A rejeição é uma das principais complicações após transplante cardíaco (TC). A biópsia endomiocárdica do ventrículo direito (BEVD) continua a ser o padrão-ouro para seu diagnóstico. Há uma necessidade de alternativas não invasivas que permitam um diagnóstico seguro e precoce de rejeição cardíaca, antes do início dos sintomas clínicos. A ecocardiografia com speckle tracking (EST) permite a análise da dinâmica de contração ventricular, possibilitando a detecção precoce de disfunção miocárdica. Os objetivos deste estudo foram comparar os parâmetros da dinâmica ventricular obtidos com a EST em pacientes transplantados e indivíduos não transplantados cardíacos e avaliar o valor da EST e da dosagem sérica de troponina I e peptídeo cerebral natriurético (BNP), como ferramentas não invasivas para a detecção precoce de rejeição celular aguda significativa (RCA) após o TC. Entre janeiro de 2014 e novembro de 2017, foram estudados, prospectivamente, 49 pacientes transplantados cardíacos com função sistólica normal, tanto do ventrículo esquerdo (VE) como do direito (VD) submetidos à BEVD para vigilância ou por suspeita clínica de rejeição. A RCA foi definida como >= 2R pelos critérios da Sociedade Internacional para Transplante de Coração e Pulmão. Quarenta e nove indivíduos saudáveis pareados por idade e sexo constituíram o grupo controle. Todos os pacientes foram submetidos à ecocardiografia convencional e à EST. Os pacientes transplantados foram submetidos, horas antes da BEVD, à dosagem de troponina I e BNP séricos. Parâmetros ecocardiográficos clássicos, strain e strain rate longitudinal global, radial e circunferencial do VE, além de strain longitudinal da parede livre do VD (SLPL-VD) foram analisados. Os 49 pacientes transplantados cardíacos (média etária 45,2 ± 11,5 anos, 28 homens) foram submetidos a 66 biópsias entre 6-12 meses após o TC. A RCA foi detectada em 17 (26%) e ausência de RCA em 49 (74%) biópsias. Strain e strain rate longitudinal, circunferencial e radial globais do VE e SL-PLVD foram significantemente menores, em valores absolutos, nos grupos dos transplantados cardíacos do que no grupo controle. O SL-PLVD apresentou valor absoluto menor no grupo com RCA do que no sem RCA (-18,28 ± 4,8% versus -22,11 ± 2,9%; p < 0,001). Um valor de SL-PLVD < 17,57% (valor absoluto) teve sensibilidade de 71%, especificidade de 90%, valor preditivo positivo de 75%, acurácia de 84% e valor preditivo negativo de 88% para detecção de RCA. A dosagem da troponina I foi significantemente mais alta em pacientes com RCA (p < 0,01). A mediana para este grupo foi 0,19 [intervalo interquartil 0,09-1,31 ng/mL], versus 0,05 [intervalo interquartil, 0,01-0,18ng/mL] para o grupo sem RCA. Na análise multivariada, o SL-PLVD foi o único preditor independente de RCA com razão de chance de 1,70 (intervalo de confiança de 95% = 1,17- 2,48); p = 0,006. Concluiu-se que o SL-PLVD derivado da EST foi marcador sensível e específico de RCA. Estes dados sugerem que esta técnica é adequada para detectar alterações na deformação ventricular direita durante um episódio de RCA / Rejection is a major complication after heart transplantation (HT). Right ventricular endomyocardial biopsy (EMB) remains the gold standard for diagnosis of rejection. There is a need for non-invasive alternatives that allow for a safe and early diagnosis of cardiac rejection prior to the onset of clinical symptoms. Speckle tracking echocardiography (STE) enables the analysis of left and right ventricular contraction dynamics, thus allowing for the early detection of myocardial dysfunction. The aims of the present study were to compare ventricular dynamics parameters obtained by STE in heart transplanted patients and control individuals. We also aimed to assess the value of STE, troponin I, and brain natriuretic peptide (BNP) serum levels as noninvasive tools for the early detection of significant acute cellular rejection (ACR) after HT. From January 2014 to November 2017, we prospectively studied 49 transplanted patients with normal left and right ventricular systolic function, who had undergone EMB for either surveillance or clinical suspicion of rejection. ACR was defined as >= 2R graded according to the revised International Society for Heart and Lung Transplantation by EMB. A total of 49 age- and sex-matched healthy individuals formed the control group. All studied patients underwent conventional echocardiography with the analysis of STE. The transplanted group also had their serum troponin I and BNP levels measured hours before undergoing EMB. Classic echocardiographic parameters left ventricular global longitudinal strain (LV-GLS), radial and circumferential strain and strain rate, and right ventricular free wall longitudinal strain (RV-FWLS) were analyzed. The 49 heart transplanted patients (mean age 45.2 ± 11.5 years, 28 men) underwent 66 biopsies, 6-12 months after HT. ACR was detected in 17 (26%) and no ACR in 49 (74%) of biopsies. LV-GLS, circumferential and radial strain and strain rate and RVFWLS values were significantly lower in heart transplant group than in control group. RV-FWLS was lower (absolute value) in the group with ACR than in the group without ACR (-18.28 ± 4.8% versus -22.11 ± 2.9%; p < 0.001). A RVFWLS < 17.57% had 71% sensitivity, 90% specificity, 75% positive predictive value, 84% accuracy, and 88% negative predictive value for detection of ACR. The troponin I level was significantly higher in patients with ACR (p < 0.01). The median value for this group was 0.19 [interquartile interval 0.09-1.31 ng/mL] vs. 0.05 [interquartile interval 0.01-0.18 ng/mL] for the group without ACR. In the multivariate analysis, RV-FWLS was the only independent predictor of ACR, with odds ratio of 1.70 (CI 95% = 1.17-2.48); p=0.006. We concluded that STE-derived RV-FWLS was a sensitive and specific marker of ACR. Our data suggest that this is a suitable technique for noninvasive detection of changes in the right ventricular deformation during an episode of ACR

Contexte : Au cours de la dernière décennie, le nombre de personnes en attente d’une transplantation cardiaque a augmenté d’environ 25%, tandis que le nombre de greffes effectuées chaque année est resté stable. Le taux de décès des patients en attente d’une greffe cardiaque est d’environ 15-20%. Le don d’organe suite à un décès cardiocirculatoire (DDC) est une alternative au don après décès neurologique (DDN) qui a permis d’augmenter le nombre d’organes disponibles comme les poumons, les reins et les foies. Compte tenu de la survenue d’une mort cardiovasculaire dans les protocoles DDC, le cœur est rarement greffé à cause des dommages infligés durant la période d’ischémie chaude. Notre équipe a précédemment démontré que l’utilisation du Celastrol, ainsi que notre analogue synthétique inhibiteur de la HSP90 ont des effets cardioprotecteurs, quand administrés au moment de la reperfusion dans des modèles in vitro de culture cellulaire et ex vivo dans des cœurs de rats montés sur le système de perfusion Langendorff. L’objectif est d’évaluer les mécanismes cardioprotecteurs rapides d’une nouvelle formulation de l’inhibiteur HSP90, et de comprendre l’efficacité de ce nouveau composé synthétique sur deux lignées de cellules : les cardiomyoblastes H9c2 issus de rats et les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (iPSC-CMs). Méthodes/Résultats : Les cellules H9c2 et iPSC-CMs ont été cultivées. La signalisation cellulaire a été analysée par western blot pour évaluer le niveau d’activation de ces différentes voies. Suite à l’optimisation des conditions pour les cellules iPSC-CMs, les deux lignées cellulaires ont été mises en condition ischémique (sans glucose, 95% N2, 5% CO2) durant la nuit, puis reperfusées, en conditions normales, avec différentes concentrations de l’inhibiteur HSP90. La viabilité cellulaire ainsi que l’ouverture des pores mitochondriaux (mPTP) ont été évaluées à l’aide de kits d’analyses, la production de radicaux libres d’oxygène à l’aide de kits de fluorescence et l’expression des ARN messagers de gènes antioxydants à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Les résultats ont montré une augmentation de l’activation des voies cytoprotectrices quand les deux lignées cellulaires étaient traitées à la concentration 10-6M du composé sans stress 4 ischémique : augmentation de HO-1 and HSP-70 dans les 30 premières minutes et AKT et ERK après 1 heure de traitement et 3 heures de récupération. Contrairement à nos attentes, le traitement au moment de la reperfusion à la concentration 10-6M a montré une diminution de la viabilité des cellules, alors que la concentration 10-7M l’a augmenté. À une concentration de 10- 7M, il y a eu diminution de la production de radicaux libres comparativement au groupe témoin. Comme attendu, cette concentration a aussi démontré une diminution de l’ouverture des mPTP. Tous ces résultats ont été observés, autant dans les cellules humaines que celles de rats. Une évaluation préliminaire de l’expression des gènes antioxydants dans les cellules H9c2 a seulement montré une augmentation de l’expression des gènes CAT et HO-1. Conclusion : Notre groupe de recherche a précédemment démontré l’efficacité des composés issus du Celastrol sur la réduction des dommages myocardiques dus à la reperfusion dans les modèles d’ischémie, incluant l’infarctus du myocarde et la donation après décès cardiocirculatoire. Ces expériences ont montré les effets bénéfiques du nouveau composé synthétique sur l’expression des gènes antioxydants, et sur l’activation d’une série de voies cytoprotectrices permettant la stabilisation de la membrane mitochondriale, réduisant aussi la production de radicaux libres, et améliorant ultimement la survie cellulaire. Des études supplémentaires sont en cours afin d’améliorer la compréhension des modes d’action, des mécanismes et des dosages optimaux du médicament, ce qui nous permettra de commencer les essais sur animaux dans le but d’introduire cette molécule en clinique dans le contexte de don d’organes. / Background: During the last decade, the number of people waiting for a cardiac transplantation has increased by about 25%, while the number of yearly transplant surgeries performed has remained steady. The death rate of patients awaiting heart transplant is about 15-20%. Organ donation after circulatory death (DCD) is an alternative to donation after neurological death (DND) that has allowed to increase the number of available organs like lungs, livers, and kidneys. However, because of the cardiac death in DCD protocols, the heart is rarely used because of the injuries suffered by the warm ischemia period. Our group has previously shown that Celastrol, along with a synthetic HSP90 inhibitor analog, have cardioprotective effects when given as postconditioning agents at the moment of reperfusion in an in vitro model on cellular cultures and an ex vivo model on rat hearts mounted on a Langendorff perfusion system. The objective is to evaluate the rapid cardioprotective mechanisms of a novel formulation of the HSP90 inhibitor compound, and to understand the efficacy of this new synthetic compound on two cell lines: rat H9c2 cardiomyoblasts and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSCCMs). Methods/Results: H9c2 rat cardiomyoblasts and human iPSC-CMs were cultured. Cell signaling was analyzed by western blot to evaluate pathway activations. Both cell lines were put in ischemic conditions (no glucose, 95% N2, 5% CO2) overnight, then reperfused (normal conditions) with different concentrations of HSP90i after optimizing the human iPSC-CMs’ stress experiment. Cell viability and mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening were evaluated using assays, oxygen-free radical production by fluorescence assay and antioxidant gene messenger RNA expression via polymerase chain reaction (PCR). Results showed an increase in cytoprotective pathway activation when both cell lines were treated with 10-6M of the compound without any stress: HO-1 and HSP-70 in the first 30 minutes while AKT and ERK after 1 hour of treatment and 3 hours of recuperation. Interestingly, treatment with the compound at 10-6M at the moment of reperfusion showed decreased viability of the cells while 10-7M improved it. Free radical production was also decreased at a concentration of 10-7M 6 when compared to the baseline, and as expected, the compound also decreased mPTP opening. These results were seen in both human and rat cell lines. Preliminary evaluation of antioxidant gene expression in H9c2 cells only showed an increase in the expression of the cytoprotective CAT and HO-1 genes. Conclusion: Our research group has previously demonstrated the efficacy of Celastrol compounds in reducing reperfusion damage in myocardial ischemia models, including myocardial infarction and donation after circulatory death. These experiments have shown that the beneficial effects of this new synthetic compound include the expression of antioxidant genes and the launching of a series of cytoprotective pathways that stabilize the mitochondrial membrane, reduce free radical production, and improve cell survival. Additional studies to fully understand the mode of action, the mechanisms and the optimal dosages are underway to allow us to move to animal trials in order to ultimately introduce the molecule in the clinical field in the context of organ donation.

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est un problème majeur fréquemment rencontré chez les greffés cardiaques. Les inhibiteurs de la calcineurine, pierre angulaire de l’immunosuppression en transplantation d’organes solides, sont considérés comme une des principales causes de dysfonction rénale postgreffe. Plusieurs autres éléments tels que les caractéristiques démographiques, cliniques et génétiques du receveur contribuent également au phénomène, mais il demeure plutôt difficile de déterminer quels sont les patients les plus à risque de développer une IRC après la transplantation. Ainsi, la découverte de nouveaux marqueurs génétiques de dysfonction rénale pourrait un jour mener à l’individualisation de la thérapie immunosuppressive selon le profil génétique de chaque patient. Or, on ne connaît pas les opinions des greffés à l’égard des tests pharmacogénomiques et l’on ne sait pas si celles-ci diffèrent des opinions exprimées par les individus en bonne santé. Cette thèse de doctorat a donc pour objectifs : 1- De décrire l’évolution de la fonction rénale à très long terme après la transplantation et d’identifier les marqueurs démographiques et phénotypiques associés à l’IRC postgreffe cardiaque; 2- D’identifier les marqueurs génétiques associés à la néphrotoxicité induite par les inhibiteurs de la calcineurine; 3- D’évaluer et de comparer les attitudes des patients et des individus en bonne santé par rapport à l’intégration clinique potentielle des marqueurs pharmacogénomiques. Trois projets ont été réalisés pour répondre à ces questions. Le premier repose sur une analyse rétrospective de l’évolution de la fonction rénale chez les patients greffés au sein de notre établissement entre 1983 et 2008. Nous y avons découvert que le déclin de la fonction rénale se poursuit jusqu’à 20 ans après la transplantation cardiaque et que les facteurs de risque d’IRC incluent entre autres l’âge avancé, le sexe féminin, la dysfonction rénale prégreffe, l’hypertension, l’hyperglycémie et l’utilisation de la prednisone. Le deuxième projet est une étude pharmacogénomique s’intéressant aux déterminants génétiques de la néphrotoxicité induite par les inhibiteurs de la calcineurine. Elle nous a permis d’illustrer pour la première fois qu’un polymorphisme génétique lié à PRKCB (gène codant pour la protéine kinase C-β) est associé avec la fonction rénale des patients greffés cardiaques, alors que cela n’est probablement pas le cas pour les polymorphismes de TGFB1 (gène codant pour le transforming growth factor-β1). La troisième section de cette thèse rapporte les résultats d’un questionnaire dont le but était de comparer les attitudes envers les tests pharmacogénomiques parmi un groupe de personnes en bonne santé, de patients greffés cardiaques et de patients souffrant d’insuffisance cardiaque. Cette étude a démontré que, bien que l’enthousiasme pour la pharmacogénomique soit partagé par tous ces individus, les craintes liées à la confidentialité et aux répercussions potentielles sur l’emploi et les assurances sont plus prononcées chez les personnes en bonne santé. En résumé, les travaux issus de cette thèse ont révélé que l’identification précoce des patients greffés cardiaques les plus susceptibles de présenter une détérioration de la fonction rénale ainsi que l’adoption d’une approche thérapeutique individualisée reposant notamment sur les applications cliniques de la pharmacogénomique pourraient éventuellement permettre de freiner cette complication postgreffe. / Chronic kidney disease (CKD) is a major problem frequently observed in cardiac transplant recipients. Calcineurin inhibitors, which have become the cornerstone of immunosuppressive treatments in solid organ transplantation, are considered a major cause of post-transplant renal dysfunction. Several other factors such as recipients’ demographic, clinical and genetic characteristics also contribute to this phenomenon, but it remains rather difficult to determine which patients present the highest risk of CKD after transplantation. Discovery of new genetic markers of renal dysfunction could one day lead to individualization of immunosuppressive therapy according to each patient’s genetic profile. However, transplant patients’ opinions towards pharmacogenomic testing remain unknown, and it is unclear whether these differ from healthy individuals’ opinions. This doctoral thesis thus aims: 1- To describe the very long-term evolution of renal function after transplantation and to identify demographic and phenotypic markers associated with postheart transplant CKD; 2- To identify genetic markers associated with calcineurin inhibitor-induced nephrotoxicity; 3- To assess and to compare the attitudes of patients and healthy individuals concerning the potential integration of pharmacogenomic markers in clinical practice. Three projects have been conducted to answer these questions. The first one relies on a retrospective analysis of the evolution of renal function in patients who received a heart transplantation at our institution between 1983 and 2008. We discovered that deterioration of renal function continues up to 20 years after transplant and that risk factors of CKD include, among others, advanced age, female gender, pretransplant renal dysfunction, hypertension, hyperglycemia and use of prednisone. The second project is a pharmacogenomic study looking at genetic determinants of calcineurin inhibitor-induced nephrotoxicity. We were able to illustrate for the first time that a genetic polymorphism related to PRKCB (gene encoding protein kinase C-β) is associated with renal function in heart transplant patients, whereas it is probably not the case for polymorphisms in TGFB1 (gene encoding transforming growth factor-β1). The third section of this thesis reports the results of a questionnaire whose purpose was to compare the attitudes towards pharmacogenomic testing in a group of healthy volunteers, cardiac transplant recipients and heart failure patients. This study demonstrated that, although enthusiasm regarding pharmacogenomics is shared equally among these individuals, preoccupations related to confidentiality and potential impacts on employment and insurance are more important in healthy volunteers. In summary, the work presented in this thesis showed that early identification of heart transplant patients who are most likely to develop renal dysfunction as well as adoption of an individualized therapeutic approach involving clinical applications of pharmacogenomics could potentially help to prevent this post-transplant complication.

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