senegal, our study shows that HPV DNA prevalence in head and neck cancer is very low and is not importantly involved in the oncogenesis. Finally, the meta-analysis measured the prevalence of HPV in cancers of the oral cavity, oropharynx, larynx and hypopharynx, and confirmed the significant relative contribution of HPV16 in these cancers. Overall, this thesis contributes to a better understanding of the potential impact of HPV prophylactic vaccines on the incidence of HPV-associated cancers.

Arrière-plan: les cellules tumorales circulantes (CTC) sont détectables dans de nombreux cancers et peuvent être utiles cliniquement pour le pronostic de la maladie, pour mesurer la récidive et pour prédire la sensibilité aux medicaments chimiothérapeutiques. Au cours des dernières années, l’études des CTC dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, du poumon, du côlon et de la prostate a grandement évolué. Alternativement, il y peu d'études à ce sujet concernant le cancer du col de l’utérus (CCU). Objectifs: Notre objectif est d’optimiser le processus d'enrichissement des CTC dans le CCU et la détection moléculaire des biomarqueurs E6 et E7. Matériel et Méthodes: Dans l’optique de mimer la présence de CTC dans le sang, nous avons dilué des cellules cancéreuses CaSki VPH16-positif provenant d’un CCU dans du sang humain prélevé sur des volontaires sains. Les CaSki ont été collectées suite à une centrifugation par densité avec le Ficoll, la lyse des globules rouges (RBC) et la lyse des RBC combinée avec un enrichissement positif et négatif à l’aide de marqueurs de surface cellulaire. Les CTC ont été détectées par la mesure d’expression des oncogènes E6 et E7 du virus du papillome humain (VPH), de la cytokératine 19 (CK19) et de la cycline p16INK4 en utilisant la technique quantitative en temps réel de Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Pour valider notre méthode de détection des CTC in vivo, nous avons recruté dix patientes atteintes d’un CCU VPH16 positif et six contrôles sains. Résultats: Dans le modèle de dilutions de cellules CaSki, la lyse des RBC seule ou combinée avec l'enrichissement négatif ou positif suggèrent des limites de détection de 1 CTC par mL de sang pour tous les biomarqueurs moléculaires utilisés. La sensibilité de détection est accrue lors de l'utilisation de l’enrichissement positif et négatif en réduisant le bruit de fond causé par les monocytes sanguins. Contrairement aux oncogènes E6 et E7, les marqueurs CK19 et p16INK4A ont été détectés chez des individus sains, les niveaux d'expression de base appropriés doivent donc être déterminés avec précision par rapport aux patientes CCU. Le gradient de densité par Ficoll a une limite de détection de seulement environ 1000 cellules par mL de sang. Enfin, les CTC ont été détectées dans 2/10 patientes en utilisant le marqueur CK19. Cependant, ces patientes étaient négatives pour les oncogènes E6/E7. Le marqueur p16INK4A était exprimé au même niveau dans tous les échantillons (CCU et normaux). Conclusion: Notre étude suggère que les oncogènes E6 et E7 du VPH16 sont les marqueurs biologiques les plus sensibles et spécifiques en qRT-PCR pour détecter les CTC dans le modèle de dilution de cellules de CCU dans le sang. Chez les patientes atteintes d’un CCU de stade précoce, seulement CK19 a révélé la présence potentielle de CTC, ce qui suggère que ces cellules sont rares à ce stade de la maladie. Mots clés: cancer du col de l’utérus, cellules tumorales circulantes, RT-qPCR, E6 et E7, CK19, p16INK4A, enrichissement immunomagnétique, détection moléculaire. / Background: Circulating tumor cells (CTCs) have been detected in many cancers and are used in multiple clinical applications including disease prognosis, tumor recurrence prediction and prediction of tumor sensitivity to chemotherapeutic drugs. Studies in most major solid cancer(s) (breast, lung, colon and prostate) are progressing rapidly, but there has been very little progress concerning uterine cervical cancer (UCC).Objective: our aim is to optimize enrichment processes and the molecular biomarker-based detection of human circulating tumor cells (CTCs) in uterine cervical cancer (UCC). Material & Methods: To mimic CTCs in patients, we designed an experimental spiking model where the CaSki HPV16-positive UCC cell line was serially diluted and spiked into human blood collected from healthy volunteers. CaSki CTCs were enriched using either Ficoll density centrifugation, red blood cell (RBC) lysis or RBC lysis combined with cell surface markers negative or positive enrichment. CTCs were detected using real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) to measure the gene expression of human papillomavirus (HPV) viral oncogenes (E6 and E7), cytokeratin 19 (CK19), or the cyclin dependent kinase inhibitor p16INK4A. Finally, ten HPV16- positive UCC patients and six healthy controls were recruited to validate CTCs detection in vivo. Result: In the spiking model, RBC lysis alone or combined with negative or positive enrichment suggests detection limits close to 1 CTC per mL of blood for all molecular biomarkers used. The sensitivity of detection increased when using positive and negative enrichment probably by reducing the peripheral blood mononuclear cell-derived RNA background. Unlike HPV oncogenes, CK19 and p16INK4A were detected in normal individuals, thus appropriate basal expression levels need to be accurately determined compared to cancer patients. Alternatively, Ficoll density gradient had a detection limit of only about 1000 cells per mL of blood. Finally CTCs were detected in 2/10 patients using CK19. None of the patients had E6/E7 transcripts and p16INK4A was expressed at similar level across all samples (cancer and healthy). Conclusion: qRT-PCR of HPV16 E6 and E7 is the most sensitive and specific biomarker used to detect CTCs in the spiking model. In early disease UCC patients, only CK19 revealed the presence of CTCs suggesting that these cells are rare at that stage of the disease. Keywords: uterine cervical cancer, circulating tumor cells, qRT-PCR, E6 and E7 oncoprotein, CK19, p16INK4A, immune-magnetic enrichment, molecular detection.

A l'échelle mondiale, le cancer du col de l'utérus (CCU) constitue un problème majeur de santé publique touchant 528 000 femmes, il est responsable de 266 000 décès chaque année. Son taux d'incidence varie d'un pays à l'autre et reste remarquablement plus élève dans les pays en voie de | développement où l'accès aux soins, même primaires reste précaire. De nombreuses études I épidémiologiques ont démontré qu'environ 99,7 % des cancers du col de l'utérus sont associés à l'infection par des Papillomavirus Humains (HPV) oncogènes, en particulier les HPV16 et 18. Ces données ont permis le développement de vaccins prophylactiques dirigés contre ces deux génotypes viraux. Il s'agit d'un des! cancers les plus faciles à prévenir et à traiter a condition qu'il soit détecté suffisamment tôt et traité| correctement. L'objectif de ce travail de thèse était d'étudier deux populations de femmes à risque du CCU qui vivent sur deux continents différents (Afrique/Europe). Ces deux populations étaient référées auprès de médecins hospitaliers pour des problèmes gynécologiques. La majorité des femmes n'avaient pas été dépistées (femmes marocaines), ou avaient été sous-dépistées selon les recommandations de l'ANAES (femmes françaises de plus de 65 ans). Au cours de cette étude, les femmes ont eu un frottis cervico-utérin (FCU) pour une analyse cytologique et une recherche d'ADN d'HPV, soit par amplification de cible (PCR ; population marocaine), soit par amplification de signa! (test hc2 ; population française). Les échantillons; HPV positifs ont ensuite été génotypes, soit par génotypage complet (INNO-LiPA ; population marocaine),| soit par génotypage partiel (qPCR HPV16,18 et 45 ; population française). Les frottis étaient normaux dans la majorité des cas : chez 81,9% des femmes marocaines et 68,6% des femmes françaises. Les frottis de signification indéterminée (ASC-US) ont été diagnostiqués chez 15,8% des femmes françaises. Les frottis en faveur d'une lésion de bas grade (LGSIL) étaient observes chez 12,9% des femmes marocaines et 7,4% des femmes françaises. Les frottis en faveur d'une lésion de haut grade (HGSIL) étaient de 5,2% chez les femmes marocaines et 4% chez les femmes françaises. Les frottis évocateurs de cancer ont été décelés uniquement dans la population française (2,9%). La prévalence d'HPV était du même ordre de grandeur (23%) dans les 2 populations et augmentait avec la sévérité de la lésion cytologique pour atteindre 75% dans les frottis HGSIL chez les femmes marocaines et plus de 90% chez les femmes françaises. La quasi-totalité des échantillons en faveur d'un CCU étaient infectés par un HPV. Par ailleurs, dans les deux populations, le génotype prévalent dans tous les types de frottis était THPV16, génotype le plus cardnogène. Un tiers (36,2%) de la cohorte des femmes marocaines était infecté par le VIH, qui s'est avéré le plus important facteur prédictif de l'infection HPV, indépendamment des autres facteurs de risqueI étudiés (caractéristiques sociodémographiques, comportement sexuel, tabagisme...). En France, le dépistage du CCU est préconisé tous les trois ans chez les femmes de 25 à 65 ans. Toutefois, les femmes âgées de plus de 65 ans dont l'espérance de vie est élevée et qui n'ont pas été ou qui ont été mal dépistées pourraient bénéficier d'un test HPV dont la Valeur Prédictive Négative est très élevée. Au Maroc, en l'absence de dépistage organise, il est aussi souhaitable de proposer un test HPV dans le cadre du dépistage j du CCU. La vaccination anti-HPV pourrait aussi prévenir ce cancer. / Worldwide, cervical cancer (CC) is a major public health problem affecting 528 000 women and responsible for 266 000 deaths every year. Its incidence rate varies from one country to another and remains remarkably higher in developing countries where access to care, even primary remains precarious. Many epidemiological studies have shown that approximately 99.7% of cancers of the cervix are associated with infection with oncogenic Human Papillomavirus (HPV), especially HPV16 and 18. These data allowed the development of prophylactic vaccines directed against these two viral genotypes. It is one of the easiest cancers to prevent by early detection of precancerous lesions. The objective of this PhD thesis work was to study two populations of women at risk of CC who live on two different continents (Africa / Europe). These two populations were referred to hospital doctors for gynecological problems. The majority of women were not screened (Moroccan women) or were under-screened according to ANAES recommendations (French women over 65 years). At entry in the study, women had a cervical smear for cytology and HPV DNA research, either by target amplification (PCR; Moroccan population) or signal amplification (hc2 test; French population). HPV positive samples were then genotyped, either with full genotyping (INNO-LiPA; Moroccan population) or with partial genotyping (qPCR targeting HPV16,18 and 45; French population). Smears were normal in most cases: in 81.9% of Moroccan women and 68.6 % of French women. Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance (ASC-US) were diagnosed in 15.8% of French women. Smears in favour of low grade lesion (LGSIL) were observed in 12.9% of Moroccan women and 7.4 % of French women. Smears in favour of high grade lesion (HGSIL) were in 5.2 % of Moroccan women and 4% of French women. Smears suggestive of cancer were detected only in the French population (2.9%). The prevalence of HPV was of the same order of magnitude (23%) in both populations; and increased with the severity of cytological lesions to reach 75% in HGSIL smears among: Moroccan women and over 90% among French women. Almost ail samples with CC were infected with high risk HPV. Furthermore, in both populations, the most prevalent genotype in ail types of smear wasHPV16, known to be the most carcinogenic. One third (36.2%) of the cohort of Moroccan women was infected with HIV, which was the most powerful predictor of HPV infection, independent of other risk factors studied (sociodemographic characteristics, sexual behavior, smoking ...).In France, CC screening is recommended every three years for women 25 to 65 years. However, women over 65 whose life expectancy is high and who have not been or have been poorly screened could benefit from an HPV test. In Morocco, in absence of organized screening, it is also desirable to provide an HPV test as a part of CC screening. The HPV vaccines could improve the situation by reducing the incidence and mortality from this cancer

À l'heure actuelle, une large proportion des recherches vouées à l'identification et au développement de nouvelles thérapies anticancéreuses est basée sur l'apoptose. Dans les dernières décennies, divers composés phytochimiques ont été caractérisés comme des agents pharmacologiques susceptibles d'éliminer les cellules cancéreuses via l'induction de l'apoptose. Parmi ceux-ci, l'isoliquiritigénine (ILG), un flavonoïde naturellement présent dans les racines de réglisse, se distingue des autres par ses nombreuses propriétés thérapeutiques incluant une activité antitumorale. Chez les mammifères, les cellules apoptotiques (CA) peuvent être complètement dégradées via leur capture par des cellules phagocytaires spécialisées ou servir de vecteurs d'ADN dans un processus appelé transfert horizontal de gènes (THG). Ainsi, il a été mis en évidence que des CA dérivées de cancer du col de l'utérus peuvent induire le transfert de séquences d'oncogènes de papillomavirus humains (HPV) à des fibroblastes primaires humains (HPFs) qui acquièrent des propriétés de cellules transformées. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l'internalisation de CA par les fibroblastes, un modèle de phagocyte non-professionnel, n'ont pas encore été clairement identifiés et la caractérisation de ces événements qui précèdent le THG est essentielle à la compréhension de ce processus et de la transformation des cellules receveuses qui peut en découler.Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse étaient, (i) d'analyser les effets anticancéreux de l'ILG sur des cellules dérivées de cancer du col de l'utérus, (ii) de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la capture des CA par les HPFs, (iii) d'étudier les événements cellulaires qui font suite à ce processus comme la maturation des phagosomes, le THG et l'acquisition de propriétés de transformation et enfin, (iv) de démontrer la preuve de la conservation de la capacité tumorigénique des CA in vivo.Un premier travail a permis de mettre en lumière les propriétés antitumorales de l'ILG via une multiplicité d'actions sur des modèles cellulaires de cancer du col de l'utérus in vitro, incluant des activités anti-proliférative, pro-apoptotique, anti-migratoire. Concernant la lignée cellulaire Ca Ski, p53 sauvage et représentative du carcinome du col utérin le plus fréquent, associé à une infection transformante par HPV16, l'apoptose induite par l'ILG semble dépendante de p53 et de la mitochondrie, mais aussi de la voie des récepteurs de mort, comme attesté par l'augmentation des niveaux de protéines p53 et p21, la dissipation du potentiel membranaire mitochondrial, la libération du cytochrome c et le clivage des caspases-9, -8 et -3. Ces effets pourraient être la conséquence de la diminution de l'expression de l'oncoprotéine virale E6 d'HPV16 induite par l'ILG entraînant la restauration de l'expression de p53. Nos travaux révèlent un fort potentiel de l'ILG contre différents types de cellules malignes et ouvrent le champ à de nouvelles modalités de traitement des cancers associés à HPV. / Most of the research strategies aiming at improving anticancer therapies currently target apoptosis. Over the last decades, several natural products derived from herbal medicine or food have been identified as pharmacological agents for cancer cell elimination through apoptosis induction. Among them, isoliquiritigenin (ILG) is a chalcone derivative isolated from liquorice and shallots which exhibits a wide variety of biological functions including antitumor properties.In mammals, apoptotic cells (AC) can either be eliminated after their capture by specialized phagocytes or act as vectors of DNA in a process named horizontal gene transfer (HGT). For instance, AC derived from cervical cancer cells can transfer human papillomavirus (HPV) oncogene sequences to human primary fibroblasts (HPFs) which subsequently acquire transformed cell properties. The molecular mechanisms underlying AC uptake by HPFs, a model of non-professional phagocytes, have not been clearly identified. Characterizing these upstream events appears critical to broaden our understanding of HGT and the ultimate transformation of recipient cells which may subsequently occur.The aims of this work were to (i) study the antitumor effects of ILG on cervical cancer cell lines,(ii) characterize the cellular and molecular mechanisms underlying AC uptake by HPF, (iii) study the cellular events which occur in HPFs following AC engulfment such as phagosome maturation, HGT and acquisition of transformed properties, and (iv) evaluate the tumorigenic properties of AC in vivo.In a first part of this PhD project, we found that ILG exhibits multiple antitumor actions on cervical cancer cells in vitro including anti-proliferative, pro-apoptotic and anti-migration properties. Further studies on apoptosis-related events were conducted in Ca Ski cells (p53wt, HPV16 DNA positive), which are representative of the most frequent cervical carcinoma. The treatment of Ca Ski cells with ILG is associated with increased levels of p53 and p21 proteins, loss of mitochondrial membrane potential, cytochrome c release and caspase-9, -8 and -3 cleavage. These features suggest that ILG-induced apoptosis is dependent on p53 and involve both mitochondrial and death receptor- mediated pathways. The effect of ILG in Ca Ski cells may be partly explained by the decrease of HPV16 E6 oncoprotein expression and the associated raise of p53 levels observed after cell treatment. Our work highlights the potential of ILG as an antitumor agent and provides the opportunity of new treatment. ln the second part of this work, we set up a method based on flow cytometry to quantitatively analyze AC uptake. This original method and microscopy analysis allowed us to show that HPFs act as non-professional phagocytes and are able to engulf subcellular fragments rather than dying whole cells, with lower efficiency and rapidity compared to professional phagocytes as macrophages. Uptake of AC by HPFs depends on time, temperature and the presence of bivalent ions. Morphological analysis and fonctional assays using endocytosis inhibitors revealed a mechanism related to phagocytosis and/or macropinocytosis. The recognition of phosphatidylserine exposed on the surface of AC by their receptor BAIl has emerged as a required event for AC uptake by HPFs.

Le cancer du col de l'utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la femme, dont l'agent étiologique majeur est l'infection par les papillomavirus humain (notamment HPV-16 et 18), qui sont de petits virus infectant les épithéliums muqueux et cutanés, et pouvant induire la formation de tumeurs. L'inducteur majeur du processus oncogène est le processus d'intégration des régions codantes pour les oncoprotéines E6 et E7, au sein de la cellule hôte suite à l'infection. Elles interférent avec le cycle cellulaire et induisent notamment l'immortalisation, voire la transformation des cellules. Les fonctions les plus connue de ces deux oncoprotéines sont la dégradation des suppresseurs de tumeur p53 et pRb, respectivement. Mon travail de thèse à consisté en la mise au point des vecteurs adénoviraux exprimant des miARN dirigés contre l'oncoprotéine E6. Exprimés in vitro ils induisent l'induction de la mort cellulaire par apoptose des cellules tumorales traitées, via l'activation de la voie de caspases, et in vivo permettent le ralentissement de la croissance de tumeurs xénogreffées à des souris Nude. De plus, la stratégie thérapeutique adénovirale a montré ses extensions possibles sur d'autres types de cancers HPV-positifs, mais également via l'expression de différentes moléculaires thérapeutiques, visant à empêcher l'interaction des oncoprotéines telles qu'E6 avec leurs partenaires cellulaires et ainsi les empêcher d'exercer les activités biologiques impliquées dans le développement de cancers. Pour finir, les adénovirus peuvent également être vu comme des outils d'extinction fonctionnels d'E6 et permettant d'étudier les répercutions sur d'autres processus cellulaires.