Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les bisphosphonates (BPs) sont des outils thérapeutiques de choix pour le traitement de l'ostéolyse maligne. Toutefois, ils n'ont pas d'effet anti-tumoral et n'améliorent pas la survie des patients. C'est pourquoi nous avons testé leur efficacité en association avec de nouveaux agents pharmacologiques ciblant les cellules responsables de la résorption osseuse, les ostéoclastes.<br />Nous avons ainsi démontré qu'un inhibiteur de cathepsine K (CKI) réduit l'activité des ostéoclastes in vitro, et de ce fait, le développement des métastases osseuses in vivo en agissant indirectement sur les cellules tumorales. De plus, un inhibiteur de tyrosine kinase (Imatinib) ralentit la formation et la progression des métastases osseuses in vivo, en ayant une activité anti-ostéoclastique et anti-tumorale. Toutefois, bien qu'une polythérapie puisse favoriser une synergie d'action entre les médicaments, nos résultats montrent que dans nos conditions d'utilisation, aucune synergie significative entre le CKI, l'Imatinib et le BP zolédronate n'a lieu.

Type II collagen, which gives the cartilage its tensile strength, is destroyed in osteoarthritis (OA). Cathepsin K is recognized as capable of cleaving type II collagen, however, the regulation of its activity in the cartilage is little known. Our hypothesis is that the activity of cathepsin K in cartilage is measured by an ELISA specific to cathepsin K cleavage site. A new specific ELISA (C2K77) was developed and tested by measuring the activity of the exogenous cathepsin K. The ELISA C2K77 was then used to measure the activity of the endogenous cathepsin K in equine articular cartilage explants cultured with or without stimulation (IL-1β, TNF-α, Oncostatin M (OSM) and LPS). Then the activity of cathepsin K was compared to that of MMPs (C1,2C ELISA) in the cartilage explants and in the freshly harvested cartilage. A significant difference was observed between normal cartilage and cartilage digested with cathepsin K (p˂0.01). There was no significant difference in the content of C2K77 between the control group and the groups stimulated while the content of C1,2C was increased by the combination of IL-1β and OSM (p = 0.002) and TNF-α and OSM (p˂0.0001). The new ELISA C2K77 demonstrates the ability to measure the activity of cathepsin K and revealed that there is a difference between the regulation of cathepsin K and MMP in articular cartilage. / Le collagène de type II, qui confère au cartilage articulaire sa résistance à la tension, est détruit dans l’arthrose. La cathepsine K est reconnue comme pouvant cliver le collagène de type II. Cependant, la régulation de son activité dans le cartilage est peu connue. Notre hypothèse est que l’activité de la cathepsine K dans le cartilage est mesurable par une ELISA spécifique au site de clivage de la cathepsine K. Une nouvelle ELISA spécifique (C2K77) a été développée et testée en mesurant l’activité de la cathepsine K exogène. L’ELISA C2K77 a ensuite été utilisée pour mesurer l’activité de la cathepsine K endogène dans des explants de cartilage articulaire équin mis en culture avec ou sans stimulations (IL-1β, TNF-α, oncostatine M (OSM) et le LPS). Puis l’activité de la cathepsine K a été comparée à celle des MMPs (avec l’ELISA C1,2C) dans les explants de cartilage et dans le cartilage fraichement récolté. Une différence significative a été observée entre le cartilage normal et le cartilage digéré avec la cathepsine K exogène (p˂0.01). Il n’y avait aucune différence significative dans la quantité de C2K77 entre le groupe control et les groupes stimulés tandis que la quantité de C1,2C a été augmenté par la combinaison de l’IL-1β et de l’OSM (p=0.002) et du TNF-α et de l’OSM (p˂0.0001). La nouvelle ELISA C2K77 démontre la capacité de mesurer l’activité de la cathepsine K et a permis de voir qu’il y a une différence entre la régulation de la cathepsine K et des MMPs.

La dégradation protéolytique du collagène de type II est considérée comme étant un facteur majeur dans le processus irréversible de dégradation de la matrice cartilagineuse lors d’ostéoarthrose. Outre les collagénases de la famille des métaloprotéinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dégrader la triple hélice intacte du collagène de type II, devenant ainsi un élément pertinent pour les recherches sur l’ostéoarthrose. L’objectif à court terme de notre étude consiste en l’identification et la caractérisation de sites de clivage spécifiques de la cathepsine K sur le collagène de type II équin. La technique d’électrophorèse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des résultats de la caractérisation moléculaire des fragments protéolytiques. La caractérisation est réalisée en combinant la digestion trypsique précédant l’analyse HPLC-ESI/MS. Les résultats ont permis d’établir les sites, présents sur la carte peptidique de la molécule de collagène de type II équin, des 48 résidus prolines (P) et 5 résidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, différents de ceux produits par les MMPs, sont observés par SDS-PAGE 1D puis confirmés par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifié suggère un site de clivage différent de l’étude antérieure sur le collagène de type II bovin et humain. L’objectif à long terme serait le développement d’anticorps spécifiques au site identifié, permettant de suivre l’activité protéolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et ÉLISA, dans le cadre du diagnostic de l’ostéoarthrose. / The proteolytic degradation of type II collagen is believed to be mainly an irreversible event in the process of cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Cathepsin K is the most active enzyme protease outside the matrix metalloproteinase (MMP) family (MMP 13, -8, -1) capable of degrading the intact triple helical type II collagen. The short term objective of our study was to characterize the specific cleavage sites of CK on type II collagen. Our long term goal is to develop antibodies specific to these sites to develop biomarkers to detect it’s cleavage, for the early diagnosis of OA. Thus, in order to achieve our first goal, Cathepsin K cleavage of equine type II collagen was first examined by SDS-PAGE electrophoresis. Molecular characterization of proteolytic fragments, and therefore cleavage sites, was performed using tryptic digestion followed by LC-ESI/MS analysis to establish a comprehensive peptide map which was used as a template to identify specific proteolytic cleavage by cathepsin K. Comprehensive peptide mapping provided information on post-translational modifications and permitted the identification of 48 proline (P) and 5 lysine (K) residues that were subject to post translational modification. Six major fragments were observed on 1D SDS-PAGE and confirmed by HPLC-ESI/MS including F1 [189-190], F2 [252-253], F3 [326-327], F4 [428-429], F5 [563-564] and F6 [824-825]. The observed F1 fragment showed that cleavage was three residues N-terminal to the site reported previously for bovine type II collagen. These new findings will be used to develop new analytical methods to quantify biomarkers associate to equine type II collagen degradation in osteoarthritis patient and/or to support the development of new treatments.

La dégradation protéolytique du collagène de type II est considérée comme étant un facteur majeur dans le processus irréversible de dégradation de la matrice cartilagineuse lors d’ostéoarthrose. Outre les collagénases de la famille des métaloprotéinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dégrader la triple hélice intacte du collagène de type II, devenant ainsi un élément pertinent pour les recherches sur l’ostéoarthrose. L’objectif à court terme de notre étude consiste en l’identification et la caractérisation de sites de clivage spécifiques de la cathepsine K sur le collagène de type II équin. La technique d’électrophorèse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des résultats de la caractérisation moléculaire des fragments protéolytiques. La caractérisation est réalisée en combinant la digestion trypsique précédant l’analyse HPLC-ESI/MS. Les résultats ont permis d’établir les sites, présents sur la carte peptidique de la molécule de collagène de type II équin, des 48 résidus prolines (P) et 5 résidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, différents de ceux produits par les MMPs, sont observés par SDS-PAGE 1D puis confirmés par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifié suggère un site de clivage différent de l’étude antérieure sur le collagène de type II bovin et humain. L’objectif à long terme serait le développement d’anticorps spécifiques au site identifié, permettant de suivre l’activité protéolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et ÉLISA, dans le cadre du diagnostic de l’ostéoarthrose. / The proteolytic degradation of type II collagen is believed to be mainly an irreversible event in the process of cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Cathepsin K is the most active enzyme protease outside the matrix metalloproteinase (MMP) family (MMP 13, -8, -1) capable of degrading the intact triple helical type II collagen. The short term objective of our study was to characterize the specific cleavage sites of CK on type II collagen. Our long term goal is to develop antibodies specific to these sites to develop biomarkers to detect it’s cleavage, for the early diagnosis of OA. Thus, in order to achieve our first goal, Cathepsin K cleavage of equine type II collagen was first examined by SDS-PAGE electrophoresis. Molecular characterization of proteolytic fragments, and therefore cleavage sites, was performed using tryptic digestion followed by LC-ESI/MS analysis to establish a comprehensive peptide map which was used as a template to identify specific proteolytic cleavage by cathepsin K. Comprehensive peptide mapping provided information on post-translational modifications and permitted the identification of 48 proline (P) and 5 lysine (K) residues that were subject to post translational modification. Six major fragments were observed on 1D SDS-PAGE and confirmed by HPLC-ESI/MS including F1 [189-190], F2 [252-253], F3 [326-327], F4 [428-429], F5 [563-564] and F6 [824-825]. The observed F1 fragment showed that cleavage was three residues N-terminal to the site reported previously for bovine type II collagen. These new findings will be used to develop new analytical methods to quantify biomarkers associate to equine type II collagen degradation in osteoarthritis patient and/or to support the development of new treatments.

Le collagène de type I osseux subit une série de modifications post-traductionnelles au cours du processus de maturation. Un certain nombre de ces modifications sont quantifiables par dosage : c’est le cas des molécules de pontage enzymatiques pyridinoline (PYD) et désoxypyridinoline (DPD), de la pentosidine (PEN) qui est un produit de glycation, et de la forme native (α) et isomérisée (β) des C-télopeptides (α et β CTX) du collagène de type I. A l’aide d’un modèle de maturation in vitro d’os bovin foetal, nous avons montré que le taux de solubilisation du collagène osseux par la cathepsine K augmente avec la durée d’incubation des os à 37°C. Nous avons également montré que cette augmentation est corrélée au taux des modifications post-traductionnelles du collagène mesurées. Lors d’une étude précédente utilisant ce même modèle de maturation d’os foetal, nous avions déterminé que les modifications post-traductionnelles du collagène osseux influençaient les propriétés mécaniques de l’os. Dans le cadre de ce travail de thèse et pour compléter cette étude, nous avons mis au point un modèle pour étudier isolément l’influence des molécules de pontage PYD et DPD sur les propriétés mécaniques de l’os. Ce modèle utilise de l’os cortical bovin traité aux U.V. puis soumis à des tests de flexion trois points. Dans la même optique, nous avons contribué à la mise au point d’un dosage en chromatographie en phase liquide à haute performance qui permet de quantifier à la fois les formes matures et immatures des molécules de pontage pyridinoliques (PYD, DPD, HLNL et DHLNL) sur le même chromatogramme / Type I bone collagen undergoes a series of posttranslational modifications during maturation process. Some of them are quantifiable by assays: the enzymatic cross-links pyridinoline (PYD) and deoxypyridinoline (DPD), the advanced glycation end product pentosidine (PEN), and the native (α) and isomerized (β) forms of the type I collagen C-telopeptides (α and β CTX). With an in vitro model of bovine fetal bone maturation, we showed that bone collagen solubilization by cathepsin K increases with the duration of bone incubation at 37°C. We also showed a correlation between this increase of solubilization and the level of measured collagen posttranslational modifications. In a previous study, using the same fetal bovine bone maturation, our results had suggested a link between bone collagen posttranslational modifications and bone mechanical properties. In the aim to complete this study, we developed a model to focus on PYD and DPD influence in bone mechanical properties. This model uses bovine cortical bone subjected to ultraviolet light before three points binding tests. In the same purpose, we contributed to develop a High-Performance Liquid Chromatography essay, quantifying mature and immature forms of pyridinium crosslinks (PYD, DPD, HLNL and DHLNL) in an unique chromatogram