Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alguns Bastonetes Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicação em infecções é subestimada. Devido à similaridade fenotípica, mudanças taxonômicas, baixa reatividade bioquímica e limitações nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificação de BGNNF é frequentemente equivocada, culminando com a denominação de diferentes micro-organismos apenas como BGNNF, por falta de melhor diferenciação. O objetivo desse estudo foi avaliar, por métodos fenotípico convencional, proteômico e molecular, a identificação de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitário no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratório clinico como BGNNF para a identificação por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotípicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi incluída no gênero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espécies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espécies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotípicos incluíram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordância com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nível de espécie foi de 64% (n=30) e apenas em gênero a concordância foi de 17% (n=8). A análise comparativa geral da identificação por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nível de espécie e 45% (n=35) apenas em gênero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordância em nível de espécie para 60%. As discordâncias parecem ser devido às diferenças nos perfis proteicos das amostras em relação às amostras-referência do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualização de perfis no sistema. A análise do polimorfismo genético de B. contaminans mostrou a ausência de um clone disseminado causando surto, além da provável origem ambiental das infecções. Os setores de nefrologia e hemodiálise contribuíram com maior número de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferença de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodilálise), entre as culturas, respectivamente. As discordâncias entre as técnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificação das espécies do CBc. Os BGNNF incomuns são de difícil caracterização independente da metodologia usada e nenhum método por si só foi capaz de identificar todas as amostras. / Some nonfermenting Gram-negative Bacilli (NFGNB) are considered of low clinical significance, and their implication in infections is usually underestimated. Due to their phenotypic similarities, frequent taxonomic changes and low biochemical reactivity, as well as to limitations of bacterial identification commercial system databases, these NFGNB are frequently misidentified and are collectively referred to as NFGNB group, in the lack of a better differentiation. The aim of the present study was to evaluate the performance of the conventional phenotypic method, the proteomic matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectometry method (MALDI-TOF MS) and of molecular methods (16S RNA and recA gene sequencing) in the identification of 78 unusual NFGNB isolated from blood cultures of pacients treated at an university hospital in Rio de Janeiro. Clonality of the predominant species identified within these isolates was determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). By the 16S rRNA gene sequence analysis, most strains (n = 31; 40%) were included in the Burkholderia spp. followed by Pseudomonas stutzeri (n = 8; 10%), Delftia acidovorans (n = 3; 4%) and Stenotrophomonas maltophilia (n = 3; 4%). The remaining bacterial isolates were included in 27 different species. By the recA gene sequencing technique, most bacteria from the Burkholderia cepacia complex (BCC), samples were classified as Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Phenotypic tests provided accurate identification of all 31 isolates included in the BCC by the 16S rRNA gene sequence analysis. For the other 47 samples, agreement of the results obtained with these two techniques in species and genus level identifications occurred in 30 (63,8%) and 17 samples (36,2%), respectively. The results obtained by the MALDI-TOF MS and 16S rRNA gene sequencing methods agreed at species and genus levels in 33 (42%) and 35 isolates (45%), respectively. When bacteria from the BCC were excluded from the analysis, the agreement between the two techniques at species level increased to 60%. Misidentification by the MALDI-TOF MS method may be due to differences in protein spectra between the samples and the reference strains in the equipment database. PFGE analysis of B. contaminans isolates revealed the absence of a disseminate clone causing an outbreak, and the probable environmental source of infections. The nefrology ang dialisis sectors contributed to the greatest number of patients with positive cultures (5 pacients and 9 isolates). Clones BcoD and BcoE were found in blood cultures of pacientes treated in a same sector with differences of 4 months (BcoD, nefrology) and 1.5 year (BcoE, dialisis). The misidentifications occurred mainly due to the hard differentiation of BCC species. Unusual NFGNB are of difficult characterization whatever the methodology used and no method alone was able to identify all the isolates.

El problema que trae aparejado la falta de un diagnóstico certero y rápido de los patógenos respiratorios en pacientes fibroquísticos tiene un fuerte impacto en el tratamiento antimicrobiano, en el control de infecciones y principalmente en la calidad de vida y sobrevida de estos pacientes. En el caso particular de los organismos del complejo Burkholderia cepacia, que colonizan a estos pacientes, son ampliamente reconocidas las dificultades y limitaciones de los métodos bioquímicos tradicionales para su identificación. En los últimos años se han puesto muchos esfuerzos en desarrollar nuevos métodos de identificación rápidos, sencillos y de bajo costo que permitan la diferenciación e identificación inequívoca de bacilos no fermentadores, pertenecientes y no pertenecientes al complejo Burkholderia cepacia. Este trabajo de tesis fue concebido con la idea de avanzar en el conocimiento general sobre las técnicas de identificación, las características genotípicas y fenotípicas de organismos del complejo B. cepacia y a su vez resolver problemas de diagnóstico del sector hospitalario y epidemiológicos de nuestro país.

Inhibition of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 by Burkholderia cepacia was evident when grown on various media (TSA, PDA, PSA, YM, KMB, PPM, NYGA, LA) with different carbon sources and under various pH and temperature conditions. In addition, B. cepacia was able to inhibit several fungal pathogens in vitro. Antagonism of B. cepacia against F. oxysporum f. sp. cubense occured at high levels of Fe³+, which may suggest that antagonism by B. cepacia did not involve siderophore production. Thin layer chromatogram (TLC) examination showed that B. cepacia produced several substances, one of which had similar R[f] value to that described for pyrrolnitrin. Cell-free supernatant of a 4-day culture of 6. cepacia was applied to an Amberlite XAD-2 column and inhibitory activity co-eluted with the 95% methanol (pH 9.5) fraction. The concentrated activated fractions showed inhibitory activity against F. oxysporum f. sp. cubense. A GC-MS chromatogram indicated numerous components in the antifungal extracts. The only compound identified in the Wiley 138 library, was 1,2- Benzenedicarboxylic acid, bis (2-Ethylhexyl) ester. Observations by light microscopy indicated that B. cepacia inhibited spore germination in F. oxysporum f. sp. cubense race 4 and retarded the mycelial growth. The interaction between the endophytic bacterium, B. cepacia and F. oxysporum f. sp. cubense race 4 was investigated with aid of scanning and transmission electron microscopy. This demonstrated that the bacterium was able to colonize the surface of hypha and macrospore of F. oxysporum f. sp. cubense. Mycelial deformation, terminal and/or intercalary swelling were evident. At later stages, hyphae of F. oxysporum f.sp. cubense, colonized by B. cepacia, were found to have collapsed. Further studies in vivo confirmed that B. cepacia colonized the hypha of F. oxysporum f. sp. cubense which had invaded banana roots. TEM observation showed that in the banana plant B. cepacia was closely associated with the healthy banana roots and a matrix was frequently found to be present between the bacterium and the plant surface. In addition, B. cepacia exists mainly in the intercellular space of the banana roots. UV irradiation treatment of B. cepacia resulted in a mutant that had lost inhibitory activity against F. oxysporum f. sp. cubense on TSA agar. Transposon mutagenesis of B. cepacia was performed by Tn5 insertion. Six mutants which had lost or had reduced inhibitory activity against F. oxysporum f. sp. cubense were generated. These mutants showed no inhibitory zones on TSA medium in the presence of the fungus. It was observed that one mutants. cepacia :: Tn5-188 appeared to lose the ability to colonize the fungal hypha, whilst a different mutant B. cepacia ::Tn5 - 217 was still able to colonize the fungal hyphae. TLC analyses showed that there was a decrease in antibiotic production in mutants B. cepacia :: Tn5 - 217 and B. cepacia - UV - 34, compared with the wild type. GC- MS analyses showed that there was no evidence of the peaks at 14.62 minutes, 20.0 minutes and 20.46 minutes in both chromatograms of mutants B. cepacia :: Tn5 -217 and 8. cepacia -UV - 34, compared with the wild type B. cepacia. No PCR products were detected using primers that were developed from sequences within the biosynthetic loci for Phi of P.fluorescens Q2-87(GenBank accession no. U41818) and PCA of P. fluorescens 2-79 (GeneBank no. L48616). Colony hybridization suggested that genomic DNA from B. cepacia could contain both Phi- and PCA probes. It was found that hybridization of genomic DNA digested with Cla-I of B. cepaca with Phl2a probe only occurred at low stringency. A hybridization signal was detected from a Cla-l fragment of approximately 2800bp. / Thesis (M.Sc.)-University of Natal, Pietermaritzburg, 1997.

Bactérias psicrotróficas foram isoladas de leite cru refrigerado oriundo de duas indústrias de beneficiamento localizadas no sul do Brasil. Contagens de bactérias psicrotróficas foram entre 4,9 e 7,8 logUFC/mL e de 5,3 a 7,2 logUFC/mL, em amostras coletadas no caminhão-tanque e no silo de armazenamento da indústria, respectivamente. Dentre as bactérias isoladas, 90% foram Gram-negativas. A maioria das cepas apresentaram baixa atividade proteolítica, mas cepas de Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca e Aeromonas sp. apresentaram valores superiores a 20 U/mL em azocaseina como substrato. Proteases das cepas selecionadas foram resistentes aos tratamentos térmicos convencionais e causaram coagulação de leite UAT depois de cinco dias de estocagem em temperatura ambiente. A atividade proteolítica de uma variedade psicrotrófica de Burkholderia cepacia isolada de leite cru refrigerado foi caracterizada. A atividade proteolítica na azocaseina apresentou atividade máxima com pH 6-7 e decréscimo com pHs ácido e alcalino. A enzima apresentou relativa estabilidade térmica entre 40-55°C durante 25 min, mantendo pelo menos 80% de sua atividade inicial a 40°C. O ensaio de coagulação do leite demostrou que a protease da B. cepacia causou coagulação do leite desnatado a partir do segundo dia, enquanto a coagulação do leite integral foi observada a partir do quinto dia. A aderência desta cepa ao aço inoxidável foi avaliada e os substratos apresentaram níveis de cerca de 107 UFC/cm², independente dos diferentes tempos de imersão. A cepa denominada de 1A4 apresentou expressiva atividade proteolítica em pH 6-7 e 40ºC, atividade de coagulação do leite e capacidade de aderir ao aço inoxidável. Estes resultados indicam que B. cepacia representa um potencial perigo a qualidade do leite e produtos lácteos. / Psychrotrophic bacteria were isolated from refrigerated raw milk of two processing plants at Southern Brazil. Psychrotrophic counts were between 4.9 and 7.8 log CFU/mL, and 5.3 to 7.2 log CFU/mL, for samples collected at the truck and the milk storage silo, respectively. Among the bacterial isolates, 90% were Gram-negative. Most strains presented low proteolytic activity, but strains of Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca and Aeromonas sp. showed higher than 20 U/mL on azocasein as substrate. Crude proteases from selected strains were resistant to conventional heat treatments and caused coagulation of UHT milk after 5 days storage at room temperature. The proteolytic activity of a psychrotrophic strain of Burkholderia cepacia isolated from refrigerated raw milk was characterized. The proteolytic activity on azocasein showed maximum activity at pH 6-7 and decrease at acid and alkaline pHs. The enzyme showed relative thermal stability in the range 40-55°C during 25 min, maintaining at least 80% its initial activity at 40°C. Milk coagulation assay showed that the crude protease from B. cepacia caused coagulation from day 2 for skimmed milk, whereas coagulation was observed from day 5 for whole milk. The adherence of this strain to stainless steel was evaluated, and the substrata had around 107CFU/cm², regardless the different immersion time evaluated. The strain 1A4 showed elevated proteolytic activity at pH 6-7 and 40ºC, high milk coagulating-activity, and elevated capability to adhere to stainless steel. These results indicate that B. cepacia may represent a potential hazadous to milk and dairy products.

A Fibrose cística (FC) é uma condição genética que predispõe os portadores a infecções crônicas repetidas do trato respiratório. O complexo Burkholderia cepacia (CBC), formado por espécies (variantes genômicas) intimamente relacionadas, são microorganismos comumente associados a essas infecções. A variante genômica do CBC envolvida na colonização de um determinado paciente influencia diretamente na progressão da sua doença e sobrevida. A identificação fenotípica do CBC é difícil por se tratar de um bacilo Gram-negativo não fermentador e a identificação de suas espécies é ainda mais complexa devido à similaridade fenotípica que existe entre elas. Os principais objetivos do estudo foram a padronização de uma técnica molecular de PCR-RFLP ("polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism") para identificação do CBC e de suas espécies e o estabelecimento da prevalência dessas espécies entre os pacientes com FC atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre no período de fevereiro a dezembro de 2006. Na análise por PCR foram utilizados iniciadores específicos para o gene recA (BCR1 e BCR2). Para o RFLP foram utilizadas as enzimas de restrição HaeIII e Mnll (New England Biolabs Inc., Hitchin, England). No período do estudo foram submetidas ao laboratório amostras de 244 pacientes com FC, sendo que em amostras de 26 pacientes foram identificadas bactérias pertencentes ao CBC. Nesse período, 10.6% (26/244) dos pacientes com fibrose cística que entraram no critério de inclusão estavam colonizados pelo CBC. A análise molecular do gene recA mostrou que B. cenocepacia foi isolada de 53.8% (14) dos pacientes, B. multivorans; 15.4% (4); B. vietnaminsis 7.7% (2) e B. ambifaria 7.7% (2). Dois pacientes 7.7% (2) estiveram colonizados por B. cenocepacia IIIA and IIIB em diferentes momentos. Em dois pacientes não foi possível realizar a identificação em nível de espécie. As técnicas moleculares, como PCR-RFLP são mais eficientes para a identificação do CBC e as únicas capazes de identificar suas variantes genômicas, o que é imprescindível para o acompanhamento clínico dos pacientes portadores de fibrose cística.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi caracterizar a identificacao, o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, a similaridade genetica e os mecanismos de resistencia a trimetoprim/sulfametoxazol (SXT) entre os isolados clinicos do complexo Burkholderia cepacia (CBc). Metodologia: Foram avaliados 82 isolados clinicos do CBc recuperados de pacientes atendidos em dois hospitais universitarios localizados na regiao sudeste do Brasil. A identificacao bacteriana foi realizada pelo sequenciamento do gene recA e pela espectrometria de massas MALDI-TOF MS. O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado para ceftazidima, cloranfenicol, levofloxacina, meropenem, minociclina, ticarcilina/acido clavulanico e SXT. Os resultados do perfil de sensibilidade tambem foram comparados entre quatro tecnicas distintas, microdiluicao em caldo, diluicao em agar, Etest e disco difusao, sendo a microdiluicao em caldo considerada a tecnica referencia. A concordancia geral e por categoria de sensibilidade, assim como as taxas de erros, foram calculadas de acordo com as recomendacoes do CLSI M23-A3. Os genes que conferem resistencia aos betalactamicos e ao SXT foram pesquisados por meio das tecnicas de PCR e sequenciamento dos respectivos amplicons. A similaridade genetica entre os isolados que carreavam genes de resistencia foi determinada por PFGE. O DNA plasmidial e cromossomal dos isolados foram extraidos utilizando as tecnicas de Kieser e kits comerciais, respectivamente. A localizacao dos genes de resistencia foi determinada por Southern blot e hibridizacao utilizando sondas especificas. O contexto genetico dos genes de resistencia encontrados entre os isolados do CBc foi determinado por PCR e sequenciamento das regioes conservadas 3ÆCS e 5ÆCS do integron de classe 1. A tecnica de conjugacao foi realizada utilizando como amostra receptora E.coli J53. Resultados: Foram identificadas, pelo sequenciamento do gene recA, B. cenocepacia (n=44), B. multivorans (n=12), B. vietnamiensis (n=10), B. contaminans (n=9) e B. cepacia (n=7). Comparando os resultados obtidos pelo recA com aqueles do MALDI-TOF MS, 100% e 75,6% dos isolados foram concordantes na identificacao ao nivel de genero e especie, respectivamente. Boas taxas de sensibilidade foram encontradas para ceftazidima (86,6%), meropenem (87,8%), minociclina (87,8%) e SXT (97,6%). A concordancia geral entre as tecnicas avaliadas foi maior que 93% entre microdiluicao em caldo e diluicao em agar, exceto para cloranfenicol (89%). Entre a tecnica referencia e os resultados obtidos pelo Etest, a concordancia geral foi maior que 92%, exceto para ceftazidima (78%), SXT (80,4%) e cloranfenicol (85,3%). A concordancia por categoria entre microdiluicao em caldo e disco difusao foi maior que 90% para a maioria dos antimicrobianos testados, exceto para cloranfenicol (52,4%), SXT (74,4%) e levofloxacina (83,3%). Dois isolados (B. cenocepacia e B. cepacia) apresentaram resistencia ao SXT e carreavam o gene dhfr22 inserido em um integron que classe 1. Entre os isolados resistentes a ceftazidima (7,3%), em apenas um (B. cenocepacia) foi detectado o gene blaOXA-10-like, tambem inserido em um integron de classe 1 o qual continha um gene cassete que confere resistencia aos aminoglicosideos, aadA1. De acordo com os resultados da hibridizacao, blaOXA-10-like estava inserido em um plasmideo de ~70 Kb. Entretanto, nao conseguimos realizar a transferencia deste plasmideo pela tecnica de conjugacao. Os dois isolados de B. cenocepacia que carreavam genes de resistencia apresentaram perfil clonal semelhante pelo PFGE. Conclusoes: O MALDI-TOF MS demonstrou ser uma excelente tecnica alternativa para a identificacao dos isolados do CBc. Boas taxas de sensibilidade foram observadas para os antimicrobianos usualmente empregados no tratamento das infeccoes causadas por estes micro-organismos. Em geral, foi observada boa concordancia entre as tecnicas de sensibilidade avaliadas neste estudo, exceto para as metodologias Etest e disco difusao na predicao da sensibilidade ao SXT. O gene dhfr22 demonstrou ser o principal mecanismo entre os isolados resistentes ao SXT. De acordo com os nossos conhecimentos, descrevemos, pela primeira vez, a presenca do gene blaOXA-10-like em um isolado clinico do CBc / FAPESP: 2012/04910-9 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Bactérias psicrotróficas foram isoladas de leite cru refrigerado oriundo de duas indústrias de beneficiamento localizadas no sul do Brasil. Contagens de bactérias psicrotróficas foram entre 4,9 e 7,8 logUFC/mL e de 5,3 a 7,2 logUFC/mL, em amostras coletadas no caminhão-tanque e no silo de armazenamento da indústria, respectivamente. Dentre as bactérias isoladas, 90% foram Gram-negativas. A maioria das cepas apresentaram baixa atividade proteolítica, mas cepas de Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca e Aeromonas sp. apresentaram valores superiores a 20 U/mL em azocaseina como substrato. Proteases das cepas selecionadas foram resistentes aos tratamentos térmicos convencionais e causaram coagulação de leite UAT depois de cinco dias de estocagem em temperatura ambiente. A atividade proteolítica de uma variedade psicrotrófica de Burkholderia cepacia isolada de leite cru refrigerado foi caracterizada. A atividade proteolítica na azocaseina apresentou atividade máxima com pH 6-7 e decréscimo com pHs ácido e alcalino. A enzima apresentou relativa estabilidade térmica entre 40-55°C durante 25 min, mantendo pelo menos 80% de sua atividade inicial a 40°C. O ensaio de coagulação do leite demostrou que a protease da B. cepacia causou coagulação do leite desnatado a partir do segundo dia, enquanto a coagulação do leite integral foi observada a partir do quinto dia. A aderência desta cepa ao aço inoxidável foi avaliada e os substratos apresentaram níveis de cerca de 107 UFC/cm², independente dos diferentes tempos de imersão. A cepa denominada de 1A4 apresentou expressiva atividade proteolítica em pH 6-7 e 40ºC, atividade de coagulação do leite e capacidade de aderir ao aço inoxidável. Estes resultados indicam que B. cepacia representa um potencial perigo a qualidade do leite e produtos lácteos. / Psychrotrophic bacteria were isolated from refrigerated raw milk of two processing plants at Southern Brazil. Psychrotrophic counts were between 4.9 and 7.8 log CFU/mL, and 5.3 to 7.2 log CFU/mL, for samples collected at the truck and the milk storage silo, respectively. Among the bacterial isolates, 90% were Gram-negative. Most strains presented low proteolytic activity, but strains of Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca and Aeromonas sp. showed higher than 20 U/mL on azocasein as substrate. Crude proteases from selected strains were resistant to conventional heat treatments and caused coagulation of UHT milk after 5 days storage at room temperature. The proteolytic activity of a psychrotrophic strain of Burkholderia cepacia isolated from refrigerated raw milk was characterized. The proteolytic activity on azocasein showed maximum activity at pH 6-7 and decrease at acid and alkaline pHs. The enzyme showed relative thermal stability in the range 40-55°C during 25 min, maintaining at least 80% its initial activity at 40°C. Milk coagulation assay showed that the crude protease from B. cepacia caused coagulation from day 2 for skimmed milk, whereas coagulation was observed from day 5 for whole milk. The adherence of this strain to stainless steel was evaluated, and the substrata had around 107CFU/cm², regardless the different immersion time evaluated. The strain 1A4 showed elevated proteolytic activity at pH 6-7 and 40ºC, high milk coagulating-activity, and elevated capability to adhere to stainless steel. These results indicate that B. cepacia may represent a potential hazadous to milk and dairy products.

A Fibrose cística (FC) é uma condição genética que predispõe os portadores a infecções crônicas repetidas do trato respiratório. O complexo Burkholderia cepacia (CBC), formado por espécies (variantes genômicas) intimamente relacionadas, são microorganismos comumente associados a essas infecções. A variante genômica do CBC envolvida na colonização de um determinado paciente influencia diretamente na progressão da sua doença e sobrevida. A identificação fenotípica do CBC é difícil por se tratar de um bacilo Gram-negativo não fermentador e a identificação de suas espécies é ainda mais complexa devido à similaridade fenotípica que existe entre elas. Os principais objetivos do estudo foram a padronização de uma técnica molecular de PCR-RFLP ("polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism") para identificação do CBC e de suas espécies e o estabelecimento da prevalência dessas espécies entre os pacientes com FC atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre no período de fevereiro a dezembro de 2006. Na análise por PCR foram utilizados iniciadores específicos para o gene recA (BCR1 e BCR2). Para o RFLP foram utilizadas as enzimas de restrição HaeIII e Mnll (New England Biolabs Inc., Hitchin, England). No período do estudo foram submetidas ao laboratório amostras de 244 pacientes com FC, sendo que em amostras de 26 pacientes foram identificadas bactérias pertencentes ao CBC. Nesse período, 10.6% (26/244) dos pacientes com fibrose cística que entraram no critério de inclusão estavam colonizados pelo CBC. A análise molecular do gene recA mostrou que B. cenocepacia foi isolada de 53.8% (14) dos pacientes, B. multivorans; 15.4% (4); B. vietnaminsis 7.7% (2) e B. ambifaria 7.7% (2). Dois pacientes 7.7% (2) estiveram colonizados por B. cenocepacia IIIA and IIIB em diferentes momentos. Em dois pacientes não foi possível realizar a identificação em nível de espécie. As técnicas moleculares, como PCR-RFLP são mais eficientes para a identificação do CBC e as únicas capazes de identificar suas variantes genômicas, o que é imprescindível para o acompanhamento clínico dos pacientes portadores de fibrose cística.

Bactérias psicrotróficas foram isoladas de leite cru refrigerado oriundo de duas indústrias de beneficiamento localizadas no sul do Brasil. Contagens de bactérias psicrotróficas foram entre 4,9 e 7,8 logUFC/mL e de 5,3 a 7,2 logUFC/mL, em amostras coletadas no caminhão-tanque e no silo de armazenamento da indústria, respectivamente. Dentre as bactérias isoladas, 90% foram Gram-negativas. A maioria das cepas apresentaram baixa atividade proteolítica, mas cepas de Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca e Aeromonas sp. apresentaram valores superiores a 20 U/mL em azocaseina como substrato. Proteases das cepas selecionadas foram resistentes aos tratamentos térmicos convencionais e causaram coagulação de leite UAT depois de cinco dias de estocagem em temperatura ambiente. A atividade proteolítica de uma variedade psicrotrófica de Burkholderia cepacia isolada de leite cru refrigerado foi caracterizada. A atividade proteolítica na azocaseina apresentou atividade máxima com pH 6-7 e decréscimo com pHs ácido e alcalino. A enzima apresentou relativa estabilidade térmica entre 40-55°C durante 25 min, mantendo pelo menos 80% de sua atividade inicial a 40°C. O ensaio de coagulação do leite demostrou que a protease da B. cepacia causou coagulação do leite desnatado a partir do segundo dia, enquanto a coagulação do leite integral foi observada a partir do quinto dia. A aderência desta cepa ao aço inoxidável foi avaliada e os substratos apresentaram níveis de cerca de 107 UFC/cm², independente dos diferentes tempos de imersão. A cepa denominada de 1A4 apresentou expressiva atividade proteolítica em pH 6-7 e 40ºC, atividade de coagulação do leite e capacidade de aderir ao aço inoxidável. Estes resultados indicam que B. cepacia representa um potencial perigo a qualidade do leite e produtos lácteos. / Psychrotrophic bacteria were isolated from refrigerated raw milk of two processing plants at Southern Brazil. Psychrotrophic counts were between 4.9 and 7.8 log CFU/mL, and 5.3 to 7.2 log CFU/mL, for samples collected at the truck and the milk storage silo, respectively. Among the bacterial isolates, 90% were Gram-negative. Most strains presented low proteolytic activity, but strains of Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca and Aeromonas sp. showed higher than 20 U/mL on azocasein as substrate. Crude proteases from selected strains were resistant to conventional heat treatments and caused coagulation of UHT milk after 5 days storage at room temperature. The proteolytic activity of a psychrotrophic strain of Burkholderia cepacia isolated from refrigerated raw milk was characterized. The proteolytic activity on azocasein showed maximum activity at pH 6-7 and decrease at acid and alkaline pHs. The enzyme showed relative thermal stability in the range 40-55°C during 25 min, maintaining at least 80% its initial activity at 40°C. Milk coagulation assay showed that the crude protease from B. cepacia caused coagulation from day 2 for skimmed milk, whereas coagulation was observed from day 5 for whole milk. The adherence of this strain to stainless steel was evaluated, and the substrata had around 107CFU/cm², regardless the different immersion time evaluated. The strain 1A4 showed elevated proteolytic activity at pH 6-7 and 40ºC, high milk coagulating-activity, and elevated capability to adhere to stainless steel. These results indicate that B. cepacia may represent a potential hazadous to milk and dairy products.

A Fibrose cística (FC) é uma condição genética que predispõe os portadores a infecções crônicas repetidas do trato respiratório. O complexo Burkholderia cepacia (CBC), formado por espécies (variantes genômicas) intimamente relacionadas, são microorganismos comumente associados a essas infecções. A variante genômica do CBC envolvida na colonização de um determinado paciente influencia diretamente na progressão da sua doença e sobrevida. A identificação fenotípica do CBC é difícil por se tratar de um bacilo Gram-negativo não fermentador e a identificação de suas espécies é ainda mais complexa devido à similaridade fenotípica que existe entre elas. Os principais objetivos do estudo foram a padronização de uma técnica molecular de PCR-RFLP ("polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism") para identificação do CBC e de suas espécies e o estabelecimento da prevalência dessas espécies entre os pacientes com FC atendidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre no período de fevereiro a dezembro de 2006. Na análise por PCR foram utilizados iniciadores específicos para o gene recA (BCR1 e BCR2). Para o RFLP foram utilizadas as enzimas de restrição HaeIII e Mnll (New England Biolabs Inc., Hitchin, England). No período do estudo foram submetidas ao laboratório amostras de 244 pacientes com FC, sendo que em amostras de 26 pacientes foram identificadas bactérias pertencentes ao CBC. Nesse período, 10.6% (26/244) dos pacientes com fibrose cística que entraram no critério de inclusão estavam colonizados pelo CBC. A análise molecular do gene recA mostrou que B. cenocepacia foi isolada de 53.8% (14) dos pacientes, B. multivorans; 15.4% (4); B. vietnaminsis 7.7% (2) e B. ambifaria 7.7% (2). Dois pacientes 7.7% (2) estiveram colonizados por B. cenocepacia IIIA and IIIB em diferentes momentos. Em dois pacientes não foi possível realizar a identificação em nível de espécie. As técnicas moleculares, como PCR-RFLP são mais eficientes para a identificação do CBC e as únicas capazes de identificar suas variantes genômicas, o que é imprescindível para o acompanhamento clínico dos pacientes portadores de fibrose cística.