Au cours des dernières années, un intérêt grandissant concernant les rôles physiologiques des endocannabinoïdes (eCBs) a été observé. Le système eCB est une cible attrayante pour la modulation du système immunitaire et de la douleur périphérique. Bien que le récepteur CB1 soit distribué dans le système nerveux, le récepteur CB2 est traditionnellement associé au système immunitaire. Ce dogme fait maintenant l’objet d’un débat depuis la découverte de l’expression du récepteur CB2 dans certains neurones. La rétine est un modèle important pour l’étude de processus neuronaux. La présence du récepteur CB1 y a été démontrée. Des études fonctionnelles rapportent que l’activation des récepteurs cannabinoïdes affecte le fonctionnement de plusieurs cellules rétiniennes. À ce jour, aucune étude ne s’est intéressée au rôle global des récepteurs CB1 et CB2 dans la rétine. Nous avons investigué les conséquences de l’élimination du récepteur CB1 (cnr1-/-) ou du récepteur CB2 (cnr2-/-) sur la fonction rétinienne mesurée par électrorétinographie. Nous avons également caractérisé la distribution du récepteur CB2 dans la rétine. Pour ce faire, nous avons comparé la spécificité de plusieurs anticorps dirigés contre le récepteur CB2. Seulement l’un des anticorps testés a montré une spécificité satisfaisante. Il a permis de détecter la présence du récepteur CB2 dans les cônes, les bâtonnets, les cellules horizontales, amacrines, bipolaires et ganglionnaires. Nos résultats d’électrorétinographie indiquent que seules les souris cnr2-/- présentent une amplitude accrue de l’onde a des ERG, en conditions scotopiques. En conditions photopiques, l’amplitude de l’onde b des souris cnr2-/- montre un schéma d’adaptation à la lumière différent des autres groupes. Aucun effet significatif n’a été observé chez les animaux cnr1-/-. Ces résultats permettent de conclure que les récepteurs CB1 et CB2 jouent des rôles différents dans le traitement visuel et que le récepteur CB2 semble être impliqué dans l’établissement des réponses rétiniennes. / Cannabinoid receptors (CB1R and CB2R) are among the most abundant G-protein coupled receptors in the central nervous system. The endocannabinoid system is an attractive target for immune system modulation and peripheral pain management. While CB1R is distributed in the nervous system, CB2R has traditionally been associated to the immune system. This dogma is currently a subject of debate since the discovery of CB2R expression in neurons. The retina is an interesting model for neuronal processes’ study. The activation of cannabinoid receptors modulates neurotransmitter release from photoreceptors and could also affect bipolar cell synaptic release. However, the impact of CB1r and CB2R on the retinal function as a whole is currently unknown. In the present study, we investigated the function of cannabinoid receptors in the retina by recording electroretinographic responses (ERG) from mice lacking either CB1 or CB2 receptors (cnr1-/- and cnr2-/-, respectively). We also documented the precise distribution of CB2R by comparing the specificity of library of CB2R antibodies. One of the antibodies tested exhibited a valuable specificity and localized CB2R expression in cones and rods photoreceptors, horizontal cells, some amacrine cells, and bipolar and ganglion cells. In scotopic conditions, the amplitudes of the awave of the ERG were increased in cnr2-/- mice, while they remained unchanged in cnr1-/- mice. Under photopic conditions, b-wave amplitudes of cnr2-/- mice required more light adaptation time to reach stable values. No effect was observed in cnr1-/- mice. These data indicate that CB2R is likely to be involved in shaping retinal responses to light and suggest that CB1 and CB2 receptors could have different roles in visual processing.

Au cours des dernières années, un intérêt grandissant concernant les rôles physiologiques des endocannabinoïdes (eCBs) a été observé. Le système eCB est une cible attrayante pour la modulation du système immunitaire et de la douleur périphérique. Bien que le récepteur CB1 soit distribué dans le système nerveux, le récepteur CB2 est traditionnellement associé au système immunitaire. Ce dogme fait maintenant l’objet d’un débat depuis la découverte de l’expression du récepteur CB2 dans certains neurones. La rétine est un modèle important pour l’étude de processus neuronaux. La présence du récepteur CB1 y a été démontrée. Des études fonctionnelles rapportent que l’activation des récepteurs cannabinoïdes affecte le fonctionnement de plusieurs cellules rétiniennes. À ce jour, aucune étude ne s’est intéressée au rôle global des récepteurs CB1 et CB2 dans la rétine. Nous avons investigué les conséquences de l’élimination du récepteur CB1 (cnr1-/-) ou du récepteur CB2 (cnr2-/-) sur la fonction rétinienne mesurée par électrorétinographie. Nous avons également caractérisé la distribution du récepteur CB2 dans la rétine. Pour ce faire, nous avons comparé la spécificité de plusieurs anticorps dirigés contre le récepteur CB2. Seulement l’un des anticorps testés a montré une spécificité satisfaisante. Il a permis de détecter la présence du récepteur CB2 dans les cônes, les bâtonnets, les cellules horizontales, amacrines, bipolaires et ganglionnaires. Nos résultats d’électrorétinographie indiquent que seules les souris cnr2-/- présentent une amplitude accrue de l’onde a des ERG, en conditions scotopiques. En conditions photopiques, l’amplitude de l’onde b des souris cnr2-/- montre un schéma d’adaptation à la lumière différent des autres groupes. Aucun effet significatif n’a été observé chez les animaux cnr1-/-. Ces résultats permettent de conclure que les récepteurs CB1 et CB2 jouent des rôles différents dans le traitement visuel et que le récepteur CB2 semble être impliqué dans l’établissement des réponses rétiniennes. / Cannabinoid receptors (CB1R and CB2R) are among the most abundant G-protein coupled receptors in the central nervous system. The endocannabinoid system is an attractive target for immune system modulation and peripheral pain management. While CB1R is distributed in the nervous system, CB2R has traditionally been associated to the immune system. This dogma is currently a subject of debate since the discovery of CB2R expression in neurons. The retina is an interesting model for neuronal processes’ study. The activation of cannabinoid receptors modulates neurotransmitter release from photoreceptors and could also affect bipolar cell synaptic release. However, the impact of CB1r and CB2R on the retinal function as a whole is currently unknown. In the present study, we investigated the function of cannabinoid receptors in the retina by recording electroretinographic responses (ERG) from mice lacking either CB1 or CB2 receptors (cnr1-/- and cnr2-/-, respectively). We also documented the precise distribution of CB2R by comparing the specificity of library of CB2R antibodies. One of the antibodies tested exhibited a valuable specificity and localized CB2R expression in cones and rods photoreceptors, horizontal cells, some amacrine cells, and bipolar and ganglion cells. In scotopic conditions, the amplitudes of the awave of the ERG were increased in cnr2-/- mice, while they remained unchanged in cnr1-/- mice. Under photopic conditions, b-wave amplitudes of cnr2-/- mice required more light adaptation time to reach stable values. No effect was observed in cnr1-/- mice. These data indicate that CB2R is likely to be involved in shaping retinal responses to light and suggest that CB1 and CB2 receptors could have different roles in visual processing.

Le système endocannabinoïde (eCB) est une cible thérapeutique intéressante pour traiter diverses conditions variées, allant de la modulation du système immunitaire à la prise en charge de la douleur neuropathique. De plus, le système eCB est impliqué dans les processus développementaux comme l’indique une exposition aux cannabinoïdes au cours du développement qui provoque des troubles neurofonctionnels. En raison de leur nature lipophile, les eCBs ne sont pas emmagasinés, mais sont plutôt synthétisés et dégradés sur demande par des enzymes. Ainsi, l’étude du patron d’expression de ces enzymes permettrait de mieux comprendre l’expression et ainsi le rôle joué par les eCBs pendant la formation du système nerveux central. Le récepteur CB1 est grandement distribué dans le système nerveux, alors que le récepteur CB2 est traditionnellement associé au système immunitaire. La découverte récente de l’expression et de l’impact fonctionnel du récepteur CB2 dans certains neurones, notamment au niveau rétinien, modifie la vision traditionnelle des rôles des eCBs. Notamment, une étude de notre laboratoire a montré que la délétion du récepteur CB2 chez des souris transgéniques (cnr2-/-) provoque une augmentation de l’amplitude de l’onde a en électrorétinographie, celle-ci reflétant l’activité des photorécepteurs rétiniens. Cette étude a mis en évidence l’importance du récepteur CB2 dans la vision, du moins au niveau rétinien. Jusqu’à ce jour, aucune étude ne s’est intéressée à l’impact des cannabinoïdes sur l’acuité visuelle. Nous avons caractérisé la distribution rétinienne des enzymes diacylglycérol lipase alpha (DAGLα) et monoacylglycérol lipase (MAGL), responsables respectivement de la synthèse et de la dégradation du ligand eCB 2-arachidonoyl glycérol (2-AG), pendant le développement postnatal. L’enzyme DAGLα est présente dès la naissance et est grandement distribuée dans la rétine, notamment dans les photorécepteurs, les cellules horizontales, amacrines et ganglionnaires. L’enzyme MAGL apparait plus tardivement et est limitée aux cellules amacrines et de Müller. Nos résultats fonctionnels indiquent que l’acuité visuelle des animaux cnr2-/- est plus élevée autant chez les adultes que pendant le développement postnatal. L’administration répétée d’un agoniste inverse du récepteur CB2 produit une augmentation de l’acuité visuelle similaire à la délétion du récepteur CB2 par génie génétique et inversement, l’administration d’un agoniste du récepteur CB2 diminue l’acuité visuelle. Enfin, l’administration d’un inhibiteur de l’enzyme MAGL, responsable de la dégradation du 2-AG, induit une diminution de l’acuité visuelle similaire à celle obtenue par un agoniste du récepteur CB2 tandis que l’administration d’un inhibiteur de l’enzyme DAGL, responsable de la synthèse du 2-AG, provoque une augmentation de l’acuité visuelle. Ces résultats suggèrent que le 2-AG est fortement présent tôt lors du développement rétinien et qu’il pourrait être impliqué dans la maturation structurelle et fonctionnelle de la rétine. De plus, les expériences fonctionnelles ont démontré que les cannabinoïdes affectent non seulement la réponse rétinienne, mais aussi l’acuité visuelle de manière significative. En outre, ces résultats confirment que les cannabinoïdes induisent leurs effets sur la vision exclusivement par le récepteur CB2. Enfin, les résultats de cette thèse accroissent les connaissances actuelles dans un contexte de légalisation grandissante du cannabis à des fins récréatives, puisqu’ils mettent en évidence l’importance des impacts sur l’acuité visuelle. / The endocannabinoid (eCB) system is a great therapeutic target for the treatment of many diseases, ranging from immune system modulation to pain management. This system is implicated in developmental processes as indicated by neurofunctional afflictions following developmental exposition to cannabinoids. Since eCBs are lipophilic, they are not stored in vesicles but rather synthesized and degraded on demand by specific enzymes. Thus, the expression pattern of these enzymes could help to better understand the expression of eCBs, and their role during central nervous system maturation. The CB1 receptor is strongly distributed in the nervous system, while the CB2 receptor is traditionally associated with the immune system. The recent finding of the CB2 receptor expression and function in some neurons, especially in the retina, changes the dogma associated with cannabinoids. A study from our laboratory found that deletion of the CB2 receptor in transgenic mice (cnr2-/-) enhances the a-wave amplitude in electroretinography, this wave reflecting photoreceptor activity. This report highlighted the importance of the CB2 receptor in vision, at least in the retina. Until now, no study aimed at the impact of cannabinoids on visual acuity. We characterized the retinal distribution of diacylglycerol lipase alpha (DAGLα) and monoacylglycerol lipase (MAGL) enzymes, responsible for the synthesis and degradation of the eCB ligand 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) during postnatal development. The enzyme DAGLα is expressed since birth and is greatly distributed across the retina such as in photoreceptors, horizontal, amacrine and ganglion cells. The enzyme MAGL is expressed later during development and is present only in amacrine and Müller cells. Our functional results show that the visual acuity of cnr2-/- mice is enhanced in adults and during postnatal development. The repeated administration of a CB2 receptor antagonist yielded a better visual acuity, and inversely a CB2 receptor agonist decreased the visual acuity. Furthermore, the administration of a MAGL inhibitor, the enzyme in charge of 2-AG degradation, induced a strong decrease in visual acuity, similar to that obtained with a CB2 receptor agonist. Inversely, a DAGL inhibitor, the enzyme responsible for 2-AG synthesis, caused an increase in visual acuity. These results suggest that 2-AG is strongly expressed early during retinal development and could be implicated in structural and functional maturation of the retina. Furthermore, we demonstrated that cannabinoids do not only affect retinal function, but also visual acuity. These results confirm that cannabinoids modulate their visual effects exclusively via the CB2 receptor. Finally, in recent years, many countries legalized cannabis for recreational and therapeutic use. The findings from this thesis increase the understanding of cannabinoids since they highlight the great impact of cannabinoids on the visual acuity.

Selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), les agonistes du récepteur opioïde Mu (MOR) sont la première ligne de traitement pour le soulagement des douleurs aiguës modérées à sévères. Cependant, ces derniers induisent de nombreux effets indésirables, tels que la dépression respiratoire et la constipation, qui limitent leur utilisation pour une gestion appropriée de la douleur. Chacun des effets indésirables des agonistes du MOR est médié par des mécanismes cellulaires et moléculaires complexes. C’est pourquoi un nombre considérable de recherches précliniques ont été menées afin de découvrir des opioïdes qui induiraient moins d’effets indésirables. Plus particulièrement, de nombreuses études se sont concentrées sur le développement d’agonistes biaisés du MOR qui ont peu ou pas de recrutement de β-arrestine 2 et qui activent préférentiellement les protéines G. Néanmoins, ces recherches n’ont pas réussi à identifier des agonistes biaisés avec un profil amélioré d’effets indésirables en clinique. Nous proposons dans cette thèse que la caractérisation des similarités signalétiques des agonistes du MOR serait une bonne alternative à l’agonisme biaisé pour l’identification d’opioïdes avec des profils d’effets indésirables distincts. Pour ce faire, nous avons développé une méthode basée sur l’utilisation de l’apprentissage non supervisé par clustering pour classifier les ligands du MOR en des catégories pharmacodynamiques. Cette classification s’est faite à l'aide des paramètres qui caractérisaient une panoplie de voies de signalisation médiées par les protéines G et par les β-arrestines. Nous avons pu associer ces différentes catégories pharmacodynamiques avec différentes fréquences de rapport d’effets indésirables d’opioïdes cliniques au programme de pharmacovigilance de la FDA (Food and drug administration) tels que des effets respiratoires et gastro-intestinaux. Nous avons également montré que cette méthode peut être plus généralement appliquée à d’autres sous-types et types de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). L’efficacité et l’innocuité des agonistes du MOR pour le soulagement des douleurs chroniques non cancéreuses, telles que les douleurs neuropathiques, est un sujet controversé et plusieurs essais cliniques ne sont pas en faveur de leur utilisation. Or, la douleur neuropathique est une maladie fréquente qui est associée à une très pauvre qualité de vie du patient et pour laquelle seulement 30 à 40% des patients rapportent un soulagement adéquat de la douleur avec les traitements actuels. Dans les modèles précliniques, les cannabinoïdes sont capables de moduler des processus impliqués dans le développement des douleurs neuropathiques. Ceci les rend des candidats prometteurs pour le soulagement de ces douleurs en clinique. Néanmoins, peu de médicaments à base de cannabis sont présentement approuvés sur le marché pour un usage thérapeutique. Ces derniers sont régulés selon leur contenu en Δ9-tétrahydrocannabinol (THC) et cannabidiol (CBD) et il existe une présomption selon laquelle les quantités de THC et les ratio THC:CBD permettraient de décrire l’activité biologique du cannabis médical. Or, les extraits commerciaux peuvent contenir jusqu’à 23 phytocannabinoïdes et de nombreux autres composés chimiques. La description de ces derniers uniquement en termes de contenus en THC et en CBD ne prend pas en considération les interactions potentielles qui peuvent arriver entre les multiples autres composants et qui peuvent aboutir à des effets cliniques différents. Nous avons donc testé dans cette thèse s’il y avait réellement une équivalence entre l’activité biologique d’un extrait de cannabis et des traitements cannabinoïdes avec des contenus en THC et/ou en CBD équivalents Nous avons démontré que les réponses analgésiques du THC et du CBD seuls, d’une combinaison THC:CBD (1 :1) et d’un extrait de cannabis de chémotype II (avec un ratio THC:CBD ≈ 1 :1) ne sont pas équivalentes dans un modèle de neuropathie diabétique chez les rats. Aux hautes doses testées, l’extrait était plus efficace à soulager la douleur que la combinaison THC:CBD (1 :1) qui, elle-même, était plus efficace que le THC et le CBD seuls. De plus, ces différents traitements engageaient les cibles moléculaires du système endocannabinoïde CB1 (récepteur cannabinoïde 1), CB2 (récepteur cannabinoïde 2) et TRPV1 de façon distincte. Ensemble ces résultats suggèrent qu’une équivalence au niveau des contenus en THC et des ratios THC:CBD ne se traduit pas par une équivalence d’activité biologique telle que l’analgésie. Dans son ensemble, cette thèse propose dans un premier temps une méthode basée sur la classification pharmacodynamique de ligands de RCPG qui pourrait être utile pour l’identification de nouveaux candidats opioïdes avec un profil d’effets indésirables amélioré. Dans un second temps, nous avons démontré que les cannabinoïdes induisent des effets analgésiques à travers différentes cibles pharmacodynamiques et que ces dernières étaient engagées de façon distincte par les différents traitements. Notre intention future est de décrire in vitro les profils signalétiques des cannabinoïdes sur ces différentes cibles et d'utiliser notre outil de classification pharmacodynamique afin de corréler ces réponses signalétiques avec leurs effets analgésiques et indésirables in vivo. Ces travaux fournissent des éléments pertinents pour le développement rationnel d’analgésiques plus efficaces et mieux tolérés en clinique. / According to the World Health Organization (WHO), Mu opioid receptor agonists (MOR) are the first line of treatment for the relief of moderate to severe acute pain. However, they induce numerous adverse effects, such as respiratory depression and constipation, which limit their use for appropriate pain management. Each of the adverse effects of MOR agonists is mediated by complex cellular and molecular mechanisms. As a result, a considerable amount of preclinical research has been conducted to discover opioids that would induce fewer adverse effects. Specifically, many studies have focused on developing biased MOR agonists that have little or no β-arrestin 2 recruitment and preferentially activate G proteins. Despite these investigations, efforts to identify biased agonists with an improved adverse event profile in the clinic have been unsuccessful. In this thesis, we propose that characterizing the signaling similarities of MOR agonists would be a good alternative to biased agonism for identifying opioids with distinct adverse effect profiles. To this end, we developed a method based on the use of unsupervised clustering learning to classify MOR ligands into pharmacodynamic categories. This classification was done using parameters that characterized a panoply of G protein- and β-arrestin-mediated signaling pathways. We were able to associate these different pharmacodynamic categories with different frequencies of clinical opioid adverse event reported to the FDA pharmacovigilance program such as respiratory and gastrointestinal effects. We have also shown that this method can be more generally applied to other subtypes and types of G protein-coupled receptors (GPCRs). The efficacy and safety of MOR agonists for the relief of chronic non-cancer pain, such as neuropathic pain, is a controversial topic and several clinical trials do not support their use. Neuropathic pain is a common condition that is associated with very poor patient quality of life and for which only 30-40% of patients report adequate pain relief with current treatments. In preclinical models, cannabinoids are able to modulate processes involved in the development of neuropathic pain. This makes them promising candidates for the relief of such pain in the clinic. However, few cannabis-based medications are currently approved for therapeutic use. For safety reasons, these are regulated according to their Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol (CBD) content under the presumption that THC amounts and THC:CBD ratios would adequately describe the biological activity of medical cannabis. Commercial extracts of medical cannabis may contain up to 23 phytocannabinoids and many other chemical compounds. Describing these products only in terms of THC and CBD content does not take into consideration the potential interactions that may occur between these multiple components and that may result in different clinical effects. We therefore tested in this thesis whether there was really an equivalence between the biological activity of a cannabis extract and cannabinoid treatments with equivalent THC and/or CBD contents. We demonstrated that the analgesic responses of pure THC and CBD, a THC:CBD (1:1) combination, and a chemotype II cannabis extract (with a THC:CBD ratio ≈ 1:1) were not equivalent in a rat model of diabetic neuropathy. At the high doses tested, the extract was more efficacious than the THC:CBD (1:1) combination which, in turn, was more efficacious than pure THC and CBD. Furthermore, these different treatments engaged the molecular targets of the endocannabinoid system CB1 (cannabinoid receptor 1), CB2 (cannabinoid receptor 2), and TRPV1 in distinct ways. Together, these results suggest that equivalence in THC content and THC:CBD ratios does not translate into equivalence in biological activity such as analgesia. Overall, this thesis firstly proposes a pharmacodynamic-based method of GPCR ligand classification that could be useful for the identification of new opioid candidates with an improved adverse effect profile. Secondly, we demonstrated that cannabinoids produced their analgesic effects via different pharmacodynamic targets and that these targets were distinctively engaged by the different treatments. Our future intention is to describe the in vitro signaling profiles of cannabinoids at these different targets, and to use our pharmacodynamic clustering tool to correlate these signaling responses with their in vivo their analgesic and adverse effects. This work provides relevant insights for the rational development of more effective and better tolerated analgesics in the clinic.

Le système endocannaboïde (eCB) est constitué des ligands, des récepteurs – les plus étudiés étant les récepteurs CB1 et CB2 – et les enzymes de synthèse et de dégradation. Les ligands étant lipophiles, ils ne sont pas encapsulés dans des vésicules, ce qui place les enzymes de synthèse et de dégradation dans une position de régulateurs clés. Plusieurs études démontrent une participation du système eCB à des processus de développement dans le système nerveux central (SNC). La rétine est un modèle important pour l’étude de ces processus car elle contient plusieurs types cellulaires bien connus, dont le patron de développement est clairement établi. Pour l’instant très peu est connu sur l’expression du système eCB durant le développement rétinien. C’est dans ce cadre que les patrons d’expression du récepteur CB1 et de l’enzyme de dégradation FAAH ont été étudiés pendant le développement rétinien postnatal chez le rat. Pour identifier les types cellulaires exprimant ces protéines, des co-marquages ont été accomplis pour le récepteur CB1 ou FAAH et des marqueurs des types cellulaires rétiniens. À P1, les cellules ganglionnaires, amacrines, horizontales et mitotiques expriment le récepteur CB1. Les cellules ganglionnaires et amacrines cholinergiques sont FAAH-positives. Au cours du développement, certains types cellulaires démontrent une expression transitoire de ces deux protéines, suggérant une implication du système eCB dans les processus de développement. Nos données démontrent également une importante expression du système eCB dans la rétine adulte, ce qui soutient l’hypothèse de son implication dans la réponse rétinienne. En bref, des études fonctionnelles in vitro sur des rétines de non-mammifères ont révélées que le récepteur CB1 modulait la réponse des cônes et des cellules bipolaires. Malgré la récente démonstration de sa présence dans la rétine, il n’existe pas de d’étude sur le rôle du récepteur CB2 dans la rétine. Dans cette thèse, les conséquences fonctionnelles de l’élimination des récepteurs CB1 ou CB2 ont été évaluées chez des souris transgéniques. Les réponses rétiniennes ont été enregistrées par électrorétinographie chez des souris cnr1-/- (CB1R-KO) et cnr2-/- (CB2R-KO). Nos données suggèrent une implication différente pour chaque récepteur dans la formation de la réponse rétinienne / The endocannabinoid (eCBs) system is composed of the ligands, the receptors - the most studied are CB1R and CB2R – and the synthesizing and degradative enzymes. The lipophilic ligands are not stored in vesicles, thereby placing the synthesizing and degradative enzymes as key regulators of the receptor function. The eCB system is thought to participate to developmental processes in the central nervous system (CNS). The rodent retina is a valuable model to study CNS development, as it contains well identified cell types with established developmental timelines. Very little is known about the distribution of this neuromodulationsystem in the developing retina. In this thesis, the expression patterns of CB1R and eCB degradative enzyme FAAH were investigated in the rat retina during postnatal development. To identify the cells expressing these proteins, co-stainings were carried out for CB1R or FAAH and retinal cell type markers. At P1, CB1R was expressed in ganglion, amacrine, horizontal and mitotic cells, whereas FAAH was present in ganglion and cholinergic amacrine cells. In the course of development, both CB1R and FAAH were transiently expressed in some cell type, suggesting a role of the eCB system in developmental processes. Furthermore, our data demonstrated an important expression of both proteins in adult animals, supporting the hypothesis that the eCB system is involved in retinal functions. Briefly, functional in vitro studies on non-mammalian retinae have revealed an effect of CB1R on cone photoreceptors and bipolar cells response. Despite the recent demonstration of CB2R mRNA and protein presence in the retina, there are no data on CB2R functional role in retina have been published. In this thesis, the consequences of removing either CB1R or CB2R from the retina of transgenic mice were evaluated. Retinal response was recorded by electroretinogram in cnr1-/- (CB1R-KO) and cnr2-/- (CB2R-KO) mice. This data suggests that both receptors are involved in shaping the retinal response to light and they have different roles in this process.

Les dérivés de l’opium (opioïdes) et du cannabis (cannabinoïdes) présentent de nombreuses propriétés intéressantes. Suite à l’identification de leurs récepteurs respectifs, diverses stratégies pharmacologiques ont tenté d’exploiter leurs propriétés analgésiques. Le clonage des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 a favorisé la découverte de composés endogènes pour ces récepteurs, les endocannabinoïdes, dont les deux plus étudiés sont l’anandamide et le 2-arachidonyl glycérol (2-AG). Cette découverte a également mené à l’identification d’enzymes qui catalysent l’inactivation de ces cannabinoïdes endogènes : une amidohydrolase des acides gras ou FAAH ainsi qu’une monoacylglycérol lipase ou MAGL. Le système cannabinoïde endogène est régulé à la hausse dans une variété de processus pathologiques, tels que les douleurs inflammatoire et neuropathique. Cette augmentation est habituellement interprétée comme une réaction physiologique visant à rétablir l’homéostasie et elle a notamment été observée en périphérie. Les endocannabinoïdes semblent donc agir de façon spécifique à des moments clés dans certains tissus ciblés afin de minimiser les conséquences reliées au déclenchement de ces douleurs. Cette observation est très intéressante d’un point de vue thérapeutique puisqu’elle suggère la possibilité de cibler les enzymes de dégradation des endocannabinoïdes dans le but d’augmenter leurs concentrations locales et d’ainsi prolonger leur action neuromodulatrice. En périphérie, l’activation des récepteurs cannabinoïdes induit des effets antinociceptifs bénéfiques tout en minimisant les effets indésirables souvent associés à leur activation centrale. Nous avons orienté nos travaux vers la modulation périphérique de ce système endogène à l’aide d’inhibiteurs des enzymes de dégradation des endocannabinoïdes afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique et d’élucider les mécanismes d’action qui sous-tendent leurs effets dans des modèles animaux de douleurs inflammatoire et neuropathique. Nous avons démontré que cette approche permet de soulager les symptômes associés à ces deux types de douleurs, et ce via les récepteurs CB1 et CB2. Les systèmes cannabinoïde et opioïde présentent des similitudes, dont des localisations similaires le long des voies de la douleur, des mécanismes d’action relayés par des récepteurs couplés aux protéines G et des propriétés pharmacologiques communes telles que l’analgésie. Le système opioïde est impliqué dans les effets antinociceptifs induits par les cannabinoïdes. À l’inverse, le rôle joué par le système cannabinoïde dans ceux induits par la morphine demeure incertain. Nous avons démontré que les effets antinociceptifs périphériques et spinaux produits par la morphine sont diminués chez les souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’expression des récepteurs CB1 ou CB2 a été éliminée, laissant supposer un rôle pour ces récepteurs dans les effets de la morphine. Nous avons de plus démontré que la diminution de l'analgésie produite par la morphine dans ces souris n'est pas causée par un dysfonctionnement des récepteurs opioïdes mu (MOP) ni par une régulation à la baisse de ces récepteurs. Nos résultats confirment l'existence d'interactions fonctionnelles entre les systèmes cannabinoïde et opioïde au niveau périphérique et spinal. Ces observations sont prometteuses d’un point de vue thérapeutique puisqu’une modulation périphérique ciblée des niveaux d’endocannabinoïdes et d’opioïdes endogènes permettrait de produire des effets analgésiques bénéfiques potentiellement synergiques tout en minimisant les effets indésirables associés à l’activation centrale de ces systèmes. / Opium (opioids) and cannabis (cannabinoids) derivatives present many interesting properties. Following the identification of their respective receptors, various pharmacological strategies have tried to exploit their analgesic properties. The cloning of cannabinoid CB1 and CB2 receptors has promoted the discovery of endogenous agonists of these receptors named endocannabinoids. The two mostly studied endocannabinoids are anandamide and 2-arachidonoyl glycerol (2-AG). This has also led to the identification of enzymes that catalyze the inactivation of these endogenous cannabinoids: a fatty acid amide hydrolase or FAAH and a monoacylglycerol lipase or MAGL. It is known that the endogenous cannabinoid system is upregulated in a variety of pathological processes, such as inflammatory and neuropathic pain. This increase is usually interpreted as a physiological response to restore homeostasis and it was particularly observed in the periphery. Endocannabinoids seem to act specifically at key moments in targeted tissues to minimize the consequences related to the onset of pain. This observation is very interesting from a therapeutic perspective because it suggests the possibility of targeting the endocannabinoid degrading enzymes in order to increase their local concentrations and thus prolong their neuromodulatory action. At the peripheral level, the activation of cannabinoid receptors induces beneficial antinociceptive effects while minimizing side effects often associated with their central activation. We focused our work on the peripheral modulation of this endogenous system using inhibitors of endocannabinoid degrading enzymes to assess their therapeutic potential and to elucidate the mechanisms of action underlying their effects in animal models of inflammatory and neuropathic pain. We have demonstrated that this approach can relieve the symptoms associated with these two types of pain, through the activation of CB1 and CB2 receptors. The opioid and cannabinoid systems have similarities, including comparable locations along the pain pathways, mechanisms of action relayed by G protein-coupled receptors and common pharmacological properties such as analgesia. The opioid system is involved in the antinociceptive effects induced by cannabinoids. In contrast, the participation of the cannabinoid system in those induced by morphine remains uncertain. We have demonstrated that peripheral and spinal antinociceptive effects induced by morphine are reduced in genetically modified mice in which the expression of CB1 and CB2 receptors was eliminated, suggesting a role for these receptors in the effects of morphine. We have further demonstrated that the decrease in morphine-induced analgesia in these mice is not caused by a malfunction of the mu opioid receptors (MOP) or by a down-regulation of these receptors. Our results confirm the existence of functional interactions between cannabinoid and opioid systems at the peripheral and spinal levels. These findings are promising from a therapeutic perspective since a targeted modulation of the levels of endocannabinoids and endogenous opioids would induce potentially synergistic beneficial analgesic effects while minimizing side effects associated with the central activation of these systems.

Le système endocannaboïde (eCB) est constitué des ligands, des récepteurs – les plus étudiés étant les récepteurs CB1 et CB2 – et les enzymes de synthèse et de dégradation. Les ligands étant lipophiles, ils ne sont pas encapsulés dans des vésicules, ce qui place les enzymes de synthèse et de dégradation dans une position de régulateurs clés. Plusieurs études démontrent une participation du système eCB à des processus de développement dans le système nerveux central (SNC). La rétine est un modèle important pour l’étude de ces processus car elle contient plusieurs types cellulaires bien connus, dont le patron de développement est clairement établi. Pour l’instant très peu est connu sur l’expression du système eCB durant le développement rétinien. C’est dans ce cadre que les patrons d’expression du récepteur CB1 et de l’enzyme de dégradation FAAH ont été étudiés pendant le développement rétinien postnatal chez le rat. Pour identifier les types cellulaires exprimant ces protéines, des co-marquages ont été accomplis pour le récepteur CB1 ou FAAH et des marqueurs des types cellulaires rétiniens. À P1, les cellules ganglionnaires, amacrines, horizontales et mitotiques expriment le récepteur CB1. Les cellules ganglionnaires et amacrines cholinergiques sont FAAH-positives. Au cours du développement, certains types cellulaires démontrent une expression transitoire de ces deux protéines, suggérant une implication du système eCB dans les processus de développement. Nos données démontrent également une importante expression du système eCB dans la rétine adulte, ce qui soutient l’hypothèse de son implication dans la réponse rétinienne. En bref, des études fonctionnelles in vitro sur des rétines de non-mammifères ont révélées que le récepteur CB1 modulait la réponse des cônes et des cellules bipolaires. Malgré la récente démonstration de sa présence dans la rétine, il n’existe pas de d’étude sur le rôle du récepteur CB2 dans la rétine. Dans cette thèse, les conséquences fonctionnelles de l’élimination des récepteurs CB1 ou CB2 ont été évaluées chez des souris transgéniques. Les réponses rétiniennes ont été enregistrées par électrorétinographie chez des souris cnr1-/- (CB1R-KO) et cnr2-/- (CB2R-KO). Nos données suggèrent une implication différente pour chaque récepteur dans la formation de la réponse rétinienne / The endocannabinoid (eCBs) system is composed of the ligands, the receptors - the most studied are CB1R and CB2R – and the synthesizing and degradative enzymes. The lipophilic ligands are not stored in vesicles, thereby placing the synthesizing and degradative enzymes as key regulators of the receptor function. The eCB system is thought to participate to developmental processes in the central nervous system (CNS). The rodent retina is a valuable model to study CNS development, as it contains well identified cell types with established developmental timelines. Very little is known about the distribution of this neuromodulationsystem in the developing retina. In this thesis, the expression patterns of CB1R and eCB degradative enzyme FAAH were investigated in the rat retina during postnatal development. To identify the cells expressing these proteins, co-stainings were carried out for CB1R or FAAH and retinal cell type markers. At P1, CB1R was expressed in ganglion, amacrine, horizontal and mitotic cells, whereas FAAH was present in ganglion and cholinergic amacrine cells. In the course of development, both CB1R and FAAH were transiently expressed in some cell type, suggesting a role of the eCB system in developmental processes. Furthermore, our data demonstrated an important expression of both proteins in adult animals, supporting the hypothesis that the eCB system is involved in retinal functions. Briefly, functional in vitro studies on non-mammalian retinae have revealed an effect of CB1R on cone photoreceptors and bipolar cells response. Despite the recent demonstration of CB2R mRNA and protein presence in the retina, there are no data on CB2R functional role in retina have been published. In this thesis, the consequences of removing either CB1R or CB2R from the retina of transgenic mice were evaluated. Retinal response was recorded by electroretinogram in cnr1-/- (CB1R-KO) and cnr2-/- (CB2R-KO) mice. This data suggests that both receptors are involved in shaping the retinal response to light and they have different roles in this process.

Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le déclenchement et le développement de la sclérodermie systémique (ScS). Nous avons mis au point un modèle murin où la maladie est déclenchée par divers types de stress oxydant, puis nous avons exploré les différentes voies d'activation des fibroblastes sous l'effet des formes réactives de l'oxygène, afin de déterminer d'éventuelles cibles thérapeutiques. Pour apprécier les effets d’un stress oxydant chronique, des solutions contenant différents oxydants ont été injectées dans la peau de souris BALB/c et BALB/c SCID. Les solutions contenant le radical hydroxyl OH° ou HOCl ont induit une maladie caractérisée, comme la ScS diffuse, par une fibrose cutanée et viscérale, et des auto-anticorps anti-ADN topoisomérase-1. Les sérums de ces souris contenaient de grandes quantités de dérivés oxydés des protéines et induisaient la prolifération des fibroblastes et la production de formes réactives de l’oxygène par les cellules endothéliales. Une fibrose pulmonaire de moindre importance était induite chez les souris BALB/c SCID. Grâce à ce nouveau modèle murin de SSc, nous avons démontré que le stress oxydant était directement responsable des anomalies observées dans les fibroblastes, les cellules endothéliales et le système immunitaire. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour analyser les voies d’activation fibroblastique dans la ScS. Dans les fibroblastes des souris exposées à HOCl, on observe une dérégulation des voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes, et des récepteurs au PDGF. On observe les mêmes dérégulations ex vivo dans les fibroblastes de patients atteints de SSc diffuse. Nous avons ainsi observé une amélioration clinique significative chez les souris sclérodermiques traitées avec un inhibiteur de l’activation de Notch, avec un agoniste des récepteurs aux cannabinoïdes, et avec des inhibiteurs de tyrosine-kinase ciblant le récepteur au PDGF. Puisque les fibroblastes sclérodermiques ont un phénotype activé et produisent de forts taux de formes réactives de l’oxygène, nous avons enfin mis à profit cette particularité pour induire l’apoptose sélective de ces cellules dans le derme des souris. Le trioxyde d’arsenic, molécule cytotoxique utilisée en thérapeutique humaine, augmente la production cellulaire de formes réactives de l’oxygène au-delà d’un seuil létal et induit ainsi l’apoptose des fibroblastes sclérodermiques. L’utilisation in vivo de cette molécule dans notre modèle murin prévient la fibrose cutanée et viscérale, et les anomalies endothéliales. Le trioxyde d’arsenic a un effet comparable dans le modèle murin de ScS associée à la réaction du greffon contre l’hôte en détruisant les lymphocytes T CD4+ alloréactifs activés et les cellules dendritiques plasmacytoïdes responsables de l’activation du système immunitaire. Les formes réactives de l’oxygène sont donc impliquées dans l’induction des lésions observées au cours de la ScS. Dans notre modèle, le rôle du système immunitaire intervient dans l'auto-entretien et l’extension systémique de la maladie. Le stress oxydant contribue à la dérégulation de diverses voies de signalisation dont les voies des récepteurs Notch, des récepteurs aux cannabinoïdes et du PDGF dans les fibroblastes. La modulation de ces voies permet d’obtenir une amélioration clinique chez les souris sclérodermiques, tout comme l’utilisation du trioxyde d’arsenic qui entraîne la délétion spécifique des fibroblastes sclérodermiques surpoduisant des formes réactives de l’oxygène. Le trioxyde d’arsenic montre également une efficacité intéressante dans le modèle de sclérodermie associée à la maladie du greffon contre l’hôte via la délétion des lymphocytes T CD4+ alloréactifs. / We defend the thesis that the oxidative stress plays a major role in the initiation and the development of systemic sclerosis. To demonstrate this thesis, we designed an original mouse model: BALB/c and BALB/SCID mice were injected intra-dermally with prooxidative agents, bleomycin or PBS for 6 weeks. Hypochlorite and hydroxyl radicals induced cutaneous and lung fibrosis in BALB/c mice, in association with anti-DNA topoisomerase-1 auto-antibodies that characterize human diffuse systemic sclerosis. Pulmonary fibrosis was less extensive in BALB/c SCID mice submitted to the same protocol. In this model of HOCl-induced systemic sclerosis, cutaneous fibroblasts display a hyperactivated phenotype that prompted us to investigate several pathways of cellular activation. The NOTCH pathway and the PGDF-receptor pathways were found upregulated in the skin of HOCl-mice. DAPT (a gamma secretase inhibitor that prevents NOTCH cleavage), Sunitinib (an inhibitor of PGDF-receptor phosphorylation), and WIN-55,212, an agonist of the cannabinoid receptors 1 and 2, dramatically improved the clinical, histological and biological signs of systemic sclerosis in the HOCl model.In our model as in patients with SSc, activated fibroblasts produce reactive oxygen species that exert an autocrine effect on their own proliferation and collagen synthesis. By analogy with tumor cells that undergo apoptosis upon cytotoxic treatment that triggers an oxidative stress beyond a lethal threshold, we showed that activated fibroblasts can be selectively killed by the cytotoxic molecule arsenic trioxide (As2O3) that generates intracellular ROS. In the mouse model of sclerodermatous-graft versus host disease (Scl-GVHD), daily intra-peritoneal injections of As2O3 abrogated the clinical symptoms (diarrhea, alopecia, vasculitis, fibrosis of the skin and visceral organs) and specifically induced the apoptosis of activated CD4+ T cells and plasmacytoid dendritic cells. Those data provide a rationale for the evaluation of As2O3 in the management of patients affected by systemic sclerosis or chronic GVHD.

Modulation of the endocannabinoid system (ECS) is of great interest for its therapeutic relevance in several pathophysiological processes. The CB2 subtype is largely localized to immune effectors, including microglia within the central nervous system, where it promotes anti-inflammation. Recently, a rational drug design toward precise modulation of the CB2 active site revealed the novelty of Pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepines tricyclic chemotype with a high conformational similarity in comparison to the existing leads. These compounds are structurally unique, confirming their chemotype novelty. In our continuing search for new chemotypes as selective CB2 regulatory molecules, following SAR approaches, a total of 17 selected (S,E)-11-[2-(arylmethylene)hydrazono]-PBD analogs were synthesized and tested for their ability to bind to the CB1 and CB2 receptor orthosteric sites. A competitive [H]CP-55,940 binding screen revealed five compounds that exhibited >60% displacement at 10 μM concentration. Further concentration-response analysis revealed two compounds, and , as potent and selective CB2 ligands with sub-micromolar activities ( = 146 nM and 137 nM, respectively). In order to support the potential efficacy and safety of the analogs, the oral and intravenous pharmacokinetic properties of compound were sought. Compound was orally bioavailable, reaching maximum brain concentrations of 602 ± 162 ng/g (p.o.) with an elimination half-life of 22.9 ± 3.73 h. Whether administered via the oral or intravenous route, the elimination half-lives ranged between 9.3 and 16.7 h in the liver and kidneys. These compounds represent novel chemotypes, which can be further optimized for improved affinity and selectivity toward the CB2 receptor.