A malária é a doença parasitária mais comum no mundo e é causada por protozoários do gênero Plasmodium spp., sendo transmitida por dípteros do gênero Anopheles spp. para hospedeiros vertebrados. Ambos, parasitas e vetores, têm desenvolvido resistência aos tratamentos e medidas profiláticas, respectivamente, indicando a necessidade de novas formas de controle. Chaperonas moleculares e co-chaperonas são interessantes alvos de estudo para desenvolvimento de terapias mais eficazes, uma vez que estas biomoléculas desempenham papel importante no processo de adaptação e sobrevivência do protozoário. As chaperonas da família Hsp90 participam de vários processos fisiológicos, que não somente auxiliar o enovelamento de proteínas clientes. Cada protômero da Hsp90 é composto por três domínios denominados N, M e C, e a proteína se organiza na forma de homodímeros flexíveis. As co-chaperonas são proteínas auxiliares, essenciais para modulação do ciclo funcional da Hsp90. A co-chaperona Aha1 (do inglês Activator of the Hsp90-ATPase activity 1) estabiliza a Hsp90 em um estado conformacional intermediário e estimula a atividade ATPásica da mesma. Neste contexto, é usual a busca por inibidores potenciais diretos e indiretos para Hsp90 e por respostas sobre seu mecanismo de inibição. O objetivo deste trabalho foi a obtenção e caracterização bioquímica e biofísica da proteína Hsp90 recombinante de Plasmodium falciparum (PfHsp90) e construções PfHsp90NM e PfHsp90M, além do mapeamento da interação com a co-chaperona Aha4 de P. falciparum (PfAha4). Os experimentos de caracterização estrutural revelam que o domínio N é menos estável termicamente do que o domínio M e também é o mais rico em estrutura secundária do tipo hélice α. A PfHsp90 comporta-se majoritariamente como homodímero alongado e flexível em solução, sendo o domínio C essencial para a dimerização, todavia as construções PfHsp90NM e PfHsp90M comportam-se como monômeros. Ensaios de fluorescência revelaram que as construções exibem diferenças na estabilidade química e que possuem estrutura terciária local com seus triptofanos parcialmente expostos ao solvente. A atividade ATPásica da PfHsp90 foi estimulada por PfAha4, e a interação entre elas foi resolvida com estequiometria de duas moléculas de PfAha4 por dímero de PfHsp90. Tal interação foi entalpicamente dirigida, ocorrendo liberação de moléculas de água, com interação mediada principalmente por contatos hidrofóbicos. O mapeamento das regiões de contato sugere que o cerne da interação ocorra entre a PfAha4 e o domínio M da PfHsp90. As diferenças exibidas pela PfHsp90 com relação as propriedades de proteínas ortólogas podem ter relação com os resíduos de aminoácidos que conectam os domínios N e M em sua estrutura, devido a sua flexibilidade, tamanho e composição. / Malaria is the most common parasitic disease in the world and is caused by protozoa of the genus Plasmodium spp., and transmitted by dipterans of the genus Anopheles spp. for vertebrate hosts. Both parasites and vectors have developed resistance to treatments and prophylactic measures, respectively, indicating the need for new forms of control. Molecular chaperones and co-chaperones are interesting targets for the development of more effective therapies, since these biomolecules play an important role in the process of adaptation and survival of the protozoan. The chaperones of the Hsp90 family participate in several physiological processes, which not only aid in the folding of client proteins. Each Hsp90 protomer have three domains called N, M and C, and the protein is organized as flexible homodimers. Co-chaperones are assistant proteins, they are essential for modulating the functional cycle of Hsp90. The Aha1 (Activator of the Hsp90-ATPase activity 1) co-chaperone stabilizes Hsp90 in an intermediate conformational state and stimulates the ATPase activity thereof. In this context, it is usual the search for direct and indirect potential inhibitors for Hsp90 and for responses about its inhibition mechanism. The objective of this work was the biochemical and biophysical characterization of the Hsp90 recombinant protein of Plasmodium falciparum (PfHsp90) and PfHsp90NM and PfHsp90M constructions, as well as to map interactions with the Aha4 co-chaperone of P falciparum (PfAha4). Structural characterization experiments show that the N domain is less thermally stable than the M domain and is also the richest in α-helix secondary structure. PfHsp90 behaves mostly as elongated and flexible homodimer in solution, domain C is essential for dimerization, on the other hand the constructs PfHsp90NM and PfHsp90M behave as monomers. Fluorescence assays revealed that the constructs exhibit differences in chemical stability and that have local tertiary structure with their tryptophans partially exposed to the solvent. The ATPase activity of PfHsp90 was stimulated by PfAha4, and the interaction between them was resolved with stoichiometry of two molecules of PfAha4 by PfHsp90 dimer. Such interaction was enthalpically driven, releasing of water molecules, with interaction mediated mainly by hydrophobic contacts. The mapping of contact regions suggests that the core of the interaction occurs between PfAha4 and the M domain of PfHsp90. The differences exhibited by PfHsp90 concerning the properties of orthologous proteins, may be related to the amino acid residues that connect the N and M domains in its structure, due to its flexibility, size and composition.

As chaperonas moleculares da família Hsp70 desempenham funções cruciais nas células de todos os organismos vivos, de procariotos a eucariotos. Nestes, estão presentes em todos os compartimentos celulares e nas mitocôndrias é expressa uma isoforma própria (mtHsp70), que participa dos processos enovelamento e maturação de proteínas bem como de sua importação para a matriz mitocondrial. Diante da crescente demanda de pesquisa sobre doenças tropicais negligenciadas, foi tomado como objeto de estudo neste trabalho uma Hsp70 mitocondrial de Leishmania braziliensis (LbmtHsp70) com o intuito de caracterizá-la estrutural e funcionalmente em comparação à ortóloga humana com maior identidade: a mtHsp70 também chamada de mortalina, GRP75, HspA9 ou PBP74. A LbmtHsp70 foi purificada em sua forma enovelada, em sistema monodisperso apresentando dados hidrodinâmicos condizentes com a forma monomérica, foi testada sua estabilidade quanto à influência de nucleotídeos de adenosina (ATP e ADP) à sua estrutura e, por fim, foram feitos ensaios para avaliar sua atividade ATPásica e de energia de interação com nucleotídeos. De forma geral, a LbmtHsp70 é bastante similar à mortalina, como pode ser evidenciado pelos resultados obtidos com algumas particularidades. / The molecular chaperones from the Hsp70 family perform critical cell roles in all organisms, from prokaryotes to eukaryotes. In the last ones, they are found in all cell compartments and a particular isoform is expressed in the mitochondria, where it carries out folding and maturation processes as well as the import of proteins to the mitochondrial matrix. In face of the growing demand for research about neglected tropical diseases, in this study a Hsp70 from Leishmania braziliensis\'s mitochondria was taken as object of study for further structural and functional characterization in comparison to the human orthologous which presents the highest identity to LbmtHsp70: the mtHsp70 also known as mortalin, GRP75, HspA9 or PB74. LbmtHsp70 was obtained in folded state in monodisperse system with hydrodynamic data consistent to monomeric conformer, stability and adenosine nucleotides influence to its structure were analyzed, and were performed assays for ATPase activity and nucleotide interaction energy. In a general way LbmtHsp70 is very similar to mortalin as can be shown through the results, but with some peculiarities.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6071.pdf: 2789101 bytes, checksum: 91e27d4de2c662fb669682eb6d3013b3 (MD5) Previous issue date: 2014-06-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Protein folding is essential for proteins proper biological function. Failures in this process can lead to the formation of poorly unfolded proteins and/or protein aggregates. In order to avoid this problem, the cells express a family of proteins known as molecular chaperones. The molecular chaperones are proteins that assist the correct folding of other proteins, and other important functions in the cells. The Hsp90 family is important for protein folding and it assists in preventing protein aggregation. Hsp90 is regulated by several co-chaperones, for example, p23. The p23 is a small acidic protein that regulates the ATPase activity of Hsp90. It has a structured N-terminal beta-sheet and an unstructured C-terminal domain. In addition to the regulatory role, as an inhibitor of ATPase activity of Hsp90, it also has chaperone activity in itself. Thus, the aim of this study was to investigate comparatively two p23 identified in the Leishmania braziliensis (Lbp23A and Lbp23B) genome. The proteins were expressed, purified and structurally and functionally characterized. Furthermore, functional assays such as intrinsic chaperone activity and inhibition of ATPase activity of Hsp90 L. braziliensis (LbHsp90) and identifying in vivo by western blotting were developed. The results indicate that these two proteins are structurally similar, however, demonstrated significant differences in chemical and thermal stability. The Lbp23 also differ in relation to chaperone activity and inhibition of ATPase activity of LbHsp90. The in vivo identification revealed the presence of both Lbp23 in extracts of L. braziliensis; besides suggesting possible post-translational modifications in Lbp23B. The results indicate that both Lbp23 are undoubtedly p23, since they show p23-like function and structural signs. / O enovelamento proteico é essencial para a correta função biológica das proteínas. Falhas nesse processo podem levar à formação de proteínas mal enoveladas e/ou agregados proteicos. Para tentar evitar esse problema, a célula expressa uma família de proteínas denominadas de chaperonas moleculares ou proteínas de choque térmico (Hsp). As chaperonas moleculares auxiliam no enovelamento correto de outras proteínas, entre outras funções importantes para as células. A família das Hsp90 são chaperonas importantes por auxiliarem no enovelamento proteico e prevenirem a agregação de proteínas. A Hsp90 é regulada por diversas co-chaperonas, como, por exemplo, a p23. A p23 é uma pequena proteína ácida que regula a atividade ATPásica da Hsp90. Ela possui um domínio N-terminal estruturado em folhas-beta e um domínio C-terminal desestruturado. Além do papel regulatório, inibindo a atividade ATPásica da Hsp90, ela possui atividade chaperona. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi estudar comparativamente as duas p23 identificadas no genoma do protozoário Leishmania braziliensis (Lbp23A e Lbp23B). As proteínas foram expressas, purificadas e caracterizadas estrutural e funcionalmente. Além disso, foram desenvolvidos experimentos funcionais como: atividade chaperona; inibição da atividade ATPásica da Hsp90 de L. braziliensis (LbHsp90) e identificação in vivo por western blotting. Os resultados indicam que essas duas proteínas são similares estruturalmente, porém, possuem estabilidade química e térmica notavelmente diferente. Ambas Lbp23 apresentam diferenças em relação à atividade chaperona e inibição da atividade ATPásica da LbHsp90. A identificação in vivo mostrou a presença das duas Lbp23 em extratos de L. braziliensis; além de sugerir possíveis modificações pós-traducionais na Lbp23B. Os resultados indicam que ambas as Lbp23 de L. braziliensis são inequivocamente p23, pois possuem sinais estruturais e função desta co-chaperona.

As chaperonas moleculares da família Hsp70 desempenham funções cruciais nas células de todos os organismos vivos, de procariotos a eucariotos. Nestes, estão presentes em todos os compartimentos celulares e nas mitocôndrias é expressa uma isoforma própria (mtHsp70), que participa dos processos enovelamento e maturação de proteínas bem como de sua importação para a matriz mitocondrial. Diante da crescente demanda de pesquisa sobre doenças tropicais negligenciadas, foi tomado como objeto de estudo neste trabalho uma Hsp70 mitocondrial de Leishmania braziliensis (LbmtHsp70) com o intuito de caracterizá-la estrutural e funcionalmente em comparação à ortóloga humana com maior identidade: a mtHsp70 também chamada de mortalina, GRP75, HspA9 ou PBP74. A LbmtHsp70 foi purificada em sua forma enovelada, em sistema monodisperso apresentando dados hidrodinâmicos condizentes com a forma monomérica, foi testada sua estabilidade quanto à influência de nucleotídeos de adenosina (ATP e ADP) à sua estrutura e, por fim, foram feitos ensaios para avaliar sua atividade ATPásica e de energia de interação com nucleotídeos. De forma geral, a LbmtHsp70 é bastante similar à mortalina, como pode ser evidenciado pelos resultados obtidos com algumas particularidades. / The molecular chaperones from the Hsp70 family perform critical cell roles in all organisms, from prokaryotes to eukaryotes. In the last ones, they are found in all cell compartments and a particular isoform is expressed in the mitochondria, where it carries out folding and maturation processes as well as the import of proteins to the mitochondrial matrix. In face of the growing demand for research about neglected tropical diseases, in this study a Hsp70 from Leishmania braziliensis\'s mitochondria was taken as object of study for further structural and functional characterization in comparison to the human orthologous which presents the highest identity to LbmtHsp70: the mtHsp70 also known as mortalin, GRP75, HspA9 or PB74. LbmtHsp70 was obtained in folded state in monodisperse system with hydrodynamic data consistent to monomeric conformer, stability and adenosine nucleotides influence to its structure were analyzed, and were performed assays for ATPase activity and nucleotide interaction energy. In a general way LbmtHsp70 is very similar to mortalin as can be shown through the results, but with some peculiarities.