Le biofilm est défini comme une communauté microbienne adhérant à une surface biotique ou abiotique, et engluée dans une matrice extracellulaire auto-produite. Les biofilms naturels sont composés de plusieurs espèces microbiennes et leurs interactions, qu'elles soient synergiques ou antagonistes, jouent un rôle important dans le développement, la composition et le fonctionnement des consortia impliqués. De plus, ces relations impliquent souvent la production de molécules antagonistes limitant la croissance ou l'adhésion bactérienne. Enfin la composition de la matrice extracellulaire joue un rôle important dans la robustesse du biofilm. Au cours de ce travail, l'étude des interactions au sein de biofilms mixtes constitués par K. pneumoniae et S. epidermidis a permis d'isoler un polysaccharide produit par K. pneumoniae, capable d'inhiber l'adhésion aux surfaces abiotiques de plusieurs autres espèces bactériennes à Gram-négatif et à Gram-positif. La caractérisation physico-chimique de cette molécules de haut poids moléculaire a permis de mettre en évidence qu'elle était composée de galactose, glucose, rhamnose et d'acide glucuronique. Par ailleurs, l'analyse d'extraits de mutants déficients pour la production de capsule a montré que ce polysaccharide correspondait à la capsule de K. pneumoniae. Son mode d'action consisterait à inhiber les interactions initiales entre bactéries et surface. Le suivi dans le temps de la formation de biofilm monospecies par K. pneumoniae avec la technique Biofilm Ring Test® a également permis de mettre en évidence un phénotype original. En effet, la détection initiale d'agrégats bactériens est suivie par une modification apparente de leur structure, qui serait liée à des changements de leur robustesse face aux forces d'aimantation magnétique. La présence d'ADN extracellulaire au sein de la matrice du biofilm pourrait jouer un rôle dans la survenue de ce phénotype comme l'indique les mesures effectuées en présence de l'enzyme DNAse I. En parallèle, l'observation de biofilm formés par K. pneumoniae dans des modèles expérimentaux cinétiques a mis en évidence des décrochements massifs de biomasse au cours de la maturation du biofilm, qui pourraient être corrélées aux modifications internes de robustesse de la matrice. L'ensemble de ces données permet de mieux caractériser les interactions intimes survenant à l'intérieur de biofilms constitués par K. pneumoniae et à terme de mieux caractériser et donc prévenir leur formation et dissémination. / Biofilms are defined as microbial communities adhering to biotic or abiotic surfaces and embedded in a self-produced extracellular matrix. Natural biofilms are composed of several microbial species and their interactions, synergistic or antagonistic, play important roles in development, composition and functioning of the consortia. Furthermore, the relationships often involve the production of antagonist molecules that impair competitors' growth or adhesion. The composition and evolution of the extracellular matrix plays also an important role in the biofilms' robustness. In this work, study of the interactions within biofilms formed by K. pneumoniae and S. epidermidis led to the isolation of a polysaccharide produced by K. pneumoniae able to inhibit the adherence to abiotic surfaces of several Gram-negative and Gram-positive bacterial species. The physico-chemical characterization of this high molecular weight molecule showed it was composed of galactose, glucose, rhamnose and glucuronic acid. This data, together with the analysis of extracts from capsule-deficient mutants, indicated that the capsule of K. pneumoniae was responsible for the biofilm inhibition phenotype, probably by inhibiting the initial interactions between bacteria and surface. By monitoring the formation of monospecies biofilm by K. pneumoniae with the Biofilm Ring Test® technique, we were able to detect an original phenotype. Indeed, detection of bacterial aggregates still occurred after a few hours of incubation but in a different way, probably related to changes of the biofilm robustness towards magnetic forces. The presence of extracellular DNA in the matrix of the biofilm is likely to play a role in the occurrence of this phenotype, as indicated by the assays performed in presence of the enzyme DNase I. At the same time, observations of biofilm formed by K. pneumoniae in kinetic experimental models showed massive detachment events during biofilm maturation, which could be correlated to changes in internal strength of the matrix. All these dtat contribute to a better characterization of the intimate interactions occuring within biofilms formed by K. pneumoniae and will ultimately lead to the development of efficient anti-biofilm strategies.

Cette thèse issue d'une collaboration entre l'Université Lyon 1 et Sanofi Pasteur (SP) porte sur l'étude du procédé de dépolymérisation et d'activation d'un polyoside capsulaire. Cette réaction est la première étape du couplage d'un vaccin (Menactra®) antiméningococcique conjugué (polyoside du méningocoque de groupe C conjugué à l'anatoxine diphtérique). L'objectif de ce travail, réalisé dans le cadre d'un programme d'amélioration de la conformité et de la robustesse des procédés de SP, est la compréhension du mécanisme et l'optimisation des paramètres clés de cette réaction. Le procédé de couplage de ce vaccin tel qu'il est décrit par SP comporte 3 étapes clés : la dépolymérisation/activation du polyoside par le peroxyde d'hydrogène, la dérivatisation par un "linker" et le greffage à la protéine. Si les 2 dernières étapes sont des réactions chimiques bien connues, la première qui permet, à la fois de réduire la masse molaire du polyoside et de générer des groupements réducteurs, est plus obscure. Une stratégie a été élaborée afin de comprendre cette réaction. Dans un premier temps, l'étude poussée du procédé a permis d'identifier les paramètres impactant la cinétique de dépolymérisation et l'activité réductrice. Ensuite, l'analyse structurale, par diverses techniques, du polyoside dépolymérisé a confirmé l'activation. Enfin, la caractérisation de modifications chimiques de macromolécules étant relativement complexe, de plus petits modèles (monomère, tétramère) ont été utilisés et ont permis d'établir un mécanisme réactionnel de la dépolymérisation du polyoside. A partir de ces résultats, plusieurs solutions ont été proposées à l'industriel pour améliorer le rendement et/ou la robustesse du procédé / This PhD work, initiated by Sanofi Pasteur in collaboration with the University of Lyon 1, concerns the study of the Menactra® vaccine, a glycoconjugate vaccine produced by covalently coupling Neisseria meningitidis serogroups A, C, W135, Y capsular polysaccharides to diphtheria toxoid. The objective was to better understand the chemistry involved in the conjugation process of the vaccine, in order to improve the process robustness and the overall conjugated yields with particular emphasis on the serogroup C. The conjugation process can be divided into 3 key steps: depolymerization/activation by hydrogen peroxide, derivatization, and conjugation. While the 2 last steps of the process are well known in bioconjugation chemistry, the exact mechanism of the first step, which serves 2 purposes, first to reduce the polysaccharide molecular weight and second, to generate the reducing groups on the polysaccharide chain, is poorly understood. An overall strategy for the characterization of the serogroup C polysaccharide depolymerization process was successfully applied to understand this reaction. We first provided a process description of this step, identified and optimized the key process parameters. Then, the structural comparison of the polysaccharide before and after the depolymerization obtained with specified analytical methods gave important information on the mechanism. Finally, well defined sialic and tetrasialic acids were reacted with H2O2 to complete the elucidation of this complex mechanism. From these results, several solutions were proposed to the industrial to improve the yield and the robustness

Avec près de 25 000 cas en 2015, le cancer du sein est de loin le cancer le plus fréquent chez les femmes canadiennes. En termes de mortalité, le cancer du sein se place au deuxième rang (13,8%), derrière le cancer du poumon (26,5%). Suite au diagnostic, 70% des femmes avec un cancer de stade avancé et 30% des femmes avec cancer précoce choisiront de subir une mastectomie totale. Plusieurs options de reconstructions mammaires sont ensuite offertes. Plus de 70% des reconstructions se feront par la mise en place d’implants mammaires (plutôt que par reconstruction autologue utilisant les tissus de la patiente). Parmi les complications survenant après cette intervention, la contracture capsulaire en est une des plus fréquente. La contracture capsulaire se définit comme la contraction anormale de la capsule fibreuse se formant autour des implants mammaires, pouvant causer des douleurs en plus d’un mauvais résultat sur le plan esthétique. Les études cliniques ont démontré un risque accru de développer une contracture capsulaire chez les femmes ayant du suivre un protocole de radiothérapie. Si plusieurs études ont cherché à démontré l’influence des radiations sur l’histologie et l’immunologie du tissu capsulaire, aucune étude ne s’était intéressée à leur effet sur l’ultrastructure capsulaire. Notre équipe a récemment démontré que l’ultrastructure capsulaire dépendait de plusieurs facteurs, notamment de la texture prothétique et du délai de reconstruction. L’objectif de ce mémoire était de décrire l’impact de la radiothérapie sur l’ultrastructure capsulaire en comparant des capsules irradiées et non-irradiées en utilisant la microscopie éléctronique à balayage. Nous avons observé, chez les échantillons issus de capsules irradiés, une perte de relief au niveau de l’interface prothèse-capsule par rapport au échantillons non irradiés. Nous avons aussi démontré que cette caractéristique ultrastructurale est associée à la présence de contracture capsulaire. Enfin, ces effets néfastes de la radiothérapie semblent altérer la capacité de la capsule à adhérer à la prothèse mammaire. En conclusion, mon projet de maîtrise aura permis de décrire pour la première fois l’impact de la radiothérapie sur l’ultrastructure des capsules périprothétiques. Bien que nos résultats ne nous permettent pas d’expliquer de façon certaine le lien potentiel avec l’évolution vers un état de contracture capsulaire, ils laissent croire que cela serait associé avec un diminution de la stabilité de la capsule sur son implant, facteur auparavant évoqué comme ayant une rôle protecteur sur la contracture capsulaire. / With around 25,000 cases in 2015, breast cancer is the most common cancer among Canadian women. In term of mortality, breast cancer is second (13.8%), only behind lung cancer (26.5%). As part of the therapeutic approaches, around 70% and 30% of women with advanced and early breast cancer (respectively) will chose to have a total mastectomy. Following a mastectomy, few options of breast reconstruction are offered to the patients. More than 70% of breast reconstructions are implant-based. Among the complications following this surgery, capsular contracture (CC) is one of the most common. CC is defined as the abnormal, and sometimes painful, contraction of the fibrous capsule that normally grows aroung breast implants, resulting in a aesthetic failure and associated with a higher surgical revision rate. Many studies have demonstrated that the incidence of CC was higher among women who had undergone radiotherapy prior to their implant-based breast breast reconstruction procedure. Most of published studies focus on the influence of radiotherapy on capsular tissue at the immune-histological level but no study has described its influence on capsular architecture. As our team recently demonstrated that capsular ultrastructure is influenced by many factors (prosthetic texture, expansion timing). The main purpose was to describe the impact of radiotherapy on periprosthetic capsule ultrastructural features by comparing irradiated and non-irradiated capsules using scanning electron microscopy (SEM). We observed a significant loss of tridimensional texture at the implant-capsule interface in irradiated capsular samples. This feature was also found to be associated with CC. Finally, our results tend to show that radiotherapy impaires the stability of capsules by preventing them to grow withing their surrounding implant texure. In conclusion, the present research project offers the first description of the capsular response following exposiong to radiations. Even though our results do not allow us to conlude to a clear relation between loss of capsular architecture and a higher risk of CC, we think that the impairement of capsular stability might be part of the answer

Les bactéries possèdent une famille particulière de tyrosine-autokinases, les BY-kinases. Ces enzymes sont impliquées dans la régulation de plusieurs processus cellulaires dont la synthèse et l'export des polysaccharides extracellulaires qui jouent un rôle crucial dans la virulence de certaines bactéries pathogènes. Cependant, les mécanismes de régulation sous-jacents sont inconnus. L'objectif de ma thèse a été de caractériser d'un point de vue structural et fonctionnel le rôle des BY-kinases. Pour cela, j'ai réalisé trois études indépendantes dans trois modèles bactériens différents. Chez Escherichia coli, j'ai identifié et étudié la surface d'interaction entre la BY-kinase Wzc et sa phosphatase associée Wzb afin de comprendre comment Wzb déphosphoryle Wzc. Chez Staphylococcus aureus, j'ai participé à la caractérisation structurale de la pseudo-BY-kinase CapB1. Par comparaison avec la structure de son homologue actif CapB2, mes études ont permis de suggérer l'existence d'un mécanisme de régulation de la synthèse des polysaccharides extracellulaires impliquant CapB2 et CapB1. Enfin, chez Streptococcus pneumoniae, j'ai mis en évidence que si l'autophosphorylation de la BY-kinase CpsD était indispensable à la synthèse de la capsule polysaccharidique, elle était également indispensable à la division de la cellule. Ainsi, mes travaux ont permis de proposer l'existence d'un mécanisme de coordination de la production de la capsule et du cycle cellulaire du pneumocoque. D'un point de vue appliqué, l'ensemble de mes travaux représente une étape préalable et prometteuse au développement de nouvelles molécules, ciblant les BY-kinases de manière spécifique, afin de lutter contre la virulence de certaines bactéries pathogènes / Bacteria possess a particular family of tyrosine-autokinases named BY-kinases. These enzymes are involved in the regulation of numerous cellular functions including the synthesis and export of extracellular polysaccharides that play a critical role in the virulence of different bacterial pathogens. However, the mechanisms of these processes remain unknown. The aim of my thesis was to characterize the role of these BY-kinases by structural and functional approaches. For that, I have realized three independent studies in three bacterial models. In Escherichia coli, I have characterized the interaction surface between the BY-kinase Wzc and its cognate phosphatase Wzb to understand how Wzb dephosphorylates Wzc. In Staphylococcus aureus, I have studied structurally the pseudo-BY-kinase CapB1. By comparison with the structure of its active homologue CapB2, my studies have allowed to suggest the existence of a mechanism controlling capsular polysaccharides synthesis involving both CapB1 and CapB2. Last, in Streptococcus pneumoniae, I have showed that while the autophosphorylation of the BY-kinase CpsD is necessary for proper synthesis of capsular polysaccharides, it is also involved in cell division. Thus, my work shows that a mechanism coordinating capsule production and cellular cycle exists in the pneumococcus. These works constitute a preliminary and promising step toward the development of new molecules, targeting specifically BY-kinases and aim to combat the virulence of bacterial pathogens

L’Opacification Capsulaire Postérieure (OCP) est la fibrose de la capsule développée sur la lentille intraoculaire implantée (LIO) suite à la dé-différenciation de cellules épithéliales cristalliniennes (LECs) subissant une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). La littérature a montré que l'incidence de l’OCP est multifactorielle, dont l'âge ou la maladie du patient, la technique de chirurgie, le design et le matériau de la LIO. La comparaison des LIOs en acryliques hydrophiles et hydrophobes montre que les premières ont une OCP plus sévère, médiée par la transition EMT. En outre, il est également démontré que l'adhérence des LECs est favorisée sur des matériaux hydrophobes par rapport à ceux hydrophiles. Une stratégie biomimétique destinée à promouvoir l’adhérence des LECs sans dé-différenciation en vue de réduire le risque de développement de l’OCP est proposée. Dans cette étude, les peptides RGD, ainsi que les méthodes de greffage et de quantification sur un polymère acrylique hydrophile ont été étudiés. La surface fonctionnalisée des LIOs favorisant l'adhérence des LECs via les récepteurs de type intégrine peut être utilisée pour reconstituer la structure capsule-LEC-LIO en sandwich, ce qui est considéré dans la littérature comme un moyen de limiter la formation de l‘OCP. Les résultats montrent que le biomatériau innovant améliore l'adhérence des LEC, et présente également les propriétés optiques (transmission de la lumière , banc optique) similaires et mécaniques (force haptique de compression, force d'injection de la LIO) comparables à la matière de départ. En outre, par rapport au matériau hydrophobe IOL, ce biomatériau bioactif présente des capacités similaires vis à vis de l’adhérence des LECs, le maintien de la morphologie, et l'expression de biomarqueurs de l’EMT. Les essais in vitro suggèrent que ce biomatériau a le potentiel de réduire certains facteurs de risque de développement de l’OCP. / Posterior Capsular Opacification (PCO) is the capsule fibrosis developed onto the implanted IntraOcular Lens (IOL) by the de-differentiation of Lens Epithelial Cells (LEC) undergoing Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT). Literature has shown that the incidence of PCO is multifactorial including patient’s age or disease, surgical technique, and IOL design and material. Reports comparing hydrophilic and hydrophobic acrylic IOLs show the former has more severe PCO after EMT transition. Additionally, the LEC adhesion is favored onto the hydrophobic materials compared to the hydrophilic ones. A biomimetic strategy to promote LEC adhesion without de-differentiation to reduce PCO development risk is proposed. RGD peptides, as well as their grafting and quantification methods on a hydrophilic acrylic polymer were investigated. The surface functionalized IOL promoting LEC adhesion via integrin receptors can be used to reconstitute the capsule-LEC-IOL sandwich structure, which is considered to prevent PCO formation in literature. The results show the innovative biomaterial improves LEC adhesion, and also exhibits similar optical (light transmittance, optical bench) and mechanical (haptic compression force, IOL injection force) properties comparing to the starting material. In addition, comparing to the hydrophobic IOL material, this bioactive biomaterial exhibits similar abilities in LEC adhesion, morphology maintenance, and EMT biomarker expression. The in vitro assays suggest this biomaterial has the potential to reduce some risk factors of PCO development.

La reconstruction en deux étapes par expanseur et implant est la technique la plus répandue pour la reconstruction mammmaire post mastectomie. La formation d’une capsule périprothétique est une réponse physiologique universelle à tout corps étranger présent dans le corps humain; par contre, la formation d’une capsule pathologique mène souvent à des complications et par conséquent à des résultats esthétiques sous-optimaux. Le microscope électronique à balayage (MEB) est un outil puissant qui permet d’effectuer une évaluation sans pareille de la topographie ultrastructurelle de spécimens. Le premier objectif de cette thèse est de comparer le MEB conventionnel (Hi-Vac) à une technologie plus récente, soit le MEB environnemental (ESEM), afin de déterminer si cette dernière mène à une évaluation supérieure des tissus capsulaires du sein. Le deuxième objectif est d‘appliquer la modalité de MEB supérieure et d’étudier les modifications ultrastructurelles des capsules périprothétiques chez les femmes subissant différents protocoles d’expansion de tissus dans le contexte de reconstruction mammaire prothétique. Deux études prospectives ont été réalisées afin de répondre à nos objectifs de recherche. Dix patientes ont été incluses dans la première, et 48 dans la seconde. La modalité Hi-Vac s’est avérée supérieure pour l’analyse compréhensive de tissus capsulaires mammaires. En employant le mode Hi-Vac dans notre protocole de recherche établi, un relief 3-D plus prononcé à été observé autour des expanseurs BIOCELL® dans le groupe d’approche d’intervention retardée (6 semaines). Des changements significatifs n’ont pas été observés au niveau des capsules SILTEX® dans les groupes d’approche d’intervention précoce (2 semaines) ni retardée. / Two-stage implant-based (expander to implant) breast reconstruction is the most frequently applied technique following total mastectomy. While the periprosthetic capsule is a normal physiologic response to any foreign body, pathological capsule formation often leads complications and suboptimal aesthetic results. The scanning electron microscope (SEM) is a powerful tool that offers unparalleled assessment of capsule ultrastructural topography. The first research aim was to compare conventional high-vacuum (Hi-Vac) SEM with newer environmental scanning electron microscopy (ESEM) technology to determine whether the latter offers superior assessment of breast capsular tissue. The second aim was to apply the most optimal SEM mode to study periprosthetic capsule ultrastructural modifications in women undergoing differing expansion protocols during the first stage of implant-based reconstruction. Ten patients were prospectively included in the first study and 48 prospectively included into the second. Conventional Hi-Vac mode was deemed superior for the comprehensive analysis of breast capsular tissue. Using Hi-Vac mode within the established study protocol, a more pronounced capsular 3-D relief was observed around BIOCELL® expanders when the first postoperative saline inflation took place at 6 weeks following expander insertion (delayed approach). No significant changes were observed with SILTEX® expander capsules in both early (2 weeks) and delayed approach groups.