A series of fluorescein and rosamine derivatives have been prepared and their spectroscopical properties analyzed to determine their usefulness as donor and/or acceptors in "through-bond" energy transfer systems. Such new systems have been tailored to possess higher quantum yields, increased water solubility and higher pH independence. Some of these compounds have also been designed with handles for bioconjugation for use in intracellular imaging. The syntheses of most of these compounds have been optimized to afford higher yields in a multigram scale. Single molecule studies on a fluorescein/rosamine cassette are also reported.

Les intégrons sont des éléments génétiques bactériens. Découverts récemment dans le contexte clinique, ils sont présents dans le génome d’un certain nombre de bactéries provenant d’environnements très variés. Ils sont composés d’un gène codant une intégrase et d’une succession de cassettes de gènes. L’activité de l’intégrase permet l’acquisition, la perte ou le réarrangement des cassettes. Par ailleurs un promoteur permet l’expression des cadres de lecture contenus dans les cassettes de gène. Ainsi les intégrons sont à la fois des réservoirs de gènes et des systèmes d'expression de ces gènes. Dans le contexte clinique, ils sont connus pour être impliqués dans l'adaptation des bactéries pathogènes. Ils sont en effet capables d'acquérir et de diffuser des gènes conférant un avantage sélectif face à la pression exercée par l’usage des antibiotiques et des biocides, et par ailleurs d’être mobilisés afin d’être transférés horizontalement. Quelques études ont porté sur les intégrons en dehors des environnements cliniques. Elles ont permis de caractériser de nombreuses cassettes de gènes, sans toutefois en atteindre toute la diversité, à partir de bactéries ou de communautés bactériennes issues d’environnements soumis à différents niveaux de contaminations. Cependant, la diversité de l'intégrase a été peu étudiée, car le plus souvent les études se sont limitées aux séquences d’intégrons cliniques. Ainsi, les intégrons environnementaux sont encore mal connus et mal caractérisés. Les objectifs de ma thèse étaient de caractériser la diversité des intégrons environnementaux, avec un focus particulier sur les intégrases, à partir d’environnements soumis à des contaminations chimiques variables, dans le but d’évaluer le rôle possible des intégrons dans l'adaptation des bactéries face à des perturbations environnementales. Au cours de ces travaux, environ 800 séquences d’intégrases différentes, pour la plupart encore inconnues, ont été obtenues à partir de différents sédiments d’eau douce et côtiers. Des études in situ et en microcosmes, d’environnements d’eau douce ou de milieux côtiers, et avec différents types et niveaux de polluants, ont permis de mettre en évidence un impact des contaminations du milieu sur la diversité des intégrons, sur l’intégrase comme sur les cassettes de gène, de manière indépendante à la structure de la communauté bactérienne. Enfin, lors de cette thèse a été réalisée la caractérisation d’un intégron potentiellement adaptatif face à une pollution pétrolière, porteur de la séquence intIOPS mise en évidence et nommée par Lionel Huang lors de sa thèse. Finalement, les résultats obtenus lors de cette thèse ont apporté de nouveaux éléments qui viennent soutenir notre hypothèse principale que les intégrons environnementaux seraient impliqués dans l’adaptation des communautés bactériennes en réponse à la présence de contaminants dans les milieux non cliniques. / Integrons are bacterial genetic elements. Recently discovered in the clinical context, they are present in the genome of a number of bacteria from a variety of environments. They are composed of a gene encoding an integrase and a succession of gene cassettes. The activity of integrase allows the acquisition, loss or rearrangement of cassettes. Furthermore, a promoter allows expression reading frames contained in the gene cassettes. Thus, integrons are both reservoirs of genes and these gene expression systems. In the clinical context, they are known to be involved in the adaptation of pathogenic bacteria. They are able to acquire and disseminate genes conferring a selective advantage over the pressure exerted by the use of antibiotics and biocides, and also being mobilized to be transferred horizontally. Some studies have focused on integrons outside of clinical environments. They have characterized many gene cassettes, without however reaching the diversity, from bacteria or bacterial communities coming from environments with different levels of contamination. However, the diversity of integrase has been little studied, because the majority of studies are limited to clinical integron sequences. Thus, environmental integrons are still poorly characterized and their diversity are little understood. The objectives of my thesis were to characterize the diversity of environmental integrate with a particular focus on integrase, from environments with varying chemical contamination, to evaluate the possible role of integrating in adapting bacteria face environmental disturbances. In this work, approximately 800 different integrase sequences, mostly unknown, were obtained from various freshwater and coastal water sediments. Field studies and microcosms of freshwater or coastal environments, with different types and levels of pollutants allowed to demonstrate an impact of environmental contaminations on the integron diversity, whether on the integrase or the gene cassettes, independently to the bacterial community structure. Finally, in this thesis the characterization of a potentially adaptive integron facing an oil pollution were performed. This integron carrying the intIOPS sequence highlighted and named by Lionel Huang during his thesis. Finally, the results obtained in this thesis provide further elements which support our main hypothesis that environmental integrons would be involved in the adaptation of bacterial communities in response to the presence of contaminants in non- clinical settings.

L’imagerie moléculaire optique joue maintenant un rôle essentiel dans le diagnostic pré-clinique et le développement de médicaments. En effet, c’est un outil précieux dans la détection et le suivi de cellules vivantes que ce soit en utilisant de simples agents de marquage ou des sondes plus développées, dites « intelligentes » et activées uniquement par une interaction spécifique avec le bio-analyte ciblé. Ce travail de thèse a consisté à développer des outils synthétiques innovants afin d’optimiser les paramètres physico-chimiques et les propriétés optiques des sondes luminescentes. Ceci dans le but de répondre à la problématique complexe de l’imagerie dans le contexte in vivo. Nous avons notamment travaillé sur des aspects de pro-fluorescence et de chémiluminescence. De nouveaux pro-fluorophores à phénol basés sur une architecture originale de type bis-coumarinique ont été développés. De plus, nous avons mis en place une méthode d’hydrosolubilisation généralisable aux fluorophores à phénol de type coumarine et xanthène. Nos recherches en chémiluminescence ont permis la synthèse de nouveaux chémiluminophores couplés à des fluorophores organiques afin d‘augmenter l’efficacité d’émission de chémiluminescence dans le rouge. Enfin, nos travaux ont permis de mettre en place les premières « cassettes » chémiluminescentes basées sur une architecture de type 1,2-dioxétane. / Optical molecular imaging is now playing a pivotal role both in pre-clinical diagnosis and drug development. Indeed, this is a valuable tool for the real time detection and monitoring of living cells either through the use of structurally simple labels or more recently by means of sophisticated fluorescent probes, called “smart” probes and only activatable upon specific interaction with the targeted bio-analyte. The aim of this PhD work was the design of new synthetic tools aimed at optimizing physico-chemical and optical properties of fluorescent probes intended for challenging in vivo imaging applications. We have focused on the pro-fluorescence and chemiluminescence approaches. New phenol-based pro-fluorophores have been developed by using an original bis-coumarinic scaffold. In the context of the chemistry of fluorophores, we have also investigated a general method for the water-solubilisation of phenol-based fluorophore belonging to the coumarin and xanthene families. Our research in chemiluminescence has led the synthesis of new chemiluminophores covalently linked to fluorescent organic dyes aimed at increasing the emission efficiency in the red region of such chemiluminophores. Thus, the first chemiluminescent “energy transfer cassettes” based on a 1,2-dioxetane scaffold have been obtained.

Acinetobacter baumannii est un pathogène opportuniste qui prend une importance clinique croissante du fait de l’acquisition de multi-résistance. Nous avons étudié chez A. baumannii les caractéristiques et la régulation des intégrons de classe 1 (IM1) qui sont des systèmes génétiques favorisant l’acquisition, l’expression et la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques. Nous avons montré qu’il existe une prédominance des promoteurs des cassettes Pc fort in vivo dans une collection d’isolats cliniques et d’environnement hospitalier et in silico dans les IM1 chez A. baumannii. Nous avons aussi montré que l’expression des Pc chez A. baumannii est 4 fois plus faible que chez E. coli, quel que soit le variant de Pc. Deux explications sont possibles pour la sélection des Pc forts chez A. baumannii : (i) la nécessité d’avoir un niveau d’expression suffisant en clinique pour survivre à la pression de sélection antibiotique et (ii) la nécessité d’une régulation de l’expression de l’intégrase, représentant un coût biologique important. En effet, A. baumannii ne possède pas le système de répression par LexA existant chez E. coli. Nos résultats ouvrent le champ de l’étude de la régulation des IM1 chez A. baumannii et ainsi l’identification de nouvelles voies d’action pour lutter contre l’antibio-résistance / Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen of increasing clinical importance due to the acquisition of multi-resistance. We studied in A. baumannii the characteristics and regulation of class 1 integrons (IM1), which are genetic systems that favor the acquisition, expression and dissemination of antibiotic resistance genes. We have shown that there is a predominance of strong Pc cassette promoters, in vivo, in a collection of clinical and hospital environment isolates, and in silico, from A. baumannii IM1 published in NCBI. We have also shown that the expression of Pc in A. baumannii is 4-fold lower than in E. coli, regardless of the Pc variant. Explanations that can be raised for the selection of strong Pc in A. baumannii are: (i) the need for a sufficient level of antibiotic resistance expression to survive the selection pressure in clinical environment; and (ii) the need for regulation of the integrase expression, which is of significant biological cost. Indeed A. baumannii does not have the LexA repression system existing in E. coli. Our results open the field of the study of IM1 regulation in A. baumannii and thus the identification of new pathways to fight antibiotic resistance.

Depuis plusieurs années, il est devenu plus aisé de détecter et d’étudier les mécanismes biologiques in cellulo grâce aux techniques d’imagerie optique que sont la fluorescence, la bioluminescence et la chimiluminescence. Bien que la fluorescence soit la technique la plus employée de nos jours, la bioluminescence et la chimiluminescence, qui sont la conséquence d’une cascade de réactions (bio)chimiques, sont très étudiées depuis quelques décennies. En effet, elles permettent de contourner la source des problèmes rencontrés dans l’utilisation d’un fluorophore : la lumière excitatrice. La chimiluminescence est par conséquent une méthode de choix pour s’affranchir de l’auto-fluorescence tissulaire. Le 1,2-dioxétane est un des motifs chimiluminescent qui, par décomposition, peut générer un état excité sur un fluorophore auquel il est connecté, autorisant ainsi sa luminescence intrinsèque. Ainsi, le but de ce projet de thèse a été de développer et d’étudier des nouvelles sondes chémiluminescentes à motif 1,2-dioxétane à coeurs naphtolique et phénolique, compatibles avec le vivant pour une détection ciblée de complexes enzymatiques. La stratégie envisagée passait par la préparation d'une plateforme chimiluminescente comportant un motif 1,2-dioxétane thermiquement stable, sur laquelle il est possible de faire varier le déclencheur (i.e. possibilité d'adapter cette plateforme à l'analyte ou événement que l'on souhaite détecter) et d'accrocher un fluorophore NIR. Deux méthodes ont été tentées : d’une part une greffe d’une version hydrosoluble d’un fluorophore connu (i.e. le Nile red) pour réaliser un transfert d’énergie à travers les liaisons (i.e. TBET), et d’autre part un couplage à un complexe de lanthanide permettant un transfert d’énergie à travers l’espace (i.e. CRET). / Since several years, it is easier to exploit biological phenomena in cellulo through technologies dealing with bioimaging. This method gathers fluorescence, bioluminescence and chemiluminescence. Even though fluorescence is the most employed technic, bioluminescence and chemiluminescence, being the consequence of (bio)chemical reaction, have been widely studied for decades. In fact, they can avoid the main problems encountered in fluorophore use: exciting light. Chemiluminescence is thus the appropriate approach to avoid biological autofluorescence. 1,2-dioxetane is one of the moieties that, upon decomposition, can generate an excited state on a connected fluorophore, giving rise to its intrinsic luminescence. The aim of our project was to develop and study new 1,2-dioxetan chemiluminescent probes based on phenol or naphthol moieties, for targeted enzymatic complexes detection with in cellulo and in vivo bioimaging. The strategy relied on the synthesis of chemiluminescent scaffolds comprising thermally stable 1,2-dioxetan, on which the trigger and the connected NIR fluorophore can be easily diversified. Two methods have been attempted: 1) coupling to a water-soluble version of a known fluorophore (i.e. Nile red) allowing an energy transfer through bonds (i.e. TBET) 2) connection with a lanthanide complex giving rise to an energy transfer through space (i.e. CRET).

This research project reports on an empirical study on the suitability and feasibility of audio cassette lectures in solving the study problems of adult distance education students. Having reviewed relevant literature on the subject the researcher collected data through: (a) Empirical investigation by contituting a two-group (experimental/control) design. (b) Questionnaires to find out opinions of students on audio cassettes. The study reveals that there is a significnt difference between the academic achievement of students who study via audio cassette lectures in addition to textbooks and face-to-face lectures and those who study through textbooks and face-to-face lectures only. The study therefore validates audio cassette lectures in an integrated study package. Other outcomes of the study are: (a) Suggestions to l.E.M.S. authorities to introduce audio cassette lectures on l.E.M.S. part-time courses. (b) Suggestions to course organisers at 1.E.M.S. to liaise with distance education institutions to adopt their instructional strategies. / Teacher Education / M. Ed. (Didactics)

This research project reports on an empirical study on the suitability and feasibility of audio cassette lectures in solving the study problems of adult distance education students. Having reviewed relevant literature on the subject the researcher collected data through: (a) Empirical investigation by contituting a two-group (experimental/control) design. (b) Questionnaires to find out opinions of students on audio cassettes. The study reveals that there is a significnt difference between the academic achievement of students who study via audio cassette lectures in addition to textbooks and face-to-face lectures and those who study through textbooks and face-to-face lectures only. The study therefore validates audio cassette lectures in an integrated study package. Other outcomes of the study are: (a) Suggestions to l.E.M.S. authorities to introduce audio cassette lectures on l.E.M.S. part-time courses. (b) Suggestions to course organisers at 1.E.M.S. to liaise with distance education institutions to adopt their instructional strategies. / Teacher Education / M. Ed. (Didactics)