Tato diplomová práce se zabývala možnostmi utilizace lignocelulosového materiálu jako obnovitelného zdroje k produkci polyhydroxyalkanoátů (PHA) biotechnologickými metodami. Teoretická část práce se zaměřuje na charakterizaci rostlinné odpadní biomasy, její enzymatickou sacharifikaci a možnosti produkce a izolace hydrolytických enzymů. Dále se pak literární rešerše zabývá bakteriální produkcí PHA a možností využití lignocelulosové biomasy pro jejich produkci. V rámci experimentální části byly vybrané odpadní substráty hydrolyzovány chemickou a enzymatickou cestou. Jako odpadní substráty byly použity výlisky z jablek, hroznového vína a řepky olejné a kávová sedlina. Získané hydrolyzáty byly použity k produkci PHA bakteriálním kmenem Burkholderia cepacia. Nejslibnějším substrátem se jevily výlisky z jablek. Ukázalo se, že vybraný bakteriální kmen je schopen utilizovat odpadní substráty i bez předchozí úpravy. Supernatant po skončení kultivace jevil následující aktivity: proteasovou, lipasovou (0.47 nmol/(mL•min)), celulasovou pro CMC (6.05 nmol/(mL•min)) a filtrační papír (4.63 nmol/(mL•min)) a xylanasovou (1.71 nmol/(mL•min)). Tyto enzymy mohou představovat zajímavý vedlejší produkt výroby PHA z odpadních zemědělských materiálů. V rámci této práce byl také posouzen vliv délky kultivace a způsob hydrolýzy na výslednou produkci PHA a enzymatickou aktivitu průmyslově zajímavých enzymů.

Little information is available regarding the applicability of various disinfectants to the control of microbial growths within water distribution systems, especially in relation to "nuisance" organisms. With regards to microbially mediated iron precipitation, an isolated heterotrophic iron precipitating bacterium was identified. An investigation of free chlorine, chloramines, and chlorine dioxide was undertaken to examine their applicability in the control and/or elimination of this type of deterioration in water quality. Environmental conditions were then varied to determine their effects on the disinfectant's efficiencies. The isolated bacterium was identified as Pseudomonas cepacia. It was determined that chlorine dioxide offered a serious challenge to chlorine as a secondary disinfectant on the basis of its biocidal capabilities and stability. Solution pH affected free chlorine's efficiency the greatest, while chloramine's poor efficiency suggested that its use should be avoided in areas of microbial iron precipitation. Water temperature and turbidity showed a minimal effect on the rate of inactivation of P. cepacia for all the disinfectants under consideration. / Master of Science

INTRODUÇÃO: Em contraste aos bons resultados do transplante pulmonar no tratamento de pacientes com doença supurativa pulmonar avançada, a colonização por Burkholderia cepacia complex (BCC), sobretudo o genomovar III, vem sendo relacionada a pior prognóstico e, por conseguinte, uma contraindicação ao procedimento em alguns centros transplantadores. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto em sobrevida após o transplante pulmonar de pacientes com doença pulmonar supurativa colonizados por BCC, além de determinar a incidência da colonização e suas variantes genômicas no Instituto do Coração/HC-FMUSP. MÉTODOS: Foram analisados prospectivamente dados clínicos e amostras de culturas do trato respiratório dos pacientes que realizaram transplante pulmonar por doença supurativa entre janeiro de 2008 e dezembro de 2013. A tipagem molecular para estudar os diferentes genótipos da BCC foi realizada a partir de janeiro de 2012 por método de sequenciamento genético e análise do gene RecA. RESULTADOS: Foram realizados 132 transplantes pulmonares, 62 pacientes com doença pulmonar supurativa, sendo 28 em pacientes com Bronquiectasias e 34 com Fibrose Cística. Observou-se a colonização por BCC em 16 pacientes; em 7 amostras identificados os seguintes subtipos: três cepas B. metallica e quatro cepas B. cenocepacia. A incidência de BCC nos pacientes com Fibrose Cística foi de 38,2%, enquanto nos pacientes com Bronquiectasias foi 10,7%. Dentre os 16 pacientes colonizados por BCC, ocorreram 2 óbitos, nenhum deles relacionados à infecção pelo agente. Um óbito foi atribuído a sepse por Acinetobacter baumannii resistente a múltiplas drogas e o outro, a disfunção orgânica múltipla. O estudo desenvolvido demostrou que a colonização por BCC não gerou impacto em mortalidade nos pacientes após o transplante pulmonar, mesmo quando colonizados pelo subtipo B. cenocepacia / INTRODUCTION: Notwithstanding the good results of lung transplantation for treatment of patients with advanced lung suppurative disease, colonization by Burkholderia cepacia complex (BCC), especially genomovar III has been related to a worse prognosis in these patients and therefore contraindication to the procedure certain centers. The aim of this study was to evaluate the impact on survival after lung transplantation in patients with suppurative lung disease colonized with BCC to determine the incidence of colonization and its genomic variants at the Heart Institute / HC -FMUSP. METHODS: We prospectively analyzed clinical data and respiratory tract samples of suppurative lung disease patients that performed lung transplantation from January-2008 through November-2013. From January-2012 through December-2013, we also subtyed the different B. cepacia genotypes by DNA sequencing primers of the gene RecA. RESULTS: 132 lung transplantation were performed, 62 patients with suppurative lung disease, 28 patients with Bronchiectasis and 34 with Cystic Fibrosis. BCC was observed in 16 patients; in 7 samples we identified the following subtypes: three strains B. metallica and four strains B. cenocepacia. The incidence of BCC in patients with Cystic Fibrosis was 38.2% while in patients with Bronchiectasis was only 10.7%. Among the 16 patients colonized with BCC, there were two deaths, none of them related to infection by the agent. One death due to sepsis Acinetobacter baumannii resistant to multiple drugs and the other, multiple organ dysfunction. The study demonstrated that colonization by BCC developed no impact on the mortality rate of patients after lung transplantation, even when colonized by the subtype B. cenocepacia

Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

Introdução: Patógenos emergentes são isolados nas vias respiratórias de pacientes com fibrose cística (FC), entre eles a Burkholderia cepacia. Atualmente, é conhecida como um conjunto de nove espécies relacionadas (\"genomovares\"), referidas coletivamente como complexo B. cepacia. A identificação fenotípica do complexo B. cepacia é difícil, e métodos de análise do genoma bacteriano, como a reação em cadeia da polimerase, que exploram diferenças no gene recA, têm mostrado grande eficácia na caracterização dos genomovares. Alguns Centros de tratamento de FC demonstraram infecções cruzadas entre os pacientes e marcadores de virulência foram identificados com freqüência em alguns deles. Métodos baseados em biologia molecular são capazes de realizar a genotipagem das cepas e têm sido utilizados na avaliação epidemiológica. Objetivos: Identificar o genomovar e a presença de marcadores de virulência entre as cepas do complexo Burkholderia cepacia isoladas de pacientes com fibrose cística atendidos no ICr e analisar as cepas do complexo Burkholderia cepacia através de genotipagem pela técnica de RAPD. Métodos: Foram coletadas 672 amostras de escarro e esfregaço de orofaringe de 140 pacientes com fibrose cística (6 meses a 19 anos) atendidos na nossa Unidade nos períodos de set/2000 a abr/2001 e jun/2003 a jun/2004. As amostras foram cultivadas em meios seletivos, incluindo meio para B. cepacia, e a identificação realizada por sistema automatizado (1º período) e por testes fenotípicos clássicos (2º período). Após a extração do DNA, as cepas foram submetidas a uma série de reações de PCR para a determinação dos genomovares (I a VII), utilizando primers direcionados à amplificação de diferentes trechos da seqüência do gene recA, sendo, em seguida, submetidas ao seqüenciamento do DNA deste gene. Os genes de virulência pesquisados foram o cblA (que codifica o pili) e o esmR (marcador de uma cepa epidêmica). A genotipagem foi realizada pela técnica do RAPD, que analisa todo o genoma bacteriano. Resultados: Foram isoladas 41 cepas do complexo B. cepacia, obtidas de 21 pacientes com fibrose cística. O método de PCR identificou o genomovar de 32/41 (78%) das cepas e todos os resultados foram confirmados através do seqüenciamento do DNA. B. cenocepacia foi o genomovar mais prevalente (n = 17), seguido da B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) e B. cepacia (n = 1). As nove cepas não caracterizadas foram submetidas ao seqüenciamento, tendo sido encontradas 5 cepas de B. gladioli, 2 cepas de X. campestris e 2 cepas permaneceram sem identificação. O gene cblA não foi identificado em nenhuma cepa, mas o gene esmR foi encontrado em 2 amostras (pacientes não relacionados). A genotipagem detectou 23 padrões distintos, sem identificar padrões idênticos entre pacientes diferentes. Conclusões: O método de PCR baseado na amplificação do gene recA mostrou ser eficaz para a determinação do genomovar. B. cenocepacia e B. multivorans foram as espécies mais prevalentes entre nossos pacientes. A prevalência de marcadores de virulência foi baixa entre as cepas isoladas. Infecção cruzada pelo complexo B. cepacia não parece ter ocorrido na nossa Unidade durante os períodos estudados. / Introduction: Emerging pathogens are found in the respiratory tract of the cystic fibrosis (CF) patients, including the bacterium Burkholderia cepacia. At the present moment, it is recognized as a group of nine related species (\"genomovars\"), collectively referred as B. cepacia complex. Phenotypical identification of B. cepacia complex is difficult, and molecular based methods such as PCR, exploring differences in recA gene sequence, showed high efficacy for genomovar determination. B. cepacia complex cross infections among CF patients were previously described in some CF treatment Centers, and virulence markers were identified in a high frequency in some of them. Molecular based methods are suitable for strain genotyping and have been used for epidemiological evaluation. Aims: To identify genomovar status and virulence markers among Burkholderia cepacia complex isolates obtained from cystic fibrosis patients attending in the ICr, and to analyze the isolates through genotyping by RAPD. Methods: 672 sputum or oropharyngeal samples were obtained from 140 cystic fibrosis patients (6 months to 19 years) attending our Unit from sep/2000 to apr/2001 and jun/2003 to jun/2004. The samples were cultivated in selective media, including B. cepacia medium, and bacterial identification obtained by automated system (first period) and by classical phenotypic tests (second period). After DNA extraction, B. cepacia complex strains were submitted to sequential PCR reactions targeting recA gene in order to determine genomovar status (I to VII), and after that, submitted to automated DNA sequencing of this gene. Virulence genes screened were cblA (cable pilus) and esmR (epidemic strain marker). Genotyping was performed by whole bacterial genome fingerprinting using RAPD. Results: 41 isolates of B. cepacia complex were obtained from 21 cystic fibrosis patients. The PCR method identified genomovar status of 32/41 (78%) isolates and all results were confirmed by DNA sequencing. B. cenocepacia was the main genomovar (n=17), followed by B. multivorans (n = 12), B. vietnamiensis (n = 2) and B. cepacia (n = 1). The nine isolates uncharacterized were submitted to sequencing and we found 5 isolates as B. gladioli, 2 isolates as X. campestris and 2 isolates remained unidentified. The cblA gene was not identified in all isolates, but esmR gene was found on 2 strains (unrelated patients). Genotyping depicted 23 patterns, without identical patterns among different patients. Conclusions: The PCR method targeting recA gene showed to be a valuable tool for determination of genomovar status. B. cenocepacia and B. multivorans were the most prevalent specie among our patients. The prevalence of virulence markers was low among the isolates. Cross infection by B. cepacia complex does not seem to have occurred in our Unit during the two studied periods.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2450743 bytes, checksum: 3e33726e56a8d6ec568fbe55fd680721 (MD5) Previous issue date: 2012-09-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The preparation of stable immobilized lipases is one of the great challenges for modern biotechnology that involves the use of these enzymes in biocatalyzed processes. The commercial application of these biocatalysts depends of an efficient immobilization and the appropriate use of supports to ensure stability to enzymes. This work focused on the study of the preparation of chemically modified supports derived from silica gel. The organofunctionalized silicas were prepared by silylation through of the heteregeneous route using the compounds 3-aminepropyl- and 3-chloropropyl trimethoxysilane resulting in the solids named Sil-propil-NH2 and Sil-propil-Cl, respectively. The solids Sil-propil-NH2 and Sil-propil-Cl reacted subsequently with the cyanuric chloride and 1,6 diaminehexane as spacer, followed by covalent attack of cyanuric chloride resulting in the matrices Sil-propil-N-CC and Sil-propil-Hex-CC. Silica gel and the modified solid were characterized measures of adsorption / desorption of nitrogen, CHN elemental analysis, thermogravimetry (TG), Si29 and C13 NMR and FTIR spectroscopy. The modified support were used in the immobilization of the Burkholderia cepacia lipase, and the catalytic performance and stability of the immobilized enzyme derivatives were investigated in the hydrolysis reaction of p-nitrophenylpalmitate (pNPP) in five consecutive reaction cycles. The results of the preparation of matrizes showed the anchoring of the triazine molecule onto silanized surface. For material Sil-propil-N-CC was observed the increasing of the nitrogen content as indicated CNH elemental analysis, that corresponded to 1.82% of N due the introduction of amino group and 3.08% of N after the reaction of the triazine molecule. For the material Sil-propil-Cl, it was observed the increasing in the nitrogen percentage for the support with spacer (2.13% of N) and after the reaction with cyanuric chloride (3.6% of N). The tests of catalytic activity operational stability of the immobilized enzymes onto supports were 2910, 3000 e 3430 U/g, respectively, for supports with aminopropyl and triazine molecule, chloropropyl with the spacer and for the surface with spacer and triazine molecule. For catalytic test were observed a higher tendency for loss of stability for support without spacer. The obtained results showed that the chemical modification reactions of silica gel enabled the covalent anchoring of the cyanuric chloride and the use of spacer resulted in higher catalytic activity and stability for the immobilized bio catalysts. / A obtenção de lipases imobilizadas estáveis é um dos maiores desafios para a biotecnologia moderna que envolve o emprego destas enzimas em processos biocatalisados. A aplicação comercial desses biocatalisadores depende de métodos eficientes de imobilização e da utilização de um suporte apropriado para assegurar estabilidade às enzimas. Nessa direção, o escopo do presente trabalho envolveu a preparação de suportes quimicamente modificados a partir da sílica gel. As sílicas organofuncionalizadas foram preparadas por silanização pela rota heterogênea, utilizando os compostos 3-aminopropiltrimetoxissilano e 3-cloropropiltrimetoxissilano originando os sólidos denominados Sil-propil-NH2 e Sil-propil-Cl, respectivamente. Os sólidos Sil-propil-NH2 e Sil-propil-Cl reagiram subsequentemente com cloreto cianúrico e o com o espaçador 1,6 diaminohexano, seguido do ataque covalente do cloreto cianúrico resultando nas matrizes Sil-propil-N-CC e Sil-propil-Hex-CC. A sílica gel e os sólidos modificados foram caracterizados pelas técnicas de termogravimetria, medidas de adsorção/dessorção de nitrogênio, análises elementar de CHN, ressonância magnética nuclear de Si29 e C13 e espectroscopia de absorção na região do infravermelho. Os suportes modificados foram utilizados na imobilização da lipase de Burkholderia cepacia, sendo que o desempenho catalítico e estabilidade dos derivados enzimáticos imobilizados foram investigados em reações de hidrólise do éster palmitato de p-nitrofenila (p-NPP) em cinco ciclos reacionais consecutivos. Os resultados das preparações dos suportes mostraram o ancoramento da molécula triazínica nas superfícies silanizadas. No material Sil-propil-N-CC foi observado um aumento do teor de nitrogênio obtido da análise elementar, que correspondeu a 1,82% de N referente à introdução do grupo amino e 3,08% de N após a reação com o composto triazínico. No caso do material Sil-propil-Cl, observou-se um aumento na porcentagem de nitrogênio do suporte contendo espaçador (2,13% N) e após a reação com o cloreto cianúrico (3,6% N). Os testes de atividade hidrolítica e estabilidade das lipases imobilizadas mostraram 2910, 3000 e 3430 U/g, respectivamente para os suportes contendo aminopropil e o anel triazínico, cloropropil e o espaçador e a superfície com espaçador e o anel triazínico. Nos ensaios catalíticos foi observada uma maior tendência de perda de estabilidade na ausência do espaçador. Os resultados obtidos mostraram que as reações de modificação química da superfície da sílica possibilitaram o ancoramento covalente do cloreto cianúrico e a presença de um espaçador possibilitou maior atividade e estabilidade aos biocatalisadores imobilizados.

INTRODUÇÃO: Em contraste aos bons resultados do transplante pulmonar no tratamento de pacientes com doença supurativa pulmonar avançada, a colonização por Burkholderia cepacia complex (BCC), sobretudo o genomovar III, vem sendo relacionada a pior prognóstico e, por conseguinte, uma contraindicação ao procedimento em alguns centros transplantadores. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto em sobrevida após o transplante pulmonar de pacientes com doença pulmonar supurativa colonizados por BCC, além de determinar a incidência da colonização e suas variantes genômicas no Instituto do Coração/HC-FMUSP. MÉTODOS: Foram analisados prospectivamente dados clínicos e amostras de culturas do trato respiratório dos pacientes que realizaram transplante pulmonar por doença supurativa entre janeiro de 2008 e dezembro de 2013. A tipagem molecular para estudar os diferentes genótipos da BCC foi realizada a partir de janeiro de 2012 por método de sequenciamento genético e análise do gene RecA. RESULTADOS: Foram realizados 132 transplantes pulmonares, 62 pacientes com doença pulmonar supurativa, sendo 28 em pacientes com Bronquiectasias e 34 com Fibrose Cística. Observou-se a colonização por BCC em 16 pacientes; em 7 amostras identificados os seguintes subtipos: três cepas B. metallica e quatro cepas B. cenocepacia. A incidência de BCC nos pacientes com Fibrose Cística foi de 38,2%, enquanto nos pacientes com Bronquiectasias foi 10,7%. Dentre os 16 pacientes colonizados por BCC, ocorreram 2 óbitos, nenhum deles relacionados à infecção pelo agente. Um óbito foi atribuído a sepse por Acinetobacter baumannii resistente a múltiplas drogas e o outro, a disfunção orgânica múltipla. O estudo desenvolvido demostrou que a colonização por BCC não gerou impacto em mortalidade nos pacientes após o transplante pulmonar, mesmo quando colonizados pelo subtipo B. cenocepacia / INTRODUCTION: Notwithstanding the good results of lung transplantation for treatment of patients with advanced lung suppurative disease, colonization by Burkholderia cepacia complex (BCC), especially genomovar III has been related to a worse prognosis in these patients and therefore contraindication to the procedure certain centers. The aim of this study was to evaluate the impact on survival after lung transplantation in patients with suppurative lung disease colonized with BCC to determine the incidence of colonization and its genomic variants at the Heart Institute / HC -FMUSP. METHODS: We prospectively analyzed clinical data and respiratory tract samples of suppurative lung disease patients that performed lung transplantation from January-2008 through November-2013. From January-2012 through December-2013, we also subtyed the different B. cepacia genotypes by DNA sequencing primers of the gene RecA. RESULTS: 132 lung transplantation were performed, 62 patients with suppurative lung disease, 28 patients with Bronchiectasis and 34 with Cystic Fibrosis. BCC was observed in 16 patients; in 7 samples we identified the following subtypes: three strains B. metallica and four strains B. cenocepacia. The incidence of BCC in patients with Cystic Fibrosis was 38.2% while in patients with Bronchiectasis was only 10.7%. Among the 16 patients colonized with BCC, there were two deaths, none of them related to infection by the agent. One death due to sepsis Acinetobacter baumannii resistant to multiple drugs and the other, multiple organ dysfunction. The study demonstrated that colonization by BCC developed no impact on the mortality rate of patients after lung transplantation, even when colonized by the subtype B. cenocepacia

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 elias_jose_silva.pdf: 1292177 bytes, checksum: 3ae3e6a67304123385483f886111a3b3 (MD5) Previous issue date: 2015-01-01 / Biosurfactants are amphipathic compounds capable of displaying a variety of surface-active properties that, among other functions, assist microorganisms that degrade and solubilize hydrophobic substrates. In recent years, the biosurfactants have been investigated as possible replacements for synthetic surfactants, especially because they have large environmental applications. In this sense, the bacterium Pseudomonas cepacia CCT6659 cultured with 2% soybean waste frying oil and 2% corn steep liquor as substrates produced a biosurfactant with potential to be applied in bioremediation of soils. Firstly, the biosurfactant was produced, isolated and submitted to Thin Layer Chromatography, being classified as an anionic biomolecule with lipid and carbohydrate combination of 75 and 25% respectively. The characterization by proton nuclear magnetic resonance (1H and 13C NMR) revealed the presence of carbonyl, olefinic and aliphatic groups, being observed typical spectra of lipids. Four sets of biodegradation experiments were carried out with a soil contaminated by hydrophobic organic compounds amended with sugar cane molasses in the presence of indigenous consortium as follows: set 1 soil + bacterial cells, set 2 soil + biosurfactant, set 3 soil + bacterial cells + biosurfactant, set 4 soil without bacterial cells and biosurfactant (control). Interestingly, when biosurfactant and bacterial cells were used (set 3), significant oil biodegradation activity occurred (83%) in the first ten days of experiments, while maximum degradation of the organic compounds (above 95%) was observed in sets 1 , 2 and 3 between 35 and 60 days. It is evident from the results that the biosurfactant alone or its producer specie is capable of promoting biodegradation to a large extent. / Os biossurfactantes são compostos anfipáticos capazes de exibir uma variedade de propriedades tensoativas que, entre outras funções, auxiliam os micro-organismos a solubilizar e degradar substratos hidrofóbicos. Nos últimos anos, os biossurfactantes têm sido investigados como possíveis substitutos para os surfactantes sintéticos, especialmente por possuírem vastas aplicações ambientais. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi caracterizar o biossurfactante produzido pela bactéria Pseudomonas cepacia CCT6659 cultivada em 2% de óleo de soja residual e 2% de milhocina e aplicar a biomolécula na remediação de solo contaminado por derivados de petróleo. O biossurfactante foi inicialmente produzido, isolado e submetido à técnica de Cromatografia em Camada Delgada, sendo classificado como uma biomolécula predominantemente hidrofóbica e aniônica contendo lipídeos e carboidratos nas proporções de 75 e 25%, respectivamente. A caracterização por Ressonância Magnética Nuclear (1H e 13C NMR) revelou a presença de grupos carbonílicos, olefínicos e alifáticos, tipicamente observados em espectros de lipídeos. Experimentos de biodegradação foram posteriormente conduzidos em solo contaminado com compostos orgânicos hidrofóbicos coletado de uma antiga região portuária na presença de um consórcio autóctone. As amostras de solo, enriquecidas inicialmente com melaço de cana, foram submetidas aos seguintes tratamentos: condição 1 solo + células bacterianas, condição 2 solo + biossurfactante, condição 3 solo + células bacterianas + biossurfactante, condição 4 solo sem adição de células e biossurfactante (controle). Os resultados obtidos demonstraram 83% de degradação dos contaminantes na presença de ambos surfactante e micro-organismo produtor (condição 3) após os primeiros dez dias de experimento, enquanto que percentuais de degradação acima de 95% foram observados nas condições 1, 2 e 3 entre 35 e 60 dias. Os resultados obtidos demonstram o potencial do biosssurfactante e de seu micro-organismo produtor como coadjuvantes dos processos de remediação em solos contaminados com derivados de petróleo.

Burkholderia cenocepcia is one of the serious infectious agents of respiratory tract among cystic fibrosis patients. There are problems mainly with strains which are capable of epidemic spread. The known epidemic in the Czech Republic was caused by ST32 strain in the past. In this work, there was completed whole genome sequence of referential isolate 1232 of B. cenocepacia ST32 in cooperation with bioinformatics by new generation sequencing techniques and by determining the problematic areas by a combination of Sanger sequencing bioinformatics approaches and manual assembling of sequence reads localized in these areas. The final version of the genome sequence was annotated by PGAAP and at the present time it is finalized. Second part of this work is dedicated to looking for a prognostic marker of infection caused by ST32 strain in patients with cystic fibrosis. We analysed the results of ST32 trancriptomic experiment and chose genes possibly connected with the cepacia syndrome - serious, mostly fatal state of infection. By quantitative PCR we compared their expression in isolates from 4 patients from time of cepacia syndrome and month before that. We checked the possibility of direct detection of the expression of these genes in clinical material. We identified genes for type III secretion system as...

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns Bastonetes Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicação em infecções é subestimada. Devido à similaridade fenotípica, mudanças taxonômicas, baixa reatividade bioquímica e limitações nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificação de BGNNF é frequentemente equivocada, culminando com a denominação de diferentes micro-organismos apenas como BGNNF, por falta de melhor diferenciação. O objetivo desse estudo foi avaliar, por métodos fenotípico convencional, proteômico e molecular, a identificação de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitário no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratório clinico como BGNNF para a identificação por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotípicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espécies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espécies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotípicos incluíram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordância com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nível de espécie foi de 64% (n=30) e apenas em gênero a concordância foi de 17% (n=8). A análise comparativa geral da identificação por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nível de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordância em nível de espécie para 60%. As discordâncias parecem ser devido às diferenças nos perfis proteicos das amostras em relação às amostras-referência do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualização de perfis no sistema. A análise do polimorfismo genético de B. contaminans mostrou a ausência de um clone disseminado causando surto, além da provável origem ambiental das infecções. Os setores de nefrologia e hemodiálise contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as culturas, respectivamente. As discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificação das espécies do CBc. Os BGNNF incomuns são de difícil caracterização independente da metodologia usada e nenhum método por si só foi capaz de identificar todas as amostras. / Some nonfermenting Gram-negative Bacilli (NFGNB) are considered of low clinical significance, and their implication in infections is usually underestimated. Due to their phenotypic similarities, frequent taxonomic changes and low biochemical reactivity, as well as to limitations of bacterial identification commercial system databases, these NFGNB are frequently misidentified and are collectively referred to as NFGNB group, in the lack of a better differentiation. The aim of the present study was to evaluate the performance of the conventional phenotypic method, the proteomic matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectometry method (MALDI-TOF MS) and of molecular methods (16S RNA and recA gene sequencing) in the identification of 78 unusual NFGNB isolated from blood cultures of pacients treated at an university hospital in Rio de Janeiro. Clonality of the predominant species identified within these isolates was determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). By the 16S rRNA gene sequence analysis, most strains (n = 31; 40%) were included in the Burkholderia spp. followed by Pseudomonas stutzeri (n = 8; 10%), Delftia acidovorans (n = 3; 4%) and Stenotrophomonas maltophilia (n = 3; 4%). The remaining bacterial isolates were included in 27 different species. By the recA gene sequencing technique, most bacteria from the Burkholderia cepacia complex (BCC), samples were classified as Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Phenotypic tests provided accurate identification of all 31 isolates included in the BCC by the 16S rRNA gene sequence analysis. For the other 47 samples, agreement of the results obtained with these two techniques in species and genus level identifications occurred in 30 (63,8%) and 17 samples (36,2%), respectively. The results obtained by the MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene sequencing methods agreed at species and genus levels in 33 (42%) and 35 isolates (45%), respectively. When bacteria from the BCC were excluded from the analysis, the agreement between the two techniques at species level increased to 60%. Misidentification by the MALDI-TOF MS method may be due to differences in protein spectra between the samples and the reference strains in the equipment database. PFGE analysis of B. contaminans isolates revealed the absence of a disseminate clone causing an outbreak, and the probable environmental source of infections. The nefrology ang dialisis sectors contributed to the greatest number of patients with positive cultures (5 pacients and 9 isolates). Clones BcoD and BcoE were found in blood cultures of pacientes treated in a same sector with differences of 4 months (BcoD, nefrology) and 1.5 year (BcoE, dialisis). The misidentifications occurred mainly due to the hard differentiation of BCC species. Unusual NFGNB are of difficult characterization whatever the methodology used and no method alone was able to identify all the isolates.