Malgré d’importants progrès en recherche fondamentale et clinique, le cancer du sein reste à ce jour le premier cancer féminin en termes d’incidence et de mortalité. Parmi les facteurs contribuant à son développement, notre laboratoire a mis en évidence le rôle des neurotrophines, en particulier le NGF (Nerve Growth Factor) et son précurseur (proNGF). D’autre part, les études récentes ont permis de démontrer l’importance des cellules souches cancéreuses (CSC) dans la tumorigenèse et dans les phénomènes de résistance thérapeutique et de métastase. Mon projet de thèse avait pour but d’étudier les effets du NGF et du proNGF sur la régulation des CSC de sein et d’évaluer la conséquence sur le développement tumoral. Nous avons pu démontrer que le NGF et le proNGF sont capables d’enrichir la population de CSC dans plusieurs lignées de cellules épithéliales mammaires cancéreuses. Cet enrichissement est lié à la surexpression de plusieurs facteurs de transcription essentiels dans le maintien de la pluripotence des cellules souches. Les expériences de tumorigenèse chez les souris montrent que les cellules cancéreuses de sein MCF-7 cultivées en présence de NGF et de proNGF présentent une tumorigenèse accrue comparée aux cellules contrôles. De façon intéressante, seul le traitement au NGF induit la formation de métastases dans cerveau, poumons et foie, ainsi que une transition épithélio-mésenchymateuse. Ces travaux ont permis de monter que le NGF et le proNGF agissent sur le compartiment des CSC et contribuent à la régulation de la plasticité des cellules cancéreuses in vitro et in vivo. / Despite significant advances in cancer research and treatment, breast cancer remains one of the leading causes of cancer-related death in women. NGF (Nerve Growth Factor) and its precursor (proNGF) are overexpressed in breast cancer cells, where they exert a mitotic, anti-apoptotic and pro-invasive effects through an autocrine loop. In the last few years, a raising number of experimental data indicate the importance of “cancer stem cells” (CSC) in tumour development, metastasis and resistance to therapies.The objective of my thesis was to evaluate the influence of NGF and proNGF on breast CSC biology and to determine their consequences on tumour development. We demonstrated that NGF and proNGF are able to enrich for CSC in several breast cancer cell lines. This enrichment is connected to the overexpression of several transcription factors essential for stem cells self-renewal and pluripotency. Tumorigenicity assays in SCID mice proved that cells from MCF-7 cell line cultured with NGF or proNGF are more tumorigenic than the control condition. Nevertheless, only cells pre-treated with NGF were able to develop metastases in brain, lung and liver and to go through an epithelial-to-mesenchymal transition, demonstrating that NGF and proNGF induce their effects through different signaling pathways. Taken together, our results have shown that NGF and proNGF contribute to the regulation of stem cells’ plasticity in vitro and in vivo. Future perspectives concern the comprehension of involved molecular mechanisms in order to better understand their implication in breast cancer development.

Selon le modèle hiérarchique, seule une sous-population tumorale, les CSC (cellules souches cancéreuses), est capable de générer une tumeur. Ces CSC possèdent des caractéristiques communes aux cellules souches normales comme la capacité d’autorenouvellement illimité et de différenciation. Plusieurs études ont montré que des traitements anti-tumoraux pouvaient générer des CSC à partir de cellules cancéreuses non souches. Ce mécanisme de reprogrammation pourrait donc être une cause majeure des échecs thérapeutiques et des récidives. Actuellement, il est impossible de différencier les CSC préexistantes des CSC induites (iCSC) suite à la reprogrammation. En effet, ces populations possèdent toutes deux les mêmes propriétés «souches» et sont identifiées par les mêmes marquages conventionnels. De plus, faute de marqueurs de reprogrammation, les études ne permettent pas un suivi dynamique de la plasticité cellulaire. Il est donc impératif de disposer de moyens spécifiques permettant l’identification de manière différentielle des CSC préexistantes et des iCSC pour l'étude de l’implication de la reprogrammation suite aux traitements. Dans le cadre de ce travail de thèse, j’ai mis en évidence que le promoteur de l’ALDH1A1 pouvait être un marqueur de l’activité des CSC. Les cellules identifiées par ce marqueur présentent des propriétés d’autorenouvellement, de différenciation, de résistances aux thérapies et de tumorigenèse in vivo. Le suivi de ces cellules par fluorescence a également permis de visualiser le phénomène de reprogrammation en temps réel suite à l’irradiation. Tout comme il a permis de mettre en évidence le plus fort potentiel d’extravasation de ces cellules dans un modèle de puces mimant un microvaisseau. J’ai ainsi par la suite construit un vecteur d’expression inductible basé sur l’activité de ce promoteur afin de suivre de manière dynamique les différentes populations cellulaires : non CSC, CSC préexistantes et iCSC. Ce vecteur se compose de plusieurs systèmes, notamment le système inductible TetON, le système CRE-loxP et le système de recombinaison Flp/FRT permettant le suivi des populations cellulaires par fluorescence. Mes travaux de thèse ont ainsi permis la génération d’outils utilisables pour le suivi dynamique des CSC et des CSC induites par les thérapies. / Many solid cancers are thought to be organized hierarchically with a small number of cancer stem cells (CSCs) able to re-grow a tumor while their progeny lacks this feature. These CSCs are associated with radioresistance. Recent studies have revealed that non-cancer stem cells may undergo dedifferentiation subsequently obtaining the phenotype and functions of CSCs. Indeed, ionizing radiation reprogrammed differentiated breast cancer cells into induced cancer stem cells (iCSCs). This mechanism of reprogramming can contribute to relapse. CSCs and iCSCs cannot be distinguished as they share the same stem cell-like properties. Breast CSCs can be isolated based on their high ALDH1 activity while iCSC studies require originally sorting of ALDH1-negative cells. Such studies are limited to in vitro experiments. In vivo reprogramming studies require designing a specific CSC and iCSC identification system.During my PhD thesis, I showed that ALDH1A1 promoter can be used to identify cells with CSC. The cells identified by fluorescent protein in which expression is controlled by ALDH1A1 promoter possess self-renewal and differentiation properties. They also exhibited higher capacity to form tumors, and an increased resistance to anticancer therapies. Monitoring of these cells by fluorescence tracking facilitated the visualization of reprogramming phenomenon in real time following the irradiation. In addition, we were able to observed the strongest extravasation potential of these cells in a microvessel mimicking chip model. I have subsequently constructed an inducible expression vector based on the activity of this promoter in order to dynamically follow the different cell populations: non-CSCs, pre-existing CSCs and iCSCs. This vector consists of several systems, including the inducible TetON system, the CRE-loxP system and the Flp / FRT recombination system for monitoring cell populations by fluorescence. My thesis work has thus enabled the generation of tools that can be used for the dynamic monitoring of CSCs and CSCs induced by therapies.

Le facteur de croissance neurotrophique NGF (Nerve Growth Factor) est un facteur mitogène et de survie pour les cellules de cancer du sein alors qu’il est sans effet sur la croissance des cellules épithéliales mammaires normales. Ce facteur de croissance agit sur ses cellules cibles par l’intermédiaire de deux récepteurs : TrkA, qui est un récepteur tyrosine kinase, et p75NTR, dépourvu d’activité catalytique intrinsèque. Le NGF stimule la survie des cellules cancéreuses mammaires via p75NTR en activant le facteur de transcription NF-ĸB. Au cours de mes travaux de thèse, je me suis tout d’abord appliqué à décrire les modifications du protéome induites par une surexpression de ce récepteur p75NTR. Pour cela, nous avons établi une lignée cellulaire MCF-7 surexprimant stablement le récepteur p75NTR. Par la suite, une étude par électrophorèse bidimensionnelle suivie par une analyse par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF/TOF a été réalisée en comparant des cellules non stressées à des cellules induites en apoptose grâce à l’apoptogène TRAIL (TNF-related-apoptosis-inducing-ligand). Au cours de cette étude, nous avons pu mettre en évidence un certain nombre de protéines régulées par la présence de p75NTR en condition d’apoptose comme les cytokératines 8, 18 et 19, la protéine chaperonne HSP27 ou bien encore la protéine ribosomale RPLP0. Ces résultats suggèrent l’importance d’une réorganisation de ces protéines afin que p75NTR puisse effectuer son effet de survie. L’autre partie de mes travaux a consisté en une étude spécifique des partenaires de signalisation de p75NTR. Pour ce faire, nous avons décidé d’appliquer la stratégie TAP-Tag (Tandem Affinity Purification-Tag), une approche de protéomique fonctionnelle, au récepteur membranaire p75NTR. Une analyse différentielle de plusieurs conditions de culture par spectrométrie de masse de type nanoLC-MS/MS a abouti à l’obtention d’une liste de partenaires potentiels de signalisation de p75NTR dans un contexte de survie cellulaire. Cependant, l’implication fonctionnelle de ces protéines doit être confirmée. L’ensemble de ces travaux a permis d’ouvrir de nouvelles pistes de recherche pour comprendre à la fois les mécanismes cellulaires mis en œuvre lors de la survie des cellules cancéreuses mammaires, mais aussi les partenaires potentiels de signalisation du récepteur p75NTR. / The growth factor NGF (nerve growth factor) is a mitogenic and survival factor for breast cancer cells but has no effect on normal epithelial mammary cell growth. This growth factor acts on breast cancer cells via two receptors : TrkA, a tyrosine kinase receptor, and p75NTR, which has no catalytic activity. NGF promotes breast cancer cells survival via p75NTR by activation of the transcriptional factor NF-κB. In the first time of my thesis work, I have described the proteome modification induced by an overexpression of p75NTR in apoptotic stress-induced breast cancer cells. We established a p75NTR overexpressing MCF-7 cell line. Thus, we investigated, by two dimensional electrophoresis followed by MALDI-TOF/TOF based mass spectrometry analysis, the proteome modification induced by the pro-apoptotic agent TRAIL (TNF-related-apoptosis-inducing-ligand). We describe some proteins regulated by p75NTR in an apoptosis condition like cytokeratin 8, 18 and 19, the HSP27 and the ribosomal protein RPLP0. These results show that the rearrangement of those proteins is associated to the survival effect of p75NTR in breast cancer cells. In a second part, we tried to identify the specific proteins partners of p75NTR for its survival pathway. For that, we applied the TAP-tag (tandem affinity purification tag) strategy, a functional proteomic approach, to the p75NTR receptor. A differential analysis by nanoLC-MS/MS mass spectrometry was conducted and we obtained a list of potentials proteins partners of the p75NTR activated survival pathway. The functional involvement of these proteins should be confirmed. Together, our work provides new data on the cellular mechanisms involved in the survival of breast cancer cells and also on the proteins partners implicated in p75NTR signaling.

La société Lesaffre International produit des extraits de levure qui, de par leurs caractéristiques nutritionnelles, possèdent un fort potentiel de valorisation en tant que source de molécules biologiquement actives et présentent donc des potentialités dans l’alimentation fonctionnelle. Nos travaux de thèse ont permis de démontrer les potentiels satiétogène et antistress de différents extraits de levure. Le potentiel satiétogène a été caractérisé dans l’extrait de levure P2005077. En effet, les tests in vitro réalisés sur cet extrait de levure ont permis de montrer son implication dans la stimulation de la sécrétion des cholecystokinines par les cellules STC-1, et ceci de manière plus importante que d’autres sources alimentaires décrites comme possédant cette capacité (soja et lait, notamment). La molécule présente dans cet extrait de levure et impliquée dans ce processus a alors été identifiée comme étant de l’uridine. L’aspect in vivo de l’étude a permis de mettre en évidence la capacité de l’extrait de levure P2005077 à diminuer la prise alimentaire à court terme de 17% et la prise de poids de 16% de chez le rat via des mécanismes endocrines, dont la sécrétion des CCK plasmatiques. La recherche du potentiel antistress, par des tests in vitro a permis de montrer que certains extraits de levure (de nom commercial AVICAM) permettait in vitro une liaison aux récepteurs opioïdes des membranes de cerveau de rat, et cela, comparativement aux protéines de lait connues dans ce sens. Enfin, ce résultat a été corrélé avec des tests in vivo réalisés chez le rat, qui ont permis de montrer l’implication du récepteur opioïde MOR dans la réponse au stress en présence de ces mêmes extraits de levure. / Yeast extracts produced by the company Lesaffre International, are a source of biologically active molecules affecting nutrition and thus can be considered as potential functional foods. The studies conducted for the completion of this thesis demonstrated the satietogenic and antistress potentials of a variety of yeast extracts. The satietogenic potential was characterized in the P2005077 yeast extract. Indeed, the in vitro tests conducted on this yeast extract showed its involvement in the stimulation of the cholecystokinines secretion by STC-1 cells. And it has been proven to be more active than the other food sources possessing this capacity (soya and milk, in particular). The molecule responsible for this effect was implied to be uridine. The in vivo experiments brought to light the ability of the P2005077 yeast extract to decrease the short-term food taking at 17 % and the weight gain at 16 % from the rat via endocrine mechanisms, of which the secretion of the plasmatic CCK. Regarding the antistress potential of the yeast extracts, in vitro tests were conducted and showed that certain yeast extracts (of trademark AVICAM) allowed a binding on the opioid receptors of brain of rat membranes. That was then compared with proteins of milk known for their antistress potential (in this sense.) Finally, the in vitro result was correlated with in vivo tests conducted with rat. It allowed to show the opioid implication of the MOR receptor in the answer to the stress in the presence of these same yeast extracts.

Les cardiopathies représentent la première cause de mortalité dans le monde, près de 30% des décès chaque année sont imputables à ce type de pathologies ; cette incidence a par ailleurs fortement augmentée au cours du siècle dernier (OMS). Les cardiopathies peuvent être classées en plusieurs sous-groupes de maladies cardio-vasculaires en fonction du tissu affecté par la pathologie. On différencie ainsi les maladies affectant les vaisseaux, le muscle cardiaque, le rythme (tissu pacemaker et de conduction) et les maladies des valves cardiaques. Les valvulopathies cardiaques peuvent être causées par des défauts des valves acquis ou innés et représentent près de 30 à 40% des malformations cardiaques recensées. Le pourcentage de patients atteints de valvulopathies augmente avec l’âge du patient, de plus, les valvulopathies représentent la principale cause de morbidité chez l’adulte, et l’enfant dans les pays développés.Ces défauts peuvent être d’origines génétiques, congénitales, toxicologique, ischémiques avec influence de différents facteurs de risques aussi bien génétiques qu’environnementaux, dans certains cas elles peuvent même être provoquées par des médicaments, le cas du Benfluorex (Mediator®) étant probablement le plus connu. Les défauts affectant les valves peuvent avoir de graves conséquences sur le fonctionnement du cœur. Ainsi, en 2008, aux États-Unis, il a été nécessaire de procéder au remplacement de près de 82000 valves cardiaques chez des patients adultes. Si le remplacement de valves cardiaques reste une avancée majeure pour les patients atteints de valvulopathies, l’utilisation de prothèses et de transplants valvulaires présentent néanmoins des limitations, notamment : une absence de croissance des prothèses, l’apparition de thromboses, ainsi que des rejets en cas de transplantation de valves allo-géniques, prélevées sur des donneurs en morts cérébrale. Ainsi, il est nécessaire d’étudier les mécanismes mis en jeu dès le développement embryonnaire, mécanismes qui pourrait avoir un effet délétère à plus ou moins long terme entrainant l’apparition d’une valvulopathie chez l’enfant, le jeune adulte ou chez la personne âgée. Pour cela l’utilisation d’un modèle cellulaire utilisable in vitro serait une avancée remarquable. Ce modèle permettrait à la fois d’élucider un certain nombre de mécanismes biologiques mis en place au cours du développement ou de la pathologie, mais aussi d’espérer la mise en place d’un protocole permettant l’utilisation clinique de cellules autologues reprogrammées pour la thérapie des tissus atteints de valvulopathies voire même une thérapie incluant une réparation endogène. / Heart disease is the leading cause of death worldwide, nearly 30% of deaths each year are attributable to such diseases; this incidence has also greatly increased in the last century (WHO).Heart disease can be classified into several subgroups of cardiovascular disease based on the tissue affected by the pathology. It thus differs diseases affecting vessels, cardiac muscle, rhythm (fabric pacemaker and conduction) and heart valve disease. Heart valve disease can be caused by defects of innate and acquired or valves represent about 30-40% of heart defects identified. The percentage of patients with valvular heart disease patients increases with age of the patient, in addition, valvular heart disease is the leading cause of morbidity in adults and children in developed countries.These defects may be of genetic origin, congenital, toxicological, with ischemic influence of various risk factors both genetic and environmental, in some cases they can even be caused by medications, if the Benfluorex (Mediator®) are probably the most known. The defects in the valves can have serious consequences on the functioning of the heart. In 2008, the United States, it was necessary to proceed with the replacement of nearly 82,000 heart valves in adult patients.If the replacement heart valves remains a major advance for patients with valvular heart disease, the use of prostheses and transplants valves nevertheless have limitations, including: no growth prostheses, the occurrence of thrombosis and releases in cases of allo-transplantation of gene valves taken from brain dead donors. Thus, it is necessary to study the mechanisms involved early embryonic development, mechanisms that could have a deleterious effect more or less long term leading the development of valvular disease in children or young adults in the old person. For this the use of an in vitro cell model used is a remarkable achievement. This model would both elucidate a number of biological mechanisms during development or pathology, but also hope the development of a protocol for the clinical use of autologous cells reprogrammed to the therapy of patients with valvular tissue or even a therapy including an endogenous repair.

L’asthme est une maladie des bronches qui affecte environ 300 millions de personnes mondialement. L’asthme sévère représente 10% de cette population et certains de ces asthmatiques ont des symptômes incontrôlés et une éosinophilie pulmonaire persistante malgré la prise quotidienne de fortes doses de corticostéroïdes. Un nombre élevé d’éosinophiles dans les voies aériennes est associé avec des symptômes incontrôlés, des exacerbations fréquentes et la sévérité de l’asthme. L’identification des facteurs responsables de cette éosinophilie est donc primordiale. Par conséquent, le but général de ma thèse était de comprendre les mécanismes impliqués dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme et sa sévérité. Le recrutement des éosinophiles du sang vers la lumière bronchique nécessite, entre autres, la participation de chimioattractants, de l’interleukine-5 et de molécules d’adhésion. Les éotaxines, CCL11, CCL24 et CCL26, sont des chimioattractants puissants et sélectifs pour l’éosinophile puisqu’elles se lient principalement sur le récepteur CCR3 présent sur l’éosinophile. Notre premier objectif était de comparer l’effet des différentes éotaxines sur la migration des éosinophiles d’asthmatiques et de sujets sains. Par la suite, nous avons focalisé nos études sur l’importance de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité. Étant donné que la CCL26 n’est pas exprimée chez les rongeurs, les études portant sur la CCL26 sont limitées comparativement à celles sur la CCL11 et la CCL24. À cet égard, notre deuxième objectif était d’évaluer le rôle de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité et de caractériser l’effet de l’IL-13 sur la production de la CCL26 par les cellules épithéliales bronchiques de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Ensuite, le troisième objectif était d’investiguer les mécanismes impliqués dans la production de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les cellules épithéliales bronchiques. Le quatrième objectif a permis d’évaluer l’importance de l’IL-5 dans le recrutement des éosinophiles, en étudiant l’effet de l’IL-5 sur la migration des éosinophiles induite par des médiateurs lipidiques, tels que l’acide 5-oxo-éicosatétraénoïque, la prostaglandine D2 et le 2- arachidonoyl-glycérol. Finalement, pour le cinquième objectif, nous avons évalué l’importance de la périostine, une protéine impliquée dans l’adhésion des éosinophiles, dans l’éosinophilie bronchique dans l’asthme. Pour conclure, les résultats obtenus dans cette thèse favoriseront l’identification de possibles cibles thérapeutiques pour diminuer l’éosinophilie pulmonaire persistante observée chez les asthmatiques sévères.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative de type autosomique dominante. Ce désordre est caractérisé par un éventail de signes cliniques incluant, principalement, des mouvements involontaires de type choréiformes, mais également des atteintes cognitives et psychiatriques. La pathologie est causée par une mutation du gène codant pour la huntingtine (HTT) entrainant ainsi la production d'une protéine anormale, la huntingtine mutée (mHTT). De par son caractère ubiquitaire, la mHTT se retrouve dans chacune des cellules de l'organisme et contribue à la dégénérescence des cellules, aussi bien au niveau du système nerveux central qu'en périphérie. En effet, les patients souffrant de la MH présentent également de l'atrophie musculaire, des anomalies cardiaques et des dysfonctionnements au niveau du système immunitaire. Des travaux effectués dans le laboratoire de recherche de la Dre Cicchetti ont montré que les cerveaux de patients MH sont aussi caractérisés par des anomalies vasculaires, qui incluent des changements au niveau de la densité et du diamètre des vaisseaux sanguins ainsi qu'une augmentation de la perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE). Cherchant à élucider l'origine de ces anomalies vasculaires, nous avons étudié les plaquettes qui, en plus de jouer un rôle dans l'hémostase, sont également impliquées dans le maintien de l'intégrité vasculaire. Les résultats d'immunobuvardage ont montré que les thrombocytes contiennent étonnamment la plus forte concentration en mHTT de toutes les cellules sanguines. La libération de facteurs plaquettaires a été mesurée par ELISA chez les patients MH et les contrôles. Nous avons également effectué des tests d'hémostase et de déplétion plaquettaire dans le modèle de souris R6/2 de la maladie. Nos résultats indiquent que les plaquettes huntingtoniennes sont dysfonctionnelles en ce qui concerne la libération de facteurs de thrombose et d'angiogenèse. Nos travaux chez un modèle murin de MH mettent en lumière le rôle insoupçonné des plaquettes dans l'homéostasie de la BHE. Dans le cadre de ce projet, le transcriptome plaquettaire et les vésicules extracellulaires dérivées de plaquettes (VEP) ont été également caractérisés. D'une part, nous avons montré que les plaquettes possédaient une signature transcriptomique unique pouvant, si validée, être utilisée comme potentiel biomarqueur de la maladie. D'autre part, les VEP provenant de patients atteints de MH et leur contenu en mHTT restent inchangés. L'ensemble des données que nous avons obtenues sur les plaquettes MH témoignent de l'impact de la mHTT en périphérie. Afin de diminuer la charge en protéines pathologiques, l'une des voies de dégradation serait la production d'anticorps par les cellules immunitaires. Cet aspect a déjà été mis en lumière dans d'autres maladies neurodégénératives, mais à ce jour, les mécanismes de dégradation de la mHTT dans la MH n'ont pas été élucidés. Nos travaux ont toutefois montré la présence d'auto-anticorps contre la mHTT/HTT dans le plasma humain à l'aide de deux méthodes complémentaires que nous avons développées à cet effet : des ELISA et des immunobuvardages. Plus précisément, nous avons observé que : 1) les patients présentant des caractéristiques cliniques sévères de la MH développent une réponse immunitaire plus importante contre HTT/mHTT que les témoins appariés, 2) le sexe influence le nombre d'anticorps anti-mHTT dans la MH et 3) les anticorps reconnaissant la structure 3D de mHTT pleine longueur corrèlent avec les scores du test de capacité fonctionnelle totale chez les patients à des stades avancés de la maladie. Ces données ouvrent la voie à l'utilisation potentielle d'anticorps pour, par exemple, neutraliser la mHTT périphérique et ainsi ralentir le développement de la pathologie. En résumé, mes travaux de recherche se sont donc consacrés à l'étude des composantes sanguines - plus particulièrement des plaquettes et des auto-anticorps - par l'utilisation d'un modèle murin MH et d'échantillons de sang provenant de patients atteints de la MH. Les données obtenues permettent (1) de confirmer l'impact de la pathologie huntingtonienne sur le système sanguin et vice-versa, (2) d'améliorer notre compréhension des mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent la MH, et (3) d'aider à identifier et développer de nouvelles cibles thérapeutiques. / Huntington's disease (HD) is an autosomal dominant neurodegenerative disorder characterized by a whole spectrum of clinical signs including early involuntary movements, such as chorea, cognitive impairments and psychiatric disturbances. The pathology is caused by a mutation in the gene coding for huntingtin (HTT), which results in the production of an abnormal form of this protein: mutant huntingtin (mHTT). Due to the ubiquitous expression of HTT, mHTT is found in every cell of the body and contributes to the cellular dysfunction in the central nervous system as well as various other peripheral organs. Accordingly, HD patients present with muscular atrophy, cardiac abnormalities and dysfunctions of the immune system, among other things. Work conducted in Dr. Cicchetti's laboratory has extended these findings to include brain vascular abnormalities, such as changes in blood vessel density and diameter, and increased permeability of the blood-brain barrier (BBB). Seeking to elucidate the origin of these vascular anomalies, we studied platelets which, in addition to playing a role in hemostasis, are also involved in maintaining vascular integrity. Immunoblot results indicated that thrombocytes contain the highest concentration of mHTT of all blood cells. Following platelet function assessment, we reported that platelets derived from HD patients are dysfunctional with respect to the release of thrombosis and angiogenesis factors. Further investigation of the functional role of platelets in HD was performed using platelet depletion assays in a commonly used transgenic mouse model of HD (R6/2). These experiments supported the clinical findings and further highlighted an unsuspected role of platelets in BBB homeostasis. As part of this project, the platelet transcriptome and the platelet derived extracellular vesicles (PEV) were also characterized. These experiments revealed a unique transcriptomic signature that can, if validated, be used as a potential biomarker of the disease while assessment of PEV derived from HD patients uncovered no differences in number or mHTT content from those derived from controls. All the data we obtained on HD platelets testify to the impact of mHTT on the periphery. In order to reduce the pathological protein load, one of the degradation pathways would be the production of antibodies by immune cells. This aspect has already been highlighted in other neurodegenerative diseases, but to date, the mechanisms of mHTT degradation in HD have not been elucidated. However, our work has now shown the presence of autoantibodies against mHTT/HTT in human plasma using two complementary methods that we have developed for this purpose: ELISA and immunoblot assays. Specifically, we observed that: 1) patients with severe clinical features of HD develop a stronger immune response against HTT/mHTT than matched controls, 2) gender influences the number of anti-mHTT antibodies in the plasma of HD patients and 3) antibodies recognizing the 3D structure of full-length mHTT correlate with total functional capacity test scores in patients at advanced stages of the disease. These data highlight the potential use of antibodies to neutralize peripheral mHTT which may, if confirmed, slow down the development of the pathology. My research work has focused on the study of blood components - in particular platelets and autoantibodies - using a mouse model of HD and blood samples from HD patients. Taken together, the data I have generated has the potential (1) to confirm the impact of HD-related pathology on the blood system and vice-versa, (2) to improve our understanding of the pathophysiological mechanisms that underlie HD and (3) to help identify and develop new therapeutic targets.

La cicatrisation cutanée est un système complexe qui regroupe différents processus biologiques comme l'hémostase, l'inflammation, Pangiogenèse et la synthèse matricielle. Les myofibroblastes sont au coeur de ce système et bien que plusieurs fonctions aient été associées aux myofibroblastes, on en sait peu sur la relation qu'ils entretiennent avec les autres cellules impliquées dans la formation du tissu de granulation. Nous avons exploré la possibilité que les myofibroblastes influencent le développement angiogénique au cours de la cicatrisation cutanée. Les fibroblastes sont connus pour avoir des propriétés proangiogéniques, mais nous avons observé à l'aide d'un modèle tridimensionnel in vitro à base de fibrine que la différenciation vers un phénotype myofibroblastique permet aux cellules d'accroître leur potentiel proangiogénique. Ce potentiel proangiogénique acquis n'est pas dû à une augmentation de la sécrétion de facteurs de croissance associés à Pangiogenèse comme le VEGF ou le bFGF, mais serait plutôt associé à une augmentation de la sécrétion d'inhibiteurs des métalloprotéinases dont TIMP-1 au cours des premières étapes du développement angiogénique, et plus tardivement par la sécrétion de TIMP-3. TIMP-1 est connu pour son effet proangiogénique alors que TIMP-3, identifié comme un inhibiteur de Pangiogenèse, permet la stabilisation du réseau vasculaire évitant ainsi sa régression. Nous avons également observé que les myofibroblastes produisaient dans le surnageant de culture des microparticules capables d'induire la prolifération des cellules endothéliales et des fibroblastes. Ces microparticules, qui contiennent du VEGF et du bFGF, ne résultent pas d'un processus apoptotique, mais d'une activation suite à l'induction par un ou des médiateur(s) contenu(s) dans les fluides corporels, représentés par le sérum et le plasma sanguin. Ces microparticules sont connues comme étant des médiateurs permettant le transfert direct entre cellules d'un ensemble de molécules bioactives. Leur présence démontre qu'il existe un réseau de communication intercellulaire spécialisé au sein du processus de cicatrisation. En conclusion, nous avons montré que les myofibroblastes, déjà associés à la synthèse de la matrice extracellulaire, sont également favorables au développement angiogénique et à la prolifération cellulaire. Chacune de ces fonctions contribue à la formation du tissu de granulation et par conséquent, elles sont importantes dans le processus de cicatrisation cutanée.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019 / La voie métabolique de glucuronidation, impliquant les enzymes uridine diphospho-glucuronosyltransférases (UGT), joue un rôle crucial dans le métabolisme des médicaments et contrôle l’exposition à divers composés exogènes via leur inactivation par la conjugaison à l’acide glucuronique. Cette voie métabolique a également comme rôle principal de maintenir l’homéostasie cellulaire et le contrôle de la biodisponibilité de nombreuses molécules endogènes. Nombre de ces composés sont impliqués dans des boucles de rétroaction régulant l’expression et l’activité de diverses voies métaboliques cellulaires, notamment via l’implication de récepteurs nucléaires et autres voies de signalisation. Une modification de l’expression et de l’activité de la voie de glucuronidation a donc le potentiel d’influencer le métabolisme cellulaire, au-delà du contrôle des substrats des enzymes UGT. Cette hypothèse est appuyée par des observations préliminaires démontrant la capacité des UGT à interagir avec des protéines d’autres voies métaboliques, affectant ainsi leur activité. De plus, les études récentes du laboratoire font état d’un transcriptome étendu de la grande famille de gènes UGT, permettant la production de protéines alternatives comprenant de nouveaux domaines peptidiques et dont les fonctions et les réseaux d’interaction demeurent inconnus. Dans le cadre de cette thèse, nos premières investigations ont porté sur les changements métaboliques associés à une modification de l’expression cellulaire d’enzymes UGT, ainsi que de leurs protéines alternatives nouvellement identifiées. Une approche métabolomique non-ciblée a révélé des répercussions importantes au niveau métabolique, parfois communes, parfois divergentes, selon l’enzyme et l’isoforme alternative étudiée. À titre d’exemple, les niveaux cellulaires de lipides bioactifs comme l’acide arachidonique sont grandement affectés dans les lysats de cellules exprimant des enzymes UGT, alors qu’ils ne le sont pas dans les lysats de cellules exprimant des protéines alternatives. Dans une seconde série d’investigations, nous avons établi les réseaux d’interactions protéiques des UGT dans le tissu rénal et hépatique humain. À l’aide d’anticorps développés au laboratoire et dirigés contre les enzymes ou les protéines alternatives UGT, nous avons réalisé une purification d’affinité sur bille couplée à la spectrométrie de masse. Ceci a permis d’établir de façon non-biaisée les interactomes endogènes des enzymes UGT et de leurs protéines alternatives dans un environnement protéique physiologique, révélant l’existence de partenaires communs et de partenaires spécifiques. En plus d’identifier des protéines associées au métabolisme des médicaments, nos travaux ont révélé plusieurs partenaires protéiques impliqués dans d’autres voies métaboliques, telles que les voies énergétiques (glycolyse, cycle des acides tricarboxyliques, oxydation des lipides, etc.). À l’aide de modèles cellulaires, nous avons démontré que certaines de ces interactions sont fonctionnelles et entrainent une modification significative de l’activité du partenaire des UGT, induisant des perturbations métaboliques et phénotypiques associées à la progression tumorale. Enfin, nos données ont révélé une induction différentielle de l’expression d’une enzyme UGT et de ses variants alternatifs suite à un traitement pharmacologique, influençant possiblement l’activité cellulaire en réponse à ces stimuli. Nos travaux soutiennent une interconnexion entre le métabolisme de glucuronidation et le métabolisme cellulaire. Ils appuient également un rôle plus vaste et complexe des protéines UGT, impliquant notamment la production d’isoformes alternatives aux structures protéiques distinctes et possédant des fonctions régulatrices possiblement différentes de celles des enzymes. Ces travaux démontrent également des interactions protéiques avec diverses voies métaboliques, permettant sans doute de moduler la réponse cellulaire à divers stimuli tout en optimisant les ressources métaboliques de la cellule. / The glucuronidation pathway, catalyzed by uridine diphospho-glucuronosyltransferases (UGTs), is crucial for drug metabolism and controls the body’s exposure to several exogenous compounds by the conjugation of a glucuronic acid moiety leading to their inactivation. A main role for this pathway is also to controls cellular levels of several endogenous compounds in order to maintain homeostasis. Many of those compounds are involved in feedback loops and control the expression and activity of numerous metabolic pathways through the regulation of nuclear receptors and other signaling events. Altered expression or activity of the glucuronidation pathway thus has the potential to influence cellular metabolism, beyond UGT substrate regulation. This hypothesis is supported by preliminary observations showing that UGTs possess the capacity to interact with enzymes from other metabolic pathways, affecting their activity. Furthermore, recent studies from our laboratory exposed an extended transcriptome for UGT genes, producing new alternative proteins comprising new domains and for which the functions and interaction networks remain unknown. In the context of this work, our first investigations explored the metabolic alterations induced by a modification in the cellular levels of UGT enzymes, as well as selected novel alternative proteins. A non-targeted metabolomics approach uncovered significant metabolic alterations, sometimes common or divergent, depending on the enzyme and the alternative isoform. As an example, bioactive lipids such as arachidonic acid were among the most modulated metabolites in lysates of cells expressing UGT enzymes but remained unchanged in cells expressing alternate proteins. In a second set of investigations, we established the interaction networks of UGT proteins in human liver and kidney tissues. We used in-house antibodies directed against UGT enzymes or their alternative proteins to conduct affinity purification coupled to mass spectrometry. These assays exposed an unbiased endogenous interactome in a physiologically relevant protein environment, revealing common and specific partners to UGT enzymes and alternative isoforms. In addition to proteins involved in drug metabolism, our work uncovered numerous partners implicated in other metabolic routes such as energetic pathways (glycolysis, tricarboxylic acids cycle, lipid oxidation, etc.). Using cellular models, we showed some of these interactions had a functional impact on cellular activity of the protein partners, triggering metabolic alterations associated with tumor progression. Lastly, our data further support a differential expression of UGT enzymes and their alternative isoforms following treatment with pharmacological compounds that could lead to variable metabolic activity in response to stimuli. Our results demonstrate functional crosstalk between UGT proteins and cell metabolism. This works also supports an extended and rather complex role for UGTs, notably through the production of numerous alternative isoforms presenting different peptide structures and likely diverse regulatory functions. Our findings indicate that one of the underlying mechanisms is related to protein-protein interactions between UGTs and proteins of other metabolic routes, likely permitting a fine regulation of cell response to stimuli while optimizing metabolic resources.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique dégénérative des muscles qui touche un garçon sur 3500. L'absence de la protéine à l'origine de la maladie, la dystrophine, entraîne une fragilité musculaire ce qui engendre une dégradation prématurée des muscles. Parmi les différentes thérapies à l'étude, on retrouve la greffe de myoblastes sains qui permet de rétablir en partie l'expression de la protéine. Cependant, la migration et la survie limitées des myoblastes ainsi que l'induction du système immunitaire restent des problèmes importants rencontrés par ce traitement. Les cellules souches isolées du muscle (MDSC) pourraient offrir un bon potentiel thérapeutique. Par exemple, il a été démontré qu'elles possèdent la capacité de migrer des vaisseaux sanguins vers les fibres musculaires pour régénérer l'expression de la dystrophine dans les muscles de souris mdx (modèle de la DMD). Toutefois, il existe plusieurs techniques d'isolement de ces cellules et les caractéristiques des différentes sous-populations sont encore mal connues. De plus, les MDSC sont très rares à l'intérieur du muscle, il faut donc utiliser des techniques permettant d'isoler un nombre maximal de cellules et des milieux soutenant une meilleure prolifération des MDSC. À cet effet, nous utilisons avec succès un milieu de culture sans sérum décrit précédemment dans la littérature pour la croissance des cellules souches de la peau. Dans ce milieu, nous avons identifié que les MDSC forment des sphéroïdes et augmentent leur population de quatre fois en dix jours. Le volume des sphéroïdes augmente aussi tout au long de la culture jusqu'à atteindre un plateau après dix jours. Dans ce travail, nous avons déterminé que la formation des sphéroïdes est un processus obligatoire dans l'expansion des MDSC. Étant donné que la plupart des protocoles nécessitent l'obtention de cellules dissociées, nous avons donc développé des techniques de dissociation enzymatique minimisant le dommage fait aux cellules et aux récepteurs cellulaires tout en maximisant le bris des sphères. L'effet du milieu de culture sur la croissance des différentes sous-populations a également été mesuré. Nous avons également déterminé que les cellules exprimant le récepteur Seal, caractéristique des cellules souches de souris, pouvait proliférer dans le milieu. Par contre, l'expression de CD34, un autre marqueur de cellules souches hématopoïétiques, chute rapidement après la mise en culture. Comme la prolifération des MDSC est faible, différents paramètres de culture ont été variés afin de voir leur influence sur la croissance. Nous avons observé que les hautes densités cellulaires initiales (2 xl0E5 cellules/ml) et les plus grands volumes de culture utilisés (plaque 6-12 puits) ont une influence positive sur l'expansion des cellules.