La formation et le développement d’une tumeur sont provoqués par une série de défauts qui se produisent à l'intérieur de la cellule cancéreuse et dans son microenvironnement. Ces anomalies permettent à la cellule de développer ses propres stratégies de croissance, de prolifération, de différenciation et de métabolisme.La modification du métabolisme respiratoire, est l'une des stratégies utilisée par les cellules cancéreuses favorisant la fermentation lactique au lieu de la phosphorylation oxydative OXPHOS (respiration). Cette adaptation métabolique porte le nom d’effet Warburg.Nous avons proposé un concept thérapeutique novateur basé sur l'induction de changements métaboliques par l'utilisation de dichloroacétate (DCA) associée avec l'immunothérapie en utilisant les cellules NK activées. Le DCA, molécule inhibitrice de la PDK, induit l'activation de la PDH, responsable de la catalyse de pyruvate en Acétylcoenzyme A (Ac-CoA), favorise alors l’oxydation du glucose dans la mitochondrie. Le DCA a déjà été utilisé depuis longtemps comme traitement hypocholestérolémiant et bloquant l’acidose lactique. Mon équipe a montré auparavant que le changement métabolique permet aux cellules tumorales d'échapper à la réponse immune.Nous avons observé que le traitement par DCA induisait, dépendante du phénotype p53, une forte up-régulation de l'expression du mRNA et des protéines de stress MICA, MICB et ULBP1, ligands spécifiques des récepteurs activateurs NKG2D des cellules NK, et induise alors une réponse cytotoxique contre les cellules tumorale.D'autre part nous avons évalué l'effet de DCA sur l'expression des transporteurs ABC qui interviennent dans l'efflux des agents anticancéreux utilisé dans la chimiothérapie. L'expression des transporteurs ABC était fortement liée aux phénotypes de chimiorésistance. Nous avons bien confirmé que le DCA provoque une diminution de l'expression de ABCB1, ABCC1, ABCC5 et ABCG2 dans les cellules wtp53 alors qu'il induit une augmentation dans les cellules mutantp53 ou nullp53.Les promoteurs des transporteurs et les protéines de stress étudiés comportent également plusieurs sites de liaison spécifique au facteur de transcription MEF2, qui est la cible d’ERK5. Nous avons bien constaté que en plus de ca capacité de changer le métabolisme tumorale, le DCA modifie l'expression ABCB1, ABCC1, ABCC5 et ABCG2 par l'activation de la voie ERK5/MEF2 .Ces résultats sont confirmé dans diverses lignées cellulaires, ainsi que dans des cellules issues de patients et dans un modèle in vivo / Tumorigenesis is caused by a series of defects that occur within the cancer cell and its microenvironment. These abnormalities allow the tumor cell to develop its own strategies for growth, proliferation, differentiation and metabolism. In the last, cancer cells favor lactic fermentation instead of oxidative phosphorylation OXPHOS (respiration). This metabolic adaptation is called the Warburg effect.We proposed an innovative therapeutic concept based on the induction of metabolic changes by the use of dichloroacetate (DCA) and this is associated with immunotherapy using activated NK cells. DCA, a pyruvate dehydrogenase kinase (PDK) inhibitor, induces the activation of pyruvate dehydrogenase (PDH), responsible for the catalysis of pyruvate to acetylcoenzyme A (Ac-CoA), promoting the oxidation of glucose/pyruvate in the mitochondria. DCA has been used for a long time as a cholesterol-lowering and anti-lactic acidosis therapy. My team has previously shown that the metabolic change allows tumor cells to escape the immune response. I have observed that DCA treatment induced a high upregulation of mRNA and protein expression of the stress ligands MICA, MICB and ULBP1. These are recognized by the NK cell activating receptor NKG2D, inducing a NK cell-mediated cytotoxic response against tumor cells. DCA-induced expression of these stress ligands depends on wtp53 expression on the tumor cell.On the other hand, we evaluated the effect of DCA on the expression of ABC carriers, which intervene in the efflux of anticancer agents used in chemotherapy. The expression of ABC carriers is strongly related to drug resistance phenotypes. We observed that DCA causes a decrease in the expression of ABCB1, ABCC1, ABCC5 and ABCG2 in wtp53 cells while it induces an increase in mutantp53 or nullp53 cells. Conversely, DCA-induced accumulation of antitumor drugs, i.e. daunorubicin, and favors chemotherapy-induced tumor death only in wtp53-expressing cancer cells. The promoters of these ABC transporters and the stress proteins presented above contain several binding sites specific to the transcription factor MEF2, which is the target of ERK5. We have found that in addition to the ability to change tumor metabolism, DCA modifies the expression ABCB1, ABCC1, ABCC5 and ABCG2 by activation of the ERK5 / MEF2 pathway. These results are confirmed in various cell lines, in cells derived from patients and in an in vivo model

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

De nombreuses données expérimentales et cliniques ont montré l'importance des cellules Natural Killer (NK) dans l'immunosurveillance antitumorale. Les stratégies thérapeutiques basées sur les cellules NK pourraient donc être une alternative de choix dans le traitement de certains types de cancers. Nous avons focalisé notre étude sur deux types de cancer incurables malgré les récents progrès thérapeutiques : la leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B) et le cancer de la prostate. Le but de notre étude est une meilleure compréhension des mécanismes mis en place par les cellules B leucémiques et les cellules tumorales prostatiques pour échapper à la réponse antitumorale des cellules NK. La connaissance de ces mécanismes d'échappement est un pré-requis indispensable à l'utilisation des cellules NK dans les thérapies antitumorales. Concernant la LLC-B, nos résultats suggèrent que les cellules NK de patients, fonctionnellement compétentes, ne peuvent pas initier une réaction immunitaire appropriée envers les cellules B leucémiques due au manque de reconnaissance de ces dernières. Concernant le cancer de la prostate, nos données préliminaires montrent que les cellules NK circulantes de patients sont également fonctionnellement compétentes, quelque soit le stade de la maladie, malgré la diminution significative de l'expression du récepteur NKp30. Ainsi, le degré d’immunogénicité des cellules B leucémiques et celui des cellules tumorales prostatiques devra être autant pris en compte que la fonctionnalité des cellules NK dans les stratégies visant à optimiser l'activité antitumorale de ces dernières. / Many experimental and clinical data have enlightened the importance of Natural Killer (NK) cells in tumor immunosurveillance. Therapeutic strategies based on NK cells could be an alternative in the treatment of certain cancers. We focused our study on two types of incurable cancers despite recent advances in treatment: B chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) and prostate cancer. The aim of our study is a better understanding of the mechanisms set up by leukemic B cells and prostate cancer cells to escape from NK antitumor response. The knowledge of these escape mechanisms is an essential prerequisite to the use of NK cells in antitumor therapies. Regarding B-CLL, our results suggest that NK cells, although functionally competent, can not initiate an appropriate immune response against leukemic B cells due to a lack of recognition of the latter. Concerning the prostate cancer, our preliminary data show that circulating NK cells are functionally competent, whatever the stage of disease, despite the significant decrease in expression of the receptor NKp30. Thus, the degree of immunogenicity of leukemic B cells and of the prostate cancer cells must be taken into account as well as the functionality of NK cells in strategies aiming at improving NK antitumor activity.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les cellules Natural Killer (NK) sont des lymphocytes capables de tuer les cellules tumorales avec une expression altérée des molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH) de classe I . Chez l’homme, cette reconnaissance de “l’absence du soi” est relayée par l’absence d’engagement des antigènes des leucocytes humains (HLA) par les récepteurs inhibiteurs des cellules NK. Chez l’homme, ces récepteurs inhibiteurs incluent les récepteurs KIR qui ont comme analogues fonctionnels chez les rongeurs les lectines Ly49. Certaines tumeurs échappent à la surveillance des NK en augmentant leur expression des molécules HLA. Donc, bloquer les interactions entre les molécules KIR et HLA est une stratégie anti-tumorale intéressante qu’INNATE PHARMA a décidé d’explorer en développant l’anticorps thérapeutique anti-KIR 1-7F9. Mais, ces interactions sont nécessaires pour l’acquisition des fonctions des NK, i.e leur éducation. De plus, elles sont impliquées dans la tolérance aux cellules du soi par les cellules NK. Anticiper la toxicité de 1-7F9, évaluer ses propriétés anti-tumorales et son impact sur l’éducation des NK étaient les objectifs de notre travail. Deux modèles murins ont été développées à ces fins. Le premier, est basé sur les souris B6 : les récepteurs inhibiteurs Ly49 C/I ont pour ligand les molécules H-2b. Le second modèle est basé sur des souris transgéniques pour un unique récepteur KIR et son ligand, en l’absence des molécules endogènes de CMH de classe I murines. Ces deux modèles ont montré que le blocage des récepteurs inhibiteurs n’altère pas la tolérance au soi des NK et est une stratégie anti-tumorale efficace qui n’altère pas la fonctionnalité des NK. / Natural Killer cells (NK cells) are lymphocytes able to kill tumors with aletered expression of Major Histocompatibility Complex (MHC) class I molecules. This “missing self” recognition is mediated by the lack of engagement of Human Leukocytes Antigens (HLA) with NK inhibitory receptors that include Killer Immunoglobulin like Receptors (or KIR) in humans. In rodents, the functional analogues of KIR are Ly49 lectins. Some tumors escape NK cell immune surveillance by increasing the expression of HLA molecules on their surface. So, blocking interactions between KIR and HLA molecules constitutes an interesting therapeutic strategy that INNATE PHARMA decided to explore, developing the anti-KIR monoclonal antibody 1-7F9. Nevertheless, these interactions are necessary for the acquisition of NK functional properties, i.e for their “education”. They are also involved in self-tolerance on educated NK cells. For the pre-clinical development of 1-7F9, it was necessary to anticipate anti-KIR mAb safety and toxicity, evaluate its anti-cancer potential and its impact on NK education. A first part of our work was performed in a surrogate B6 mouse model:Ly49 C/I inhibitory receptors have H-2b molécules as endogenous ligand. Their interactions were blocked with anti-Ly49 C/I monoclonal antibody. In a second part, we report the generation of transgenic mice expressing a single inhibitory KIR in the context of its HLA ligand and in absence of endogenous mouse MHC class I molecules. Both models showed that the blockade of NK inhibitory receptors interactions with their endogenous ligands did not break self tolerance, had a strong anti-tumor effect and did not abrogate NK functionality.

Le glioblastome (GBM) représente environ 50 % des gliomes, le type de tumeur cérébrale le plus répandu. Sa forte agressivité se traduit par un faible et inquiétant taux de survie médian de 8 mois. La résistance intensive aux traitements actuels du GBM souligne la nécessité d'approches innovantes. Malgré l'essor récent d’immunothérapies ces dernières années, le GBM présente plusieurs attributs qui entravent l’efficacité de ces thérapies. Les cellules Natural Killer (NK) possèdent d’intéressantes propriétés anti-tumorales qui encouragent leur utilisation en tant que source prometteuse de thérapie cellulaire adoptive pour relever les défis posés par le GBM. Ce projet est une collaboration avec Scott McComb (National Research Center, Ottawa), dont l'équipe a développé des vecteurs lentiviraux de récepteurs antigéniques chimériques (CARs) ciblant EGFRvIII et HER2, respectivement exprimés dans 30 % et surexprimés dans 80 % des cas de GBM. Nous proposons d’adapter ces constructions aux domaines activateurs transmembranaires et intracellulaires optimisés pour la signalisation des cellules NK. L’objectif est d'optimiser la stabilité de l'expression CAR dans les cellules NK. Cela permettra d'augmenter durablement l'efficacité et la spécificité de la cytotoxicité cellulaire de cellules cancéreuses EGFRvIII+ et HER2+. Des vecteurs lentiviraux codant pour le rapporteur eGFP sous 5 promoteurs différents ont été produits. Des cellules NK primaires activées ont été modifiées par transduction lentivirale et triées en fonction de l'expression du transgène afin d'enrichir la population de cellules modifiées. Nos données suggèrent que la séquence régulatrice minimale UCOE pourrait conférer à elle seule une expression stable et robuste du transgène dans les cellules NK pendant 12 semaines. Ce promoteur a ensuite été incorporé dans les constructions CAR-NK pour optimiser la stabilité d’expression du CAR. L’efficience des CAR anti-EGFRvIII et des CAR anti-HER2 ont été évaluées in vitro en utilisant la lignée cellulaire U87 dérivée du GBM dans des tests de cytotoxicité. Parmi les constructions sélectionnées, CAR-F269 et sdCAR-HER2-6 ont montré une cytotoxicité significativement améliorée par rapport aux cellules NK non modifiées contre des cibles spécifiques de l'antigène. L'amélioration de la cytotoxicité observée avec sdCAR-HER2-6 était positivement corrélée à l'intensité de l'expression de HER2 dans les cellules cibles. Ce projet représente une preuve de principe qui suggère le potentiel de la thérapie CAR-NK comme une voie prometteuse dans la lutte contre le GBM et d'autres tumeurs solides. / Glioblastoma (GBM) accounts for approximately 50% of gliomas, the most prevalent type of brain tumor. Its high aggressiveness results in a worrying poor median survival rate of 8 months. Intensive resistance to current treatments for GBM highlights the need for innovative approaches. Despite recent growth in immunotherapies, GBM exhibits several hallmarks that hinder effectiveness of such therapies. Natural killer (NK) cells display interesting anti-tumoral properties that encourage their use as a promising adoptive cell therapy source to address the GBM challenges. This project is a collaboration with Scott McComb (National Research Center, Ottawa), whose team developed lentiviral vectors coding for chimeric antigen receptors (CARs) targeting EGFRvIII and HER2, which are respectively expressed in 30% and overexpressed in 80% of GBM cases. We propose to adapt these constructs to transmembrane and intracellular activator domains which are optimized for NK cell signaling. The objective is to optimize the stability of CAR expression in NK cells. This will allow for a sustained increase in killing efficacy and specificity of EGFRvIII+ and HER2+ cells. First, lentiviral vectors encoding the eGFP reporter under 5 different promoters were produced. Activated primary NK cells were modified by lentiviral transduction and sorted for transgene expression to enrich the population of modified cells. Our data suggest that the minimal regulatory sequence UCOE may confer alone a stable and robust transgene expression in NK cells for 12 weeks. The UCOE promoter was then incorporated into CAR-NK constructs to optimize the stability of CAR expression. The efficiency of anti-EGFRvIII CARs and anti-HER2 CARs were evaluated in vitro using the GBM-derived U87 cell line in cytotoxicity assays. Among the screened constructs, CAR-F269 and sdCAR-HER2-6 exhibited significantly enhanced cytotoxicity against antigen-specific targets, in comparison to unmodified NK cells. The enhancement of cytotoxicity observed with sdCAR-HER2-6 was found to positively correlate with the intensity of HER2 expression in the target cells. This project represents a proof of principle that suggests the potential of CAR-NK therapy as a promising avenue of in the fight against GBM.

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L’immunothérapie a permis des avancées majeures dans la thérapie du cancer. Le traitement par des cellules T modifiées pour exprimer un récepteur chimérique d’antigène (CAR) a changé complètement la vision de la thérapie de la leucémie. L’efficacité de ce traitement sur des cancers résistants, a ouvert la voie à la thérapie cellulaire et génique dans ce contexte. Malgré les premiers résultats très positifs, il s’avère que l’épuisement cellulaire et la perte des cellules T thérapeutiques est un problème majeur pour maintenir l’efficacité de la thérapie CAR et prévenir les rechutes. Les travaux présentés dans cette thèse visent à permettre l’utilisation d’autres types cellulaires pour la thérapie CAR. L’hypothèse de travail est que les cellules NK ou les cellules souches hématopoïétiques (HSC) permettrait de dépasser les limites de la thérapie CAR utilisant les cellules T. Pour permettre l’utilisation des cellules NK, un des problèmes technique est la transduction par les vecteurs viraux. Les travaux présentés ici démontrent que l’utilisation de l’enveloppe BaEV permet une transduction efficace des NK avec un vecteur lentiviral. Par cette méthode nous avons pu générer de grandes quantités de cellules NK transduites avec un CAR, prouvant la possibilité d’utiliser les NK dans la thérapie CAR. L’utilisation des HSC dans la thérapie CAR, permettrait de produire des cellules CAR T en permanence pour renouveler les cellules T épuisées. Cependant, la surexpression d’un récepteur CAR sur toutes les cellules dérivant des HSC pourrait être un problème. Pour permettre l’utilisation des HSC, nous avons développé des promoteurs spécifiques courts restreignant l’expression du transgène à une population précise. Nous avons prouvé la spécificité d’un promoteur T et démontré la possibilité de l’utiliser dans le contexte de la thérapie CAR utilisant les HSC. Ces travaux sont une preuve de concept de l’utilisation d’autres cellules que les cellules T dans la thérapie CAR. / Immunotherapy has allowed major advances in cancer therapy. The treatment using modified T cells with a chimeric antigen receptor (CAR) completely changed the vision of leukemia therapy. The efficiency against resistant cancer paved the way to cellular and gene therapy in this context. Despite very positive results at first, the disappearance and exhaustion of therapeutic cells seems to be a major problem to maintain the efficiency of the CAR treatment and prevent relapses. The work of this thesis is to allow the use cell types other than T cells for CAR therapy. The hypothesis is that NK cells or hematopoietic stem cells (HSC) could overcome the limitation of CAR therapy using T cells. To allow the use of CAR NK cells, a major technical issue is the transduction by viral vectors. The work presented here shows the use of BaEV envelope to pseudotype vectors allows an efficient transduction of NK cells. Using this method, we were able to produce large amounts of CAR NK cells, showing the possibility to use NK cells in CAR therapy. The use of HSC in CAR therapy, could allow the permanent replenishment of the pool of CAR T cells once exhausted. Despite that advantage, the overexpression of a CAR receptor on all hematopoietic cells coming from those HSC could be an issue. To allow the use of HSC, we developed short specific promoters restraining the expression of the transgene to a precise population. We prove the specificity of a T cell promoter and demonstrated the possibility to use it in CAR therapy using HSC. This work is a proof of concept of the use of other population than T cells in CAR therapy.