INTRODUÇÃO: O endotélio corneal exerce papel primordial para a fisiologia da córnea. Seus dados morfológicos gerados pelo microscópio especular (MEC) como densidade endotelial (DE), área celular média (ACM), coeficiente de variação (CV) e porcentagem de células hexagonais (HEX) são importantes para avaliar sua vitalidade. Para interpretar estes dados de forma padronizada e reprodutível, foi utilizado um programa estatístico de análise amostral, Cells Analyzer PAT. REQ.(CA). OBJETIVO: Demonstrar valores de referência para DE, ACM, CV e HEX. Demonstrar o percentual de células endoteliais marcadas e desconsideradas no exame ao marcar-se 40, 100 e 150 células em uma única imagem do mosaico endotelial e o perfil do intervalo de confiança (IC) das variáveis estudadas ao se considerar 40, 100, 150 e tantas células quantas indicadas pelo CA. Demonstrar o erro amostral de cada grupo estudado. MÉTODOS: Estudo transversal. Os exames de MEC foram realizados com o aparelho Konan NONCON ROBO® SP-8000, nos 122 olhos de 61 portadores de catarata (63,97 ± 8,15 anos de idade). As imagens endoteliais caracterizaram se pelo número de células marcadas e consideradas para cálculo dos seguintes dados: DE, ACM, CV e HEX. Os grupos foram formados de 40, 100, 150 células marcadas numa única imagem endotelial e Grupo CA em que foram marcadas tantas células quanto necessárias em diferentes imagens, para obter o erro relativo calculado inferior ao planejado (0,05), conforme orientação do programa CA. Estudou-se o efeito do número de células sobre IC para as variáveis endoteliais utilizadas. RESULTADOS: A média dos valores de referência encontrados para DE foi 2395,37 ± 294,34 cel/mm2; ACM 423,64 ± 51,09 m2; CV 0,40 ± 0,04 e HEX 54,77 ± 4,19%. O percentual de células endoteliais desconsideradas no Grupo 40 foi 51,20%; no Grupo 100, 35,07% e no Grupo 150, 29,83%. O número médio de células calculado inicialmente pelo CA foi 247,48 ± 51,61 e o número médio de células efetivamente incluídas no final do processo amostral foi 425,25 ± 102,24. O erro amostral dos exames no Grupo 40 foi 0,157 ± 0,031; Grupo 100, 0,093 ± 0,024; Grupo 150, 0,075 ± 0,010 e Grupo CA, 0,037 ± 0,005. O aumento do número de células diminuiu a amplitude do IC nos olhos direito e esquerdo para a DE em 75,79% e 77,39%; ACM em 75,95% e 77,37%; CV em 72,72% e 76,92%; HEX em 75,93% e 76,71%. CONCLUSÃO: Os valores de referência da DE foi 2395,37 ± 294,34 cel/mm2; ACM foi 423,64 ± 51,09 m2; CV foi 0,40 ± 0,04 e HEX foi 54,77 ± 4,19%. O percentual de células endoteliais desconsideradas no Grupo 40 foi 51,20%; no Grupo 100 foi 35,07% e no Grupo 150 foi 29,83%. O programa CA considerou correto os exames nos quais 425,25 ± 102,24 células foram marcadas entre duas e cinco imagens (erro relativo calculado de 0,037 ± 0,005). O aumento do número de células diminuiu a amplitude do IC para todas as variáveis endoteliais avaliadas pela MEC / INTRODUCTION: Corneal endothelium plays an important role in physiology of the cornea. Morphological data generated from specular microscope such as endothelial cell density (CD), average cell area (ACA), coefficient of variance (CV) and percentage of hexagonal cells (HEX) are important to analyze corneal status. For a standard and reproducible analysis of the morphological data, a sampling statistical software called Cells Analyzer PAT. REC (CA) was used. PURPOSE: To determine normal reference values of CD, ACA, CV and HEX. To analyze the percentage of marked and excluded cells when the examiner counted 40, 100, 150 cells in one endothelial image. To analyze the percentage of marked and excluded cells according to the statistical software. To determine the confidence interval of these morphological data. METHODS: Transversal study of 122 endothelial specular microscope image (Konan, non-contact NONCON ROBO® SP- 8000 Specular Microscope) of 61 human individuals with cataract (63.97 ± 8.15 years old) was analyzed statistically using CA. Each image was submitted to standard cell counting. 40 cells were counted in study Group 40; 100 cells were counted in study Group 100; and 150 cells were counted in study Group 150. In study group CA, the number of counted cells was determined by the statistical analysis software in order to achieve the most reliable clinical information (relative error < 0,05). Relative error of the morphological data generated by the specular microscope were then analyzed by statistical analysis using CA software. For Group CA, relative planned error was set as 0.05. RESULTS: The average normal reference value of CD was 2395.37 ± 294.34 cells/mm2, ACA was 423.64 ± 51.09 m2, CV was 0.40 ± 0.04 and HEX was 54.77 ± 4.19%. The percentage of cells excluded for analysis was 51.20% in Group 40; 35.07% in Group 100; and 29.83% in Group 150. The average number of cells calculated initially by the statistical software was 247.48 ± 51.61 cells and the average number of cells included in the final sampling process was 425.25 ± 102.24 cells. The average relative error was 0.157 ± 0.031 for Group 40; 0.093 ± 0.024 for Group 100; 0.075 ± 0.010 for Group 150 and 0.037 ± 0.005 for Group CA. The increase of the marked cells decreases the amplitude of confidence interval (right and left eyes respectively) in 75.79% and 77.39% for CD; 75.95% and 77.37% for ACA; 72.72% and 76.92% for CV; 75.93% and 76.71% for HEX. CONCLUSION: The average normal reference value of CD was 2395.37 ± 294.34 cells/mm2, ACA was 423.64 ± 51.09 m2, CV was 0.40 ± 0.04 and HEX was 54.77 ± 4.19%. The percentage of excluded cells for analysis was 51.20% in Group 40; 35.07% in Group 100 and 29.83% in Group 150. CA software has considered reliable data when 425.25 ± 102.24 cells were marked by the examiner in two to five specular images (calculated relative error of 0.037 ± 0.005). The increase of the marked cells decreases the amplitude of confidence interval for all morphological data generated by the specular microscope

Resumo: Os objetivos com este estudo foram descrever como as condições de higiene de vacas leiteiras variam ao longo do tempo e de acordo com as estações do ano; avaliar se as vacas são consistentes para sua higiene corporal; estudar as possíveis relações entre o escore de limpeza e o comportamento das vacas, em particular aqueles relacionados ao uso do espaço e à termorregulação e por fim, avaliar se há relação entre o escore de limpeza e a contagem de células somáticas do leite (CCS). Para isso foram utilizados animais de duas propriedades particulares localizadas no estado de São Paulo. Durante nove meses foi realizada uma avaliação mensal da higiene de todas as vacas em lactação, perfazendo um total de 3554 observações para 545 animais. A higiene foi expressa por meio de um escore de limpeza de quatro pontos (muito limpa, limpa, suja e muito suja). Para avaliar a relação entre o escore de limpeza e o comportamento foram avaliadas categorias comportamentais de postura, posicionamento e atividades dos animais para, no mínimo, 46 vacas em lactação, durante três dias consecutivos nos meses de julho e agosto de 2007 (estação seca) e dezembro de 2007 e janeiro de 2008 (estação chuvosa). Para o estudo da relação entre a higiene e a contagem de células somáticas individual das vacas foi avaliado um total de 2218 dados de CCS para 404 vacas. Foi encontrada variação individual na higiene das vacas, sendo que na estação seca os animais apresentaram-se mais limpos que na estação chuvosa. Apesar da variação, aproximadamente metade das vacas é consistente para a sua higiene, permanecendo maior parte do tempo em uma mesma condição - limpa para a maioria. Foi encontrada associação entre a higiene das vacas e o seu comportamento. Para explicar essa associação as categorias comportamentais podem ser caracterizadas em: comportamentos que determinam a transferência... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aims of this study were to describe the variation on dairy cow's body hygiene conditions over time and according to the seasons, verify if the cows are consistent for hygiene, to identify the relationship between the cleanliness score and the cow's behavior, particularly those related to land use and thermoregulation and finally, to associate the cow's cleanliness score and their milk somatic cell count (SCC). During nine months the body hygiene was accessed for lactating cows from two Brazilians commercial farms, a total of 3554 observations for 545 animals. The hygiene was expressed as a four points cleanliness score. To evaluate the relationship between the cleanliness score and behavior, behavioral categories of posture, positioning and activities were assessed for at least 46 dairy cows in two months of dry season and two of rainy season. The SCC was accessed for 404 cows, a total of 2218 data. Individual variation was found in the cow's hygiene, and in the dry season the animals maintained cleaner than in the rainy season. Although the variation, approximately half of the cows are consistent for their hygiene - clean for the majority. The body hygiene was associated with the cow's behavior. To explain this association the behavioral categories can be summarized as: behaviors that determine the directly transfer of dirt to the cows' body (to lie down in a mud surface), while others behaviors are indirectly related to the transfer of dirty (lie down in a shaded place). In addition the behaviors as rumination and feeding does not determine the direct transfer of dirt to the body, however, these may be indicators of heat tolerance and the individual social ranking in the group, and differences in these characteristics are related to exposure of animals to certain dirty areas. The cleanliness score have effect on SCC (F = 4.85; df = 3; p < 0,01), and good hygiene condition... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Mateus José Rodrigues Paranhos da Costa / Coorientador: Marcelo Simão da Rosa / Banca: Luciandra Macedo de Toledo / Banca: Maria Imaculada Fonseca / Mestre

A mastite subclínica em caprinos é causada principalmente pelo Staphylococcus spp., sendo os estafilococos coagulase negativa (SCN) os patógenos de maior ocorrência e o S. aureus, a espécie de estafilococos mais pesquisada. Dessa forma, pouco se conhece sobre a patogenicidade de SCN e outros estafilococos coagulase positiva (SCP), além do S. aureus. Também há poucos estudos sobre a variação da viabilidade celular na mastite subclínica de cabras. Assim, o objetivo do presente estudo foi determinar os fatores de virulência de adesão e produção de biofilme de estirpes de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de leite de cabras, verificando possíveis associações com a viabilidade celular. Para realizar a colheita das amostras, primeiramente, foi efetuada um exame físico da glândula mamária, com posterior realização dos testes da caneca de fundo preto e California mastitis test (CMT). A colheita do leite foi efetuada em três alíquotas: análises microbiológicas, contagem de células somáticas (CCS) e viabilidade celular. Realizou-se a identificação, teste de antibiograma e PCR (Reação em cadeia polimerase) dos Staphylococcus spp. isolados nas amostras de leite. Os genes de virulência pesquisados no PCR foram: cna, eno, ebpS, fnbA, fnbB, fib e bap. Avaliou-se a quantidade de CCS, em equipamento de citometria de fluxo, e a viabilidade celular, após centrifugações das amostras de leite e visualização das células em microscópio, utilizando o corante azul de Trypan. Os resultados foram: 122 amostras com crescimento bacteriano e dessas, 110 (90,2%) foram identificadas como Staphylococcus spp., sendo 90 (73,8%) de SCN e 12 (16,4%) de SCP. As espécies mais isoladas de estafilococos foram: S. epidermidis (24,55%), S. lugdunensis (15,40%) e S. intermedius (13,64%). As amostras apresentaram maior resistência aos antimicrobianos: penicilina (81,8%), oxacilina (60,0%) e ampicilina (55,5%). Observou-se maior sensibilidade para: enrofloxacina (99,1%), eritromicina (98,2%), gentamicina (98,2%) e vancomicina (98,2%). Com relação aos fatores de virulência pesquisados, foram encontradas amostras positivas para todos os genes, com exceção do gene fnbB: eno (53,6%), bap (43,7%), ebpS (19,1%), fnbA (18,2%) e fib (16,4%). Mais de um gene foi detectado em algumas estirpes, sendo que as associações de maior ocorrência foram: bap/eno em SCN e ebpS/eno/fib/fnbA em SCP. Os valores da CCS das amostras de leite com isolamento de Staphylococcus spp., SCN e SCP foram maiores do que nas amostras sem isolamento bacteriano e as estirpes com presença da associação de genes ebpS/eno/fib/fnbA apresentaram maior CCS do que bap/eno. Com relação à viabilidade celular, as amostras com isolamento de Staphylococcus spp. apresentaram maior viabilidade celular do que as amostras sem isolamento bacteriano e não houve associação dos genes identificados nas estirpes com a viabilidade celular. Concluiu-se que os genes eno e bap apresentaram maior ocorrência nas estirpes de Staphylococcus spp., sendo os mais encontrados nos isolados de SCN e os genes ebpS, fib e fnbA foram os mais detectados nos SCP. A viabilidade celular foi maior nas amostras com isolamento de Staphylococcus spp. em relação as sem isolamento bacteriano e não houve associação entre os fatores de virulência das estirpes de Staphylococcus spp. e a viabilidade celular. / Subclinical mastitis in goats is mainly caused by Staphylococcus spp., coagulase-negative staphylococci (CNS) is the most frequent pathogens and S. aureus, the most researched specie of staphylococci. Thus, little is known about the pathogenicity of SCN and other coagulase-positive staphylococci (CPS), beyond the S. aureus. There are few studies on the variation of cell viability in subclinical mastitis of goats. The aim of the present study was to determine the virulence factors of adhesion and biofilm production of Staphylococcus spp. strains isolated from milk samples of goats, verifying for possible associations with cell viability. To collect samples, firstly, was performed a physical examination of the mammary gland, with subsequent tests for mug of black background and California mastitis test (CMT). Three aliquots of milk were collected: microbiological analysis, somatic cell count (SCC) and cell viability. Identification, antibiotic susceptibility testing and PCR (polymerase chain reaction) were performed of Staphylococcus spp. isolated from milk samples. Virulence genes researched in PCR were: cna, eno, ebpS, fnbA, fnbB, fib and bap. Evaluation of CCS, using flow cytometry equipment, and cell viability, after centrifugation of milk samples and visualization the cells in the microscope using Trypan blue dye, were performed. The results were: from 122 samples with bacterial growth, 110 (90.2%) were identified as Staphylococcus spp., 90 (73.8%) of CNP and 12 (16.4%) of the CNP. The most isolated staphylococci species were: S. epidermidis (24.55%), S. lugdunensis (15.40%) and S. intermedius (13.64%). Samples showed higher resistance to antimicrobials: penicillin (81.8%), oxacillin (60.0%) and ampicillin (55.5%). We observed higher sensitivity to: enrofloxacin (99.1%), erythromycin (98.2%), gentamicin (98.2%) and vancomycin (98.2%). Regarding virulence factors researched, positive samples were found for all genes, except fnbB gene: eno (53.6%), bap (43.7%), ebpS (19.1%), fnbA (18.2%) and fib (16.4%). More than one gene were detected in some strains, with the most frequent associations were bap/eno in CNS and ebpS/eno/fib/fnbA in CNP. The values of SCC of milk samples with isolation of Staphylococcus spp., CNS and CNP were higher than samples without bacterial isolation and the isolation of strains with combination of ebpS/eno/fib/fnbA genes showed higher SCC than bap/eno. Regarding cell viability, samples with isolation of Staphylococcus spp. showed higher cell viability than samples without bacterial isolation and there was no association of the genes identified in strains with cell viability. In conclusion, eno and bap genes were more frequent in Staphylococcus spp. strains, eno and bap genes were mostly found in isolated CNS and ebpS, fib and fnbA genes were more detected in CNP. Cell viability was higher in samples with isolation of Staphylococcus spp. compared those without bacterial isolation and there was no association between the virulence factors of Staphylococcus spp. strains and cell viability.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-10-21T18:53:24Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Evando Alves Filgueiras - 2013.pdf: 1115430 bytes, checksum: 62f6695a211d8461f75ac10013af7bed (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-10-21T20:21:49Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Evando Alves Filgueiras - 2013.pdf: 1115430 bytes, checksum: 62f6695a211d8461f75ac10013af7bed (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-21T20:21:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Evando Alves Filgueiras - 2013.pdf: 1115430 bytes, checksum: 62f6695a211d8461f75ac10013af7bed (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-11-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Biological additives, such as probiotics, prebiotics and digestive enzymes, as well as the combination of these components - commonly called synbiotics - are an alternative to improve livestock performance. In order to evaluate the effects in dairy cattle of a synbiotic containing microencapsulated bacteria, a meta- analysis was conducted using results obtained on commercial farms. Variables included milk production and quality, and reproductive performance. Data were collected on 22 farms feeding a commercial synbiotic composed of microencapsulated probiotics, prebiotics and fibrolytic enzymes (Biofórmula Leite®). All herds followed the manufacturer's recommended dosage of 2 g / animal / day. Information was collected on bulk tank milk production and quality (Somatic Cell Count - SCC,and contents of milk fat, protein and total solids), as well as reproductive data, such as inseminations and calving dates. These data were pooled for meta-analysis, which was performed according to the mixed models procedures recommended by St. Pierre. An analysis of variance was performed, considering the farm as a random variable and treatment as a fixed effect, with time period nested within farm. For each analysis, we used the GLM procedure of Minitab (Minitab, Inc., State College, PA, USA). A probability level of 0.05% was used to determine the statistical significance of each effect. Treatment with the synbiotic produced significant reductions in bulk tank SCC(-41%) , and in calving interval (- 73 days). There was no significant effect on the contents of fat, protein, and total solids in milk. The synbiotic additive used in this study proved to be an effective tool in the reduction of somatic cells in milk, as well as improving the fertility of animals. / Os aditivos biológicos, como os probióticos, prebióticos e enzimas digestivas, ou mesmo, a combinação destes componentes, comumente denominada de simbióticos, têm se mostrado como uma alternativa para melhorar o desempenho dos animais. Com a finalidade de observar os benefícios advindos dos simbióticos com bactérias microencapsuladas em bovinos de leite, objetivou-se nessa pesquisa, realizar uma meta-análise dos resultados obtidos em nível de campo com a utilização de um produto simbiótico no desempenho produtivo, reprodutivo e na qualidade do leite de vacas leiteiras. Os dados foram coletados em 22 propriedades que utilizam o simbiótico comercial Biofórmula Leite®, composto por probióticos, prebióticos e enzimas fibrolíticas. A dosagem utilizada em todas as propriedades seguiu a indicação do fabricante de 2 g/animal/dia. Foram coletadas informações de qualidade do leite (Contagem de Células Somáticas - CCS, teores de Gordura, Proteína e Sólidos Totais), foram registradas também as médias de produção dos animais ou quantidades entregues no laticínio, bem como os dados reprodutivos, como datas das inseminações e dos partos. Esses dados foram agrupados para realização de uma meta-análise, que foi realizada de acordo com os procedimentos de modelos mistos preconizados por St. Pierre. Foi realizada uma análise de variância usando o modelo misto, considerando a fazenda como variável aleatória e o tratamento como efeito fixo, e o período aninhado na fazenda. Para cada análise, foi utilizado o procedimento GLM do Minitab (Minitab, Inc., State College, PA, EUA). O nível de probabilidade de 0,05% foi utilizado para determinar a significância estatística de cada efeito. Foi observada uma redução significativa na média de CCS dos tanques (-41%), além de uma redução de 73 dias no IP. Não foi constatado efeito significativo nos teores de gordura, proteína, e sólidos totais do leite. O aditivo simbiótico utilizado neste estudo demonstrou ser uma ferramenta eficaz na redução de células somáticas no leite, bem como na melhoria da fertilidade dos animais.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-10T13:37:40Z No. of bitstreams: 2 Tese - Fernanda Antunha de Freitas - 2017.pdf: 2346803 bytes, checksum: bd45deff358e61395cc4402088476fd7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-10-10T13:38:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Fernanda Antunha de Freitas - 2017.pdf: 2346803 bytes, checksum: bd45deff358e61395cc4402088476fd7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-10T13:38:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Fernanda Antunha de Freitas - 2017.pdf: 2346803 bytes, checksum: bd45deff358e61395cc4402088476fd7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-05-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Intramammary infections can be triggered by a large number of etiologic agents and may lead to changes in the mammary gland parenchyma, composition of milk and reduction of milk production. The aim of the present study was to evaluate the electrophoretic profile of cow milk proteins by the analysis of microfluidic electrophoresis lab-on-a-chip and its alterations in relation to milk samples with different SCC and the presence of pathogenic microorganisms. A total of 101 milk samples were collected from cows from two dairy farms located in the state of Goiás. Microbiological analyzes, somatic cell counts, centesimal composition and microfluidic electrophoresis were performed. For the correlation test between the protein profile and the SCC the samples were stratified into five groups of somatic cells scores. The data were analyzed using descriptive statistics through the analysis of variance and graphical representations. There was a significant increase in the value of the protein component in relation to the SCS 1 and 3, 1 and 4 and 1 and 5. It was also possible to observe statistical difference in the results of the Lactose component when comparing SCS 1 and 3 and SCS 3 and 4. The evaluation of the variable "Concentration" of milk proteins was possible to observe differences in the concentration values of SCS. Statistical difference was also observed for concentration of α-LA when compared SCS 1,2 and 3 to SCS 5; For IgG, SCS samples 4 and 5 showed different concentrations of SCS samples 1,2 and 3; the LF protein showed different results among samples from the SCS 1 and 5. The microorganisms identified were Staphylococcus spp. Negative Coagulase, Arcanobacterium pyogenes, Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Bacillus spp. and yeast. There is no statistical evidence that the mean concentration of the proteins present in milk samples is different between any groups of samples with different microorganisms evaluated. In the comparison between the concentrations of each protein expressed in each group of samples, a statistical difference was observed in the concentration of α-lactalbumin between samples from the yeast group and samples without bacterial growth. It was concluded that whey proteins of high abundance have their concentration decreased with the occurrence of mastitis; Defense proteins such as Lactoferrin, Lactoperoxidase, IgG and IgM have their concentration increased when comparing milk samples from cows with subclinical mastitis and milk samples from healthy cows; Lactoferrin and IgG proteins are potential targets for identifying cows with subclinical mastitis in milk samples and may be considered biomarkers. It was also concluded that intramammary infections caused by the microorganisms identified in the present study do not alter the concentration of whey proteins of lactating cows; Milk samples with high SCC may present negative results for microbiological culture; The SCN showed higher frequency of isolation in milk samples from lactating cows, revealing opportunistic and saprophytic characteristics; And infection of the mammary gland caused by yeast causes a significant increase of the α-lactalbumin protein. / As infecções intramamárias podem ser causadas por um grande número de agentes etiológicos e cursar com alterações no parênquima da glândula mamária, na composição no leite e no volume de leite produzido. Considerando o exposto, objetivou-se com o presente estudo avaliar o perfil eletroforético de proteínas de amostras de leite de vacas por meio da análise de eletroforese microfluídica lab-on-a-chip e suas alterações em relação às amostras de leite com diferentes CCS e à presença de microrganismos patogênicos. Foram coletadas 101 amostras de leite de vacas provenientes de duas propriedades leiteiras localizadas no estado de Goiás. Foram realizadas análises microbiológicas, contagem de células somáticas, composição centesimal e eletroforese microfluídica lab –on – a chip. Para o teste de correlação entre o perfil de proteínas e a CCS as amostras foram estratificadas em cinco grupos de Escores de Células Somáticas. Os dados foram analisados utilizando estatística descritiva por meio do teste de análise de variância e representações gráficas. Verificou-se um aumento significativo no valor do componente proteína em relação aos ECS 1 e 3, 1 e 4 e 1 e 5. Também foi possível observar diferença estatística nos resultados do componente Lactose quando se comparou os ECS 1 e 3 e 3 e 4. Na avaliação descritiva da variável “Concentração” das proteínas do leite foi possível observar diferenças nos valores das concentrações em função do ECS. Observou-se também diferença estatística para os resultados obtidos para as proteínas α-LA, quando comparados os ECS 1,2 e 3 e o ECS 5; para a IgG, as amostras de ECS 4 e 5 apresentaram concentrações diferentes das amostras dos ECS 1,2 e 3; e a proteína LF, apresentou resultados diferentes entre as amostras de ECS 1 e 5. Os microrganismos isolados e identificados que apresentaram crescimento nas amostras coletadas foram bactérias coagula negativo do gênero Staphylococcus, Arcanobacterium pyogenes, Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Bacillus spp. e leveduras. Não há evidência estatística de que a média da concentração das proteínas presentes nas amostras de leite de vacas seja diferente entre nenhum grupo de amostras com diferentes microrganismos avaliados. Na comparação entre as concentrações de cada proteína expressa em cada grupo de amostras, verificou-se diferença estatística na concentração da proteína α- lactalbumina entre as amostras do grupo de leveduras e amostras sem crescimento bacteriano. Concluiu-se que proteínas de alta abundância do soro de leite tem sua concentração diminuída em função da severidade da mastite; proteínas de defesa, como Lactoferrina, Lactoperoxidase e IgG e IgM têm aumento em suas concentrações quando se comparam amostras de leite de vacas com mastite subclínica e amostras de leite de vacas sadias; as proteínas Lactoferrina e IgG constituem alvos em potencial para identificar vacas com mastite subclínica a partir de amostras de leite, podendo ser consideradas biomarcadores. Concluiu-se ainda que infecções intramamárias causadas pelos microrganismos isolados e identificados no presente estudo não alteram a concentração das proteínas no soro de leite de vacas em lactação; as amostras de leite com altas CCS podem apresentar resultado negativo para cultura microbiológica; os SCN apresentaram maior frequência de isolamento em amostras de leite de vacas em lactação, revelando características de oportunistas e saprófitas; e a infecção da glândula mamária causada por leveduras provoca aumento significativo da proteína α-lactoalbumina.

O objetivo do presente estudo foi avaliar as características físico-químicas, microbiológicas, índices de proteólise, lipólise e viscosidade do iogurte natural batido, elaborado a partir de leite integral contendo três níveis de células somáticas (CS): <400.000 células/mL, 400.000-800.000 células/mL e >800.000 células/mL. Cada tipo de leite foi obtido da ordenha de animais previamente selecionados de acordo com o nível de CS e a composição do leite. Para a fabricação do iogurte, o leite foi padronizado quanto ao teor de sólidos totais (ST) e transferido para tanque multi-uso, no qual foi submetido à pasteurização (90ºC, 15 minutos), seguida da adição da cultura starter, incubação (42ºC, aprox. 3 horas) e envase do produto. O iogurte foi mantido em câmara fria a 5ºC, sendo que os parâmetros de qualidade foram avaliados mediante a colheita de amostras nos dias 1, 10, 20 e 30 após a fabricação. A seqüência de elaboração foi repetida seis vezes, no período de março a agosto/2003. As análises efetuadas no produto incluíram: pH, acidez, percentuais de gordura, ST, sólidos não-gordurosos (SNG), nitrogênios total (NT), não caseinoso (NNC) e não protéico (NNP), ácidos graxos livres (AGL), viscosidade aparente, contagem de bactérias láticas e coliformes a 30º e 45ºC. Não foram constatadas diferenças (P > 0,05) entre os parâmetros físico-químicos e microbiológicos obtidos no leite e no iogurte. Os índices de proteólise dos iogurtes, estimados através da relação NT – NNC / NT – NNP, mantiveram-se constantes, não apresentando diferenças entre os tratamentos (P > 0,05). A viscosidade do iogurte produzido com leite contendo mais de 800.000 células/mL foi maior (P < 0,05) em relação aos outros tratamentos nos dias 10, 20 e 30 após a fabricação, observando-se uma correlação positiva (P < 0,05) com os níveis de CS no 10º e 20º dia de armazenamento. A concentração de AGL foi maior (P < 0,05) no iogurte de alta contagem de CS no 1º e 30º dia de armazenamento, sendo observada uma correlação positiva (P < 0,05) com o nível de CS nos mesmos dias. Os resultados indicam que o aumento dos níveis de CS no leite não apresenta efeitos sobre a proteólise do iogurte, porém origina um aumento na viscosidade e no grau de lipólise do produto durante o armazenamento por 30 dias. / The aim of the present study was to evaluate physical, chemical and microbiological characteristics, as well as proteolysis, lipolysis and viscosity of plain stirred yoghurt produced from whole milk with somatic cell counts (SCC) at levels of < 400,000 cells/mL, 400,000-800,000 cells/mL and > 800,000 cells/mL. Each milk treatment was obtained from selected cows, according to its SSC status and milk composition. Yoghurts were produced after standardisation of milk total solids (TS), followed by pasteurisation (90ºC, 15 minutes), addition of starter culture, incubation (42ºC, approx. 3 hours) and packaging. Yoghurts were stored at 5ºC, and quality evaluation was conducted in samples collected on days 1, 10, 20 and 30 after production. Manufacturing procedures were repeated for six times, from March to August/2003. Yoghurt analyses included: pH, acidity, fat, protein, TS, solids non-fat (SNF), total nitrogen (TN), non-casein nitrogen (NCN) and non-protein nitrogen (NPN), free fatty acids (FFA), apparent viscosity, lactic bacteria counts and coliforms at 30 and 45ºC. There were no differences (P > 0.05) in physical, chemical and microbiological parameters of milk and yoghurt among treatments. Proteolysis, as estimated by TN – NCN / TN – NPN relation, was constant for all treatment yoghurts (P > 0.05). Viscosity of high SCC yoghurt (> 800,00 cells/mL) increased (P < 0.05) on 10, 20 and 30 days storage, and a positive correlation (P < 0.05) with SCC was observed on days 20 and 30. FFA content was higher (P < 0.05) on days 1 and 30 of storage, and besides there was a positive correlation (P < 0.05) between SCC and FFA levels on the same days of storage. Results indicate that high SCC milk do not affect proteolysis of yoghurt, although it increases viscosity and lypolisis during storage for 30 days.

Vacas em lactação apresentam capacidade de síntese endógena de ácido ascórbico para suprir os seus requerimentos, no entanto, sob condições estressantes como altas temperaturas e umidade, elevadas produções de leite, parasitoses e incidência de doenças, pode haver produção insuficiente de ácido ascórbico para as demandas metabólicas do animal. Foram objetivos do presente estudo avaliar o efeito do estágio de lactação e número de lactações sobre a concentração plasmática de ácido ascórbico de 153 vacas em lactação e 40 vacas no período seco em 3 fazendas leiteiras, e sua correlação com: a contagem de células somáticas (CCS) no leite, níveis de glicose plasmática, níveis de ácidos graxos não-esterificados (AGNE), níveis de insulina plasmática, níveis de beta-hidroxibutirato (BHBA) plasmático, níveis de aspartato-aminotransferase (AST) plasmática, níveis de produção de leite e escore de condição corporal. Os animais foram escolhidos ao acaso e agrupados em 5 grupos de acordo com o estágio de lactação (estágio 1: 1-28 dias; estágio 2: 29-56 dias; estágio 3: 57-140 dias; estágio 4: 141-280 dias e estágio 5: vacas secas) e de acordo com o número de lactações (primíparas ou multíparas). Amostras de sangue foram coletadas para determinação de ácido ascórbico plasmático utilizando técnica de cromatografia líquida de alta pressão. A análise estatística foi realizada com o uso do programa computacional SAS. A concentração média (mg/L) de ácido ascórbico plasmático foi de 2,67; 2,60; 2,46; 2,63 e 2,60 para os estágios de 1 a 5 respectivamente, e de 2,52 e 2,63 para multíparas e primíparas. Foi identificada correlação negativa entre o ácido ascórbico plasmático e glicose e AGNE plasmáticos, e correlação positiva entre ácido ascórbico plasmático e produção de leite. Não foram registradas correlações entre ácido ascórbico plasmático e demais parâmetros. Baseado nos resultados do presente estudo, foi possível concluir que o ácido ascórbico plasmático não sofreu efeito de estágio de lactação ou número de lactações, e ainda que identificada correlação entre ácido ascórbico plasmático e as variáveis glicose, AGNE e produção de leite não foi possível identificar o fator determinante da variabilidade do ácido ascórbico plasmático em vacas leiteiras. / Dairy cows are totally dependent of endogenous synthesis of ascorbic acid to meet their requirements. Therefore, any condition that decrease the availability of ascorbic acid precursors like glucose and galactose, may result in insufficient synthesis of ascorbic acid. High producing dairy cows may be predisposed to subclinical ascorbic acid deficiency due to the elevated demand for glucose to lactose synthesis by mammary gland. The purpose of this study was to determine the effects of stage of lactation and number of lactations on plasma ascorbic acid concentration, and to establish the association between plasma ascorbic acid level and glucose, insulin, non-esterified fatty acids (NEFA), beta-hydroxybutyrate (BHBA), aspartate-amino transferase (AST), milk somatic cell count (SCC), milk yield and body condition score in dairy cows. One hundred and ninety three dairy cows (153 lactating and 40 dry cows) from 3 different herds were used in this study. Animals were randomly selected, and assigned to 5 groups according the stage of lactation (stage 1: 1-28 days; stage 2: 29-56 days; stage 3: 57-140 days; stage 4: 141-280 days and stage 5: dry cows) and the number of lactation (primiparous or multiparous). Blood samples were taken for ascorbic acid determination by HPLC technique. Statistical analysis was performed using the SAS program. Statistical significance was declared at the 5% level. Average plasma ascorbic acid concentration (mg/L) for Group 1 to 5 were 2.67; 2.60; 2.46; 2.63 and 2.60, respectively, and 2.63 and 2.52 for primiparous and multiparous cows. A negative correlation was observed between ascorbic acid and both glucose and NEFAs and a positive correlation between ascorbic acid and milk yield. No correlation was found between ascorbic acid and other parameters. Results of this study demonstrated that plasma ascorbic acid concentration did not change in response to stage of lactation and number of lactations and eventhough plasma ascorbic acid was correlated to glucose, NEFAs and milk yield, it was not possible to identify the factor that determine ascorbic acid variability in dairy cows.

Os objetivos deste trabalho foram determinar a sensibilidade e especificidade do limiar de contagem de células somáticas (CCS) de vacas Gir para o diagnóstico de mastite subclínica causada por patógenos primários e secundários e avaliar os efeitos de rebanho, vaca, mês de coleta, quarto mamário, presença de infecção intramamária, tipo de microrganismo e suas interações sobre o logCCS e composição do leite. Avaliou-se a hipótese que o limiar da CCS para detecção de mastite subclínica é igual entre vacas Gir e Holandesas. Foram utilizadas 221 vacas Gir em lactação, provenientes de três fazendas comerciais. Foram coletadas amostras de leite individuais por quarto mamário e compostas uma vez por mês, durante um ano. Foram realizadas análises de CCS, composição do leite e cultura microbiológica. O quarto mamário e a vaca foram considerados unidades experimentais. Para determinar a sensibilidade, especificidade e odds ratio (OR) dos limiares da CCS para identificação de quartos infectados, foram utilizados quatro valores de CCS: 100, 200, 300 e 400 (x 103 células/mL), assim como a correlação entre a CCS e composição do leite. Não houve efeito do rebanho sobre o logCCS para amostras individuais de quartos mamários e compostas, mas vaca dentro de rebanho foi o principal fator responsável pela variação do logCCS. Houve efeito do rebanho sobre a composição do leite, assim como o mês de coleta apresentou efeito tanto sobre o logCCS quanto para a composição do leite, considerando as duas unidades experimentais. A presença de infecção intramamária afetou negativamente a composição do leite, exceto sobre o teor de gordura; sendo que os maiores teores de lactose, proteína e ESD foram encontrados em amostras sem isolamento bacteriano. Os maiores logCCS foram obtidos em amostras infectadas. O limiar da CCS de 100 x 103 células/mL apresentou, em ambas as unidades experimentais, maiores valores de sensibilidade e valor preditivo negativo. O limiar de 200 x 103 células/mL apresentou maior chance da ocorrência de mastite do que o limiar de 100 x 103 células/mL. Foi observada correlação negativa entre CCS com lactose e extrato seco desengordurado (ESD), mas a correlação foi positiva entre CCS com gordura e proteína, tanto em nível de quarto mamário quanto de vaca. Portanto, a composição do leite foi influenciada pela CCS, os teores de lactose e ESD diminuíram em altas CCS, enquanto que as concentrações de gordura e proteína aumentaram. / The aim of this study was to determine the sensibility and specificity of somatic cell count (SCC) threshold in Gyr cows to diagnosis the subclinical mastitis caused by primary and secondary pathogens, and to evaluate the effect of herd, cows, month, mammary quarter, intramammary infection, type of microorganism and their interactions on logSCC and milk composition. The hypothesis to be tested was that the SCC threshold to detection of subclinical mastitis is the same for Holstein and Gir cows. A total of 221 lactation Gir cows from three commercial dairy farms was selected. Composed and quarter individual milk samples were collected once a month, during one year for SCC, milk composition and bacteriological analysis. The mammary quarter and the cow were considered experimental units. To determine the sensibility, specificity and odds ratio (OR) from SCC threshold to identify the infected quarters four values of SCC: 100, 200, 300 and 400 (x 103 cells/mL) were used. It was also evaluated the correlation between SCC and milk composition. There was no effect of herd on logSCC in individuals and composed samples, but cow nested within herd was major factor responsible for the logSCC variation. The month of sampling presented significant effect on logSCC and milk composition in both experimental units. The intramammary infection presence affected negatively the milk composition, except of fat concentration. Higher lactose, protein and non-fat solids (NFS) percentages were found in negative samples and higher logSCC were observed in infected samples. The SCC threshold of 100 x 103 cells/mL presented the major sensibility and negative predictive value for subclinical mastitis detection. The threshold of 200 x 103 cells/mL had higher chance to have mastitis than the threshold of 100 x 103 cells/mL. It was observed a negative correlation between SCC with lactose and NFS; but the correlation was positive between SCC with fat and protein in mammary quarters and cow level. Milk composition was influenced by SCC, once the lactose and NFS percentages decreased in samples with high SCC and the protein and fat concentration increased.

A presente tese estudou o diagnóstico e tratamento da mastite bovina pela avaliação do uso de um teste prático de CCS, pela utilização de cultura bacteriológica a campo e pela definição de protocolos de tratamento. Para rápida determinação da CCS, o teste Somaticell® foi usado em amostras de leite tendo o resultado comparado à contagem eletrônica e avaliado por tipo de amostra e pessoa. O Somaticell determinou corretamente a CCS de amostras frescas de leite de quartos mamários. A correlação registrada entre o Somaticell e a CCS eletrônica foi 0,92 e o coeficiente de concordância 0,82. O teste mostrou adequada validade para determinar infecções intramamárias (sensibilidade 91,3%; especificidade 96,0%) e apresentou contagens mais elevadas em amostras contendo patógenos. Pequena variação foi verificada nos resultados do teste quando realizado em duplicata. Entretanto na análise geral dos dados, a variação observada não foi significativa nem afetou a quantidade de amostras com mastite subclínica. Amostras de leite conservadas a 4 ºC por até 5 horas não influenciaram os resultados do Somaticell, mas amostras congeladas ou adicionadas do conservante bronopol não devem ser usadas. Quanto ao diagnóstico da mastite clínica, as infecções causadas por bactérias Gram positivas foram em maioria isoladas de casos clínicos com alteração visual do leite e edema de úbere, de vacas reincidentes e com CCS mensal média maior de 200.000 céls/mL. Por outro lado, as mastites causadas por bactérias Gram negativas apresentaram em maioria casos clínicos com comprometimento sistêmico em vacas de alta produção. Enquanto isso, as amostras mastíticas com ausência de crescimento na cultura laboratorial apresentaram grau da mastite e perfil do animal variado. A cultura bacteriológica realizada na propriedade leiteira com o conjunto dos meios Sangue Base Azida, MacConkey e Vogel-Johnson, mostrou adequada recuperação dos patógenos causadores de mastite clínica. Do total de 203 cultivos realizados na fazenda e em laboratório 79,3% mostraram concordância. A taxa de concordância das culturas foi afetada pelo número de unidades formadoras de colônia presente na amostra de leite. A sensibilidade e especificidade registradas para a cultura a campo foram 83,0 e 76,5%, respectivamente, as quais foram positivamente influenciadas pelo isolamento de bactérias Gram positivas, e negativamente pelo isolamento de bactérias Gram negativas e resultados com ausência de crescimento. O cultivo feito na fazenda mostrou vantagens em usar amostras de leite frescas, porém a leitura precoce do crescimento bacteriano e a metodologia simples reduzem sua acurácia. Para o tratamento das mastites clínicas com base no resultado da cultura a campo, foi encontrada taxa geral de cura bacteriológica de 69,7%. A CCS da maioria dos tetos que apresentaram mastite se manteve elevada até 21 dias pós-detecção da doença. Mastites causadas por bactérias Gram negativas mostraram taxas de cura mais altas. Já as mastites causadas por Staphylococcus aureus tiveram as menores taxas de cura apesar da utilização de tratamento antibiótico estendido. As mastites de grau 1 e 2, com isolamento de bactérias Gram negativas e ausência de crescimento na cultura bacteriológica, não apresentaram diferença em cura sendo ou não tratadas com antibiótico intramamário. / The present thesis investigated the diagnosis and treatment of bovine mastitis by using a simple test for somatic cell count, on-farm bacteriological culture and guided treatment protocols. To rapidly determine SCC, Somaticell® test was used on milk samples having the results compared to electronic count and evaluated by sample type and reader. The Somaticell test correctly determined the SCC in fresh milk samples of mammary quarters. The correlation between Somaticell and electronic SCC was 0.92, being kappa coefficient equals to 0.82. This test presented good reliability to determine intramammary infections using a threshold of 205.000 cells/mL (sensitivity = 91.3% and specificity = 96.0%) and showed greater SCC in samples containing major mastitis pathogens. Minor intra-individual variation was detected when performing the test. Probably, the homogenization procedure of the test is the most likely explanation for the observed variation. However, the final analysis indicated that this variation was not significant and did not affect the amount of samples classified as having subclinical mastitis. Milk samples preserved at 4 ºC up to 5 hours did not change test results. Nevertheless, frozen or bronopol preserved samples were not suitable for this test. Clinical mastitis data indicated that infections caused by Gram positive bacteria were mainly seen on clinical cases with visual milk abnormalities and udder edema of clinical recurrent animals showing monthly average SCC greater than 200,000 cells/mL. In contrast, clinical mastitis caused by Gram negative bacteria was frequently associated with systemic signs in high producing cows. In addition, mastitic samples without bacterial growth in the laboratory did not present a defined pattern in relation to mastitis grade and animal characteristic. The on-farm bacteriological culture using Azide Blood Agar Base, MacConkey Agar and Vogel-Johnson Agar, showed adequate recovery of mastitis causing pathogens. In 79.3% of the cultures (n = 203) the on-farm results agreed with the standard laboratory culture. Interestingly, the concordance rate was affected by the number of colony forming units in the milk sample. The sensitivity and specificity of on-farm culture were 83.0 and 76.5%, respectively. These results were positively influenced by growth of Gram positive bacteria and negatively influenced by growth of Gram negative bacteria and samples with no growth. The use of fresh milk samples in on-farm culture seemed advantageous for bacterial recovery, although premature plate reading of bacterial growth and simplicity of this methodology might reduce its accuracy. Mastitis treatment guided by on-farm culture showed an overall bacteriological cure rate of 69.7%. In the majority of quarters, SCC remained elevated within 21 days after detection of clinical mastitis. Gram negative bacteria presented greater cure rates. On the contrary, Staphylococcus aureus mastitis displayed the lowest cure rate even by using extended antibiotic treatment. Intramammary antibiotic treatment did not show effect on cure rates of grade 1 and 2 clinical mastitis caused by Gram negative bacteria or with negative growth in the on-farm culture.

A exploração dos bubalinos para a produção de leite e elaboração de seus derivados é uma atividade que tem crescido nos últimos anos no Brasil. Os búfalos apresentam problemas sanitários semelhantes aos bovinos. Objetivou-se neste estudo, desenvolver o isolamento e caracterização fenotípica e molecular dos principais microrganismos causadores de mastites subclínicas em búfalas (Bubalus bubalis) em quatro granjas leiteiras da região central do Estado de São Paulo, Brasil, através dos testes contagem de células somáticas (CCS), contagem padrão em placas (CPP), caracterização fenotípica e bioquímica dos microrganismos isolados e confirmação pela técnica de PCR, assim como também avaliar o perfil de sensibilidade bacteriana aos principais antimicrobianos para os patógenos mais frequentemente isolados em casos de mastite subclínica em bubalinos. Foram coletadas 20 amostras de leite de búfalas em lactação no ano de 2013, que apresentaram CCS acima de 200.000 cel/mL em controles realizados pelas fazendas. Tendo como base a Instrução Normativa Nº62 de 2011 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), que trata de padrões microbiológicos para leite bovino. Das 20 amostras analisadas neste trabalho, apenas 1 (5%) estava dentro do padrão estabelecido (1 x 104 UFC/mL) com uma variação nos resultados encontrados de 1,0 x 104 UFC/mL a 57,7 x 105 UFC/mL. A CCS apresentou uma mediana de 721.000 cel/mL no leite (valor mínimo: 205.000, valor máximo: 2.264.000), indicando presença de mastite subclínica. Constatou-se que os agentes com maior frequência de isolamento foram Staphylococcus epidermis (17%), Staphylococcus aureus (15%) e Bacillus spp. (14%). Os ensaios de PCR confirmaram os resultados obtidos com o isolamento na caracterização fenotípica e bioquímica de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Streptococcus spp. e Escherichia coli. Com a realização do antibiograma, foi possível traçar um perfil de sensibilidade aos diferentes antibióticos testados. O estudo de sensibilidade bacteriana detectou maior sensibilidade (100%) do Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermis aos antibióticos gentamicina e vancomicina; para o gênero Streptococcus spp. à gentamicina e oxacilina e para Escherichia coli à ampicilina. / The exploration of buffaloes for milk production and dairy products is an activity that has grown in recent years in Brazil. Buffaloes present similar health problems for cattle. The objective of this study was to determine the isolation and the phenotypic and molecular characterization of the main microorganisms causing of subclinical mastitis in buffaloes (Bubalus bubalis) on four dairy farms in the central region of state of Sao Paulo, Brazil, through testing somatic cell count (SCC), standard plate count (SPC), phenotypic and biochemical characterization of the microorganisms isolated and confirmed by PCR technique, as well as to evaluate the profile of bacterial sensitivity to antibiotics given for the major pathogens commonly isolated in cases of subclinical mastitis in buffaloes Twenty milk samples from lactating buffaloes were analyzed in 2013 that have presented SCC above 200,000 cells/mL. Based on the Instruction Normative N°62 of 2011 of the Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) which deals with microbiological standards for bovine milk, of the 20 samples analyzed in this study, only 1 (5%) was within the established standard (1x104 CFU/mL) with a variation in the results of 1.0x104 CFU/mL to 57.7x105 CFU/mL. The CCS showed a median of 721,000 cells/mL in the milk (minimum value; 205,000, maximum value: 2,264,000), indicating the presence of subclinical mastitis. It was found that agents with higher frequency of isolation were Staphylococcus epidermis (17%), Staphylococcus aureus (15%) and Bacillus spp. (14%). The PCR assays confirmed the results obtained with isolating in the phenotypic and biochemical characterization of Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus spp. and Escherichia coli. With the realization of the antibiogram was possible to draw a profile of resistance of different antibiotics tested. The study of bacterial sensitivity showed that for higher sensitivity (100%) of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis to antibiotics gentamicin and vancomycin; for the genus Streptococcus spp. to gentamicin and oxacillin and for Escherichia coli to ampicilina.