京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第21467号 / 農博第2310号 / 新制||農||1064(附属図書館) / 学位論文||H31||N5162(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻 / (主査)教授 平井 伸博, 准教授 赤松 美紀, 教授 森 直樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Heritage apple cultivars for cider-making are often distinguished by a high concentration of tannins (phenolic compounds), and/or acid. The phenolic content of some cider apples far exceeds that of white wine, however most cider fermentation practices are directly taken from white winemaking, not accounting for effects of high concentrations of phenolic compounds on yeast fermentation. The objective of this study was to determine the impact of ferulic acid, p-coumaric acid, and chlorogenic acid—at concentrations reported in apples—and their interactions with yeast assimilable nitrogen (YAN) on fermentation kinetics and cider aroma. Our hypothesis was that the phenolic compounds present in high-tannin cider apples would negatively impact fermentation kinetics, but not alter the aroma, and that added YAN would reduce these effects. Ferulic acid negatively affected fermentation performance (p < 0.05), but p-coumaric acid and chlorogenic acid did not. p-Coumaric acid led to the greatest changes in cider aroma. Differences were also detected for different concentrations of ferulic acid. Chlorogenic acid did not affect aroma. Yeast strain influenced fermentation performance and cider aroma. Finally, addition of exogenous YAN improved fermentation performance for the low concentration ferulic acid condition, but not for the high concentration. Adding YAN also changed cider aroma in the presence of p-coumaric acid. / Master of Science in Life Sciences / Hard cider is increasingly popular in the United States. Heritage apple cultivars are traditional cider apples, often distinguished by a high concentration of tannins (phenolic compounds), and/or acid, unlike dessert apples that are typically higher in sugar than tannins. While the phenolic content of some cider apples far exceeds that of white wine, most cider fermentation practices are directly taken from white winemaking, and do not account for the effects of high concentrations of phenolic compounds on fermentation performance. The objective of this study was to determine whether three phenolic compounds—ferulic acid, p-coumaric acid, and chlorogenic acid—at concentrations reported in apples, would inhibit fermentation or alter the aroma of the cider, and if adding yeast assimilable nitrogen (YAN), a yeast nutrient, would reduce these effects. Our hypotheses were that the phenolic compounds present in high-tannin cider apples would negatively impact fermentation performance, but not alter the aroma, and that added YAN would reduce these effects. Ferulic acid negatively affected fermentation performance (p < 0.05), but p-coumaric acid and chlorogenic acid did not. Addition of nitrogen improved fermentation performance for the low concentration ferulic acid condition, but not for the high concentration. p-Coumaric acid led to the greatest changes in cider aroma, with differences in aroma also detected for ferulic acid ciders. Chlorogenic acid did not affect aroma or fermentation performance. Yeast strain and YAN addition also influenced fermentation performance and aroma.

Tesis por compendio / [ES] En el primer capítulo, se caracterizó una colección de seis accesiones de berenjenas, 21 accesiones de 12 especies silvestres y 45 híbridos interespecíficos de berenjena con especies silvestres utilizando 27 descriptores morfológicos y 20 descriptores morfométricos de frutos basados en la herramienta fenómica Tomato Analyzer. Observamos diferencias significativas entre los tres grupos, con híbridos que muestran valores intermedios para la mayoría de los descriptores. Las especies silvestres mostraron una amplia diversidad para ampliar la base genética de la berenjena. En el segundo capítulo, el mismo material se caracterizó para el contenido en compuestos fenólicos del fruto, el color de la pulpa de la fruta y los caracteres relacionados con el pardeamiento. Mientras que el ácido fenólico predominante en la berenjena cultivada fue el ácido clorogénico (> 65.0%), en los parientes silvestres fue de menos del 50% del área del pico del cromatograma HPLC. Las variedades cultivadas presentaron un color de carne más claro y baja actividad de polifenol oxidasa (PPO). Los híbridos interespecíficos fueron intermedios para todos los caracteres estudiados. En el tercer capítulo, realizamos un estudio genético Linea por Probador (L × P) utilizando dos líneas cultivadas, una con citoplasma oriental y otra occidental con cuatro probadores que representan tres especies silvestres: S. insanum, S.anguivi y S . lichtensteinii. Además, evaluamos el material para 3 descriptores bioquímicos, 12 morfológicos y 8 de Tomato Analyzer. Encontramos diferencias significativas para los 23 caracteres estudiados. Los valores más altos para la componente SCA se determinaron en comparación con la componente GCA. En general, los probadores del genepool secundarios fueron mejores para la mejora de los caracteres bioquímicos, mientras que las especies de genepool primarias fueron mejores para los caracteres morfológicos. En el cuarto capítulo, para obtener información sobre la genética de caracteres importantes en la berenjena, realizamos el primer estudio genético detallado de la berenjena con 10 genotipos diversos de berenjena, entre ellos una accesión de S. insanum, mientras que el resto fueron variedades tradicionales con forma del fruto muy diversa. Cuando se cruzaron en un diseño de medio dialelo, los 10 padres produjeron un conjunto de 45 híbridos. Evaluamos padres e híbridos para 14 descriptores de características morfológicas y 14 características morfométricas del fruto. También determinamos las distancias genéticas utilizando 7,335 marcadores de SNP polimórficos. Del mismo modo, en el quinto capítulo, estudiamos los compuestos fenólicos del fruto, el color de la pulpa del mismo y los caracteres relacionados con el pardeamiento en el mismo material. Se determinó que la accesión de S. insanum accession INS2 presenta valores altamente significativos para los compuestos fenólicos totales y el contenido de ácido clorogénico. Se encontraron efectos significativos para la aptitud combinatoria específica y general para los caracteres bioquímicos estudiados. De manera similar a lo encontrado anteriormente, la distancia genética entre los padres no fue útil para predecir el comportamiento de los híbridos.Finalmente, en el sexto capítulo, hemos desarrollado un protocolo de agroinfiltración para la expresión transitoria de un gen en el fruto de la berenjena utilizando GUS; Vector pCAMBIA1304. Posteriormente, para probar la utilidad del protocolo, utilizamos la hidroxicinamoil CoA-quinato transferasa (SmHQT) de berenjena, que es la enzima central estudiada para aumentar el contenido de ácido clorogénico, en la construcción del gen con el promotor específico en un vector de transformación de plantas (pBIN19). Además, en nuestro casete, también coexpresamos la proteína P19 del Tomato bushy stunt virus para sobreexpresar la proteína. En esta tesis proporcionamos información sobre los parientes sil / [CA] En el primer capítol, es va caracteritzar una col·lecció de sis accessions d'albergínies, 21 accessions de 12 espècies silvestres i 45 híbrids interespecífics d'albergínia amb espècies silvestres utilitzant 27 descriptors morfològics i 20 descriptors morfomètrics de fruits basats en l'eina fenómica Tomato Analyzer. Observarem diferències significatives entre els tres grups, amb híbrids que mostren valors intermedis per a la majoria dels descriptors. Les espècies silvestres van mostrar una àmplia diversitat per a ampliar la base genètica de l'albergínia.En el segon capítol, el mateix material es va caracteritzar per al contingut en compostos fenòlics del fruit, el color de la polpa de la fruita i els caràcters relacionats amb el pardejament. Mentre que l'àcid fenòlic predominant en l'albergínia cultivada va ser l'àcid clorogènic (> 65.0%), en els parents silvestres va ser de menys del 50% de l'àrea del pic del cromatograma HPLC. Les varietats cultivades van presentar un color de carn més clar i baixa activitat de polifenol oxidasa (PPO). Els híbrids interespecífics van ser intermedis per a tots els caràcters estudiats. Curiosament, no trobem correlacions significatives entre el contingut de compostos fenòlics totals o àcid clorogènic i el pardejament de la polpa de la fruita. En el tercer capítol, realitzem un estudi genètic Línia per Emprovador (L × P) utilitzant dues línies cultivades, una amb citoplasma oriental i una altra occidental amb quatre emprovadors que representen tres espècies silvestres: S. insanum, S. anguivi i S. lichtensteinii. A més, avaluem el material per a 3 descriptors bioquímics, 12 morfològics i 8 de Tomato Analyzer. Trobem diferències significatives per als 23 caràcters estudiats. Els valors més alts per a la component SCA es van determinar en comparació amb la component GCA. En el quart capítol, per a obtindre informació sobre la genètica de caràcters importants en l'albergínia, realitzem el primer estudi genètic detallat de l'albergínia amb 10 genotips diversos d'albergínia, entre ells una accessió de S. insanum, mentre que la resta van ser varietats tradicionals amb forma del fruit molt diversa. Quan es van creuar en un disseny de mitjà dial·lel, els 10 pares van produir un conjunt de 45 híbrids. Avaluem pares i híbrids per a 14 descriptors de característiques morfològiques i 14 característiques morfomètriques del fruit. També determinem les distàncies genètiques utilitzant 7,335 marcadors de SNP polimòrfics. En l'estudi de l'herència dels caràcters morfològics importants per al desenvolupament d'híbrids en albergínia, es va trobar que la distància genètica entre els pares té un valor limitat per a predir el rendiment dels híbrids en aquest cultiu. Es va determinar que l'accessió de S. insanum accessió INS2 presenta valors altament significatius per als compostos fenòlics totals i el contingut d'àcid clorogènic. Es van trobar efectes significatius per a l'aptitud combinatòria específica i general per als caràcters bioquímics estudiats. De manera similar a l'oposat anteriorment, la distància genètica entre els pares no va ser útil per a predir el comportament dels híbrids. Finalment, en el sisé capítol, hem desenvolupat un protocol d'agroinfiltració per a l'expressió transitòria d'un gen en el fruit de l'albergínia utilitzant GUS; Vector pCAMBIA1304. Posteriorment, per a provar la utilitat del protocol, utilitzem la hidroxicinamoil CoA-quinat transferasa (SmHQT) d'albergínia, que és l'enzim central estudiat per a augmentar el contingut d'àcid clorogènic, en la construcció del gen amb el promotor específic en un vector de transformació de plantes (pBIN19). A més, en el nostre casset, també coexpresem la proteïna P19 del Tomato bushy stunt virus per a sobreexpresar la proteïna. En aquesta tesi proporcionem informació sobre els parents silvestres d'albergínies per a caràcters morfològics i bioq / [EN] In the first chapter, a collection of six eggplant accessions, 21 accessions of 12 wild species (the only primary genepool species S. insanum and 11 secondary genepool species) and 45 interspecific hybrids of eggplant with wild species were characterized using 27 morphological descriptors and 20 fruit morphometric descriptors based on the phenomics tool Tomato Analyzer. We observed significant differences among the three groups with hybrids showing intermediate values for most of the descriptors. The wild species showed an extensive diversity for broadening the genetic base of eggplant. In the second chapter, the same material was characterized for the fruit phenolics, fruit flesh colour and browning related traits. Wild relatives showed greater variation for the fruit phenolics than cultivated eggplant. While, the predominant phenolic acid in cultivated eggplant was chlorogenic acid (>65.0%), in the wild relatives it was less 50% of HPLC chromatogram peak area. Cultivated varieties had lighter flesh colour and low polyphenol oxidase (PPO) activity. The interspecific hybrids were found to be intermediate for all the characters studied. Interestingly, we found no significant correlations between total phenolics or chlorogenic acid contents and fruit flesh browning. In the third chapter, we performed a Line by Tester (L ×T) genetic study using two cultivated lines one with oriental and another with occidental cytoplasm along with four testers representing three wild species namely, S. insanum, S.anguivi, and S. lichtensteinii. Further, we evaluated the material for 3 biochemical, 12 morphological and 8 Tomato Analyzer based descriptors. We found a significant amount of variation for all the 23 traits studied. The higher values for the SCA component were determined as compared to the GCA component. Overall, the secondary genepool testers were better for the biochemical traits improvement whereas, the primary genepool species was better for the morphological traits. In the fourth chapter, in order to gain information regarding the genetics of important traits in eggplant, we performed the first detailed genetic study of eggplant with 10 diverse eggplant genotypes among them an S. insanum accession, while the remaining nine were highly diverse shaped fruits of popular eggplant cultivars. When crossed in a half-diallel matting design 10 parents produced a set of 45 hybrids. We evaluated parents and hybrids for 14 morphological and 14 fruit morphometric traits descriptors. We also determined the genetic distances using 7,335 polymorphic SNP markers. In the study of the genetics of important morphological traits for hybrid development in eggplant, we found that genetic distance among parents had limited value to predict hybrid performance in this crop. Likewise, in the fifth chapter, we studied the fruit phenolics, fruit flesh colour and browning related traits in the same material. We determined that S. insanum accession INS2 displayed values highly significant for the total phenolics and CGA content. Significant specific and general combining ability effects were found for the biochemical traits studied. Similarly, the genetic distance among parents was nonsignificant to predict hybrids performance. Finally, in the sixth chapter, we have developed an agroinfiltration protocol for the transient expression of a gene in the eggplant fruit using GUS bearing; pCAMBIA1304 vector. Thereafter, to prove the usefulness of the protocol, we have used the eggplant hydroxycinnamoyl CoA-quinate transferase (SmHQT), which is the central enzyme studied to increase the chlorogenic acid content, in a gene construct with the specific promoter in a plant transformation vector (pBIN19). Also, in our cassette, we also co-expressed the P19 protein of Tomato bushy stunt virus to overexpress the protein. Overall, in this thesis, we have provided information regarding the wild relatives of eggplants from a morphological and biochemical prospective. / Kaushik, P. (2019). Application of Conventional, Biotechnological and Genomics Approaches for Eggplant (Solanum melongena.L). Breeding with a Focus on Bioactive Phenolics [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/122295 / Compendio

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Dicaffeoylquinic acid (DCQA) is a natural polyphenolic compound widely distributed in plants such as coffee beans, which possesses a range of pharmacological activities. Herein, is reported studies undertaken towards the first total synthesis of 3,5-DCQA conjugates. Two synthetic routes were investigated. The first route involves a seven step sequence beginning from quinic acid. The overall yield via this synthetic approach was 30%. The key steps involved in the sequence were a regioselective benzylation of the C-3-hydroxyl group followed by silyl protection of the C-1 and C-4 hydroxyl groups. Deprotection of the benzyl group by hydrogenolysis and opening of the lactone afforded the 3,5-diol. Esterification of the 3,5-diol with 3,4-tert-butyldimethylsilyl caffeoyl chloride afforded the di-ester. Removal of the protecting groups afforded 3,5-DCQA. The second route involved selective protection of the C-3-hydroxyl group with silyl followed by benzylation of the C-1 and C-3 hydroxyl groups. Saponification of the lactone ring followed by benzylation of the carboxylic acid gave the benzyl ester. Silyl deprotection afforded the 3,5-diol. The 3,5-diol was subsequently esterified by refluxing in toluene with commercially available Meldrum’s acid. In the final step, the synthesis of 3,5-DCQA was achieved by a Knoevenagel condensation of 3,4-dihydroxybenzaldehyde and a malonate ester of quinic acid. An efficient method for the synthesis of possible metabolites of quinic acid conjugates was also described. This protocol employs N-(4-methoxyphenyl)-trifluoroacetimidate glucuronyl as the donor. The key reaction in this sequence was the coupling of N-(4-methoxyphenyl)-trifluoroacetimidate glucuronyl with 4-hydroxy-3-methoxy-benzaldehyde.

Ácido clorogênico (ACG) é o termo utilizado para designar um grupo de compostos fenólicos oriundos da reação de esterificação entre ácidos hidroxicinâmicos (p-cumárico, caféico e ferúlico) e ácido quínico. São amplamente encontrados em produtos naturais e exercem ações antioxidantes, citotóxicas, antitumorais, antibacterianas, antifúngicas e antiinflamatórias. Apesar da descrição dos seus efeitos antiinflamatórios em diferentes modelos experimentais, a literatura é carente quanto suas ações específicas em funções inflamatórias de neutrófilos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos do ACG sobre funções de neutrófilos in vitro. Neutrófilos foram obtidos do lavado peritoneal de ratos Wistar, machos, 4 horas após a injeção local de glicogênio de ostra a 1% e foram incubados, na presença ou ausência de LPS, com ACG nas concentrações de 25, 50, 100 ou 1000 &#181;M. A viabilidade celular (exclusão por trypan-blue), a secreção de citocinas e prostaglandina E2 (ensaio imunoenzimático); a produção de óxido nítrico (reação de Griess); a expressão de moléculas de adesão (citometria de fluxo); a aderência e a quimiotaxia foram avaliadas. Os resultados obtidos mostraram que o ACG não afetou as secreções do fator de necrose tumoral-&#945;,de interleucina 1&#946;, do óxido nítrico e de prostaglandina E2 em condições basais ou após estimulação pelo LPS. Diferentemente, a incubação com ACG inibiu a aderência de neutrófilos à cultura primária de célula endotelial de microcirculação de ratos e a quimiotaxia in vitro frente ao peptídeo formilado (N-formilmetionil- leucil-fenilalanina). Estes últimos efeitos podem estar associados à ação do ACG sobre a expressão de moléculas de adesão, já que o ACG elevou a expressão de L-selectina e reduziu as expressões de &#946;2 integrina e da molécula de adesão plaqueta e endotélio. Os dados obtidos não foram dependentes de alterações da viabilidade celular. Em conjunto, os resultados mostram que o ACG possui efeito direto sobre funções de neutrófilos responsáveis pela interação ao endotélio microvascular e pela migração orientada em resposta a estímulo inflamatório. Estes efeitos podem contribuir, pelo menos em parte, para redução da migração de neutrófilos para focos de inflamação na vigência de tratamento com ACG amplamente descrita na literatura. / Chlorogenic acid (CGA) is the term utilized to design a group of phenolic compounds from the sterification reaction between the hydroxycinnamic acids (p-coumaric, caffeic and ferulic acid) and the quinic acid. They are largely found in natural products and exert anti-oxidant, citoxic, anti-tumoral, anti-bactericidal, anti-fungicidal and anti-inflammatory activity. Besides the description of its anti-inflammatory effect in different experimental models, the literature is scarse regarding its specific actions in neutrophil inflammatory functions. Therefore, the aim of this present work was to investigate the CGA effects on neutrophils functions in vitro. Neutrophils were obtained from the peritoneal lavage of male Wistar rats four hours after a local injection of oyster glycogen 1% and were incubated, in the presence or absence of LPS, with CGA in the concentrations of 25, 50, 100 or 1000 &#181;M. The cellular viability (trypan-blue exclusion), the cytokines secretions (enzyme-linked immunosorbend assay), production of nitric oxide (Greiss reaction); adhesion molecules expression (flow citometry), adherence and chemotaxis in vitro were assessed. The results shows that the CGA did not affect the secretion of the tumor necrosis factor-&#945; , of nitric oxide and prostaglandin E2 and only the incubation with 50&#181;M of CGA inhibited the secretion of Interleukin 1&#946; after stimulation with LPS. Differently, the incubation with CGA inhibited the adherence of neutrophils on the primary culture of endothelial cell from the micro-circulation of rats and the chemotaxis in vitro against formylated peptide (fenyl-metyl-leucyl-alanin). This lasts effects might be associated with the action of CGA on the expression of adhesion molecules, hence this compound was capable of elevate the expression of L-selectin and reduce the expression of &#946;2 integrin and PECAM-1. The data here obtained are not dependent of cellular viability alterations. In conjunct, the data here obtained shows that the CGA has direct effect on neutrophils functions responsible of the interaction with the micro vascular endothelium and the oriented migration in response to an inflammatory stimuli. These effects can contribute, at least in part, to the decreased neutrophil migration in the inflammatory focus in the presence of CGA treatment.

A imunidade inata é um mecanismo ativado rapidamente para permitir a defesa do organismo contra injúrias de diferentes origens. No entanto, a exacerbação do processo inato é prejudicial ao hospedeiro e pode levar a cronicidade do processo. Os neutrófilos são as células importantes na resposta inata, que após exercerem suas ações no processo, devem ser eliminadas para o retorno da homeostasia. Nesta fase, os neutrófilos entram em apoptose e são fagocitados por macrófagos residentes. O ácido clorogênico (ACG) é componente frequente de alimentos, em especial em grãos, e apresentam propriedades anticancerígenas, antimutagênicas, antipiréticas, antifúngicas, antioxidantes, analgésicas e anti-inflamatórias. Neste último contexto, as ações do ACG na instalação do processo têm sido bem demonstradas, mas seu potencial de interferir com a resolução da inflamação ainda é fragmentária. Desta forma, o presente trabalho visou avaliar os mecanismos de ação do ACG na resolução da inflamação, focando nos mecanismos de morte dos neutrófilos, de fagocitose e \"killing\" de macrófagos. Para tanto, foram empregados camundongos, adultos, machos da linhagem Swiss. Neutrófilos peritoneais foram recrutados 4 horas após injeção local de glicogênio de ostra 1% e macrófagos peritoneais foram obtidos 96 horas após a injeção local de tioglicolato de sódio a 3%. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com ACG por 24 horas, na concentração 1, 10, 50 e 100 mM, aumentou a porcentagem de número de neutrófilos apoptóticos e não alterou a porcentagem de neutrófilos em necrose; a incubação de ACG por 1 hora, na concentração 1, 10, 50 e 100 mM, com macrófagos peritoneais aumentou a capacidade destas células fagocitarem neutrófilos apoptóticos; reduziu a secreção do tumor de necrose tumoral (TNF-alfa), não alterou a secreção de interleucina-10 e não interferiu com as expressões de MHC-II e de CD36. Em conjunto, os dados obtidos sugerem que o ACG pode controlar a resolução da inflamação por induzir a apoptose de neutrófilos e a fagocitose destes por macrófagos. / Innate immunity is a rapidly activated mechanism to allow the body\'s defense against injuries from different origins. However, exacerbation of innate process is detrimental to the host and can lead to chronic process. Neutrophils are important cells in innate response, which after performing their actions in the process, should be eliminated for the return of homeostasis. At this stage, the neutrophils undergo to apoptosis and are phagocytosed by resident macrophages. The chlorogenic acid (CGA) is a frequent component of foods, in particular grain, and it has anticancer, antimutagenic, antipyretic, antifungal, antioxidant, anti-inflammatory and analgesic properties. In this latter context, the actions of the ACG in the initial phases of the inflammatory process have been well documented, but its potential to interfere with the resolution of inflammation is still fragmented. Thus, the present study aimed to evaluate the mechanisms of action of ACG in the resolution of inflammation, focusing on mechanisms of neutrophil death and phagocytosis of macrophages. Hence, Swiss adult, male mice were employed as donor of neutrophils and macrophages. Peritoneal neutrophils were recruited 4 hours after local injection of 1% oyster glycogen and used for assessment of cell death mechanism, besides being used as apoptotic cells to be phagocyted. Peritoneal macrophages recruited 96 hours after the injection of 3% thioglycollate medium were used to 1) phagocytosis assay 2) Quantification of inflammatory mediators in the supernatant 3) quantification of MHC-II and CD36. The results showed that treatment with ACG, during 24 hours, at concentrations of 1, 10, 50 or 100 mM increased the percentage of apoptotic neutrophils and did not induced necrosis; incubation of macrophages during 1 hour with 1, 10, 50 or 100 mM increased the capacity of these cells to phagocyte apoptotic neutrophils; reduced tumor secretion of tumor necrosis factor (TNF-alpha) and did not alter the secretion of interleukin-10, and did not interfere with the expression of MHC-II and CD36. Together, these data suggest that the ACG can control the resolution of inflammation, by interfering with events in neutrophils and macrophages.

A epilepsia é uma enfermidade, caracterizada por eventos cerebrais paroxísticos auto-sustentados e recorrentes, que apresenta manifestações eletro-clínicas e neuropatológicas únicas, que podem alterar a estrutura e funcionamento do encéfalo, cujas manifestações são diferentes entre si. Afeta cerca de 50 milhões de pessoas no mundo. Modelos animais e ferramentas biológicas são importantes para se entender lesões neuroniais. Sabe-se que logo depois da administração de Li-Pilo em ratos - status epilepticus (SE), inicia-se uma cadeia de eventos neuroquímicos, como a produção de radicais livres,dentre outros, que podem piorar ou perpetuar as crises posteriores. A utilização de agentes antioxidantes, com ação no Sistema Nervoso Central pode significar uma alternativa co-adjuvante na prevenção das epilepsias secundárias, de animais de laboratório e talvez em humanos. Neste trabalho avaliou-se a ação antioxidativa e neuroprotetora do ácido clorogênico (AC), in vivo, em ratos submetidos ao SE. Comparou-se ademais o efeito do AC com o efeito de um antioxidante, o acido ascórbico. Ao tratar os animais com AC (30 mg/kg), houve uma diminuição significativa (50%), [F (7, 40)= 14,42; P < 0,0001], da produção de MDA, importante produto da peroxidação lipídica; assim como uma diminuição significativa (72%), [F (7,40)= 11,26; P < 0,0001], na atividade da SOD, enzima que atua como agente antioxidante endógeno. A ação do AC, diminuindo a concentração de MDA (49%), que é um dos substratos da SOD, levaria a uma menor taxa de SOD (59%). Pensando no que acontece com um fármaco que iniba essa cascata de peroxidação, esses resultados estão de acordo com a literatura, na qual se ressalta que a ação da SOD pode estar diretamente relacionada com a presença do MDA. E o mais importante, constatou-se que o AC (30 mg/kg) protegeu as células hipocampais, ou seja, diminuiu significativamente a perda de células nas regiões CA3 [F (4,25)= 15,55; P < 0,0001] (48%), e no hilus do hipocampo [F (4,25)= 6,276, P<0,0001] (75%). Da mesma forma, houve uma diminuição significativa de neurônios em degeneração (Fluoro Jade C+) na CA3 [F(2,15)= 40,90; P<0,0001]. Podemos concluir que o AC é um eficiente inibidor da proliferaçãode agentes oxidantes, que levam à morte celular, quando comparado com o ácido ascórbico, no hipocampo de ratos Wistar, quando induzido o SE com Li-Pilo. Portanto, sendo neuroprotetor / Epilepsy is a disorder characterized by paroxysmal self-sustained and recurrent brain events, featuring electro-clinical and neuropathological phenomena unique, which may change the structure and functioning of the brain, whose manifestations are different. It affects about 50 million people worldwide. Animal models and are important biological tools for understanding neuronal injury. It is known that soon after the administration of Li-Pilo in rats - status epilepticus (SE), starts a chain of neurochemical events such as the production of free radicals, among others, that may worsen or perpetuate the subsequent seizures. The use of antioxidant agents acting on the central nervous system can alternatively mean a co-adjuvant in secondary preven-tion of epilepsy, laboratory animals and possibly humans. In our study we evaluated the antioxi-dative action and chlorogenic acid (CA) neuroprotective using Litio-Pilocarpine in vivo, in rats. It compared the effects of CA in addition to the effect of an antioxidant, ascorbic acid. By treating the animals with CA (30 mg / kg), a significant decrease in [F (7, 40) = 14.42; P <0.0001], the production of MDA, important product of lipid peroxidation; as well as a significant decrease in [F (7,40) = 11.26; P <0.0001] (50%), the activity of SOD, an enzyme that acts as an endogenous antioxidant. The action of CA, decreasing the concentration of MDA (49%), which is one of the SOD substrates, would lead to a lower rate of SOD (72%). Thinking about what happens to a drug that inhibits this peroxidation cascade, these results are consistent with the literature, in which it points out that the action of SOD can be directly related to the presence of MDA. Furthermore, it was found that the CA (30 mg / kg) protected the hippocampus cells, or significantly decreased cell loss in CA3 [F (4,25) = 15.55; P <0.0001] (59%), and hilus regions of the hippocampus [F (4,25) = 6.276, P <0.0001] (48%). Likewise, a significant reduction in neu-ronal degeneration (Fluoro Jade C +) in the CA3 [F (2,15) = 40.90; P <0.0001] (75%). We con-clude that the CA is an effective inhibitor of the proliferation of oxidizing agents, leading to cell death when compared to the ascorbic acid in the hippocampus of Wistar rats when induced SE with Li-Pilo. However, CA was neuroprotector in this model.

A imunidade inata é um mecanismo ativado rapidamente para permitir a defesa do organismo contra injúrias de diferentes origens. No entanto, a exacerbação do processo inato é prejudicial ao hospedeiro e pode levar a cronicidade do processo. Os neutrófilos são as células importantes na resposta inata, que após exercerem suas ações no processo, devem ser eliminadas para o retorno da homeostasia. Nesta fase, os neutrófilos entram em apoptose e são fagocitados por macrófagos residentes. O ácido clorogênico (ACG) é componente frequente de alimentos, em especial em grãos, e apresentam propriedades anticancerígenas, antimutagênicas, antipiréticas, antifúngicas, antioxidantes, analgésicas e anti-inflamatórias. Neste último contexto, as ações do ACG na instalação do processo têm sido bem demonstradas, mas seu potencial de interferir com a resolução da inflamação ainda é fragmentária. Desta forma, o presente trabalho visou avaliar os mecanismos de ação do ACG na resolução da inflamação, focando nos mecanismos de morte dos neutrófilos, de fagocitose e \"killing\" de macrófagos. Para tanto, foram empregados camundongos, adultos, machos da linhagem Swiss. Neutrófilos peritoneais foram recrutados 4 horas após injeção local de glicogênio de ostra 1% e macrófagos peritoneais foram obtidos 96 horas após a injeção local de tioglicolato de sódio a 3%. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com ACG por 24 horas, na concentração 1, 10, 50 e 100 mM, aumentou a porcentagem de número de neutrófilos apoptóticos e não alterou a porcentagem de neutrófilos em necrose; a incubação de ACG por 1 hora, na concentração 1, 10, 50 e 100 mM, com macrófagos peritoneais aumentou a capacidade destas células fagocitarem neutrófilos apoptóticos; reduziu a secreção do tumor de necrose tumoral (TNF-alfa), não alterou a secreção de interleucina-10 e não interferiu com as expressões de MHC-II e de CD36. Em conjunto, os dados obtidos sugerem que o ACG pode controlar a resolução da inflamação por induzir a apoptose de neutrófilos e a fagocitose destes por macrófagos. / Innate immunity is a rapidly activated mechanism to allow the body\'s defense against injuries from different origins. However, exacerbation of innate process is detrimental to the host and can lead to chronic process. Neutrophils are important cells in innate response, which after performing their actions in the process, should be eliminated for the return of homeostasis. At this stage, the neutrophils undergo to apoptosis and are phagocytosed by resident macrophages. The chlorogenic acid (CGA) is a frequent component of foods, in particular grain, and it has anticancer, antimutagenic, antipyretic, antifungal, antioxidant, anti-inflammatory and analgesic properties. In this latter context, the actions of the ACG in the initial phases of the inflammatory process have been well documented, but its potential to interfere with the resolution of inflammation is still fragmented. Thus, the present study aimed to evaluate the mechanisms of action of ACG in the resolution of inflammation, focusing on mechanisms of neutrophil death and phagocytosis of macrophages. Hence, Swiss adult, male mice were employed as donor of neutrophils and macrophages. Peritoneal neutrophils were recruited 4 hours after local injection of 1% oyster glycogen and used for assessment of cell death mechanism, besides being used as apoptotic cells to be phagocyted. Peritoneal macrophages recruited 96 hours after the injection of 3% thioglycollate medium were used to 1) phagocytosis assay 2) Quantification of inflammatory mediators in the supernatant 3) quantification of MHC-II and CD36. The results showed that treatment with ACG, during 24 hours, at concentrations of 1, 10, 50 or 100 mM increased the percentage of apoptotic neutrophils and did not induced necrosis; incubation of macrophages during 1 hour with 1, 10, 50 or 100 mM increased the capacity of these cells to phagocyte apoptotic neutrophils; reduced tumor secretion of tumor necrosis factor (TNF-alpha) and did not alter the secretion of interleukin-10, and did not interfere with the expression of MHC-II and CD36. Together, these data suggest that the ACG can control the resolution of inflammation, by interfering with events in neutrophils and macrophages.

Ácido clorogênico (ACG) é o termo utilizado para designar um grupo de compostos fenólicos oriundos da reação de esterificação entre ácidos hidroxicinâmicos (p-cumárico, caféico e ferúlico) e ácido quínico. São amplamente encontrados em produtos naturais e exercem ações antioxidantes, citotóxicas, antitumorais, antibacterianas, antifúngicas e antiinflamatórias. Apesar da descrição dos seus efeitos antiinflamatórios em diferentes modelos experimentais, a literatura é carente quanto suas ações específicas em funções inflamatórias de neutrófilos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos do ACG sobre funções de neutrófilos in vitro. Neutrófilos foram obtidos do lavado peritoneal de ratos Wistar, machos, 4 horas após a injeção local de glicogênio de ostra a 1% e foram incubados, na presença ou ausência de LPS, com ACG nas concentrações de 25, 50, 100 ou 1000 &#181;M. A viabilidade celular (exclusão por trypan-blue), a secreção de citocinas e prostaglandina E2 (ensaio imunoenzimático); a produção de óxido nítrico (reação de Griess); a expressão de moléculas de adesão (citometria de fluxo); a aderência e a quimiotaxia foram avaliadas. Os resultados obtidos mostraram que o ACG não afetou as secreções do fator de necrose tumoral-&#945;,de interleucina 1&#946;, do óxido nítrico e de prostaglandina E2 em condições basais ou após estimulação pelo LPS. Diferentemente, a incubação com ACG inibiu a aderência de neutrófilos à cultura primária de célula endotelial de microcirculação de ratos e a quimiotaxia in vitro frente ao peptídeo formilado (N-formilmetionil- leucil-fenilalanina). Estes últimos efeitos podem estar associados à ação do ACG sobre a expressão de moléculas de adesão, já que o ACG elevou a expressão de L-selectina e reduziu as expressões de &#946;2 integrina e da molécula de adesão plaqueta e endotélio. Os dados obtidos não foram dependentes de alterações da viabilidade celular. Em conjunto, os resultados mostram que o ACG possui efeito direto sobre funções de neutrófilos responsáveis pela interação ao endotélio microvascular e pela migração orientada em resposta a estímulo inflamatório. Estes efeitos podem contribuir, pelo menos em parte, para redução da migração de neutrófilos para focos de inflamação na vigência de tratamento com ACG amplamente descrita na literatura. / Chlorogenic acid (CGA) is the term utilized to design a group of phenolic compounds from the sterification reaction between the hydroxycinnamic acids (p-coumaric, caffeic and ferulic acid) and the quinic acid. They are largely found in natural products and exert anti-oxidant, citoxic, anti-tumoral, anti-bactericidal, anti-fungicidal and anti-inflammatory activity. Besides the description of its anti-inflammatory effect in different experimental models, the literature is scarse regarding its specific actions in neutrophil inflammatory functions. Therefore, the aim of this present work was to investigate the CGA effects on neutrophils functions in vitro. Neutrophils were obtained from the peritoneal lavage of male Wistar rats four hours after a local injection of oyster glycogen 1% and were incubated, in the presence or absence of LPS, with CGA in the concentrations of 25, 50, 100 or 1000 &#181;M. The cellular viability (trypan-blue exclusion), the cytokines secretions (enzyme-linked immunosorbend assay), production of nitric oxide (Greiss reaction); adhesion molecules expression (flow citometry), adherence and chemotaxis in vitro were assessed. The results shows that the CGA did not affect the secretion of the tumor necrosis factor-&#945; , of nitric oxide and prostaglandin E2 and only the incubation with 50&#181;M of CGA inhibited the secretion of Interleukin 1&#946; after stimulation with LPS. Differently, the incubation with CGA inhibited the adherence of neutrophils on the primary culture of endothelial cell from the micro-circulation of rats and the chemotaxis in vitro against formylated peptide (fenyl-metyl-leucyl-alanin). This lasts effects might be associated with the action of CGA on the expression of adhesion molecules, hence this compound was capable of elevate the expression of L-selectin and reduce the expression of &#946;2 integrin and PECAM-1. The data here obtained are not dependent of cellular viability alterations. In conjunct, the data here obtained shows that the CGA has direct effect on neutrophils functions responsible of the interaction with the micro vascular endothelium and the oriented migration in response to an inflammatory stimuli. These effects can contribute, at least in part, to the decreased neutrophil migration in the inflammatory focus in the presence of CGA treatment.