As infecções em pacientes submetidos a transplantes de órgãos sólidos são importante causa de morbidade, além de serem definidoras da sobrevida desta população. A maioria das infecções que ocorre nos dois primeiros meses pós-transplante é relacionada à assistência à saúde (IRAS). O objetivo deste trabalho é identificar fatores de risco para IRAS por bactérias Gram-negativas (BGN) multi-droga resistentes (MDR) em pacientes submetidos a transplante de fígado (TF), nos dois primeiros meses após o transplante. Os objetivos secundários são: identificar fatores de risco para aquisição por MDR GNB em pacientes submetidos a TF, e determinar o impacto das IRAS por MDR GNB na sobrevida desses pacientes. Foram avaliados os TF consecutivos realizados em pacientes adultos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) no período de novembro de 2009 a novembro de 2011. A vigilância microbiológica foi realizada no dia do TF, e semanalmente até a alta hospitalar ou 60 dias após o transplante. Os sítios de coleta foram swab de orofaringe ou secreção traqueal, swab retal e swab axilar. Foram pesquisadas as seguintes bactérias: A. baumannii. P. aeruginosa e Enterobactérias resistentes a carbapenêmico, e K. pneumoniae e E. coli produtoras de betalactamase de espectro estendido (ESBL). Posteriormente, as amostras clínicas foram comparadas com as cepas da mesma espécie isoladas em culturas de vigilância por tipagem molecular. A análise de fatores de risco foi realizada por tipo de infecção e espécie de bactéria. Na análise estatística utilizou-se o teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher para variáveis dicotômicas, e teste de Mann-Whitney para variáveis ordenáveis. A análise multivariada foi realizada por regressão logística. A análise de sobrevida foi realizada por regressão de Cox. O nível de significância de P considerado foi 0,05. Foram realizados, no período, 229 transplantes em 202 pacientes, e analisados 214 transplantes em 195 pacientes. O motivo de indicação do transplante mais frequente foi cirrose pelo vírus C, 33%. Foram identificados no período do estudo 110 pacientes (56,4%) com IRAS pós-TF, e um total de 201 infecções. Em 76,3% dos pacientes com IRAS (84/110) foi isolado MDR GNB em alguma amostra clínica relacionada à infecção. Os dois principais sítios de infecção foram infecção de sitio cirúrgico (32%) e infecção primária de corrente sanguínea (27%). Os dois microrganismos mais frequentemente isolados das IRAS foram A. baumannii e K. pneumoniae, e a proporção de infecções por cepas resistentes a carbapênemico foi, respectivamente, 100% e 48,9%. Os fatores de risco para infecções por MDR GNB pós-TF foram: retransplante precoce, volume de concentrados de hemácias transfundidos no intra-operatório da cirurgia do TF, colonização por MDR GNB no pré-transplante, tempo prolongado de internação em UTI e tempo prolongado de isquemia fria. Cento e cinco pacientes adquiriram algum MDR GNB nos 60 dias pós-TF, e o único fator de risco detectado para aquisição de MDR GMB no pós-TF foi tempo prolongado de sonda vesical de demora. A análise de clonalidade demonstrou que as cepas de MDR identificadas pré-TF eram fortemente relacionadas às cepas isoladas das infecções no pós-TF para A. baumannii e K. pneumoniae resistente a carbapenêmico. As infecções por MDR GNB apresentaram uma tendência a aumentar o risco de óbito nos 60 primeiros dias pós-TF, mas esta / Bacterial infections among patients submitted to liver transplantation (LT) are an important cause of morbidity and have huge impact on patients\' survival. The majority of infections in the first two months after LT are related to healthcare assistance. The aim of this study has been to identify risk factors for healthcare-associated infections (HAI) caused by multidrug-resistant Gram-negative bacteria (MDR GNB) in liver transplant patients in the first two months after LT. The secondary aims have been to identify risk factors for acquisition of MDR BGN among liver transplant patients and analyze the survival rate during the first two months after LT. We analyzed consecutive liver transplantations performed at Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) from November 2009 to November 2011. Surveillance cultures were performed on a weekly basis, starting on the day of the LT until the hospital discharge or 60 days after the LT. We collected surveillance cultures through swab from oropharynx (or tracheal secretion), axillary and inguinal rectal sites. We surveyed the following bacteria: carbapenem-resistant A. baumanni, P. aeruginosa, Enterobacteriaceae, ESBL-producing K. pneumoniae, and E. coli. The strains isolated from surveillance culture were compared to strains isolated from clinical cultures through PFGE. The risk factor analysis was performed for each type of MDR bacterium for risk of colonization and infection. The statistical analysis was carried out for dichotomous variables using chi-square tests or Fisher\'s exact tests when appropriate; Mann-Whitney tests were used for continuous variable and step-wise logistic regression was used for multivariate analysis. The survival rate analysis was performed using Cox regression. The significant value of P was 0.05. During the study period, 229 liver transplantations were performed in 202 patients and we analyzed 214 LT performed in 195 patients. The main baseline disease that warranted LT was virus C cirrhosis, 33%. 110 (56.4%) patients developed healthcare-associated infections after the LT and a total of 201 infections were identified; 84 (76.3%) patients had MDR GNB isolated from clinical cultures related to HAI. Surgical wounds (31%) and primary bloodstream (27%) were the most prevalent infection sites. The risk factors for HAI by MDR GNB after the LT were: re-transplantation, volume of blood units transfused during the LT surgery, colonization by MDR GNB before the LT, prolonged time of ICU stay, and prolonged time of cold ischemia. 105 patients acquired MDR GNB during the first 60 days after the LT; the only risk factor identified was the prolonged use of urinary drain. The clonal analysis showed that strains isolated in the period before the LT were closely related to strains isolated from clinical culture after the LT for carbapenem-resistant A. baumannii e K. pneumoniae. The infections by MDR GNB have been shown to increase the risk of death in the first 60 days after LT

Serratia sp. ATCC 39006 (S39006) is known for producing carbapenem and prodiginine antibiotics; 1-carbapen-2-em-3-carboxylic acid (car) and prodigiosin. It displays different motility mechanisms, such as swimming and swarming aided by flagellar rotation and biosurfactant production. In addition, S39006 produces gas vesicles to float in aqueous environments and enable colonization of air-liquid interfaces. Gas vesicles are thought to be constructed solely from proteins expressed from a gene cluster composed of two contiguous operons, gvpA1-gvpY and gvrA-gvrC. Prior to this study, three cognate regulators, GvrA, GvrB, and GvrC, encoded by the right hand operon were known to be essential for gas vesicle synthesis. Post-transcriptional regulators such as RsmA-rsmB were also known to be involved in the inverse regulation of gas vesicles and flagella based motility. Furthermore, gas vesicle formation, antibiotic production, and motility in S39006 were affected by cell population densities and de-repressed at high cellular densities through a quorum sensing (QS) system. The aim of this research study was to identify novel regulatory inputs to gas vesicle production. Mutants were generated by random transposon mutagenesis followed by extensive screening, then sequencing and bioinformatic identification of the corresponding mutant genes. After screening, 31 mutants and seven novel regulatory genes impacting on cell buoyancy were identified. Phenotypic and genetic analysis revealed that the mutations were pleiotropic and involved in cell morphology, ion transport and central metabolism. Two new pleiotropic regulators were characterized in detail. Mutations in an ion transporter gene (trkH) and a putative transcriptional regulator gene (floR) showed opposite phenotypic impacts on flotation, flagella-based motility and prodigiosin, whereas production of the carbapenem antibiotic was affected in the transcription regulator mutant. Gene expression assays with reporter fusions, phenotypic assays in single and double mutants, and proteomics suggested that these regulatory genes couple different physiological inputs to QS and RsmA-dependent and RsmA-independent pathways.

As infecções em pacientes submetidos a transplantes de órgãos sólidos são importante causa de morbidade, além de serem definidoras da sobrevida desta população. A maioria das infecções que ocorre nos dois primeiros meses pós-transplante é relacionada à assistência à saúde (IRAS). O objetivo deste trabalho é identificar fatores de risco para IRAS por bactérias Gram-negativas (BGN) multi-droga resistentes (MDR) em pacientes submetidos a transplante de fígado (TF), nos dois primeiros meses após o transplante. Os objetivos secundários são: identificar fatores de risco para aquisição por MDR GNB em pacientes submetidos a TF, e determinar o impacto das IRAS por MDR GNB na sobrevida desses pacientes. Foram avaliados os TF consecutivos realizados em pacientes adultos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) no período de novembro de 2009 a novembro de 2011. A vigilância microbiológica foi realizada no dia do TF, e semanalmente até a alta hospitalar ou 60 dias após o transplante. Os sítios de coleta foram swab de orofaringe ou secreção traqueal, swab retal e swab axilar. Foram pesquisadas as seguintes bactérias: A. baumannii. P. aeruginosa e Enterobactérias resistentes a carbapenêmico, e K. pneumoniae e E. coli produtoras de betalactamase de espectro estendido (ESBL). Posteriormente, as amostras clínicas foram comparadas com as cepas da mesma espécie isoladas em culturas de vigilância por tipagem molecular. A análise de fatores de risco foi realizada por tipo de infecção e espécie de bactéria. Na análise estatística utilizou-se o teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher para variáveis dicotômicas, e teste de Mann-Whitney para variáveis ordenáveis. A análise multivariada foi realizada por regressão logística. A análise de sobrevida foi realizada por regressão de Cox. O nível de significância de P considerado foi 0,05. Foram realizados, no período, 229 transplantes em 202 pacientes, e analisados 214 transplantes em 195 pacientes. O motivo de indicação do transplante mais frequente foi cirrose pelo vírus C, 33%. Foram identificados no período do estudo 110 pacientes (56,4%) com IRAS pós-TF, e um total de 201 infecções. Em 76,3% dos pacientes com IRAS (84/110) foi isolado MDR GNB em alguma amostra clínica relacionada à infecção. Os dois principais sítios de infecção foram infecção de sitio cirúrgico (32%) e infecção primária de corrente sanguínea (27%). Os dois microrganismos mais frequentemente isolados das IRAS foram A. baumannii e K. pneumoniae, e a proporção de infecções por cepas resistentes a carbapênemico foi, respectivamente, 100% e 48,9%. Os fatores de risco para infecções por MDR GNB pós-TF foram: retransplante precoce, volume de concentrados de hemácias transfundidos no intra-operatório da cirurgia do TF, colonização por MDR GNB no pré-transplante, tempo prolongado de internação em UTI e tempo prolongado de isquemia fria. Cento e cinco pacientes adquiriram algum MDR GNB nos 60 dias pós-TF, e o único fator de risco detectado para aquisição de MDR GMB no pós-TF foi tempo prolongado de sonda vesical de demora. A análise de clonalidade demonstrou que as cepas de MDR identificadas pré-TF eram fortemente relacionadas às cepas isoladas das infecções no pós-TF para A. baumannii e K. pneumoniae resistente a carbapenêmico. As infecções por MDR GNB apresentaram uma tendência a aumentar o risco de óbito nos 60 primeiros dias pós-TF, mas esta / Bacterial infections among patients submitted to liver transplantation (LT) are an important cause of morbidity and have huge impact on patients\' survival. The majority of infections in the first two months after LT are related to healthcare assistance. The aim of this study has been to identify risk factors for healthcare-associated infections (HAI) caused by multidrug-resistant Gram-negative bacteria (MDR GNB) in liver transplant patients in the first two months after LT. The secondary aims have been to identify risk factors for acquisition of MDR BGN among liver transplant patients and analyze the survival rate during the first two months after LT. We analyzed consecutive liver transplantations performed at Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) from November 2009 to November 2011. Surveillance cultures were performed on a weekly basis, starting on the day of the LT until the hospital discharge or 60 days after the LT. We collected surveillance cultures through swab from oropharynx (or tracheal secretion), axillary and inguinal rectal sites. We surveyed the following bacteria: carbapenem-resistant A. baumanni, P. aeruginosa, Enterobacteriaceae, ESBL-producing K. pneumoniae, and E. coli. The strains isolated from surveillance culture were compared to strains isolated from clinical cultures through PFGE. The risk factor analysis was performed for each type of MDR bacterium for risk of colonization and infection. The statistical analysis was carried out for dichotomous variables using chi-square tests or Fisher\'s exact tests when appropriate; Mann-Whitney tests were used for continuous variable and step-wise logistic regression was used for multivariate analysis. The survival rate analysis was performed using Cox regression. The significant value of P was 0.05. During the study period, 229 liver transplantations were performed in 202 patients and we analyzed 214 LT performed in 195 patients. The main baseline disease that warranted LT was virus C cirrhosis, 33%. 110 (56.4%) patients developed healthcare-associated infections after the LT and a total of 201 infections were identified; 84 (76.3%) patients had MDR GNB isolated from clinical cultures related to HAI. Surgical wounds (31%) and primary bloodstream (27%) were the most prevalent infection sites. The risk factors for HAI by MDR GNB after the LT were: re-transplantation, volume of blood units transfused during the LT surgery, colonization by MDR GNB before the LT, prolonged time of ICU stay, and prolonged time of cold ischemia. 105 patients acquired MDR GNB during the first 60 days after the LT; the only risk factor identified was the prolonged use of urinary drain. The clonal analysis showed that strains isolated in the period before the LT were closely related to strains isolated from clinical culture after the LT for carbapenem-resistant A. baumannii e K. pneumoniae. The infections by MDR GNB have been shown to increase the risk of death in the first 60 days after LT

Introdução: As polimixinas são consideradas as opções terapêuticas de resgate para o tratamento das infecções de corrente sanguínea (ICS) por bacilos Gram-negativos (BGN) com resistência aos carbapenens (CR) e a combinação com outro antimicrobiano tem sido utilizada apesar da falta de evidência clínica para esta prática. Objetivo: Avaliar o uso de polimixina B intravenosa em monoterapia e em combinação com outro antimicrobiano para ICS por BGN CR. Pacientes e Métodos: Foi um estudo de coorte retrospectivo em um hospital terciário, incluindo 99 pacientes. A comparação dos tipos terapias foi através do propensity score. Resultados: A mortalidade global em 30 dias foi de 43,4%: 40,7% (24 de 59) e 47,5% (19 de 40), p=0,51, em pacientes que receberam combinação e monoterapia, respectivamente. A sepse grave/choque séptico no dia da ICS, alta pontuação do escore de bacteremia de Pitt e a presença de neoplasia como doença de base foram, independentemente, associados a maior mortalidade em 30 dias no modelo de regressão de Cox. A terapia combinada não foi significativamente associada a este resultado (hazard ratio, 0,70; intervalo de confiança de 95%, 0,36-1,36); p=0,29). Apesar de não ser significativa, houve uma tendência a um efeito benéfico da associação em pacientes com ICS por BGN CR da família Enterobacteriaceae. Não houve diferença no desenvolvimento de insuficiência renal aguda em pacientes que receberam terapia de combinação comparado com os que receberam monoterapia. Conclusão: Não houve diferença na mortalidade em 30 dias em pacientes com ICS por BGN CR tratados com polimixina B em combinação com outro antimicrobiano ou em monoterapia. A prática rotineira de combinar um segundo antibiótico em esquemas baseados em polimixinas, especialmente, se a bactéria apresenta resistência in vitro ao carbapenem, ainda necessita estudos clínicos adicionais. / Background: Polymyxins are usually the last resort therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria (CR GNB) bloodstream infections (BSIs), combination with another antimicrobial has been used despite the lack of clinical evidence supporting such practice. Objetive: We aimed to assess the use of intravenous polymyxin B in combination with another antimicrobial in comparison with polymyxin B as a single drug for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. Patient and methods: We compared combination versus monotherapy with polymyxin B for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. It was a retrospective cohort study at a tertiary-hospital including 99 patients. Results: The overall 30-day mortality was 43.4%: 40.7% (24 of 59) and 47.5% (19 of 40), P=0.51, in patients receiving combination and monotherapy, respectively. Severe sepsis/ septic shock at BSI onset higher Pitt bacteremia score and neoplasia were independently associated with higher 30-day mortality in a Cox-regression model. Combination therapy was not significantly associated with this outcome (Hazard Ratio, 0.70; 95% confidence interval, 0.36-1.36); P=0.29). Although not significant, there was a tendency to a beneficial effect of combination in patients with Enterobacteriaceae CR GNB BSIs. There was no difference in development of AKI in patients receiving combination therapy compared to those receiving monotherapy. Conclusions: There was no difference in 30-day mortality in patients with CR GNB BSIs treated with polymyxin B in combination with another antimicrobial compared with polymyxin B alone. The routine practice of combining a second antibiotic in polymyxins-based regimes, especially if the bacteria present in vitro resistance to the agent, still lacks support from clinical studies.

Introdução: As polimixinas são consideradas as opções terapêuticas de resgate para o tratamento das infecções de corrente sanguínea (ICS) por bacilos Gram-negativos (BGN) com resistência aos carbapenens (CR) e a combinação com outro antimicrobiano tem sido utilizada apesar da falta de evidência clínica para esta prática. Objetivo: Avaliar o uso de polimixina B intravenosa em monoterapia e em combinação com outro antimicrobiano para ICS por BGN CR. Pacientes e Métodos: Foi um estudo de coorte retrospectivo em um hospital terciário, incluindo 99 pacientes. A comparação dos tipos terapias foi através do propensity score. Resultados: A mortalidade global em 30 dias foi de 43,4%: 40,7% (24 de 59) e 47,5% (19 de 40), p=0,51, em pacientes que receberam combinação e monoterapia, respectivamente. A sepse grave/choque séptico no dia da ICS, alta pontuação do escore de bacteremia de Pitt e a presença de neoplasia como doença de base foram, independentemente, associados a maior mortalidade em 30 dias no modelo de regressão de Cox. A terapia combinada não foi significativamente associada a este resultado (hazard ratio, 0,70; intervalo de confiança de 95%, 0,36-1,36); p=0,29). Apesar de não ser significativa, houve uma tendência a um efeito benéfico da associação em pacientes com ICS por BGN CR da família Enterobacteriaceae. Não houve diferença no desenvolvimento de insuficiência renal aguda em pacientes que receberam terapia de combinação comparado com os que receberam monoterapia. Conclusão: Não houve diferença na mortalidade em 30 dias em pacientes com ICS por BGN CR tratados com polimixina B em combinação com outro antimicrobiano ou em monoterapia. A prática rotineira de combinar um segundo antibiótico em esquemas baseados em polimixinas, especialmente, se a bactéria apresenta resistência in vitro ao carbapenem, ainda necessita estudos clínicos adicionais. / Background: Polymyxins are usually the last resort therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria (CR GNB) bloodstream infections (BSIs), combination with another antimicrobial has been used despite the lack of clinical evidence supporting such practice. Objetive: We aimed to assess the use of intravenous polymyxin B in combination with another antimicrobial in comparison with polymyxin B as a single drug for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. Patient and methods: We compared combination versus monotherapy with polymyxin B for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. It was a retrospective cohort study at a tertiary-hospital including 99 patients. Results: The overall 30-day mortality was 43.4%: 40.7% (24 of 59) and 47.5% (19 of 40), P=0.51, in patients receiving combination and monotherapy, respectively. Severe sepsis/ septic shock at BSI onset higher Pitt bacteremia score and neoplasia were independently associated with higher 30-day mortality in a Cox-regression model. Combination therapy was not significantly associated with this outcome (Hazard Ratio, 0.70; 95% confidence interval, 0.36-1.36); P=0.29). Although not significant, there was a tendency to a beneficial effect of combination in patients with Enterobacteriaceae CR GNB BSIs. There was no difference in development of AKI in patients receiving combination therapy compared to those receiving monotherapy. Conclusions: There was no difference in 30-day mortality in patients with CR GNB BSIs treated with polymyxin B in combination with another antimicrobial compared with polymyxin B alone. The routine practice of combining a second antibiotic in polymyxins-based regimes, especially if the bacteria present in vitro resistance to the agent, still lacks support from clinical studies.

Introdução: As polimixinas são consideradas as opções terapêuticas de resgate para o tratamento das infecções de corrente sanguínea (ICS) por bacilos Gram-negativos (BGN) com resistência aos carbapenens (CR) e a combinação com outro antimicrobiano tem sido utilizada apesar da falta de evidência clínica para esta prática. Objetivo: Avaliar o uso de polimixina B intravenosa em monoterapia e em combinação com outro antimicrobiano para ICS por BGN CR. Pacientes e Métodos: Foi um estudo de coorte retrospectivo em um hospital terciário, incluindo 99 pacientes. A comparação dos tipos terapias foi através do propensity score. Resultados: A mortalidade global em 30 dias foi de 43,4%: 40,7% (24 de 59) e 47,5% (19 de 40), p=0,51, em pacientes que receberam combinação e monoterapia, respectivamente. A sepse grave/choque séptico no dia da ICS, alta pontuação do escore de bacteremia de Pitt e a presença de neoplasia como doença de base foram, independentemente, associados a maior mortalidade em 30 dias no modelo de regressão de Cox. A terapia combinada não foi significativamente associada a este resultado (hazard ratio, 0,70; intervalo de confiança de 95%, 0,36-1,36); p=0,29). Apesar de não ser significativa, houve uma tendência a um efeito benéfico da associação em pacientes com ICS por BGN CR da família Enterobacteriaceae. Não houve diferença no desenvolvimento de insuficiência renal aguda em pacientes que receberam terapia de combinação comparado com os que receberam monoterapia. Conclusão: Não houve diferença na mortalidade em 30 dias em pacientes com ICS por BGN CR tratados com polimixina B em combinação com outro antimicrobiano ou em monoterapia. A prática rotineira de combinar um segundo antibiótico em esquemas baseados em polimixinas, especialmente, se a bactéria apresenta resistência in vitro ao carbapenem, ainda necessita estudos clínicos adicionais. / Background: Polymyxins are usually the last resort therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria (CR GNB) bloodstream infections (BSIs), combination with another antimicrobial has been used despite the lack of clinical evidence supporting such practice. Objetive: We aimed to assess the use of intravenous polymyxin B in combination with another antimicrobial in comparison with polymyxin B as a single drug for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. Patient and methods: We compared combination versus monotherapy with polymyxin B for CR GNB BSIs, adjusting for a propensity score for indication of combination therapy. It was a retrospective cohort study at a tertiary-hospital including 99 patients. Results: The overall 30-day mortality was 43.4%: 40.7% (24 of 59) and 47.5% (19 of 40), P=0.51, in patients receiving combination and monotherapy, respectively. Severe sepsis/ septic shock at BSI onset higher Pitt bacteremia score and neoplasia were independently associated with higher 30-day mortality in a Cox-regression model. Combination therapy was not significantly associated with this outcome (Hazard Ratio, 0.70; 95% confidence interval, 0.36-1.36); P=0.29). Although not significant, there was a tendency to a beneficial effect of combination in patients with Enterobacteriaceae CR GNB BSIs. There was no difference in development of AKI in patients receiving combination therapy compared to those receiving monotherapy. Conclusions: There was no difference in 30-day mortality in patients with CR GNB BSIs treated with polymyxin B in combination with another antimicrobial compared with polymyxin B alone. The routine practice of combining a second antibiotic in polymyxins-based regimes, especially if the bacteria present in vitro resistance to the agent, still lacks support from clinical studies.

[pt] As infecções por bactérias Gram-negativas Resistentes aos Carbapenêmicos (CR-GNB) estão entre as maiores preocupações atuais da área da, especialmente em Unidades de Terapia Intensiva (UTI), e podem estar associadas ao aumento do tempo de hospitalização, morbidade, custos e mortalidade. Esta tese tem como objetivo desenvolver uma abordagem abrangente e sistemática aplicando técnicas de aprendizado de máquina para construir modelos para prever a aquisição de CR-GNB em UTIs de hospitais brasileiros. Propusemos modelos de triagem para detectar pacientes que não precisam ser testados e um modelo de risco que estima a probabilidade de pacientes de UTI adquirirem CR-GNB. Aplicamos métodos de seleção de características, técnicas de aprendizado de máquina e estratégias de balanceamento para construir e comparar os modelos. Os critérios de desempenho escolhidos para avaliação foram Negative Predictive Value (NPV) and Matthews Correlation Coefficient (MCC) para o modelo de triagem e Brier score e curvas de calibração para o modelo de risco de aquisição de CR-GNB. A estatística de Friedman e os testes post hoc de Nemenyi foram usados para testar a significância das diferenças entre as técnicas. O método de ganho de informações e a mineração de regras de associação avaliam a importância e a força entre os recursos. Nosso banco de dados reúne dados de pacientes, antibióticos e microbiologia de cinco hospitais brasileiros de 8 de maio de 2017 a 31 de agosto de 2019, envolvendo pacientes hospitalizados em 24 UTIs adultas. As informações do laboratório foram usadas para identificar todos os pacientes com teste positivo ou negativo para CR-GNB, A. baumannii, P. aeruginosa ou Enterobacteriaceae. Há um total de 539 testes positivos e 7.462 negativos, resultando em 3.604 pacientes com pelo menos um exame após 48 horas de hospitalização. Dois modelos de triagem foram propostos ao tomador de decisão do hospital. O modelo da floresta aleatória reduz aproximadamente 39 por cento dos testes desnecessários e prevê corretamente 92 por cento dos positivos. A rede neural evita testes desnecessários em 64 por cento dos casos, mas 24 por cento dos testes positivos são classificados incorretamente. Os resultados mostram que as estratégias de amostragem tradicional, SMOTEBagging e UnderBagging obtiveram melhores resultados. As técnicas lineares como Regressão Logística com regularização apresentam bom desempenho e são mais interpretáveis; elas não são significativamente diferentes dos classificadores mais complexos. Para o modelo de risco de aquisição, o Centroides Encolhidos Mais Próximos é o melhor modelo com um Brier score de 0,152 e um cinto de calibração aceitável. Desenvolvemos uma validação externa a partir de 624 pacientes de dois outros hospitais da mesma rede, encontrando bons valores de Brier score (0,128 and 0,079) em ambos. O uso de antibióticos e procedimentos invasivos, principalmente ventilação mecânica, são os atributos mais importantes e significativos para a colonização ou infecção de CR-GNB. Os modelos preditivos podem ajudar a evitar testes de rastreamento e tratamento inadequado em pacientes de baixo risco. Políticas de controle de infecção podem ser estabelecidas para controlar a propagação dessas bactérias. A identificação de pacientes que não precisam ser testados diminui os custos hospitalares e o tempo de espera do laboratório. Concluímos que nossos modelos apresentam bom desempenho e parecem suficientemente confiáveis para prever um paciente com esses patógenos. Esses modelos preditivos podem ser incluídos no sistema hospitalar. A metodologia proposta pode ser replicada em diferentes ambientes de saúde. / [en] Infections by Carbapenem-Resistant Gram-negative bacteria (CR-GNB) are among the most significant contemporary health concerns, especially in intensive care units (ICUs), and may be associated with increased hospitalization time, morbidity, costs, and mortality. This thesis aims to develop a comprehensive and systematic approach applying machine-learning techniques to build models to predict the CR-GNB acquisition in ICUs from Brazilian hospitals. We proposed screening models to detect ICU patients who do not need to be tested and a risk model that estimates ICU patients probability of acquiring CR-GNB. We applied feature selection methods, machine-learning techniques, and balancing strategies to build and compare the models. The performance criteria chosen to evaluate the models were Negative Predictive Value (NPV) and Matthews Correlation Coefficient (MCC) for the screening model and Brier score and calibration curves for the CR-GNB acquisition risk model. Friedman s statistic and Nemenyi post hoc tests are used to test the significance of differences among techniques. Information gain method and association rules mining assess the importance and strength among features. Our database gathers the patients, antibiotic, and microbiology data from five Brazilian hospitals from May 8th, 2017 to August 31st, 2019, involving hospitalized patients in 24 adult ICUs. Information from the laboratory was used to identify all patients with a positive or negative test for carbapenem-resistant GNB, A. baumannii, P. aeruginosa, or Enterobacteriaceae. We have a total of 539 positive and 7,462 negative tests, resulting in 3,604 patients with at least one exam after 48 hours hospitalized. We proposed to the hospital s decision-maker two screening models. The random forest s model would reduce approximately 39 percent of the unnecessary tests and correctly predict 92 percent of positives. The Neural Network model avoids unnecessary tests in 64 percent of the cases, but 24 percent of positive tests are misclassified as negatives. Our results show that the sampling, SMOTEBagging, and UnderBagging approaches obtain better results. The linear techniques such as Logistic Regression with regularization give a relatively good performance and are more interpretable; they are not significantly different from the more complex classifiers. For the acquisition risk model, the Nearest Shrunken Centroids is the best model with a Brier score of 0.152 and a calibration belt acceptable. We developed an external validation of 624 patients from two other hospitals in the same network, finding good Brier score (0.128 and 0.079) values in both. The antibiotic and invasive procedures used, especially mechanical ventilation, are the most important attributes for the colonization or infection of CR-GNB. The predictive models can help avoid screening tests and inappropriate treatment in patients at low risk. Infection control policies can be established to control these bacteria s spread. Identifying patients who do not need to be tested decreases hospital costs and laboratory waiting times. We concluded that our models present good performance and seem sufficiently reliable to predict a patient with these pathogens. These predictive models can be included in the hospital system. The proposed methodology can be replicated in different healthcare settings.

Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.

Após o surgimento e disseminação das β-lactamases de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenemeertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha devido à estabilidade apresentada contra estas enzimas. A desvantagem destes antibióticos é a sua capacidade de induzir resistência aos β-lactâmicos e a outros antibióticos quimicamente não relacionados. O imipenem tem favorecido a indução de cefalosporinases cromossômicas (AmpC) e também tem sido relacionado, in vivo, com a seleção de mecanismos intrínsecos de resistência, contribuindo com o perfil multi -droga resistente (MDR). Esse perfil é freqüentemente associado à diminuição da permeabilidade por alteração na síntese de porinas em conjunto com um aumento da atividade de bombas de efluxo, as quais não permitem o estabelecimento de uma concentração ativa do antibiótico no interior da célula bacteriana. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o estabelecimento do perfil MDR em enterobactérias provenientes de isolados clínicos em função da exposição a diferentes concentrações de imipenemin vitro. A seleção do grupo das amostras estudadas foi feito por meio da determinação do perfil de sensibilidade dos isolados, tipagem molecular e ensaio de hidrólise de Imipenem. Nos isolados selecionados para a indução foi realizada numa etapa inicial (etapa basal) a análise de porinas de membrana externa por SDS-PAGE e o estudo de genes codificadores de β-lactamases pela técnica de PCR. O estudo do estabelecimento do perfil MDR foi feito por meio de passagens sucessivas das amostras em meio contendo concentrações sub-inibitórias de imipenem seguido de análise fenotípica (CIM e acúmulo do antibiótico intracelular e SDS-PAGE), e a análise da expressão gênica de genes associados a permeabilidade de membrana (ompC, ompF eAcrA) e genes reguladores(marA e ompR). Após a indução com o imipenem, 77% dos isolados induzidos aumentaram a CIM para os carbapenêmicos, mudando assim o perfil de resistência observado na etapa basal Também foi afetado o perfil de resistência para outros antibióticos não relacionados a β-lactámicos, porém numa percentagem menor. Com relação à alteração da permeabilidade, a perda de porina foi observada apenas para um isolado, no entanto a diminuição na expressão gênica de Omp36 foi significativa desde o começo da indução. A expressão da bomba de efluxoAcrAB foi afetada pela indução com imipenem, aumentando significativamente a expressão de AcrA, enquanto os reguladores estudados, MarA e OmpR tiveram a sua expressão induzida pelo imipenem. Foi possível observar também associação do nível de expressão gênica do regulador MarA com a expressão de AcrA,porém não foi possível observar uma associação estatisticamente significativa deste regulador com o perfil de expressão de OMPs. A indução de OmpR foi associado com um aumento da expressão de RNAm de Omp35, já para Omp36 foi possível observar apenas uma tendência na repressão deste gene. O estudo da resposta destes genes reguladores e determinantes de resistência, em resposta à exposição ao com o imipenem in vitro, permitiu reportar o comportamento molecular da bactéria numa resposta adaptativa no estagio inicial do estabelecimento do fenótipo MDR. A utilização de isolados clínicos com diversos determinantes de resistência permitiu observar a variabilidade nas respostas adaptativas das enterobacterias, o que é fundamental para a compreensão dos mecanismos de adaptação da bactéria e sua contribuição na falha terapêutica. / After emergence and broad dissemination of extended spectrum β-lactamases into the Enterobacteriaceae family, the carbapenemic antibiotics (imipenem, meropenem and ertapenem) have been considered the chosen therapy in the treatment of nosocomial infections by the stability that these antibiotics show to these enzymes. The disadvantage of carbapenems is theirs capacity to induce resistance against β-lactamics and to other chemically unrelated antibiotics. The imipenem has been shown to induce chromosomal cephalosporinases (AmpC) and it was also related, in vivo, with the selection of intrinsic mechanism leading to multi-drug resistance profile (MDR). This profile is usually associated with membrane impermeability due to reduced outer membrane porin synthesis with an incremented activity of efflux pumps, which results in a reduced concentration of antibiotics inside the bacteria. This study aimed to evaluate the establishment of the MDR profile in Enterobacteriaceae from clinical isolates by exposure to different concentrations of imipenem in vitro. The selection of the study group was performed by determination of antibiotic susceptibility profile,molecular typing and hydrolysis assay of imipenem. In the selected isolates submitted to induction, in an initial step (baseline), was performed the outer membrane porin analysis by SDS-PAGE and the gene-specific amplification of B-lactamase enzymes by PCR. The study of the establishment of MDR was performed by progressive passages with subclinical concentrations of imipenem, followed each one by the evaluation of phenotypic profile (MIC, accumulation antibiotic in celland SDS-PAGE) and gene expression analysisof genes related to membrane permeability (ompC, ompF and acrA) and regulatory genes(MarA and ompR). After induction with imipenem, 77 % of the isolates increased the MIC for the carbapenems, changing the resistance profile at the baseline. In a lesser percentage, the resistance profile to other β-lactams-unrelated antibiotics was also affected. Loss of porin was observed only for an isolated, however a significantly decreased Omp36 mRNA expression was observed from the start of induction. The expression of the efflux pump AcrAB ,was also affected by the imipenem induction, significantly increasing the AcrA gene expression, whereas the studied regulatory genes,MarA and OmpR,were induced by the imipenem. It was also possible to observe an association between the expression of the regulator MarA and the expression of AcrA, nevertheless no association was observed between this regulator and OMPs . OmpR induction was associated with an increased Omp35mRNA expression, however only a trend for the repression of Omp36was observed. The study of the response of these regulatory genes and genetic determinants of resistance, in response to the imipenem exposure in vitro, allowed to report the molecular behavior of the bacteria in an adaptive response in the initial stage of the establishment of a MDR phenotype. The use of clinical isolates with diverse resistance determinants allowed observing the variability in adaptive responses in enterobacteria, which is important to understand the adaptive mechanisms of bacteria to this antibiotic, the involvement in the emergence of the MDR profile and its contribution to the treatment failure.

Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.