Le phéochromocytome (PCC) est une tumeur neuroendocrine rare qui se développe principalement aux dépens des cellules chromaffines de la médullo-surrénale. Dans la majorité des cas, les PCCs sont caractérisés par une hypersécrétion de catécholamines responsables de divers effets délétères chez les patients dont le principal est une hypertension (phéochromocytomes symptomatiques, PS). Cependant, il existe également une forme particulière de PCCs asymptomatiques qui sécrètent des taux physiologiques de catécholamines (phéochromocytomes incidentaux, PI). Parmi les patients porteurs de PI, certains sont hypertendus (PIH) et d’autres non (PIN). Afin de mieux caractériser les différents profils sécrétoires de PCCs (PS et PI), nous avons recherché une implication potentielle des microARNs (miRNAs). Nous avons réalisé une analyse transcriptionnelle des miRNAs exprimés dans 32 échantillons de PCCs (12 PS, 12 PIN et 8 PIH). Le miRNome a été réalisé par qRT-PCR microfluidique (Taqman Low Density Array, TLDA) pour 671 miRNAs. L’analyse statistique (Limma) des données d’expression a permis d’identifier 4 miRNAs significativement sur-exprimés (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) et 3 miRNAs sous-exprimés (497-3p, 32-5p, 190b-5p) dans les tumeurs PIN par rapport aux PS. Pour identifier les cibles potentielles des miRNAs, de nombreux logiciels de prédictions bioinformatiques sont disponibles en ligne mais les résultats qu’ils génèrent sont très divergents. Afin de contourner ce problème nous avons développé miRabel, un nouvel outil de prédiction des cibles potentielles des miRNAs et des fonctions biologiques qui leurs sont associées. Le principe général consiste à agréger les résultats de 3 autres algorithmes de prédiction sélectionnés pour leur complémentarité. Au final, les analyses des courbes ROC (Receiver Operating Characteristic), de la précision et du Recall ont montré que cet outil est plus efficace i) que les algorithmes qu’il agrège et ii) que d’autres logiciels de prédictions couramment utilisés tels que miRWalk, MBSTAR et TargetScan. Une analyse d'enrichissement (Modular Enrichment Analysis ou MEA, Genecodis3) des cibles prédites pour les miRNAs différentiellement exprimés a révélé qu’ils peuvent moduler significativement l’activité de quelques dizaines de voies de signalisation dont celles du cytosquelette d’actine et des SNAREs (impliquées dans le transport vésiculaire). En se basant sur l’expression des miRNAs, leurs énergies d’hybridation avec leurs cibles ainsi que leurs effets physiologiques potentiels, les ARNm des gènes PAK3, MLCP, MLCK (cytosquelette d’actine), SNAP25 et STX1A (SNAREs) ont été retenus pour la suite de l’étude. Les essais luciférases ont mis en évidence une interaction entre la totalité de l’extrémité 3’UTR des ARNm de MLCK et miR-32, STX1A et miR-550a-3p, SNAP25 et miR-7-1-3p ainsi que miR-550a-3p. Les autres interactions testées se sont révélées négatives. Les analyses par RT-qPCR ont montré une diminution significative du niveau d’ARNm de MLCK et de STX1A suite à la transfection de miR-32-5p et miR-550a-3p respectivement. Concernant SNAP25, un effet inhibiteur de miR-550a-3p / 7-1-3p est observé. Cet effet a été confirmé au niveau protéique pour STX1A et SNAP25. / Pheochromocytomas (PCC) are rare neuroendocrine tumors which arise from chromaffin cells of the adrenal medulla. In most cases, PCCs are characterized by a hypersecretion of catecholamines, which is responsible for most of deleterious effects in the patients with hypertension being the main symptom (symptomatic pheochromocytomas, SP). However, some PCCs are asymptomatic and secrete physiological levels of catecholamines (Incidental Pheochromocytomas, IP). Among patients with an IP, some are hypertensive (HIP) and other are strictly normotensive (NIP). In order to better understand the different secretory profiles of PCCs (SP and IP), we investigated the potential role of microRNAs (miRNAs) in this process. We started by identifying differentially expressed miRNAs between 12 SP, 12 NIP and 8 SP. The miRNome was done by microfluidic qRT-PCR (Taqman Low Density Array, TLDA) for 671 miRNAs. Statistical analysis (Limma) of the expression results identified 4 miRNAs significantly over-expressed (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) and 3 under-expressed (497-3p, 32-5p, 190b-5p) in NIP tumors when compared to SP. To identify potential miRNAs’ targets, numerous bioinformatic prediction methods are available but their results are quite divergent. To circumvent this issue, we developed miRabel, a new miRNAs’ targets prediction tool and their associated biological functions. MiRabel aggregated the results of 3 other prediction algorithms selected for their features complementarity. The analysis of ROC, precision and recall curves showed that this tool is more efficient i) than the aggregated prediction methods and ii) than other recent or widely used tools such as miRWalk, MBSTAR and TargetScan. A Modular Enrichment Analysis (MEA, Genecodis3) of the miRNAs’ predicted targets revealed that they could potentially regulate the activity of a few pathways of which the actin cytoskeleton and the SNAREs (involved in vesicular transport). PAK3, MLCP, MLCK (Actin cytoskeleton), SNAP25 and STX1A (SNAREs) were selected to be experimentally validated based on miRNA’s expression, hybridization energy and potential physiological impact. Experimental validations of the selected interactions are achieved by luciferase gene reporter, RT-qPCR assays and western-blots following the transfection of studied miRNAs. Luciferase assays showed a direct interaction between the whole 3’UTR of MLCK mRNA and miR-32-5p, STX1A and miR-550a-3p, SNAP25 and miR-7-1-3p as well as miR-550a-3p. The other tested interactions came out to be negative. A significant decrease of MLCK mRNA and STX1A were observed by RT-qPCR analysis after transfecting miR-32-5p and miR-550a-3p respectively. As for SNAP25, the inhibitory effect of miR550a-3p/7-1-3p could be observed. This effect was confirmed at the protein level by western-blots for STX1A and SNAP25. We then evaluated the physiological effect of miR-550a-3p/7-1-3p on the regulated secretion of PC12 rat PCC cells. This was achieved using a nano-luciferase fused to growth hormone 1 (GH1). Once stimulated (59 mM potassium and 2 mM barium), miR-550a-3p over-expression decreased the secretory capacity of PC12 cells while miR-7-1-3p could not. This project represents the first study aiming to understand the regulation of the catecholamine secretion pathway by miRNAs in the pathophysiological context of PCC patients. Eventually, the characterization of this miRNA’s network should improve patient care in the field of hypersecreting neuroendocrine tumors.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les troubles du sommeil, tels que la somnolence diurne excessive et les attaques narcoleptiques, sont fréquemment observés chez les patients Parkinsoniens. Malgré de nombreux efforts cliniques à l’échelle mondiale, il reste à déterminer si ces troubles sont causés par les lésions neuronales dopaminergiques (DAergiques) ou non DAergiques, par les troubles moteurs ou par les effets délétères des médicaments anti-parkinsoniens. Par une approche pluridisciplinaire (analyse EEG; mesure de l’activité locomotrice; tests pharmacologiques; immunohistochimie) chez le félin traité au MPTP, nous avons étudié la corrélation possible entre perte DAergique et troubles du cycle veille-sommeil (V/S). Le MPTP (5mg/kg/jour x5, i.p.) induit en période aiguë, une hypersomnie en sommeil lent (SL), une suppression du sommeil paradoxal (SP), ainsi qu’une diminution de la locomotion et une difficulté à l’initiation des mouvements. Les agonistes DAergiques (L-dopa; ropinirole) empêchent l’hypersomnie en SL de façon transitoire. Durant la période chronique, les taux d’éveil et de SL reviennent à la normale. Le SP augmente transitoirement et s’associe à des épisodes narcoleptiques. Les analyses ex-vivo révèlent une diminution du marquage TH (corps cellulaire de la substance noire ; fibres du striatum). Le marquage des neurones cholinergiques (cerveau antérieur basal et tegmentum mésopontique) semblent inchangée. Nos résultats montrent donc que le MPTP induit chez le félin des symptômes moteurs et des troubles du sommeil proches de ceux observés chez les patients parkinsoniens. Cette étude suggère également une corrélation possible entre les troubles du cycle V/S et la perte des cellules DAergiques / Motors disorders are not the only symptoms of Parkinson disease (PD), and sleep disorders such as somnolence and narcolepsy are frequently reported in PD patients. Despite much investigation worldwide, it remains unknown whether these disorders are caused by dopaminergic (DArgic), non-DArgic neural lesions, nocturnal motor disability or deleterious effect of anti-PD drugs. Using multiple experimental approaches (EEG and sleep-wake recordings/pharmacological dosing / immunohistochemistry) in cats treated with MPTP, which causes DArgic neuronal loss, we have studied the possible correlation between the induced effects on the sleep-wake (S/W) cycle and those on DArgic neurons. MPTP (5mg/kg/day x 5, i.p.) caused, during the acute period, a slow wave sleep hypersomnia (SWS, up to 80% of recorded time) and a suppression of paradoxical sleep (PS), accompanied with pronounced behavioural somnolence, marked decrease in locomotion and difficulty to initiate movements. DArgic agonists L-dopa and ropinirole transiently prevented hypersomnia in SWS. During the chronic period, whereas the amount of W and SWS returned to control, PS transiently increased, associated with narcolepsy-like episodes. Ex-vivo analyses revealed marked decrease in TH labelling (cell bodies in the substantia nigra and terminal-like dots in the striatum) whereas cholinergic neurons in the basal forebrain and mesopontine-tegmentum seemed unchanged. Thus, MPTP treated cats showed major signs of motor and S/W disorders similar to those seen in PD patients and so could serve as useful animal model. Our results also suggest a possible correlation/causality between the MPTP-induced S/W disorders and DArgic cell loss.

Ce travail porte sur l’étude fonctionnelle de deux gènes préférentiellement exprimés dans deux régions du cerveau touchées par des pathologies neurodégénératives : Capucine, un marqueur du striatum, structure qui dégénère au cours de la maladie de Huntington et Agpat4, un marqueur de l’aire tegmentaire ventrale et de la substance noire compacte, dont les neurones dopaminergiques sont sélectivement atteints lors de la maladie de Parkinson. Des lignées de souris invalidées pour ces gènes ont été générées au laboratoire et au cours de ma thèse j’ai procédé à leur caractérisation. L’expression striatale du gène de la Capucine étant significativement diminuée dans des modèles murins de la maladie de Huntington, nous avons souhaité évaluer son rôle éventuel dans la pathogenèse de cette maladie. Pour ce faire, nous avons examiné, dans le cadre d’une collaboration, l’effet du knock-out et de la surexpression du gène de la Capucine sur la vulnérabilité des neurones striataux à un fragment de la Huntingtine mutée dans un modèle murin de la maladie de Huntington. Les données montrent que la Capucine n’a pas d’effet significatif sur la toxicité du fragment de la Huntingtine mutée dans le modèle étudié.La protéine Agpat4 présente des homologies de séquence avec des acyltransférases impliquées dans le métabolisme des phosphoglycérides. J’ai réalisé des études d’expression par différentes techniques de biologie moléculaire qui montrent que le gène d’Agpat4 est exprimé dans la plupart des tissus catécholaminergiques. Pour déterminer l’activité endogène d’Agpat4 et son rôle physiologique dans les tissus où elle est exprimée, j’ai comparé le métabolome de tissus de souris invalidées pour le gène d’Agpat4 et sauvages par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. Mes résultats indiquent que l’invalidation du gène d’Agpat4 perturbe le métabolisme non seulement de différentes classes de lipides, notamment les lysophosphatidyléthanolamines, mais aussi celui des catécholamines. / This work concerns the functional study of two genes preferentially expressed in two brain regions affected by neurodegenerative diseases: Capucine, a marker of the striatum, a structure that degenerates in Huntington's disease and Agpat4, a marker of the ventral tegmental area and the substantia nigra pars compacta, whose dopaminergic neurons are selectively affected in Parkinson's disease. Mouse lines deficient for Capucine and Agpat4 have been generated in the laboratory and during my PhD thesis I carried out their characterization.As the striatal gene expression of Capucine is significantly reduced in mouse models of Huntington's disease, we wished to evaluate its possible role in the pathogenesis of this disease. In a collaborative work, we examined the effect of the knockout and overexpression of the Capucine gene on the vulnerability of striatal neurons to a mutant Huntingtin fragment in a mouse model of Huntington’s disease. The data show that Capucine has no significant effect on the toxicity of the mutant Huntingtin fragment in the considered model.The Agpat4 protein has sequence homologies with acyltransferases involved in the metabolism of phosphoglycerides. I conducted expression studies using different molecular biology techniques, which showed that the Agpat4 gene is expressed in most catecholaminergic tissues. To determine the endogenous activity of Agpat4 and its physiological role in the tissues where it is expressed, I compared the metabolomes of Agpat4-deficient and wild-type mice tissues by liquid chromatography coupled with mass spectrometry. My results indicate that Agpat4 deficiency alters not only the metabolism of different lipid classes, in particular lysophosphatidylethanolamines, but also the metabolism of catecholamines.

Ce travail porte sur l'étude fonctionnelle de deux gènes préférentiellement exprimés dans deux régions du cerveau touchées par des pathologies neurodégénératives : Capucine, un marqueur du striatum, structure qui dégénère au cours de la maladie de Huntington et Agpat4, un marqueur de l'aire tegmentaire ventrale et de la substance noire compacte, dont les neurones dopaminergiques sont sélectivement atteints lors de la maladie de Parkinson. Des lignées de souris invalidées pour ces gènes ont été générées au laboratoire et au cours de ma thèse j'ai procédé à leur caractérisation. L'expression striatale du gène de la Capucine étant significativement diminuée dans des modèles murins de la maladie de Huntington, nous avons souhaité évaluer son rôle éventuel dans la pathogenèse de cette maladie. Pour ce faire, nous avons examiné, dans le cadre d'une collaboration, l'effet du knock-out et de la surexpression du gène de la Capucine sur la vulnérabilité des neurones striataux à un fragment de la Huntingtine mutée dans un modèle murin de la maladie de Huntington. Les données montrent que la Capucine n'a pas d'effet significatif sur la toxicité du fragment de la Huntingtine mutée dans le modèle étudié.La protéine Agpat4 présente des homologies de séquence avec des acyltransférases impliquées dans le métabolisme des phosphoglycérides. J'ai réalisé des études d'expression par différentes techniques de biologie moléculaire qui montrent que le gène d'Agpat4 est exprimé dans la plupart des tissus catécholaminergiques. Pour déterminer l'activité endogène d'Agpat4 et son rôle physiologique dans les tissus où elle est exprimée, j'ai comparé le métabolome de tissus de souris invalidées pour le gène d'Agpat4 et sauvages par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. Mes résultats indiquent que l'invalidation du gène d'Agpat4 perturbe le métabolisme non seulement de différentes classes de lipides, notamment les lysophosphatidyléthanolamines, mais aussi celui des catécholamines.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Objectifs : Identifier le rôle des récepteurs de l'angiotensine II (AT1 et AT2) et des canaux calciques de type-L dans la sécrétion des catécholamines par les médullo-surrénales in vivo. Théories et hypothèses : Selon plusieurs études réalisées en laboratoire, la sécrétion basale des catécholamines médullaires, en réponse à l'angiotensine II, est principalement contrôlée par la stimulation des récepteurs AT1. Cette sécrétion des catécholamines n'est pas complètement inhibée en présence d'un antagoniste des récepteurs AT1, ce qui suggère l'implication de d'autres voies d'activation, soit les récepteurs AT2, soit les canaux calciques de type-L. De telles études n'ont jamais été réalisées à partir d'un modèle animal in vivo. Nous avons donc tenté de vérifier ces hypothèses dans les trois études présentées ici, dans lesquelles nous avons utilisé un antagoniste sélectif des récepteurs AT1 (BMS 186295), deux antagonistes sélectifs des récepteurs AT2, [le PD 123319 et le CGP 42112], et un bloqueur des canaux calciques de type-L, [la nifédipine]. Méthodes : Nous avons travaillé chez le chien anesthésié, ce qui nous a permis d'administrer les différents agents pharmacologiques directement dans la glande surrénale tout en minimisant les effets systémiques. Les concentrations plasmatiques des catécholamines étaient mesurées à partir d'échantillons prélevés de la veine surrénale et l'aorte. Le dosage des catécholamines a été réalisé par la technique de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) couplé à un détecteur électrochimique. Résultats : Nos résultats confirment que la sécrétion des catécholamines par les médullo-surrénales, en réponse à l'angiotensine II, est principalement contrôlée par la stimulation des récepteurs AT1. En effet, le BMS 186295 a inhibé significativement la sécrétion de catécholamines induite par l'administration de l'angiotensine II. Le PD 123319 et le CGP 42112 ont également inhibé, la libération des catécholamines en réponse à l'angiotensine II, suggérant cette fois-ci une participation des récepteurs AT2 dans la sécrétion des catécholamines. Enfin, nous avons observé que la nifédipine inhibe que partiellement la réponse médullaire à l'angiotensine II. Cependant, celle-ci a inhibé complètement la libération des catécholamines induite par l'administration de Bay K 8644, un activateur sélectif du canal calcique de type-L. Nos résultats ont indiqué que la combinaison du BMS 186295 et du PD 123319 n'a pas davantage inhibé cette sécrétion lorsque compare aux réponses obtenues avec le BMS 186295 ou le PD 123319 administré en monothérapie. De plus, nous avons démontré que la nifédipine combinée à ces deux antagonistes, diminuent significativement la sécrétion des catécholamines lorsque comparée à celle obtenue avec la combinaison des deux antagonistes des récepteurs à l'angiotensine II. Conclusions : Nos résultats suggèrent que les récepteurs à l'angiotensine II (AT1 et AT2) peuvent moduler la sécrétion des catécholamines par les médullo-surrénales chez le chien anesthésié. Les canaux calciques de type-L, sensibles à la dihydropyridine, semblent également impliqués de façon directe et indirecte dans la sécrétion des catécholamines médullaires induite par l'angiotensine II. Puisque les deux mécanismes contrôlés par le récepteur AT1 et le récepteur AT2 sont fonctionnellement impliqués de façon similaire dans la sécrétion des catécholamines induite par l'angiotensine II, il semblerait que la stimulation simultanée de ces récepteurs soit nécessaire pour permettre cette sécrétion chez le chien anesthésié.

Un dispositif de stimulation électrique in vitro sur des lignées cellulaires a été optimisé afin de nous permettre d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la SHF. Deux lignées cellulaires (GH3 et PC12) ont été analysées au niveau transcriptomique, protéomique et de la sécrétion hormonale et de neurotransmetteurs.Nous avons comparé les niveaux de sécrétion de PRL des GH3 traitées par SHF, SBF ou par la dopamine; ainsi que les niveaux des catécholamines (DA, AD et NA) des PC12 traitées par SHF, SBF ou par la 6-OHDA. La synthèse protéique des cellules stimulées a été analysée par les techniques d'incorporation de 35S méthionine et de SELDI-TOF-MS. Enfin nous avons recherché les modifications d'expression génique des cellules stimulées en utilisant la technique des microarray à base d'oligonucléotides longs sur nylon et détection radioactive.Les premières expériences montrent une diminution significative de la quantité de prolactine à un niveau comparable à celui obtenu avec l'inhibiteur conventionnel, la dopamine. De la même façon, la production de catécholamines dans le milieu est inhibée. Les données transcriptomiques montrent l'existence des profils d'expression caractéristique de la neurostimulation à haute fréquence, avec environ 100 gènes discriminants impliqués dans la synthèse protéique, la signalisation calcique, l'énergétique cellulaire pour les principaux. Nous avons confirmé l'impact de la neurostimulation sur la synthèse protéique en SELDI-TOF comme en incorporation de méthionine. Un mécanisme original de SHF peut donc être proposé, impliquant la neutralisation de la synthèse protéique dans l'inactivation réactionnelle des structures neuronale